PT1467761E - Tratamento da doença oftálmica neovascular - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Tratamento da doença oftálmica neovascular"

CAMPO TÉCNICO A invenção refere-se à utilização de inibidores de quinase ligada a integrina (ILK) no tratamento de várias doenças do olho com patologia subjacente de neovascularização da córnea, íris, retina ou coróide.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A visão é de importância fundamental ao longo da vida. No entanto, o olho pode ser um órgão frágil e é susceptivel a vários distúrbios degenerativos hereditários e/ou relacionados com a idade. Nos Estados Unidos, uma causa comum de cegueira irreversível ou perda grave de visão é a distrofia da retina. A retina é a túnica sensorial do olho, contendo receptores sensíveis à luz, um complexo de neurónios e epitélio pigmentado, organizados em camadas discretas. Nos humanos, a mácula é a porção da retina que se situa directamente por trás do cristalino. Os cones, as células fotorreceptoras responsáveis pela visão central, estão altamente concentrados na mácula. A retina periférica é composta essencialmente por bastonetes que são responsáveis pela visão lateral e nocturna. A neovascularização ocorre em muitas doenças do olho. Devido ao seu impacto epidemiológico significativo, especialmente entre a população em envelhecimento, tem-se

tornado um problema de saúde pública relevante. A neovascularização, uma alteração patológica caracterizada por um crescimento descontrolado de tecido vascular, pode ocorrer em várias partes do olho, incluindo a córnea, íris, retina e coróide. As consequências da neovascularização nestes tecidos oculares delicados são fibrose, exsudação e/ou hemorragia que são responsáveis por perda de visão em muitas doenças do olho comuns. A neovascularização da córnea caracteriza-se pela invasão de capilares vasculares a partir do plexo vascular límbico para a córnea normalmente avascular. Nalguns casos, a 2

ΕΡ 1 467 761 /PT neovascularização da córnea está associada com um decréscimo na acuidade visual. A etiologia da neovascularização da córnea não é totalmente compreendida. No entanto, é geralmente considerada como uma consequência de dano mecânico ou químico, ou secundária a infecção. A neovascularização da córnea está associada com uma variedade de condições clínicas, incluindo utilização de lentes de contacto, trauma e cirurgia anterior (e.g. transplante de córnea), infecções virais, bacterianas ou por protozoários, queimaduras com bases e algumas doenças imunológicas. A neovascularização da íris caracteriza-se pela formação de novos vasos sanguíneos gotejantes na superfície anterior da íris e no recesso do ângulo da câmara. Na fase tardia da doença, os vasos engrossam e são acompanhados de tecido fibroso, ocluindo assim o ângulo e causando o glaucoma neovascular secundário, uma condição caracterizada por pressão intra-ocular elevada, neovascularização da íris e rede trabecular. A neovascularização da íris e glaucoma neovascular consequente respondem fracamente a terapias e são frequentemente a causa de cegueira e enucleação. A neovascularização da íris está associada com uma variedade de doenças sistémicas e oculares e é secundária a trauma ou terapias, incluindo cirurgia e radiação. A oclusão da veia central da retina e a diabetes mellitus são consideradas como as causas principais de neovascularização da íris. A neovascularização da retina envolve o crescimento de capilares novos a partir de vasos que surgem do disco óptico ou retina interna. Na fase tardia, pode ocorrer perda de visão devido ao desenvolvimento de várias complicações, incluindo a formação de cicatrizes, descolamento da retina por tracção e hemorragia. A neovascularização da retina está associada com uma variedade de doenças oculares e sistémicas. Entre estas, a diabetes mellitus, retinopatia de prematuridade, oclusão da veia central da retina, oclusão de ramos da veia da retina e doença de células falciformes estão muito frequentemente associadas com a neovascularização da retina. 3

ΕΡ 1 467 761 /PT A neovascularização da coróide (CNV) caracteriza-se por uma invasão de vasos sanguíneos novos através da membrana de Bruch. A consequência da CNV é a perda de visão grave e irreversível. A CNV está associada com uma variedade de doenças oculares, incluindo condições degenerativas, doenças inflamatórias ou infecciosas e trauma. A degeneração macular relacionada com a idade (AMD), estrias angióides, miopia patológica, síndrome de histoplasmose ocular, sarcoidose e uveíte crónica são apenas alguns exemplos de condições oculares que têm como alteração patológica subjacente significativa, a neovascularização da coróide. 0 tratamento actual para muitas formas de neovascularização ocular envolve a fotocoagulação ou crioterapia. A pan-fotocoagulação da retina ou focal é a terapia convencional actual para a retinopatia diabética. Ela é parcialmente eficaz na redução da velocidade de perda de visão em pacientes com retinopatia diabética. A fotocoagulação também é um tratamento destrutivo com efeitos secundários indesejados, tais como CNV, fibrose sub-retinal, expansão de cicatrizes de fotocoagulação e queimaduras acidentais da fóvea que podem causar perda de acuidade visual central e formação de escotoma. Os pacientes com boa acuidade visual irão menos provavelmente reconhecer os benefícios deste tratamento agressivo e irão mais provavelmente notar os seus efeitos secundários, que podem incluir alguma perda de visão central e periférica e uma redução na visão de cor e nocturna. A terapia com Visudyne™, uma aplicação ocular de terapia fotodinâmica (PDT) utilizando o fotossensibilizador verteporfina (Visudyne™, Novartis Ophthalmics) e luz vermelha (690 nm), é um tratamento de escolha para pacientes com lesões predominantemente clássicas da forma húmida de AMD. Também é eficaz no tratamento de neovascularização da coróide subfoveal oculta, secundária a AMD. No entanto, em muitos pacientes, é necessário repetir o tratamento a intervalos de três meses ao longo de um a dois anos subsequentes, devido a CNV recorrente. As causas do crescimento vascular recorrente não são totalmente compreendidas e podem envolver múltiplos factores, incluindo a indução de factores de crescimento ou mediadores inflamatórios a seguir a PDT. 4

ΕΡ 1 467 761 /PT A wortmanina é descrita por Oikawa et al., Eur. J. Pharmacol. 318:93-96 (1996) como sendo um inibidor potente e selectivo de PI3K, com utilidade potencial no tratamento de distúrbios dependentes de angiogénese. De igual modo, o WOOl/83481 descreve a utilização de uma nova classe de inibidores de PI3K que podem ser utilizados para inibir o crescimento celular anormal em que ο PI3K desempenha um papel. 0 desenvolvimento futuro de tratamentos para a doença oftálmica neovascular é de grande interesse.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona a utilização de um inibidor de quinase ligada a integrina (ILK) capaz de modular directamente a expressão de ILK, ou bloquear directamente a actividade catalítica ou de ligação de ILK no fabrico de um medicamento para o tratamento da neovascularização ocular.

Os inibidores são agentes que interferem com a via de sinalização de ILK, incluindo agentes bloqueadores de quinase ligada a integrina (ILK); compostos que de outro modo previnem a ligação de ligandos de ILK naturais a ILK; ou compostos que impedem a expressão de, ou sinalização através de ILK. Este tratamento é utilizado isolado como terapia única, ou em combinação com uma segunda terapia como um adjuvante, para prevenir, para reduzir ou para reverter a perda de acuidade visual, bem como a perda de visão secundária a neovascularização da córnea, íris, retina ou coróide.

Num aspecto, a invenção refere-se à utilização de um inibidor de ilk como definido acima, no fabrico de um medicamento para prevenir, para reduzir ou para reverter a neovascularização num olho de um animal que tem uma lesão neovascular, compreendendo os passos de identificar a referida lesão no olho do animal, administrar ao animal uma quantidade de inibidor de molécula pequena de ILK, suficiente para permitir que o referido composto se localize na referida lesão.

Noutro aspecto, a prevenção, redução da reversão refere-se a uma perda de acuidade visual ou perda de visão num 5

ΕΡ 1 467 761 /PT paciente com lesão de neovascularização da córnea, íris, retina ou coróide associada com várias doenças do olho, compreendendo os passos de administrar uma quantidade de um inibidor de ILK suficiente para permitir que o referido inibidor se localize na referida lesão. Numa concretização preferida, um inibidor de ILK será administrado isolado como terapia única. Noutra concretização preferida, um inibidor de ILK será administrado numa altura adequada, antes, concorrentemente ou após, em relação a uma segunda terapia, incluindo, mas não se limitando a terapia fotodinâmica, tal como terapia com Visudyne™, fotocoagulação ou termoterapia transpupilar, como tratamento adjuvante para a neovascularização ocular.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

As Figuras 1A-1D mostram células endoteliais humanas HUVEC crescidas num suporte de Matrigel na presença ou ausência do inibidor de ILK MC-1 (Figuras IA e 1C) , MC-2 (Figuras 1B e D) ou controlo de solvente (dimetilsulfonamida, DMSO).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA CONCRETIZAÇÃO

Como aqui descrito, os compostos que modulam a actividade de quinase ligada a integrina (ILK) são administrados sistémica ou localmente para tratar doenças oftálmicas com uma patologia subjacente que é característica de neovascularização ocular. Este tratamento é utilizado isolado como uma terapia única, ou em combinação com uma segunda terapia como um adjuvante para prevenir, para reduzir ou para reverter a perda de acuidade visual, bem como a perda de visão secundária a neovascularização da córnea, íris, retina ou coróide.

Num aspecto, a invenção refere-se à utilização de um inibidor de ILK como definido acima no fabrico de um medicamento para prevenir, para reduzir ou para reverter a neovascularização ocular num olho de um animal com uma lesão neovascular, compreendendo os passos de identificar a referida lesão no olho do animal, administrar ao animal uma quantidade de inibidor de ILK de molécula pequena, suficiente para permitir que o referido composto se localize na referida 6

ΕΡ 1 467 761 /PT lesão. Os métodos que utilizam administração local que proporciona uma concentração localizada prolongada, que podem utilizar implantes de libertação controlada, soluções viscosas ou outra formulação tópica, são de interesse particular. Um inibidor de ILK pode ser administrado isolado como terapia única, ou em combinação com uma segunda terapia, por exemplo a um tempo adequado, antes, concorrente com ou após, em relação a uma segunda terapia, incluindo mas não se limitando a terapia fotodinâmica, incluindo mas não se limitando a terapia com Visudyne™, fotocoagulação ou termoterapia transpupilar, como tratamento adjuvante para a neovascularização ocular.

Alguns exemplos de distúrbios oculares que podem ser tratados por várias concretizações da presente invenção incluem, sem limitação: doenças da retina (retinopatia diabética, edema macular diabético, glaucoma crónico, descolamento da retina, retinopatia de células falciformes, degeneração macular relacionada com a idade (AMD) devido a neovascularização sub-retinal), rubeose, irite; doenças inflamatórias; uveíte crónica; neoplasmas (retinoblastoma, pseudoglioma); iridociclite heterocrómica de Fuch; glaucoma neovascular; neovascularização da córnea (inflamatória, transplante, hipoplasia da íris de desenvolvimento); neovascularização resultante de uma vitrectomia e facectomia combinadas; doenças vasculares (isquemia da retina, insuficiência vascular da coróide, trombose da coróide, isquemia da artéria carótida); neovascularização do nervo óptico e neovascularização devido a penetração do olho ou dano ocular de contusão.

AGENTES MODULADORES DE ILK A ILK é uma serina/treonina quinase de 59 kDa que está associada com as caudas citoplasmáticas das integrinas βΐ e β3. A actividade enzimática para ILK é modulada pela interacção de células com o componente de matriz extracelular fibronectina, aglomeração de integrina e vários factores de crescimento. Devido à sua associação íntima com uma grande variedade de vias de sinalização que foram directa ou indirectamente implicadas em vários processos patológicos, a ILK pode representar um alvo terapêutico para uma variedade de condições clínicas, incluindo angiogénese, cancro, inflamação 7

ΕΡ 1 467 761 /PT e auto-imunidade. A sequência genética da ILK humana está descrita nas patentes US Nos 6013782 e 6001622.

Os agentes que bloqueiam a actividade de ILK proporcionam um ponto de intervenção numa via de sinalização importante. Vários agentes são úteis para reduzir a actividade de ILK, incluindo agentes que modulam directamente a expressão de ILK, e.g. vectores de expressão, agentes anti-sentido específicos para ILK, anticorpos específicos de ILK e seus análogos, moléculas orgânicas pequenas que bloqueiam a actividade catalítica de ILK, etc. Por exemplo, inibidores de moléculas pequenas de quinase ligada a integrina estão descritos na patente US N°s 6214813 e 6436915, 6420400 e nos exemplos respectivos. Os inibidores anti-sentido de ILK estão descritos na patente US N° 6177273.

Os agentes que bloqueiam a actividade de ILK são utilizados no tratamento de doença ocular relacionada com neovascularização. Vários agentes são úteis na redução da actividade de ILK, incluindo agentes que modulam directamente a expressão de ILK, e.g. agentes anti-sentido específicos para ILK, anticorpos específicos para ILK e seus análogos, moléculas orgânicas pequenas que bloqueiam a actividade catalítica ou de ligação de ILK, etc. Por exemplo, estão descritos inibidores de moléculas pequenas de quinase ligada a integrina na patente US N° 6214813, no pedido US co-pendente com o N° de série 09/747563 e no pedido co-pendente intitulado "Hydrazonopyrazole derivatives and their use as anti-proliferative agents". Descrevem-se inibidores anti-sentido de ILK na patente US N° 6177273.

Agentes de interesse para sub-regular a actividade de ILK incluem o bloqueio directo de locais de ligação de [Ptdlns/3,4,5)P3] através de ligação competitiva, impedimento estéreo, etc. Têm particular interesse os anticorpos que se ligam aos domínios PH bloqueando desse modo o local. Os anticorpos incluem fragmentos, e.g. F(Ab), F(Ab)' e outras mimetizações do local de ligação. Estes anticorpos podem ser produzidos por imunização com a proteína ou domínio específico. Os mimetizadores são identificados por métodos de pesquisa. Também têm interesse, análogos de [Ptdlns/3,4,5)P3] 8 ΕΡ 1 467 761 /PT que competem para locais de ligação, mas não resultam na inactivação de ILK.

Uma vez que a actividade de ILK é supra-regulada pela presença do lipido [Ptdlns/3,4,5)P3] , a actividade de ILK pode ser manipulada por agentes que bloqueiam a ligação de [Ptdlns/3,4,5)P3] a ILK. A sequência de aminoácidos de ILK contém um motivo de sequência encontrado em domínios de homologia pleckstrin (PH) que estão envolvidos na ligação fosfatos de fosfatidilinositol. Os inibidores são administrados in vivo ou in vitro a uma dose suficiente para proporcionar estas concentrações no tecido alvo. A pesquisa de drogas pode ser utilizada para identificar agentes que modulam a função de ILK. Podem-se identificar ligandos ou substratos que inibem a acção de ILK. Pode-se utilizar uma grande variedade de testes para este fim, incluindo testes de ligação proteína-proteína in vitro marcados, testes de desvio de mobilidade electroforética, imunoensaios para ligação de proteínas e semelhantes. 0 conhecimento da estrutura tridimensional de ILK, derivada da cristalização de proteína ILK recombinante, purificada, leva à concepção racional de drogas pequenas que inibem especificamente a actividade de ILK. Estas drogas podem dirigir-se para domínios específicos de ILK, e.g., o domínio catalítico da quinase, domínios de repetição de anquirina, domínios de homologia de pleckstrin, etc. Entre os agentes de interesse para pesquisa de drogas encontram-se os que interferem com a ligação de caudas citoplasmáticas de integrina a ILK; a actividade de quinase de ILK; ou a ligação de [Ptdlns/3,4,5)P3] aos domínios PH de ILK. 0 termo "agente" tal como aqui utilizado, descreve qualquer molécula, e.g., proteína ou medicamento, com capacidade para alterar a função fisiológica de ILK. Os agentes candidatos incluem várias classes químicas, embora tipicamente sejam moléculas orgânicas, de preferência compostos orgânicos pequenos com um peso molecular superior a 50 e inferior a cerca de 2 500 daltons. Os agentes candidatos compreendem grupos funcionais necessários para a interacção estrutural com proteínas, em particular ligação de hidrogénio e incluem tipicamente pelo menos um grupo amina, carbonilo, 9

ΕΡ 1 467 761 /PT hidroxilo ou carboxilo, de preferência pelo menos dois dos grupos químicos funcionais. Os agentes candidatos muitas vezes compreendem estruturas de carbono cíclicas ou heterocíclicas e/ou estruturas aromáticas ou poliaromáticas substituídas com um ou mais dos grupos funcionais acima. Também se encontram agentes candidatos entre biomoléculas, incluindo péptidos, sacáridos, ácidos gordos, esteróides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estruturais ou suas combinações.

Testes de interesse podem detectar agentes que bloqueiam a função de ILK, tal como ligação a integrina, actividade de quinase, sub-regulação de E-caderina, supra-regulação de LEF-1, propriedades de ligação, etc. Por exemplo, uma construção de expressão compreendendo um gene ILK pode ser introduzida numa linha celular sob condições que permitem a expressão. 0 nível de actividade de ILK é determinado por um teste funcional, como anteriormente descrito. Num teste de pesquisa, adicionam-se agentes candidatos e detecta-se a formação de matriz de fibronectina. Noutro teste, determina-se a capacidade dos agentes candidatos aumentarem a função de ILK.

MÉTODOS DE TRATAMENTO

Os métodos objecto são utilizados para fins profiláticos ou terapêuticos, para tratar doenças oculares, para prevenir, reduzir ou reverter a perda de acuidade visual, bem como a perda de visão secundária a neovascularização da córnea, íris, retina ou coróide. Tal como aqui utilizado, o termo "tratar" é utilizado para designar quer a prevenção da doença, quer o tratamento de condições preexistentes. Apesar do tratamento durante as fases precoces ser desejável, os sintomas adversos da doença podem ser pelo menos parcialmente aliviados por tratamento durante as fases tardias.

Na prática da presente invenção, administra-se uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de ILK a um indivíduo que sofre de uma doença ou distúrbio relacionado com a neovascularização, ou com um tecido que foi neovascularizado. 0 inibidor pode ser administrado de acordo com o método da invenção, quer isolado, quer em combinação com outras terapias conhecidas para neovascularização. Quando co- 10

ΕΡ 1 467 761 /PT administrado com uma ou mais terapias, o inibidor pode ser administrado quer em simultâneo com o(s) outro tratamento, quer sequencialmente. Se administrado sequencialmente, o médico assistente irá decidir qual a sequência de administração adequada, que pode ser antes, ou após uma segunda terapia.

As terapias secundárias de interesse incluem terapia fotodinâmica, incluindo, mas não se limitando a terapia com verteporfina (VISUDYNE™) , veja-se, por exemplo Madreperla (2001) Arch Ophthalmol. 119(11):1606-1610; Harding (2001) Eye 15(Pt 3):407-12; Sharma (2001) Can Fam Physician. 47:955, 963, U.S. 55756541 "Vision through photodynamic therapy of the eye", fotocoagulação ou termoterapia transpupilar, veja-se, por exemplo Rogers et al. (2001) Curr Opin Ophthalmol. 12(3):212-5; Ardjomand et al. (2001) Ophthalmologica. 215(3):241-4; Mainster et al. (2000) Ophthalmic Surg Lasers, 31(5):359-73. Outras terapias incluem, sem limitação as apresentadas no U.S. 6297228, "Use of angiostatic steroids in photodynamic therapy", U.S. 6271233 "Method for treating ocular neovascular diseases"; U.S. 6248734 "Use of photodynamic therapy for prevention of secondary cataracts"; U.S. RE37180 "Photochemotherapeutical obstruction of newly-formed blood vessels"; U.S. 6225303 e 5798349 "Use of green porphyrins to treat neovasculature in the eye"; U.S. 6217895 "Method for treating and/or preventing retinal diseases with sustained release corticosteroids"; U.S. 6214819 "Method for treating ocular neovascular diseases" e semelhantes.

Quando se utiliza terapia fotodinâmica em conjunção com inibidores de ILK no tratamento de doenças neovasculares oculares, pode-se utilizar uma grande variedade de fotossensibilizadores, incluindo, mas não se limitando a, derivados de hematoporfirina, feoforbida, clorinas, bacterioclorinas, ftalocianinas, purpurinas, merocianinas, texafrinas e porfirinas verdes, bem como precursores de protoporfirina, tal como ácido aminolevulinico (ALA) e seus derivados. Cada fotossensibilizador pode ser activado com luz contendo um comprimento de onda absorvido pelo fotossensibilizador. Os fotossensibilizadores podem ser administrados local ou sistemicamente, de preferência por injecção. A dose de inibidor de ILK na composição farmacêutica 11

ΕΡ 1 467 761 /PT da presente invenção dependerá da natureza e gravidade da condição a ser tratada e da natureza de tratamentos anteriores a que o paciente tenha sido submetido. Por fim, o médico assistente irá decidir a dose com a qual tratar cada paciente individual. Inicialmente, o médico assistente pode administrar doses baixas e observar a resposta do paciente. Doses maiores podem ser administradas até se obter o efeito terapêutico óptimo para o paciente e nessa altura a dosagem não é mais aumentada.

Algumas doenças prestam-se a tratamento agudo, enquanto que outras requerem uma terapia a longo prazo. A retinopatia proliferativa pode atingir um limiar no espaço de dias, como se observa na ROP, alguns casos de retinopatia diabética e glaucoma neovascular. As crianças prematuras estão em risco de neovascularização por volta do tempo que corresponderia a 35 semanas de gestação, algumas semanas antes do nascimento e permanecerão em risco durante um curto período de tempo até a retina se tornar vascularizada.

Existem modelos animais adequados para determinar a dosagem adequada, embora a eficácia de um efeito terapêutico para diferentes mamíferos varie grandemente, por exemplo, as doses são tipicamente 20, 30 ou mesmo 40 vezes menores (por unidade de peso corporal) no homem em relação ao rato. De igual modo, o modo de administração pode ter um efeito grande na dosagem. Foi estabelecido um modelo de murídeo de neovascularização da retina induzida por oxigénio que ocorre em 100% dos animais tratados e é quantificável (Smith et al. (1994) Invest. Qphthalmol. Vis. Sei. 35:101-111). A bioactividade pode ser determinada por métodos, incluindo o teste de permeabilidade de vasos de Miles (Miles e Miles (1952) J. Physiol. (Lond.) 118:228) que mede a permeabilidade dos vasos e a mitogenicidade das células endoteliais que mede o crescimento celular. Outros modelos adequados são apresentados nos Exemplos.

Os compostos da presente invenção podem ser incorporados numa variedade de formulações para administração terapêutica. A administração de um inibidor de ILK pode ser por fornecimento utilizando qualquer meio adequado, incluindo, mas não se limitando a, aplicação sistémica, local ou mesmo 12

ΕΡ 1 467 761 /PT directa no tecido alvo. O fornecimento local de um inibidor de ILK proporciona uma concentração local elevada, ao mesmo tempo que reduz a probabilidade de efeitos secundários anti-angiogénicos não específicos, ou outros efeitos secundários indesejados que possam seguir-se à administração sistémica de um inibidor de ILK.

Para aplicação local, administra-se um inibidor de ILK numa gama de cerca de 0,05 a 0,2, ou cerca de 0,5 a 2,0 mg/ml numa formulação adequada, quer intra-ocularmente (intra-vítreo, sub-retinal, intra-câmara anterior, intrascleral), periocularmente (topicamente na córnea, subconjuntiva, subtenoniana, transcleral). Para aplicação sistémica administra-se uma gama de 0,05 a 100 mg/kg de peso corporal, de preferência menos do que cerca de 10 mg/kg.

Para administração intra- ou periocular, pode-se administrar um inibidor de ILK numa formulação injectável, quer por uma injecção intra-ocular nas concentrações acima descritas e a uma frequência de uma vez a cada 2-6 meses, ou por implantação intra-ocular de um dispositivo ou formulação específica de um inibidor de ILK que permite a libertação controlada do inibidor de ILK ao longo de um período de tempo. Para aplicação na córnea, pode-se aplicar um inibidor de ILK numa formulação adequada, topicamente, na córnea, a uma frequência de uma vez a cada 4-6 horas. Para aplicação sistémica, pode-se administrar um inibidor de ILK numa formulação adequada, oralmente, 1-3 vezes por dia.

Os compostos da presente invenção são formulados em composições farmacêuticas por combinação com transportadores ou diluentes adequados, farmaceuticamente aceitáveis e podem ser formulados em preparações na forma sólida, semi-sólida, líquida ou gasosa, tal como comprimidos, cápsulas, pós, grânulos, unguentos, soluções, supositórios, injecções, inaladores, geles, microesferas e aerossóis. Deste modo, a administração dos compostos pode ser conseguida de vários modos, incluindo por administração oral, bucal, rectal, parentérica, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, intratecal, etc. A ILK pode ser sistémica após administração, ou pode ser localizada utilizando um implante que actua de modo a reter a dose activa no local da implantação. 13

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Os compostos da presente invenção podem ser administrados isolados, em combinação uns com os outros ou podem ser utilizados em combinação com outros compostos e terapias conhecidos. Em formas de dosagem farmacêuticas, os compostos podem ser administrados na forma dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis ou podem também ser utilizados isolados ou em associação adequada, bem como em combinação com outros compostos farmaceuticamente activos.

Para preparações orais, os compostos podem ser utilizados isolados ou em combinação com aditivos adequados para produzir comprimidos, pós, grânulos ou cápsulas, por exemplo, com aditivos convencionais, tais como lactose, manitol, amido de milho ou amido de batata; com ligantes, tais como celulose cristalina, derivados de celulose, acácia, amido de milho ou gelatinas; com desintegrantes, tais como amido de milho, amido de batata ou carboximetilcelulose sódica; com lubrificantes, tais como talco ou estearato de magnésio e, se desejado, com diluentes, agentes tamponantes, agentes molhantes, conservantes e aromatizantes.

Os compostos podem ser formulados em preparações para injecção, por dissolução, suspensão ou emulsão num solvente aquoso ou não aquoso, tais como óleos vegetais ou semelhantes, glicéridos de ácido alifático sintéticos, ésteres de ácidos alifáticos superiores ou propilenoglicol e, se desejado, com aditivos convencionais, tais como solubilizantes, agentes isotónicos, agentes de suspensão, agentes emulsionantes, estabilizadores e conservantes.

Os implantes para formulações de libertação controlada são bem conhecidos na arte. Os implantes são formulados como microesferas, chapas, etc. com polímeros biodegradáveis ou não biodegradáveis. Por exemplo, os polímeros de ácido láctico e/ou ácido glicólico formam um polímero erodível que é bem tolerado pelo hospedeiro. 0 implante é colocado na proximidade do local de infecção de modo que a concentração local de agente activo é aumentada em relação ao resto do corpo. 0 termo "forma de dosagem unitária", tal como aqui utilizado, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para indivíduos humanos e 14

ΕΡ 1 467 761 /PT animais, em que cada unidade contém uma quantidade pré-determinada de compostos da presente invenção calculada numa quantidade suficiente para produzir o efeito desejado em associação com um diluente, transportador ou veículo farmaceuticamente aceitável. As especificações para as novas formas de dosagem unitária da presente invenção dependem do composto particular utilizado e do efeito a ser alcançado e da farmacodinâmica associada com cada composto no hospedeiro.

Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como veículos, adjuvantes, transportadores ou diluentes podem ser facilmente adquiridos pelo público. Além disso, as substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes de ajuste de pH e tamponantes, agentes de ajuste de tonicidade, estabilizadores, agentes molhantes e semelhantes, podem ser facilmente adquiridos pelo público.

Os peritos terão em conta que os níveis de dose podem variar em função do composto específico, da gravidade dos sintomas e da susceptibilidade do indivíduo a efeitos secundários. Alguns dos compostos específicos são mais potentes que outros. As dosagens preferidas para um determinado composto podem ser facilmente determinadas pelos peritos na arte, por meio de uma variedade de meios. Um meio preferido é medir a potência fisiológica de um determinado composto.

Deve entender-se que a presente invenção não é limitada à metodologia, protocolos, linhas celulares, espécies ou géneros animais, construções e reagentes particulares, descritos, dado que estes podem variar. Também deve entender-se que a terminologia aqui utilizada é apenas para fins de descrição de concretizações particulares e não deve ser entendido que limita o âmbito da presente invenção, o qual será determinado pela linguagem nas reivindicações.

Deve ter-se em conta que, tal como aqui utilizado e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um/uma" e "o/a" incluem referências plurais, salvo se o contexto claramente indicar de outro modo. Assim, por exemplo, a referência a "um ratinho" inclui uma pluralidade destes ratinhos e a referência 15

ΕΡ 1 467 761 /PT a "a citóquina" inclui referência a uma ou mais citóquinas e seus equivalentes, conhecidos dos peritos na arte, etc.

Salvo definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o normalmente entendido por um perito na arte à qual pertence a presente invenção. Embora se possam utilizar na prática ou teste da invenção quaisquer métodos, dispositivos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos, os métodos, dispositivos e materiais preferidos são agora descritos.

Os exemplos seguintes são apresentados de modo a proporcionar aos peritos na arte uma revelação e descrição completas do modo de realizar e utilizar a invenção e não pretendem limitar o âmbito do que é considerado como a invenção. Foram feitos esforços para assegurar a exactidão em relação aos números utilizados (e.g. quantidades, temperatura, concentrações, etc.) mas deverão ser permitidos alguns erros experimentais e desvios. Salvo indicação em contrário, as partes são partes em peso, o peso molecular é peso molecular médio, a temperatura é em graus centígrados; e a pressão é à, ou próximo da atmosférica.

EXPERIMENTAL EXEMPLO 1

Tratamento de AMD utilizando um inibidor de ILK como adjuvante da terapia com Visudyne™ 0 efeito terapêutico de um inibidor de ILK na AMD é avaliado utilizando a acuidade visual como resultado clínico principal. Os pacientes com lesões de CNV subfoveal provocadas por AMD são analisados quanto à presença de lesões que satisfazem os critérios de inclusão. Os critérios de inclusão são definidos como a presença de lesões que medem 5400 ym ou menos na dimensão linear maior com evidência de CNV clássica e acuidade visual melhor corrigida de aproximadamente 20/40 a 20/200 com base na análise angiográfica de fluoresceína e da acuidade visual. Aqueles que se determina que são qualificados para o tratamento de AMD são distribuídos aleatoriamente em 4 grupos. Os Grupos A, B e C são tratados com terapia de 16

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Visudyne™ convencional com uma terapia auxiliar utilizando um inibidor de ILK. Os pacientes do grupo D são tratados com terapia de Visudyne™ convencional em combinação com um placebo do inibidor de ILK.

Para terapia de Visudyne™ convencional administram-se aos pacientes 30 ml de Visudyne™ (0,15 mg por quilograma de peso corporal). O ingrediente activo em Visudyne™ é verteporfina, também conhecida como BPD-MA (US5095030). A administração é por infusão intravenosa durante um período de 10 minutos. Quinze minutos após o final da infusão, a luz laser é aplicada durante 83 segundos à lesão de CNV através de uma lente de contacto do fundo do olho de ampliação conhecida, para resultar numa exposição de luz de 50 J/cm2. Uma mancha circular de aproximadamente 6000 micra englobando a área da lesão é exposta a luz laser.

Para a terapia auxiliar, os pacientes dos grupos A, B e C recebem uma administração oral diária de um inibidor de ILK descrito na patente US N° 6214813 no pedido US co-pendente com o N° de série 09/747563, ou no pedido co-pendente intitulado "Hydrazonopyrazole derivatives and their use as anti-proliferative agents" nas doses de 5, 10, 20 mg por quilograma de peso corporal, respectivamente. O tratamento auxiliar tem início três dias após o paciente receber a terapia de Visudyne™ convencional e continua durante um período de um mês.

Como monitorização, os pacientes são examinados a cada três meses. A cada visita de monitorização regularmente programada, fazem-se medições de acuidade visual melhor corrigida, medições de limiar de contraste, exame oftalmoscópico, fotografia estereoscópica do fundo do olho e angiografia de fluoresceina.

Alternativamente, os pacientes que têm lesões de CNV subfoveais provocadas por AMD recebem uma dose oral diária de um inibidor de ILK, como descrito acima, como terapia isolada, mas não recebem terapia de Visudyne™. 17

ΕΡ 1 467 761 /PT EXEMPLO 2

Tratamento da retinopatia diabética utilizando um inibidor de ILK O efeito terapêutico de um inibidor de ILK na retinopatia diabética proliferativa é avaliado utilizando a acuidade visual como resultado clínico principal. Os pacientes com retinopatia diabética proliferativa e acuidade visual de 20/100 ou melhor, em cada olho, são incluídos na avaliação clínica. Os pacientes são distribuídos aleatoriamente em 3 grupos de tratamento e um grupo de placebo. Os grupos A, B e C são tratados com administração oral diária de um inibidor de ILK, como descrito no Exemplo 1 na dose de 5, 10, 20 mg por quilograma de peso corporal. Os pacientes do grupo D recebem placebo. O tratamento continua por um período de 24 meses.

Como monitorização, os pacientes são examinados a cada 4 meses. A cada visita de monitorização regularmente programada, fazem-se medições de acuidade visual melhor corrigida, medições de limiar de contraste, exame oftalmoscópico indirecto, fotografia estereoscópica do fundo do olho, angiografia de fluoresceína e análise de fenda-lâmpada utilizando lentes de 78 ou 90 dioptrias. EXEMPLO 3

Avaliação da expressão de ILK no tecido vascular ocular

Este exemplo documenta a verificação de que a ILK é um alvo terapêutico para doenças com patologia subjacente de neovascularização ocular.

Submeteram-se amostras de olho de babuíno post mortem a análise imuno-histológica para a expressão de ILK na vasculatura ocular. Os tecidos obtidos de fresco foram rapidamente congelados por imersão num recipiente Dewar de azoto líquido. Prepararam-se secções transversais de 5-10 micra e fixaram-se em acetona fria (-20°C). Fez-se imuno-histologia utilizando um anticorpo anti-ILK de coelho (Upstate Biotechnology Institute, NY. Cat.# 06-550) e Zymed

• , TM

Histostatin Plus kit (Zymed, Cat.#85-97 43) . 18

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Detectou-se uma expressão abundante de ILK no endotélio da coróide e retina em amostras de olho de babuíno post mortem. Sob condições semelhantes, não se detectou nenhum nível significativo de expressão de ILK em células epiteliais pigmentadas da retina. Além disso, não se observou nenhuma expressão significativa de ILK em neurónios e fotorreceptores. EXEMPLO 4 0 inibidor de ILK MC-2 (KP-31861), como se verificou no pedido de patente co-pendente com o N° de série 10/077238 inibe a angiogénese num modelo in vitro de angiogénese.

Utilizou-se o modelo seguinte para avaliar a actividade angiogénica de inibidores de ILK. Este modelo proporciona uma medição in vitro quantificável, de curto prazo, conveniente, da actividade anti-angiogénica do inibidor de ILK. Cresceram-se células endoteliais humanas HUVEC num suporte de Matrigel (VWR No. de catálogo CACB 354234) na presença ou ausência do inibidor de ILK MC-1 (Figura 1, painéis A e C) , MC-2 (Figura X, painéis B e D) ou controlo de solvente (dimetilsulfonamida, DMSO). A formação de tubos foi quantificada por um método de análise de imagem assistido por computador, utilizando Image Pro Plus (Media Cybernetics, ML) que mede o comprimento total do tubo, tal como capturado pelo microscópio em cada poço às 5h após a aplicação do inibidor de ILK. A viabilidade celular foi determinada medindo a actividade de desidrogenase mitocondrial no sobrenadante da cultura às 8h, utilizando o teste de proliferação de MTS (3-(4,5-dimetiltiozol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil-2-(4-sulfo-fenil)-2H-tetrazólio) (Promega Corporation, FL, USA., Pat. N°. TB169) . O reagente MTS foi adicionado à cultura às 5 h após aplicação do inibidor de ILK. As células foram incubadas a 37°C por mais 3 h e o sobrenadante de cultura foi recolhido e mediu-se a absorvância a 490 nm com um leitor de placas ELISA.

Detectou-se um efeito inibitório na formação do tubo endotelial com MC-2. Observou-se cerca de 35, 60 ou 70% de inibição da formação de tubo às 5 h após a aplicação de 50, 100 ou 150 μΜ de MC-2, respectivamente. No entanto, a viabilidade celular medida pela actividade metabólica das células não foi significativamente afectada pelo inibidor de 19

ΕΡ 1 467 761 /PT ILK, MC-2, com base em todas as medições de MTS de sobrenadante recolhido às 8 h a partir da mesma cultura. Para o MC-2 a actividade metabólica era cerca de 90, 80 e 75% dos niveis de controlo, a estas concentrações. EXEMPLO 5

Tratamento da neovascularização da córnea com um inibidor de ILK, utilizando um modelo de ratinho. O modelo seguinte proporciona um teste in vivo quantificável que pode ser utilizado para avaliar a actividade anti-angiogénica de um inibidor de ILK. A neovascularização da córnea é induzida por um procedimento conhecido como cauterização por nitrato de prata. O procedimento envolve aplicações tópicas de nitrato de prata na córnea tocando cuidadosamente a conjuntiva/limbo durante um segundo, e em seguida tocando a córnea central de um ratinho anestesiado durante 8 segundos, com um aplicador de nitrato de prata (Graham-Field, NY, Item # 1590, nitrato de prata a 75%, nitrato de potássio a 25%) . Imediatamente a seguir, o olho é lavado com 10 ml de solução salina, seguido de aplicação tópica de unguento oftálmico Gentak (sulfato de gentamicina a 0,3%) no olho, para prevenir infecções bacterianas. A neovascularização da córnea é registada e avaliada examinando e fotografando a córnea diariamente, utilizando um estéreo-microscópio de dissecação ligado a uma câmara de vídeo de cor e a um computador. A angiogénese é avaliada com base no crescimento de vasos sanguíneos novos na córnea anteriormente avascular, utilizando um sistema de pontuação (pontuação de 0-4) que vai desde nenhuma neovascularização até neovascularização da córnea muito grave. Além disso, no final da experiência (dias 5-7), a neovascularização da córnea é quantificada utilizando análise de imagens assistida por computador (Image Pro Plus, Media Cybernetics, ML) de vasos sanguíneos corados com corante, em montagens de córnea total post mortem. A vasculatura da córnea é corada por injecção IV de FITC-dextrano de peso molecular elevado em ratinhos anestesiados, antes de eutanásia. 20

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Os animais recebem diariamente administração intraperitoneal de um inibidor de ILK na dose de 5, 25 ou 50 mg/kg, começando no dia 2 após o procedimento de cauterização com nitrato de prata, até 24 h antes do final da experiência. A neovascularização da córnea de animais tratados com inibidor de ILK é comparada com a dos animais tratados com veículo. EXEMPLO 6

Tratamento da neovascularização da coróide com um inibidor de ILK utilizando um modelo de CNV de macaco. O modelo seguinte proporciona um teste in vivo que pode ser utilizado para avaliar o potencial terapêutico de inibidores de ILK para o tratamento de CNV. A CNV é induzida por queimaduras de laser verde de árgon que são colocadas na mácula de macacos cinomólogos, utilizando uma modificação do modelo de Ryan, como descrito no US 5798349. A queimadura de laser com um tamanho de 50 pm de diâmetro é induzida por exposição a luz laser de 350-450 mW a 514 nm, durante 0,1 segundos, utilizando um laser de árgon (Coherent Árgon Dye Laser #920, Coherent Medicai Laser, Polo Alto, CA). A CNV é monitorizada por avaliação semanal com fotografia do fundo do olho e angiografia de f luoresceína. No final da experiência (2-3 meses após a indução de CNV), os olhos são enucleados sob anestesia profunda e fixados em fixador de Kanovsky modificado. A bissecção é realizada 20 min após a fixação. Os tecidos são então embebidos e criam-se secções para análise histológica e imunológica, utilizando anticorpos contra marcadores específicos de vasculatura, incluindo CD-31 e VE-caderina. A extensão da neovascularização é quantificada utilizando um sistema de análise de imagens assistido por computador Pro Plus (Media Cybernetics, ML)

Os animais recebem diariamente administração oral de um inibidor de ILK a uma dose de 10, 50 ou 100 mg/kg para começar após o início de CNV (2-3 semanas após o tratamento laser) . Como controlo, um grupo de macacos recebeu diariamente tratamento oral apenas com veículo. A CNV em animais tratados com inibidor de ILK é comparada com o de animais tratados com 21

ΕΡ 1 467 761 /PT veículo quanto a evidências angiográficas e imuno-histológicas de CNV. EXEMPLO 7

Tratamento de neovascularização da retina com um inibidor de ILK utilizando um modelo de ratinho de retinopatia induzida por isquemia 0 modelo seguinte proporciona um teste in vivo que pode ser utilizado para avaliar o potencial terapêutico dos inibidores de ILK para o tratamento de retinopatia. Este é um modelo de ratinho de retinopatia de prematuridade. A retinopatia em ratinhos é induzida utilizando ratinhos mãe e recém-nascidos. Os ratinhos são expostos com as suas mães que amamentam a 75% de oxigénio/25% de azoto desde o dia 7 ao dia 12 pós-natal e em seguida são colocados de novo em contacto com o ar ambiente.

No dia 17, todas as crias são pesadas, submetidas a eutanásia e perfundidas com 1 ml de fixador (paraformaldeído a 4%/sacarose a 8%/tampão fosfato de sódio, pH 7,2) através do ventrículo esquerdo do coração. Os olhos são enucleados e colocados em fixador. Os tecidos fixados são embebidos em parafina e cortam-se secções de 4 pm. 0 procedimento de imuno-histologia é realizado para avaliar a extensão de neovascularização da retina utilizando anticorpos contra marcadores específicos do endotélio, incluindo CD-31 e VE-caderina. A coloração específica vascular é quantificada utilizando o método de análise de imagens assistido por computador (Image Pro Plus, Media Cybernetics, ML). 0 inibidor de ILK a doses de 5, 25 ou 50 mg/kg é administrado diariamente através de injecção intraperitoneal, desde o dia 12 até ao dia 16. O grupo de controlo recebe diariamente injecção de veículo. O efeito inibidor do inibidor de ILK na neovascularização da retina é determinado comparando a extensão de coloração vascular em ratinhos tratados com o inibidor de ILK e tratados apenas com veículo.

Lisboa

Claims (17)

1. ΕΡ 1 467 761 /PT 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um inibidor de quinase ligada a integrina (ILK) capaz de modular directamente a expressão de ILK ou bloquear directamente a actividade catalítica ou a actividade de ligação de ILK, no fabrico de um medicamento para o tratamento de neovascularização ocular.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido tratamento reduz ou reverte a perda de acuidade visual secundária a neovascularização da córnea, íris, retina ou coróide.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2 compreendendo ainda a administração de uma segunda terapia para neovascularização.
4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 3, em que a segunda terapia é seleccionada do grupo constituído por terapia com Visudyne™, fotocoagulação e termoterapia transpupilar.
5. 5. Utilização de acordo com as reivindicações 1 a 3, em que a referida neovascularização ocular é seleccionada do grupo constituído por retinopatia diabética, glaucoma crónico, descolamento da retina, retinopatia de células falciformes, degeneração macular relacionada com a idade (AMD) devida a neovascularização sub-retinal), rubeose irite; doenças inflamatórias; uveíte crónica; neoplasmas; iridociclite heterocrómica de Fuch; glaucoma neovascular; neovascularização da córnea; neovascularização resultante de uma vitrectomia e facectomia combinadas; isquemia da retina, insuficiência vascular da coróide, trombose da coróide, isquemia da artéria carótida; neovascularização do nervo óptico e neovascularização devido a penetração do olho ou terapia ocular com contusão.
6. 6. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 em que o referido inibidor de ILK é administrado sistemicamente. ΕΡ 1 467 761 /PT 2/3
7. 7. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o referido inibidor de ILK é administrado localmente.
8. 8. Utilização de acordo com a reivindicação 7, em que a referida administração local utiliza implantes de libertação controlada.
9. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 7, em que a referida administração local utiliza uma formulação tópica.
10. 10. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 em que o referido inibidor de ILK é administrado intra-ocularmente.
11. 11. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 em que o referido inibidor de ILK é administrado periocularmente.
12. 12. Utilização de acordo com a reivindicação 9, em que o referido inibidor de ILK é administrado topicamente na córnea.
13. 13. Utilização de acordo com a reivindicação 10, em que o referido inibidor de ILK é administrado por injecção intra-ocular.
14. 14. Utilização de acordo com a reivindicação 10, em que o referido inibidor de ILK é administrado por implantação intra-ocular.
15. 15. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, em que o referido inibidor de ILK é anti-sentido específico para ILK.
16. 16. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, em que o referido inibidor de ILK é um anticorpo específico de ILK e um seu análogo.
17. 17. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, em que o referido inibidor de ILK é uma ΕΡ 1 467 761 /PT 3/3 molécula orgânica pequena que bloqueia a actividade catalítica ou de ligação de ILK. Lisboa,