PT1509597E - Processo para isolar células indiferenciadas mesenquimatosas do folículo piloso - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA ISOLAR CÉLULAS INDIFERENCIADAS MESENQUIMATOSAS DO FOLÍCULO PILOSO" A presente invenção diz respeito a um processo para isolar células indiferenciadas mesenquimatosas do folículo piloso.

Com excepção das mucosas, das palmas das mãos e das plantas do pés, os foliculos pilosos existem em todo o integumento humano, representando os foliculos pilosos uma entidade funcional complexa autocontida, um órgão miniatura. Sob os pontos de vista topográfico e anatómico, é possível distinguir quatro partes, a) infundibulo: secção entre o óstio do folículo piloso e a intercepção da glândula sebácea no canal piloso; b) istmo: secção entre a intercepção da glândula sebácea e a inserção do M. arrector pili; c) infrainfundibulo (parte suprabulbar) : secção entre a inserção do M. arrector pili até ao bolbo; e d) o bolbo piloso, incluindo a papila dérmica folicular. Estima-se que no couro cabeludo haja cerca de 100 000 foliculos pilosos terminais, que estão dispersos sobre o couro cabeludo em grupos de 3-5 foliculos pilosos, as chamadas unidades foliculares. Estas unidades foliculares estão rodeadas por uma rede de fibras de colagénio e estão separadas umas das outras por fibras de colagénio mais grossas. O bolbo piloso, em forma de cebola, forma a extremidade proximal do folículo piloso em crescimento e penetra, no caso do pêlo terminal, no tecido adiposo subcutâneo (figura 2a, pormenor). As células da matriz pilosa, localizadas no bolbo piloso, diferenciam-se, formando assim a haste. As 2 células da matriz são designadas por "células amplificadoras de trânsito", isto é, uma população de células que morrem a seguir a uma fase de crescimento proliferativo intenso. A papila pilosa dérmica folicular (figuras 2b e 2c), que é alimentada por uma rede fina de nervos e de vasos sanguineos, expande-se dentro do bolbo piloso proximal e apresenta tipicamente a forma de uma cebola. A papila pilosa dérmica distingue-se da derme pelo facto de estar embutida na matriz extracelular que se assemelha a uma membrana basal, no que diz respeito à sua composição. Assim, durante a fase de crescimento do folículo piloso (a chamada anagénese), os fibroblastos individuais da papila pilosa dérmica podem contactar directamente os ceratinócitos da matriz, através de apêndices celulares. Os melanócitos localizados sobre o vértice da papila dérmica revelam actividade de melanogénese, dependente do ciclo piloso, desde a fase IV da anagénese até ao inicio da catagénese (fase de regressão). A actividade dos ceranócitos da matriz é regulada pelos sinais morfogénicos e mitogénicos, com as células especializadas da papila pilosa. No caso de disfunções neste segmento do foliculo piloso, a fase de crescimento (anagénese) é interrompida e o folículo entra na fase de regressão, isto é, a catagénese. Isto mostra que os processos que destroem os ceranócitos da matriz e a região protuberante sobreposta (zona bojuda) podem conduzir a uma perda irreversível de pêlo, ao passo que os agentes nocivos que apenas afectam a função das células papilares podem determinar o tamanho da papila e a espessura das hastes do pêlo que irão ser formadas. Deste modo, as maiores papilas pilosas dérmicas são encontradas nos 3 folículos do pêlo terminal da barba e as papilas pilosas dérmicas cada vez mais pequenas são encontradas nos folículos pilosos do couro cabeludo afectados por alopecia androgenética. 0 invólucro de tecido conjuntivo da raiz do cabelo (DS = invólucro dérmico), designado por folículo piloso, é constituído por duas camadas de fibras de colagénio, das quais a interior está disposta circularmente em torno da haste pilosa. A parte exterior, mais espessa, do invólucro mesenquimatoso da raiz contém fibras de colagénio e fibras elásticas que se desenvolvem paralelamente à haste do pêlo. Além disso, existe uma rede circular de fibras nervosas que penetram na membrana basal vítrea, indicando a função táctil do pêlo. 0 invólucro mesenquimatoso da raiz do pêlo funde-se com a papila pilosa dérmica folicular na extremidade proximal, o bolbo piloso. A haste pilosa está rodeada por invólucros radiculares epiteliais telescópicos, em forma de camisa. Ao longo da extensão de formação e pigmentação da haste pilosa intrafolicular é possível definir facilmente, em secção transversal, um invólucro radicular interior (IRI) e um invólucro radicular exterior (IRE). 0 IRI é formado pela camada de Henle exterior, sobretudo de estratificação dupla, a camada de Huxley média multiestratificada e a cutícula. As três camadas são formadas a partir das células da matriz localizadas no bordo exterior do bolbo piloso. Enquanto o invólucro radicular exterior se funde continuamente na camada de células basais da epiderme, o IRI termina, aproximadamente, ao nível do infundíbulo. Assim, a transição distai para o revestimento epidérmico do óstio do folículo piloso revela uma cornificação epidérmica. 4

Directamente por baixo do orifício da glândula sebácea, o IRE fica adjacente ao IRI. Uma localização importante do IRE é o ponto de inserção do M. arrector pili, designado por bojo. Presume-se que seja nesta região, e também na sua proximidade, que as células indiferenciadas epiteliais do folículo piloso tenham a sua sede. Por meio de um corte horizontal ao nível do istmo, é possível reconhecer o pêlo terminal, em comparação com um corte transversal do IRI, pela sua haste pilosa mais grossa, e as hastes pilosas do velo que são mais finas do que o IRI. 0 folículo piloso é constituído por duas espécies de células primárias. Um tipo dessas células provém da ectoderme/epiderme embrionária no início da morfogenese do folículo piloso e o outro tipo provém das partes mesodérmicas. Embora as células indiferenciadas epiteliais do folículo piloso estejam localizadas essencialmente dentro da região designada por "bojo", ou próximo dela, (ponto de inserção do músculo do bojo piloso), do folículo piloso, considera-se como doutrina consagrada que as células indiferenciadas mesenquimatosas estão na papila dérmica. A propósito disto, estudos anteriores comprovaram que é possível implantar em segmentos da pele, desprovidos de pêlos, papilas dérmicas preparadas e que isto induz a formação de novos folículos pilosos (Oliver, 1970, Jahoda et al., 1984, Reynolds et al., 1999). Assim, o local de remoção das células da papila determina o tipo de pêlo formado (v.g., as papilas de vibrissas de murganho induzem outras vez vibrissas numa orelha de murganho). As papilas dérmicas (DP) também podem ser colocadas em meio nutriente para aumentar o número de células. Estas células de DP, criadas em cultura, também podem ser implantadas em zonas 5 da pele desprovidas de pêlo (v.g.r palmas das mãos) conseguindo, ainda assim, induzir a formação de novos foliculos pilosos (Messenger, 1984). Na realidade, as células das DP conseguem induzir a formação de pêlo, mas não repovoam a região dos DSC ou a região das DS. A abreviatura DSC significa "cálice do invólucro dérmico" (dermal sheath cup) e indica a localização das células. Além disso, o pêlo formado pelas células das DP tem apenas um curto periodo de vida.

No documento WO99/03505 demonstra-se que as células indiferenciadas mesenquimatosas estão presentes no invólucro piloso. 0 documento W099/03505 também esclarece que as células indiferenciadas mesenquimatosas do invólucro piloso possuem uma actividade de fosfatase alcalina. A perda de cabelo é uma parte do processo de envelhecimento (alopecia senil), resultando da acção de mecanismos patológicos activos, como sucede no caso da alopecia androgenética, alopecia areata e alopecias de cicatrizações/traumáticas, ou é uma resposta à quimioterapia. De um modo geral, a perda de cabelo é considerada, socialmente, como um aspecto negativo. A forte procura para evitar a queda do cabelo, ou para o substituir, levou ao desenvolvimento de inúmeros medicamentos, produtos e técnicas diferentes. No domínio da pesquisa biológica capilar, a papila dérmica contida na unidade que é o folículo piloso, foi identificada como sendo a estrutura que determina o desenvolvimento e a diferenciação do folículo piloso durante a embriogenese e que controla tanto o crescimento da fibra pilosa como o ciclo do folículo piloso. No caso de muitas doenças relacionadas com a queda de cabelo, incluindo a mais 6 vulgar, a alopecia androgenética, a papila dérmica é influenciada por factores exógenos que fazem com que a papila dérmica não consiga manter a vitalidade do foliculo piloso. Em parte, isto pode ser atribuído a uma redução do tamanho e à perda de células da papila dérmica. 0 tamanho reduzido da papila dérmica está associado, directamente, ao tamanho reduzido dos folículos pilosos.

De uma maneira simplificada, as doenças pilosas podem ser definidas em função de pêlo "excessivo" (hipertricose/ hirsutismo) ou em função de pêlo "insuficiente" (todas as formas de alopecia, tais como, mas sem que isso constitua qualquer limitação, alopecia areata, alopecia androgenética, pseudopelada, líquen planopilarís, lúpus eritematoso, hipotricose congénita e atriquias (atriquia papular e outras), queda de cabelo difusa, no caso de uma doença metabólica, por exemplo, uma disfunção da tiróide, alopecias resultantes de queimaduras ou traumas, alopecias em resposta a uma quimioterapia, ou de outros tipos a definir). Entre as diversas alopecias, apenas para a alopecia androgenética há no mercado unicamente dois agentes activos autorizados (finasteride e minoxidil). Nenhum agente activo afecta as células indiferenciadas e nenhum agente consegue garantir um crescimento de cabelo, cosmeticamente aceitável, em todos os casos. 0 tratamento da hipertricose é realizado, essencialmente, por meios físicos, isto é, por destruição do foliculo piloso com recurso a terapia laser. Neste caso, a inibição da função das células indiferenciadas é mais eficaz.

Assim sendo, há uma procura justificada de meios para tratar o crescimento insuficiente de cabelo. 7 A presente invenção tem por objecto resolver este problema, em conformidade com o descrito nas reivindicações anexas.

As figuras seguintes ilustram a invenção A figura 1 é uma ilustração esquemática de um foliculo piloso terminal. A figura 2 representa um corte histológico de um cabelo em fase de anagénese. 0 pormenor assinalado indica o corte ilustrado nas figuras 2b e c. A abreviatura DSC significa "dermal sheath cup" (cálice do invólucro dérmico) e indica a posição das células. As células do DSC estão claramente definidas, em termos anatómicos e topográficos, pela sua posição dentro do foliculo piloso e estão situadas no pólo do bolbo piloso, numa posição envolvente do bolbo piloso, formando um cálice. A abreviatura DP significa "dermal papilla" (papila dérmica). A abreviatura DS significa "dermal sheath" (invólucro dérmico)

As figuras 3 (a) a (i) ilustram as fases diferenciadas de um esquema de dissecação para a obtenção de células do cálice do invólucro dérmico (DSC). Os pêlos intactos, em fase de anagénese (a) , são preparados ao microscópio estereoscópico. A imagem amplificada em (b) ilustra o nivel de dissecação: faz-se um corte através do pêlo no pólo superior da zona pigmentada; o cálice do invólucro dérmico (DSC) pode ser removido conjuntamente com a papila pilosa dérmica (c). Esta parte do tecido é revirada (d) e a papila dérmica (e) é separada do bolbo piloso (f); permanecem os componentes epiteliais (h) do foliculo piloso e o tecido conjuntivo (i) = 'dermal sheath' = DS (invólucro dérmico).

As figuras 4 (a) a (c) ilustram o resultado de uma implantação de células de DSC numa orelha de murganho. Os 8 tecidos de DSC foram isolados na cultura celular, tendo as células sido implantadas numa primeira orelha de murganho desprovida de pêlo. Após a implantação de células de DSC de vibrissas, na orelha direita, as vibrissas cresceram nessa orelha do murganho. Na orelha esquerda, não tratada, não se observou o desenvolvimento de nenhumas vibrissas. As figuras 4b e 4c ilustram as respectivas ampliações.

As figuras 5 (a) a (f) correspondem a histogramas da actividade de fosfatase alcalina. Esta figura ilustra a expressão forte da fosfatase alcalina na papila pilosa dérmica, ao passo que as células de DSC apenas manifestam uma expressão fraca. A expressão termina abruptamente na transição de DSC para DS (figuras 3b e c, figuras 5a-c). As células de DP (figura 5f) e de DSC (figura 5e), criadas em cultura, revelam um padrão de crescimento idêntico in vitro, com tendência para a formação das chamadas pseudopapilas. As células de DS têm tendência para apresentar um padrão de crescimento com células fortemente alongadas, com uma disposição semelhante às das escamas dos peixes (figura 5d) . As células de DP (figura 5f) revelam uma forte actividade de fosfatase alcalina, as células de DSC (figura 5e) revelam uma fraca actividade de fosfatase alcalina e as células de DS (figura 5d) não revelam nenhuma actividade de fosfatase alcalina. A figura 6 mostra papilas pilosas dérmicas induzidas e repovoadas após a implantação de células de DSC. Foram criadas em cultura células fluorescentes de DSC provenientes de murganhos TgN-GFPX, conforme publicado, tendo sido implantadas em orelhas de murganhos SCID. Decorridos 6 meses, foi possivel observar o crescimento de pêlo novo (figura 4) . Após o implante, foram encontradas 9 células fluorescentes por meio de microscopia confocal laser, tanto na região da papila pilosa dérmica como na região do DSC e também, em parte, dentro do invólucro dérmico (a, b) . Embora algumas de todo o conjunto de células de papila recém-formadas revelassem fluorescência, outras células (c, d) revelaram uma fluorescência diminuta, o que é um indicador de que as células de DSC podem repovoar uma papila preexistente para assim se formar um pêlo mais grosso. A figura 7 mostra o resultado de uma absorção 'Western' para a proteína MSP: foram utilizados extractos de MSP, provenientes de células de DP criadas em cultura (citossol = pista 1, ligadas à membrana = pista 4); de células do cálice dérmico (citossol = pista 2, ligadas à membrana = pista 5) e de fibroblastos foliculares (citossol = pista 3, ligados à membrana = pista 6) que foram objecto de separação cromatográfica (SDS-PAGE: poliacrilamida a 12%), com absorção sobre uma membrana de nylon (Hybond ECL, Amersham Biosciences GmbH, Freiburg, Alemanha). As membranas foram bloqueadas com leite em pó desnatado a 5% e com Tween 20 a 0,5% (Sigma-Aldrich, GmbH, Munique, Alemanha) e lavadas em PBS. Utilizou-se um anticorpo policlonal anti-MSP humano conjugado na cabra, contra MSP (HGFL (N—19), sc-6088, Santa Cruz), no sistema de detecção ECL (Amersham), em conformidade com as instruções do fabricante. É possível reconhecer, nitidamente, uma banda forte a 56 kD, especialmente nas células da papila dérmica.

As células indiferenciadas mesenquimatosas do folículo piloso dos adultos (DSC) têm a característica de formarem um folículo piloso totalmente novo, de migrarem para o interior de uma papila pilosa preexistente, de fazerem parte do 10 tecido conjuntivo dérmico e de terem menos actividade de fosfatase alcalina do que as células da papila dérmica. De preferência, as células de DSC provêm de um mamifero, particularmente seleccionado entre murganhos, ratos, coelhos, cobaias, cabras, porcos, vacas ou seres humanos. As células de DSC, ao contrato das células do invólucro folicular (DS) de tecido conjuntivo e da papila dérmica (DP), são capazes e têm a propriedade, respectivamente, de formarem um folículo piloso totalmente novo ou de migrarem para uma papila pilosa preexistente para que seja produzido pêlo maior e mais grosso. Além disso, estas células são capazes e têm a propriedade de fazerem parte do invólucro dérmico de tecido conjuntivo. Estas duas caracteristicas não são reveladas pelas células do DS nem pelas células da DP. As células indiferenciadas adultas mesenquimatosas do foliculo piloso, doravante também designadas por células indiferenciadas de DSC, ou células de DSC, encontram-se em torno do pólo inferior do bolbo piloso (doravante também designado por taça pilosa ou cálice piloso), com uma disposição em forma de cálice, tendo sido designadas, por isso, células do cálice piloso (cálice do invólucro dérmico = DSC) . O termo "adulto" aqui utilizado, a propósito das células indiferenciadas mesenquimatosas significa que as células indiferenciadas mesenquitamosas não são células indiferenciadas embrionárias, mas sim células indiferenciadas mesenquimatosas isoladas a partir de organismos adultos.

As células de DSC podem ser caracterizadas bioquimicamente. Assim sendo, recorreu-se à expressão da fosfatase alcalina. Ao contrário das células da DP, as células do DSC manifestam apenas uma actividade limitada de fosfatase alcalina. As células da DP caracterizam-se pelo 11 facto de manifestarem uma actividade significativa de fosfatase alcalina durante todo o ciclo piloso. A actividade da fosfatase alcalina é significativamente menos pronunciada nas células do DSC. As células do DS não revelam nenhuma actividade de fosfatase alcalina. No contexto da presente invenção, uma fraca actividade de fosfatase alcalina significa que a actividade das células do DSC é cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% ou 50% menor, em comparação com as células da DP. Além disso, uma actividade de fosfatase alcalina inferior significa que a actividade das células do DSC é pelo menos cerca de 10% menor, de preferência pelo menos cerca de 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45% ou 50% menor do que a pronunciada actividade de fosfatase alcalina nas células da DP. A presente invenção diz respeito a um processo para isolar células indiferenciadas mesenquimatosas do foliculo piloso, o qual compreende os passos seguintes: a) preparação de pêlo vital, b) clivagem do pêlo preparado no passo a), c) isolar o bolbo piloso, implantado sob a forma de um cálice, conjuntamente com a papila pilosa dérmica, d) separar a papila pilosa dérmica e o bolbo piloso, e) criar em cultura o bolbo piloso obtido no passo d), f) reunir as células confluentes.

De preferência, os folículos pilosos são provenientes de um mamífero, em especial seleccionado entre murganhos, ratos, coelhos, cobaias, cabras, porcos, bovinos ou seres humanos. Além disso, a presente invenção diz respeito a células indiferenciadas mesenquimatosas do foliculo piloso, susceptiveis de serem obtidas pelo processo de acordo com a invenção 12 É possível isolar as células do DSC recorrendo ao processo a seguir descrito. Em primeiro lugar, divide-se um folículo piloso nas suas partes componentes, por microdissecação, conforme adiante se descreve. Assim, prepara-se pêlo vital, v.g., pêlo intacto de anagénese, num microscópio de dissecação. No caso de pêlo pigmentado, faz-se um corte transversal através do pêlo ao nível do seu pólo superior (figura 3b, setas), sendo arrancado o DSC em forma de cálice implantado, conjuntamente com a papila pilosa dérmica (DP) (figura 3c) . Esta parte do tecido é revirada (figura 3d) e a papila pilosa dérmica (figura 3e) é separada do bolbo piloso (figura 3f). Este processo pode ser utilizado não só para a preparação de células indiferenciadas mesenquimatosas do folículo piloso mas também pode ser adaptado para a preparação de células indiferenciadas mesenquimatosas das unhas e do aparelho dentário. 0 processo pode ser praticado com todos os organismos eucarióticos, v.g., com mamíferos, em especial com seres humanos. 0 bolbo piloso obtido é multiplicado numa cultura celular em condições convencionais. Por exemplo, a cultura pode ser feita do modo a seguir descrito. Utiliza-se como meio de cultura o meio basal AmnioMax C 100 (Gibco) e o suplemento AmnioMax C100. Em primeiro lugar, faz-se uma cultura de DSC neste meio em placas de cultura de 24 cavidades (Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA), em condições estéreis e convencionais (37°C, 5% de C02, 500 pL de meio). Decorridos alguns dias, as células desenvolvem-se espontaneamente e são removidas com tripsina-EDTA à razão de 200 pL/cavidade, depois de terem chegado a uma cultura confluente (interrompe-se a tripsinação com 260 pL de meio AmnioMax/cavidade, após a remoção das células), sendo 13 transferidas para balões de cultura de 25 mL (Greiner, Frickenhausen). Para tal, junta-se as células todas que são centrifugadas durante 10 minutos a 1000 r.p.m., deita-se fora o sobrenadante e com as células prepara-se nova suspensão em 5 mL de AmnioMax. Renova-se o meio em cada 3 dias. Para se confirmar que as células obtidas são células indiferenciadas mesenquimatosas, realiza-se uma detecção com fosfatase alcalina. Para tal, as células podem ser criadas em cultura sobre lamelas de vidro estéreis, fixadas em acetona e analisadas conforme descrito nos exemplos. O período de incubação para a detecção in vitro, de acordo com o que está descrito nos exemplos, está compreendido entre cerca de 30 minutos e cerca de 1,5 horas e é, preferencialmente, igual a cerca de 1 hora em condições convencionais.

Recorrendo ao mesmo processo, é possível isolar e multiplicar as células indiferenciadas mesenquimatosas, quer das unhas quer do aparelho dentário.

As células de DSC podem ser multiplicadas por meio de uma cultura celular e as culturas celulares podem ser desenvolvidas ao longo de diversas passagens. As células de DSC apresentam, por um lado, características morfológicas e, por outro lado, características bioquímicas que são claramente distintas entre si. Os fibroblastos do revestimento dérmico de tecido conjuntivo (DS) apresentam, morfologicamente, um padrão típico de crescimento, que faz lembrar um padrão de tipo escama de peixe. As células de DSC crescem de uma maneira mais compacta, não formam estas estruturas tipo escama de peixe e têm tendência para formarem as chamadas pseudopapilas, isto é, no balão de cultura de células há diminutas acumulações de células que 14 são morfologicamente parecidas com uma papila pilosa dérmica. Conforme já se disse anteriormente, os fibroblastos do revestimento folicular de tecido conjuntivo (DS) não expressam nenhuma fosfatase alcalina, as células de DSC expressam apenas muito pouca e as células das DP manifestam uma forte actividade de fosfatase alcalina In vítro e In vivo.

As células do tecido conjuntivo, no pólo inferior do invólucro de tecido conjuntivo, as chamadas células do bolbo piloso (DSC), podem regenerar todas as estruturas relevantes da unidade folicular pilosa formada pela derme. Devido a esta propriedade, permitem a formação de pêlo novo em crescimento ou a formação de pêlo mais grosso, por repovoamento com uma papila pilosa pequena. 0 período de vida do cabelo recém-formado não está limitado temporalmente, mas pode ser, em princípio, duradouro. No entanto, tal capacidade regenerativa duradoura, após a implantação de células das DP, nunca foi descrita. Todas as experiências com células de DP são apenas temporárias, ao passo que células indiferenciadas genuínas, com uma possibilidade duradoura de proliferarem, são introduzidas na pele por implantação de células de DSC.

As células indiferenciadas mesenquimatosas do folículo piloso podem ser utilizadas para fins terapêuticos e profiláticos e também para tratamentos cosméticos. As células indiferenciadas de DSC podem ser utilizadas para a preparação de um agente para o tratamento ou para a profilaxia de alopecia ou para terapia génica.

As células susceptíveis de serem obtidas pelo processo de acordo com a invenção podem ser utilizadas para tratar uma alopecia, em particular, alopecia areata, alopecia 15 androgenética, pseudopelada, alopecia provocada por liquens planopilaris, lúpus eritematoso, hipotricose congénita e atriquia, perda de cabelo difusa resultante de uma doença metabólica, alopecia resultante de queimaduras ou traumas ou alopecia resultante de quimioterapia e também de terapia génica. A sua aplicação pode ser efectuada, v.g., injectando as células em solução (v.g., uma solução salina fisiológica) ou por implantação, isto é, inseridas numa matriz (v.g., colagénio) ou acondicionadas em lipossomas. Se não for suficiente uma única injecção ou uma única implantação, é possível efectuar tratamentos subsequentes. Se forem preferíveis determinados modos de aplicação para zonas da pele individualizadas, as células de DSC podem ser administradas em função disso.

As correspondentes células indiferenciadas mesenquimatosas das unhas e do aparelho dentário possuem propriedades correspondentes (Chuong et al., 2001, Thesleff, 2000). Uma razão para que assim seja poderia ser o facto de partilharem origens evolucionárias comuns e o facto de a posição das células indiferenciadas mesenquimatosas do folículo piloso também ser encontrada no caso das unhas e dos dentes, uma vez que durante a embriogénese são recapituladas estruturas morfológicas importantes. Assim sendo, eventualmente também é possível regenerar dentes com células, criadas em cultura, do aparelho dentário peribulbar. Utilizando as propriedades morfogénicas, por analogia com o pêlo, é possível induzir a formação de dentes novos ou de unhas novas ou mais grossas.

Graças à aptidão das células de DSC para formarem novos folículos pilosos ou para acrescentar mais aos folículos pilosos dérmicos que já se encontrem presentes, é então possível tratar todos os tipos de quedas de cabelo e de 16 miniaturização do cabelo. Para além disso, é de referir o longo período de vida das células de DSC e a sua aptidão para serem facilmente implantadas e se manterem completamente funcionais. As células de DSC dos folículos pilosos, das unhas ou do aparelho dentário também podem ser utilizadas em terapia génica, quando for necessária a produção de substâncias secretórias. Estas células podem ser geneticamente modificadas, de tal modo que, v.g., após a transfecção, tais células sejam capazes de segregar o produto desejado. Através da pele, o produto poderia ser distribuído sistemicamente por meio do sangue. Como exemplo, é possível referir a transfecção das células de DSC com um gene da insulina. Após a implantação destas células, agora produtoras de insulina, seria possível o tratamento de diabetes mellitus. São conhecidos muitos outros exemplos respeitantes a uma deficiência de um produto de secreção (hormonas, proteínas, citoquinas, quimioquinas, factores de crescimento, lipomediadores).

Microdissecação: em primeiro lugar efectuou-se a separação de folículos pilosos de vibrissas de um murganho, obtendo-se os seus componentes por microdissecação. Antes de mais, conforme ilustrado na figura 3a, efectuou-se a preparação de pêlos intactos em fase de anagénese, por dissecação ao microscópio. No caso do pêlo pigmentado, efectuou-se um corte transversal através do pêlo, ao nível do pólo superior da zona pigmentada (figura 3b, setas) e arrancou-se o bolbo piloso implantado, em forma de cálice (DSC), conjuntamente com a papila pilosa dérmica (figura 3c) . Revirou-se este componente tecidual (figura 3d) e efectuou-se a separação entre a papila pilosa dérmica (figura 3e) e o bolbo piloso (figura 3f). Após a dissecação, 17 ficaram os invólucros radiculares epiteliais (figuras 3h) e o revestimento de tecido conjuntivo (figura 3i).

Cultura celular: subsequentemente, multiplicou-se em cultura celular o bolbo piloso dissecado. Como meio utilizou-se o meio basal AmnioMax C 100 (Gibco) e o suplemento AmnioMax C100. Inicialmente, as células de DSC foram criadas em cultura em placas de cultura de 24 cavidades (Falcon, Franklin Lakes, NJ, EUA) no referido meio, em condições estéreis e em condições convencionais (37°C, 5% de C02, 500 pL de meio). Decorridos alguns dias, as células cresceram espontaneamente e foram removidas com tripsina-EDTA, à razão de 200 pL/cavidade, depois de terem alcançado uma cultura confluente (interrupção da tripsinação com 260 pL de meio AmnioMax/cavidade após a remoção de todas as células), tendo sido transferidas para balões de cultura de 25 mL (Greiner, Frickenhausen) . Para tal, juntou-se as células todas que foram centrifugadas a 1000 r.p.m. durante 10 minutos e depois deitou-se fora o sobrenadante, tendo as células sido recolocadas em suspensão em 5 mL de AmnioMax. O meio foi renovado em cada 3 dias. Como meio utilizou-se o meio basal AmnioMax C 100 (Gibco) e o suplemento AmnioMax C100. Inicialmente, as células de DSC foram criadas em cultura em placas de cultura de 24 cavidades (Falcon, Franklin Lakes, NJ, EUA) no referido meio, em condições estéreis. Decorridos alguns dias, as células desenvolverem-se espontaneamente, multiplicaram-se e foram objecto de subcultura em balões de cultura de 25 mL (Greiner, Frickenhausen), utilizando métodos convencionais.

Detecção da fosfatase alcalina: para a investigação in vivo, os tecidos foram congelados e embebidos no reagente OCT (Tissue tec, Sakura, Zoeterwounde, Holanda), tendo sido 18 preparadas secções congeladas com a espessura de 6 pm. A fosfatase alcalina foi detectada utilizando a solução de substrato de fosfatase alcalina "fast red TR" (da Pierce Company, Rockford, IL, EUA): 10 mg de 'fast red TR', tal como fornecida, 10 mL de tampão de substrato, 1,5 mL de 'naftol AS-MX fosfato' concentrado, tal como fornecido) a pH 8,1, em conformidade com as instruções do fabricante. O período de revelação decorreu durante 30 minutos na ausência de 'levamisole'. Para a detecção da fosfatase alcalina in vitro, as células foram criadas em cultura em lamelas de cobertura estéreis, fixadas em acetona, tendo o reagente sido utilizado conforme descrito para a medição da fosfatase alcalina. O período de incubação foi de 1 hora.

Indução do crescimento de pêlo: Após algumas passagens das células, estas ainda eram capazes de induzir pêlo novo. A seguir a uma pequena lesão (arranhão), injectou-se 3-5 xlO6 células, em 0,1 mL de PBS, na derme de uma orelha de murganho, numa proximidade de cerca de 2 mm da lesão, utilizando uma agulha estéril de calibre 16. Para estas experiências, os animais foram anestesiados com 1,66 mL de cloridrato de xilazina (Rompun, Bayer Vital Leverkusen, Alemanha) em 10 mL de cloridrato de cetamina (Hexal, Holzkirchen, Alemanha). Depois disto, observou-se durante várias semanas se havia crescimento de pêlo novo. Decorridos 2 meses, observou-se o crescimento de pêlo após a implantação de células de DP e de DSC, mas não após a implantação de células de DS. O crescimento de pêlo prosseguiu durante um período de 6 meses, sugerindo isso que estas observações clínicas não são um fenómeno transitório. Além disso, foi possível observar que o pêlo já existente 19 previamente havia ficado mais grosso, após a implantação (figura 6).

Microscopia de laser confocal: para além das propriedades biológicas das células de DSC para induzirem o crescimento de pêlo, observou-se a migração de células diferentes após a implantação, tendo para isso sido

preparados tecidos dissecados a partir das três zonas pilosas morfológicas descritas (DP, DS, DSC) dos murganhos (STOCK

TgN(GFPX)4Nagy). Estes murganhos foram seleccionados porque todas as células nucleadas destes animais contêm proteinas fluorescentes verdes. As células provenientes destes tecidos foram criadas em cultura e tratadas ao longo de um periodo de 6 semanas. Os três tipos distintos de células foram injectados nas orelhas de murganhos imunoincompetentes

CbySmm.CBl7-Píicdcscld/J. Além disso, injectou-se da mesma maneira células não fluorescentes provenientes de murganhos GFP STOCK TgN(GFPX) 4Nagy C3H/HeJ e de ratos PVG/OlaHsd. Verificou-se se havia crescimento de pêlo novo ou se havia um engrossamento de pêlo já existente previamente. Decorridos 2-6 meses, os animais foram sacrificados e as orelhas foram objecto de fixação. Para tal, os tecidos foram fixados em paraformaldeido (Sigma, Deisenhofen) a 4% em PBS^ durante 2 horas, tendo sido depois passados várias vezes por PBS_/“. 0 tecido foi fixado em "Tissue-Tek" à temperatura ambiente e guardado durante 24 horas a +4°C, ao abrigo da luz. Subsequentemente, os tecidos foram arrefecidos lentamente para -70°C numa caixa de polistireno forrada a celulose (a designada "técnica de congelamento lento"). Inicialmente, o bloco de tecidos foi aquecido para -20°C durante 30 minutos. Depois foram preparadas secções compreendidas entre 20 e 40 pm, utilizando um crióstato, as quais foram 20 colocadas sobre lamelas de microscópio que foram tratadas previamente com poli-L-lisina a 1% (Sigma, Deisenhofen, Alemanha). Efectuou-se a secagem à temperatura ambiente. A seguir, as secções foram passadas uma vez por PBS ou pelo meio de cobertura, v.g., glicerol, contendo água. Depois disto, os tecidos foram analisados utilizando um microscópio de laser da empresa Zeiss (Gõttingen, Alemanha), modelo LSM 410, a trabalhar com comprimentos de onda de excitação de 488 nm, com emissão entre 500-520 nm, com progressão ao longo do eixo do Z a intervalos de 2 pm, utilizando um laser de árgon-crípton.

Seguidamente, foram feitas secções sequenciais (20-40 pm) que foram analisadas para se pesquisar a presença de células que expressam GFP (= proteína fluorescente verde), utilizando o microscópio de laser confocal. Graças a estas experiências, pesquisas preliminares permitiram confirmar que é possível o crescimento de pêlo novo, mediante a implantação de células de DP, e que apenas as células implantadas formam pêlo novo, ao passo que as células de DS implantadas não originaram a formação de pêlo, mas foram visíveis na derme sob a forma de uma população difusa de células de expressão de GFP, quando se utilizou um microscópio confocal. As células de DP implantadas apenas levaram à formação de uma nova papila pilosa dérmica, mas não à formação de um invólucro folicular de tecido conjuntivo. Pelo contrário, as células de DSC formaram, simultaneamente, uma nova papila pilosa dérmica e uma parte do invólucro folicular de tecido conjuntivo. Devido ao facto de as células do invólucro piloso dérmico serem capazes de reconstruir todas as estruturas pilosas dérmicas, e tendo em conta que as células da papila pilosa dérmica não são capazes de o fazer, é possível inferir 21 que as células de DSC são menos diferenciadas e mais pluripotentes do que as células da papila pilosa dérmica. Por tal motivo, as células de DSC são as células indiferenciadas mesenquimatosas adultas do foliculo piloso. A figura 4 ilustra a caracteristica indutora das células de DSC. Dito de forma abreviada, como resultado poder-se-ia afirmar que as células de DSC são células indiferenciadas putativas a partir das quais se formam a papila dérmica e o invólucro folicular de tecido conjuntivo.

Comprovou-se que se forma, após a implantação de DSC, pêlo novo e que as células de DSC implantadas formam células novas de papila dérmica e também um invólucro novo de tecido conjuntivo. Isto foi visível no microscópio confocal pela fluorescência verde, tanto na zona do bolbo piloso como na zona da papila dérmica como no invólucro de tecido conjuntivo. A análise efectuada seis meses após a injecção de células revelou que as células que expressam GFP ainda estavam presentes nas estruturas foliculares pilosas relevantes. As células injectadas têm um ciclo celular típico muito lento e manifestam uma capacidade regenerativa. Não houve nenhuma mobilização de células dérmicas que não expressam GFP, por parte do hospedeiro. Além disso, seria possível observar células individuais fluorescentes verdes no pêlo existente previamente, indicando que as células de DSC implantadas colonizam as células existentes da papila dérmica, proporcionando, assim, um pêlo mais espesso.

Literatura

Chuong CM, Hou L, Chen PJ, Wu P, Patel N, Chen Y (2001) Dinosaur's feather and chicken tooth? Tissue engineering of the integument. Eur J Dermatol 11:286-292. 22

Hutchinson PE, Thompson JR (1997) The crosssectional size and shape of human terminal scalp hair. Br J Dermatol 136:159-165

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REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A presente listagem de referências citadas pela requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte da patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado durante a compilação das referências, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o EPO não assume nenhuma responsabilidade.

Literatura citada na descrição, para além das patentes de invenção • Chuong CM; Hou L; Chen PJ; Wu P; Patel N; Chen Y.

Dinosaur's feather and chicken tooth? Tissue engineering of the integument. Eur j Dermatol, 2001, vol. 11, 286-292 [0032] • Hutchinson PE; Thompson JR. The cross-sectional size and shape of human terminal scalp hair. Br J Dermatol, 1997, vol. 136, 159-165 [0032] • Hutchinson PE; Thompson JR. The size and form of the medulla of human scalp hair is regulated by the hair cycle and cross-sectional size of the hair shaft. Br J Dermatol, 1999, vol. 140, 438-445 [0032] • Jahoda CA; Horne KA; Oliver RF. Induction of hair growth by implantation of cultured dermal papilla cells. Nature, 11. Oktober 1984, vol. 311 (5986), 560-2 [0032] • Kligman A. The human hair cycle. J invest Dermatol, 1959, vol. 31, 307-316 [0032] • Messenger AG. The culture of dermal papilla cells from human hair follicles. Br J Dermatol., Juni 1984, vol. 110 (6), 685-9 [0032] 24 • Oliver RF. The induction of hair follicle formation in the adult hooded rat by vibrissa dermal papillae. J Embryol Exp Morphol., Februar 1970, vol. 23 (1), 219-36 [0032] • Paus R; Cotsarelis G. The biology ofhair follicles. N Engl J Med, 1999, vol. 341, 491-497 [0032] • Reynolds AJ; Lawrence C; Cserhalmi-Friedman PB; Chrlstiano AM; Jahoda CA. Trans-gender induction of hair follicles. Nature, 04. November 1999, vol. 402 (6757), 33-4 [0032] • Sperling LC. Hair anatomy for the clinician. J Am Acad Dermatol, 1991, vol. 25, 1-17 [0032] • Thesleff I. Genetic basis of tooth development and dental defects. Acta Odontol Scand, 2000, vol. 58, 191-194 [0032]

Lisboa, 23/03/2010

Claims (3)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para isolar células indiferenciadas mesenquimatosas do foliculo piloso, o qual compreende os passos seguintes: a) clivar o pêlo previamente preparado, b) isolar o bolbo piloso, implantado sob a forma de um cálice com a papila pilosa dérmica, c) separar a papila pilosa dérmica e o bolbo piloso, d) criar em cultura o bolbo obtido no passo c) para proporcionar células indiferenciadas mesenquimatosas, apresentando as células indiferenciadas mesenquimatosas uma actividade de fosfatase alcalina, e) juntar as células confluentes.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o foliculo piloso provém de um mamífero.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que o mamífero é um murganho, um rato, um coelho, uma cobaia, uma cabra, um porco, um boi ou um ser humano. Lisboa, 23/03/2010