KR102022631B1 - 고리형 펜타뎁시펩타이드를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고리형 펜타뎁시펩타이드인 네오-N-메틸산살바미드 (NMSSV)를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 (Angiogenesis) 억제용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로, 본 발명의 NMSSV는 혈관신생과 관련된 세포 이동 및 튜브 형성을 억제하는 활성이 우수하고, 혈관내피성장인자로 유도된 혈관신생을 농도 의존적으로 억제하므로, 혈관신생 억제, 및 혈관신생이 비정상적으로 조절되는 다양한 질환의 치료제로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

고리형 펜타뎁시펩타이드를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물 {Pharmaceutical composition for the Anti―Angiogenesis containing cyclic pentadepsipeptide as an effective ingredient}

본 발명은 본 발명은 고리형 펜타뎁시펩타이드인 네오-N-메틸산살바미드 (NeoN-methylsansalvamide, NMSSV)를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 (Angiogenesis) 억제용 약학적 조성물 등에 관한 것이다.

혈관신생 (angiogenesis)은 조직이나 장기로 신규의 혈관을 생성하는 생물학적 과정으로, 정상적인 생리조건에서 인간 또는 동물은 매우 제한적인 상황에서만 신생 혈관을 생성한다. 이러한 혈관신생은 단백질 분해효소에 의한 혈관 기저막의 분해, 혈관벽을 형성하는 혈관내피세포의 이동, 증식 및 혈관내피세포 분화에 의한 튜브 (맥관)의 형성으로 혈관이 재구성되어 새로운 모세혈관이 생성되는 단계를 포함하는 일련의 순차적인 단계를 통해 일어난다.

또한, 혈관이 신생되는 과정은 다양한 음성 및 양성 조절인자들에 의해 엄격히 조절되고 있는데 (Folkman and Cotran., Int. Rev. Exp. Patho., 16, 207~248, 1976), 이러한 혈관신생이 정상적으로 조절되지 못하면 당뇨성 망막병증, 류마티스성 관절염, 염증, 자궁내막증, 노화에 따른 시력감퇴, 건선, 혈관종 등의 병리학적 장애를 유발하게 된다.

혈관신생과 관련이 있는 질환을 크게 분류해 보면 관절염과 같은 염증성 질환, 당뇨병성 망막증과 같은 안과 질환, 건선(psoriasis)과 같은 피부과 질환 및 암으로 나눌 수 있다. 혈관신생에 의한 안과 질환으로는 노인성 퇴화반(macular degeneration), 당뇨병의 합병증으로 망막에 있는 모세혈관이 초자체를 침습하여 결국 눈이 멀게 되는 당뇨성 망막증(diabetic retinopathy), 조숙아의 망막증, 신생혈관 녹내장과 같은 질병 등이 있으며, 이러한 질병에 의하여 해마다 전 세계적으로 수백만 명이 실명하게 된다. 또한, 관절염은 자가면역 이상이 원인으로 작용하나 병이 진행하는 과정에서 활액강에 생긴 만성염증이 혈관신생을 유도한다고 알려져 있으며, 새로운 모세혈관이 관절을 침습하여 연골이 파괴되어 생기는 질병이다. 아울러, 건선도 피부에 생기는 만성의 증식성 질환인데, 빠른 증식을 하기 위해서는 많은 혈액이 공급되어야 하므로 혈관신생이 활발히 일어날 수밖에 없다. 따라서, 신생혈관 형성을 억제하는 물질의 발견은 신생혈관 형성과 관련된 질병인 당뇨성 망막병증, 류마티스성 관절염, 염증, 자궁내막증, 노화에 따른 시력감퇴, 건선, 혈관종 등의 질병 치료에도 광범위하게 사용될 수 있어, 현재 학계 및 산업계는 이러한 기능을 갖는 신규 물질에 대한 연구개발을 계속적으로 진행시키고 있다.

또한, 비정상적인 혈관신생은 종양의 성장과 증식에 필요한 영양과 산소를 공급하는 역할을 하며, 종양까지 침투한 신생 모세혈관은 전이하는 암세포가 혈액순환계로 들어갈 수 있는 기회를 제공하여 암세포가 전이될 수 있도록 한다. 따라서, 혈관신생의 기전에 대한 연구 및 이를 억제할 수 있는 물질의 개발은 암의 예방 및 치료에 있어서 관심의 초점이 되고 있으며, 최근에는 동물의 암 모델과 인간의 임상실험에서 종양의 혈관신생 저해는 종양의 성장과 발달을 효과적으로 저해할 수 있고 환자의 생명을 연장할 수 있다는 사실이 증명되면서 혈관신생 억제제 개발에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

현재까지 개발된 혈관신생 억제제로는 약 200 여종이 보고되어 있는데, 이러한 혈관신생 억제제로는 특정 혈관 형성 촉진인자의 활성을 감소시키는 기전, 혈관내피세포의 성장억제 또는 고사를 유도하는 기전, 혈관형성촉진인자나 내피세포 생존인자를 조절하는 간접인자들의 작용을 억제하는 기전 및 체내에 존재하는 혈관신생 억제제들의 활성을 증가시키는 기전에 역할을 하는 4가지로 크게 분류할 수 있고, 특히 안지오스타틴 (angiostatin), 엔도스타틴 (endostatin), PK5, 프로트롬빈 크링글 2 (prothrombin kringle 2)과 같은 혈관형성 억제제들이 잘 알려져 있다 (O'Relly, M.S. 등 Cell., 79, 315~328, 1994; Lee. T.H., Biol. Che., 273, 28805~28812, 1998). 다만, 기존에 이미 다양한 혈관신생 억제제가 알려져 있더라도, 상기 억제제는 우수한 활성을 오랜 시간 동안 유지하기 어려우며, 약학적 특성이 낮고 쉽게 변성될 수 있는 문제점이 있어, 새로운 신생혈관 억제 물질의 개발이 요구되고 있다.

한편, 본 발명의 고리형 펜타뎁시펩타이드인 네오-N-메틸산살바미드 (NMSSV)는 산살바미드A (Sansalvamide: San A) 및 N-메틸산살바미드(N-Methylsansalvamide)와 4개의 구성 아미노산들 및 1개의 하이드록시산의 결합순서가 다른 고리형 펜타뎁시펩타이드로서, 산살바미드 A, N-메틸산살바미드 및 이들을 기본 고리구조로 이용하여 유기합성된 동족체들에서 보고된 바 없는 혈관신생의 억제 활성과 관련하여서는 알려진 바가 없는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 혈관신생 억제 활성을 갖는 물질을 찾기 위해 노력한 결과, 인간 혈관내피세포인 HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial cell)에 네오-N-메틸산살바미드 (NMSSV)를 처리한 결과, 세포 이동 및 튜브 형성을 농도 의존적으로 억제하는 것을 확인하고, 레이저로 망막에 손상을 유발한 동물모델에서 NMSSV 처리에 따라 병반의 크기가 감소하고 혈관내피세포의 분화·이동이 감소됨을 확인함으로써, 상기 네오-N-메틸산살바미드 (NMSSV)가 혈관신생 억제용 조성물 및 황반변성 관련 신생혈관을 억제할 수 있는 질환 치료제의 유효성분으로 사용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 하기 화학식 1의 고리형 펜타뎁시펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 (Angiogenesis) 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

[화학식 1]

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1의 고리형 펜타뎁시펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 (Angiogenesis) 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명의 일 구현예로, 상기 조성물은 혈관신생에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 질환은 상기 질환은 관절염, 류마티스 관절염, 만성염증 (chronic inflammation), 골관절염, 당뇨병성 망막증 (diabetic retionpathy), 조숙아 망막증, 신생혈관성 녹내장, 신생혈관에 의한 각막질환, 퇴화반/황반변성 (macular degeneration), 반점의 변성, 익상편, 망막변성, 홍색증, 증식성 망막증, 후수정체 섬유증식증, 과립성 결막염, 건선, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 건선, 지루성 피부염 또는 여드름일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 화학식 1의 고리형 펜타뎁시펩타이드는 혈관내피세포의 증식을 억제할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 화학식 1의 고리형 펜타뎁시펩타이드는 혈관내피세포에서 ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinases 1/2), AKT(Protein Kinase B) 또는 eNOS (endothelial nitric oxide synthase)의 인산화를 억제할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 화학식 1의 고리형 펜타뎁시펩타이드는 혈관내피세포의 세포 이동을 억제할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 화학식 1의 고리형 펜타뎁시펩타이드는 혈관내피세포 분화에 의한 튜브 형성을 억제할 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1의 고리형 펜타뎁시펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 관련 질환 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

[화학식 1]

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 혈관신생 관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약제를 생산하기 위한 상기 화학식 1의 고리형 펜타뎁시펩타이드의 용도를 제공한다.

본 발명은 고리형 펜타뎁시펩타이드인 네오-N-메틸산살바미드 (NMSSV)를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 (Angiogenesis) 억제용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로, 본 발명의 NMSSV는 혈관신생과 관련된 세포 이동 및 튜브 형성을 억제하는 활성이 우수하고, 혈관내피성장인자로 유도된 혈관신생을 농도 의존적으로 억제하므로, 혈관신생 억제, 및 황반변성과 같이 혈관신생이 비정상적으로 조절되는 다양한 질환의 치료제로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 MTT 분석을 통하여 NMSSV에 의한 HUVEC의 VEGF-유도 증식 억제 효과를 확인한 도면이다.
도 2는 NMSSV에 의한 HUVEC의 VEGF-유도 ERK1/2, AKT 및 eNOS의 인산화 억제 효과를 확인한 도면이다.
도 3은 NMSSV에 의한 HUVEC의 VEGF-유도 콜로니 튜브 형성 억제 효과를 확인한 도면이다.
도 4는 NMSSV에 의한 HUVEC의 VEGF-유도 세포 이동 억제 효과를 확인한 도면이다.
도 5는 NMSSV에 의한 HUVEC의 VEGF-유도 침입 억제 효과를 확인한 도면이다.
도 6은 대동맥 고리 분석을 통하여 NMSSV에 의한 생체 외 (ex vivo) VEGF-유도 혈관형성 억제 효과를 확인한 도면이다.
도 7은 마트리겔 플러그 분석을 통하여 NMSSV에 의한 생체 내 (in vivo) VEGF-유도 혈관신생 억제 효과를 확인한 도면이다.
도 8은 혈관조형술을 통하여 CNV 동물모델에서 NMSSV 투여에 의한 fluorescein leakage 감소를 확인한 도면이다.
도 9는 면역형광염색을 통하여 CNV 동물모델에서 NMSSV 투여에 의한 혈관내피세포 생성 감소를 확인한 도면이다.

본 발명자들은 고리형 펜타뎁시펩타이드인 네오-N-메틸산살바미드 (NMSSV)가 혈관신생과 관련된 세포 이동 및 튜브 형성을 억제하는 활성을 보이는 점에 기반하여 상기 NMSSV의 혈관내피성장인자로 유도된 혈관신생의 농도-의존적 억제 효과 등을 구체적으로 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1의 고리형 펜타뎁시펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 (Angiogenesis) 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명에서 "고리형 펜타뎁시펩타이드"는 상기 화학식 1로 표시되는 구조를 갖는 화합물로서, 천연물로부터 분리되거나 인공적으로 합성할 수 있으며, 인공적으로 합성하여도 동일한 효과를 갖는 것은 당업자에게 자명하다.

본 발명에서, "네오-N-메틸산살바미드 (NMSSV)"는 종래 보고된 산살바미드 A 및 N-메틸산살바미드와 구성 아미노산들 및 하이드록시산의 결합순서에 차이가 있는 15환 원자의 고리형 펩타뎁시펩타이드로서, 푸사리움 솔라니(Fusarium solani) KCCM90040 [기탁번호 : KCCM10881P]에서 생산될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약학적 조성물은 혈관신생에 의해 유발되는 질환을 개선, 예방 또는 치료할 수 있으며, 본 발명의 조성물에 의한 개선, 예방 또는 치료 대상 질병인 "혈관신생 관련 질환" 또는 “혈관신생에 의해 유발되는 질환”은 신생혈관 형성이 비정상적으로 진행되어 야기되는 질환을 의미한다. 본 명세서 내에서 “혈관신생 관련 질환”과 “혈관신생에 의해 유발되는 질환”은 상호 호환적으로 기재할 수 있다.

본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 혈관신생 관련 질환은 혈관형성-의존성 암, 양성 종양,관절염, 류마티스 관절염, 만성염증 (chronic inflammation), 골관절염, 당뇨병성 망막증 (diabetic retionpathy), 조숙아 망막증, 신생혈관성 녹내장, 신생혈관에 의한 각막질환, 퇴화반/황반변성 (macular degeneration), 반점의 변성, 익상편, 망막변성, 홍색증, 증식성 망막증, 후수정체 섬유증식증, 과립성 결막염, 건선, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 건선, 홍색증, 지루성 피부염 또는 여드름 등이 될 수 있으며, 바람직하게는 비 정상적인 혈관신생에 의해 유발되는 염증성 질환, 안과질환, 및/또는 피부과 질환일 수 있으며, 보다 구체적으로, 황반변성 또는 관절염일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 고리형 펜타뎁시펩타이드는 세포 이동 및 혈관내피세포 분화에 의한 튜브 형성 억제를 통해 혈관신생 관련 질환의 치료 또는 예방을 수행할 수 있다.

한편, 본 발명에서 사용되는 용어, "예방"은 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 혈관신생 관련 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

또한, 본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 혈관신생 관련 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 고리형 펜타뎁시펩타이드는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산 (free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, 하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 상기 화학식 1로 표시되는 고리형 펜타뎁시펩타이드를 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시켜서 건조하거나 또는 석출 된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 100 내지 500 mg을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 본 발명의 고리형 펜타뎁시펩타이드의 세포 이동 및 튜브 형성 억제 효과를 확인하기 위하여, 인간 혈관내피세포인 HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial cell)에 NMSSV를 처리한 결과, 튜브 형성 (도 3 참조) 및 세포 이동 (도 4 참조)을 농도-의존적으로 억제하는 것을 확인하고, 혈관내피성장인자인 VEGF (Vascular endothelial growth factor)로 유도된 혈관신생에 대하여 유의적인 억제 활성을 나타내는 것을 확인하였다 (도 6 및 도 7 참조).

또한, 본 발명의 구체적인 실시예를 통하여, 본 발명자들은 레이저를 조사하여 맥락막 신생혈관이 유도된CNV 동물 모델을 제작하고, NMSSV 처리에 따른 병반의 크기 및 혈관내피세포의 분포를 확인한 결과, NMSSV 처리에 따라 병반의 크기 및/또는 정도가 감소하고, 상대적으로 협소한 공간에서 혈관내피세포가 분포되어 있음을 확인하여 NMSSV가 비정상적인 혈관 형성을 억제하고, 혈관에서 액체의 누출을 억제하여 황반변성과 같이 망막 및/또는 맥락막에서 혈관신생 및/또는 혈관손상에 의해 유발되는 질환의 치료 효과가 있음을 확인하였다(도 8 및 9 참조).

따라서, 본 발명의 고리형 펜타뎁시펩타이드는 혈관신생과 관련된 세포 이동 및 튜브 형성 억제하는 활성이 우수하고, 혈관내피성장인자로 유도된 혈관신생을 농도 의존적으로 억제하므로, 혈관신생 억제용 조성물에 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있으며, 특히 망막 또는 맥락막에서 비정상적인 혈관생성 억제 및 혈관에서의 누출을 억제하므로, 혈관신생에 의해 유발되는 질환의 치료를 위한 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.

이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1의 고리형 펜타뎁시펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 (Angiogenesis) 관련 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "개선"이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다. 이때, 상기 기능성 식품 조성물은 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 개선을 위하여 해당 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "건강기능식품"이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 이는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

상기 조성물의 양은 전체 건강기능식품 중량의 0.001 중량% 내지 90 중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 40 중량%로 포함할 수 있고, 장기간 섭취 용도일 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으나, 유효성분이 안전성 면에서 아무런 문제가 없어 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있기 때문에 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적/식품 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 치료방법을 제공한다. 본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험 준비 및 실험 방법

1-1. 실험 재료

인간 재조합 VEGF는 R&D Systems (Minneapolis, MN)에서 구입하였으며, ERK, phospho-ERK, AKT, phospho-AKT, eNOS, phospho-eNOS, 및 항체는 Cell Signaling (Danvers, MA)에서 구입하였다.

1-2. MTT 분석

인간 제대정맥혈관내피세포 (HUVECs)를 80-90% confluence까지 배양한 후, 1% FBS가 첨가된 M199 배지에서 6 시간 동안 추가로 배양한 후, VEGF (50 ng/ml)의 존재 하에서 여러 농도의 네오-N-메틸산살바미드 (NMSSV)으로 24 시간 동안 처리하였다. HUVEC 세포의 생존 능력과 성장 억제에 있어서 네오-N-메틸산살바미드 (NMSSV)의 효과는 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석 방법으로 측정하였다.

1-3. ERK1/2, AKT 및 eNOS의 인산화 분석

HUVECs 세포를 80-90% confluence까지 배양한 후, 1% FBS가 첨가된 M199 배지에서 6 시간 동안 추가로 배양한 후, VEGF (50 ng/ml)의 존재 하에서 여러 농도의 네오-N-메틸산살바미드 (NMSSV)로 10 분 동안 처리하였다. HUVEC 세포의 ERK1/2, AKT 및 eNOS의 인산화 분석에 있어서 네오-N-메틸산살바미드 (NMSSV)의 효과는 각각의 항체를 이용하여 웨스턴 분석 방법으로 측정하였다.

1-4. 마트리겔 플러그 (Matrigel Plug) 분석

1-4-1. 투여

시험물질 투여군과 VEGF (50ng/ml)를 설정하였고, 각 군당 8주령 C57BL/6 마우스 6마리씩 구성하였다. Matrigel 0.5 ml, heparin 50 U/ml 및 시험물질을 농도별로 투여 직전에 조제하여 사용하였으며, 시험물질 투여군에도 VEGF가 포함되도록 조제하였다. 투여 7일 경과 후, 마트리겔 플러그 (matrigel plug)를 적출하여 사진 촬영을 수행하였고, Drabkin method (Drabkin reagent kit 525, Sigma-Aldrich, Louis, MO)를 사용하여 헤모글로빈의 양을 측정하여 정화하였다.

1-4-2. 투여경로

1 ml 주사기를 사용하여 시험 동물의 등쪽 피하에 0.6 ml씩 투여하였다.

1-5. 상처-치유 이동 (wound-healing migration) 분석

세포가 90% 정도 자라면 배지를 석션 (suction)한 후 옐로 팁 (yellow tip)으로 플레이트의 바닥을 일정하게 긁어 라인 (line)을 만든 후, PBS로 세척하고 VEGF (50 ng/ml)의 존재 하에서 여러 농도의 네오-N-메틸산살바미드 (NMSSV)으로 24 시간 동안 처리하였다. 24 시간 후에 세포가 처리 농도별로 이동하는 경향을 현미경 배율 x40으로 하여 위치를 표시하여 사진을 찍어 관찰하였다.

1-6. 트랜스웰 침입 (transwell invasion) 분석

Polycarbonate Nucleopore membrane (Corning, Corning, NY)으로 제조된 modified Boyden chamber를 이용하여 실험을 수행하였다. 세포에 트립신-EDTA을 첨가한 후 세포를 모으고 헤마토사이토미터 (hematocytometer)를 이용하여 세포를 측정한 후, 4 x 10⁵ cells/ml로 만들어 각각 분주하였다. 아래 웰에는 배지를 700 μl 첨가하고 인서트 (insert)를 얹은 후, 인서트에는 VEGF (50 ng/ml)의 존재 하에서 여러 농도의 네오-N-메틸산살바미드 (NMSSV)으로 제조된 세포를 100 μl 씩 분주하여 37 ℃ 인큐베이터에서 24 시간 동안 배양하였다. 인큐베이션을 끝낸 후 상위 챔버 (upper chamber)의 젤라틴 (gelatin)을 통과하지 못한 인서트의 세포를 면봉으로 닦아내었다. 통과된 세포를 4 % 파라포름알데히드로 고정시킨 다음 크리스탈 바이올렛을 이용하여 염색하고, PBS로 2 회 세척한 후 유리판에 올렸다. 그 후 현미경을 이용하여 관찰하며 임의의 5곳을 지정하여 사진을 찍어 관찰하였다.

1-7. 대동맥 고리 (aortic ring) 분석

마트리겔 150 μl를 48-웰 플레이트에 넣고 흔들어 골고루 펴주고 37 ℃ 인큐베이터에서 30 분 동안 굳혀주었다. C57BL/6 마우스를 에터 (ether)로 과마취하여 희생시킨 후, 대동맥을 적출하여 PBS에 세척하며 지방을 제거하고, Human Endothelial-SFM으로 옮겨 미세 가위 (micro sissor)를 이용하여 세절하였다. 세절된 대동맥을 굳힌 마트리겔 위에 올려놓고 마트리겔 50 μl를 대동맥 조직 위에 떨어뜨린 후, 37 ℃ 인큐베이터에서 30 분 동안 굳혀주었다. 네오-N-메틸산살바미드 (NMSSV)와 VEGF이 포함된 배지를 200 μl 씩 넣어주고 37 ℃ CO₂ 인큐베이터에서 배양하면서 관찰하였다. 시험물질 처리 후 14일 동안 배양하였다. 배양 7, 14일째 invert microscope (OLYMPUS, CKX41)로 관찰하고 촬영하여 Toupview program (OLYMPUS, ver.3.5)으로 촬영하여 생성된 혈관의 길이를 측정 하였다.

1-8. 콜로니 튜브 형성실험 (colony tube formation assay)

HUVECs 세포를 마트리겔 (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA)이 도말된 플레이트에서 80-90% confluence까지 배양한 후, 1% FBS가 첨가된 M199 배지에서 6 시간 동안 추가로 배양한 후, VEGF (50 ng/ml)의 존재 하에서 여러 농도의 네오-N-메틸산살바미드 (NMSSV)로 24 시간 동안 처리하였다. 튜브 형성은 phase-contrast microscope를 사용하여 촬영하였다.

1-9. 맥락막 신생혈관 억제 실험

1-9-1. 맥락막 신생혈관 유도 동물모델제작

Wet-AMD의 병변과 유사한 병변을 갖도록 레이저를 조사하여 맥락막 신생혈관을 유도하는 마우스 모델 (CNV, choroidal neovascularization)을 제작하였다. 보다 구체적으로, 6주령의 C57BL/6, 수컷 마우스를 오리엔트에서 구입하여, 1주일간 순화시킨 후, 마취시켜서 동공을 확장하였다. 이어서, Diode green laser (532 nm, 200 mW, 0.8 sec, 50 μm, photocoagulator)를 시신경 주위로 12, 3, 6, 9시 방향으로 조사하여 안구당 3-4 부위에 손상(injury)을 유발하여, 동물모델을 제작하였다.

1-9-2. 투여

상기 1-9-1 실시예의 방법으로 마우스를 레이저로 손상을 유발하고 1일 후에 마취한 후 34 gauge needle을 이용하여 유리체 내에 2 μL를 1회 양안에 투여하였다(Intravitreal injection). 이어서, 레이저 조사 14일 경과 후에 혈관조형술(Angiography) 및 CNV 염색 및 이미징(Staining and imaging of CNV)을 수행하였다.

1-9-3. 혈관조형술(Angiography)

레이저 조사 14일 경과 후, 마우스를 산동하고 팍사론을 80 mg/kg으로 복강에 주사하여 전신 마취한 후, 1% Fluorescein을 복강 내 주사하였다. 그리고 MicronIV 장비를 이용하여 촬영한 후, CNV 병변 면적은 Image-Pro Plus software를 이용하여 측정하였다.

1-9-4. 면역형광염색(immunofluorescence)

레이저 조사 14일 경과 후, 마우스에서 안구를 적출한 후 4% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde)에 1시간 동안 고정하였다. 이후 현미경 하에서 각막 및 수정체를 가위로 잘라 제거하고, 망막을 집게로 조심스럽게 제거하여 망막색소상피(retinal pigment epithelium: RPE)/맥락막(choroid)/공막 복합조직을 준비하였다. 망막평면 표본고정 (retinal flat mount)한 복합조직을 5% bovine serum albumin와 0.5% Triton X-100을 포함한 PBS에서 1시간 동안 교반하였고, 세척 후 혈관내피세포 마커인 isolectin B4 (Invitrogen, USA)를 1:100으로 희석하여 4°C에서 밤새(overnight) 반응시켰다. 그 후 PBS로 세척한 뒤 슬라이드글라스 위에 fluorescence mounting medium (Vector, USA)와 함께 조직을 고정 후 커버슬립으로 덮고 형광현미경을 통해 관찰, 사진촬영을 하였다. CNV 병변 면적은 Image-Pro Plus software를 이용하여 측정하였다.

실시예 2. 네오 -N- 메틸산살바미드 ( NMSSV )에 의한 HUVEC (Human umbilical vein endothelial cell)의 VEGF (Vascular endothelial growth factor)-유도 증식 억제 효과 확인

VEGF-유도 HUVEC에서 본 발명의 네오-N-메틸산살바미드 (NMSSV, Peak 2, 이하 P2)의 증식 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-2의 방법으로 VEGF (50 ng/ml)의 존재 또는 부재 하에 다양한 농도의 P2와 함께 세포를 배양하고, 배양 24 시간 후, MTT 분석을 수행하여 세포 증식을 확인하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, P2는 VEGF에 의해 유도된 HUVEC의 증식을 용량-의존적으로 억제함을 확인하였으며, 나아가, 5 μg/ml의 P2에서 유의미한 세포사멸이 검출되지 않았기 때문에, 후속 실험은 비-세포독성 농도인 5 μg/ml 미만으로 수행하였다.

실시예 3. NMSSV에 의한 VEGF -유도 HUVEC에서의 다운스트림 시그널링 (downstream signaling) 억제 효과 확인

먼저, 앞선 연구에서 HUVEC에서 VEGF에 대한 혈관신생 반응에 ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinases 1/2) 및 AKT/eNOS (AKT/endothelial nitric oxide synthase) 경로가 관여한다는 사실이 입증되었는바, HUVEC에서 VEGF에 의해 유도된 하위 신호 분자 (downstream signaling molecules)에 대한 P2의 영향을 확인하기 위하여, ERK1/2, AKT 및 eNOS의 인산화를 확인하였다. 이때, HUVEC는 VEGF 자극 전, 10 분 동안 P2와 함께 40 분 동안 예비 배양되었다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, P2는 HUVEC에서 VEGF에 의해 유도된 ERK1/2, AKT 및 eNOS의 인산화를 억제하는 것을 확인하였다.

실시예 4. NMSSV에 의한 VEGF-유도 HUVEC에서의 튜브 형성, 이동 및 침입 억제 효과 확인

내피 세포 (endothelial cells)에 의한 모세혈관-유사 관 (tubular) 구조의 형성은 혈관신생의 발달에서 가장 필수적인 단계 중 하나로, P2가 마트리겔 (matrigel)에 있는 HUVEC의 모세혈관-유사 네트워크 구조의 형성을 억제하는지 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, VEGF는 마트리겔에서 HUVEC의 혈관 네트워크를 유도하였으며, HUVEC의 VEGF-유도 콜로니 튜브 형성은 P2의 추가에 의해 크게 억제되었다.

다음으로, 내피 세포 (endothelial cells)의 이동 및 침입 또한 새로운 혈관 형성을 초래하는 혈관신생의 주요 단계인바, 상처-치유 이동 분석 및 트랜스웰 침입 분석을 사용하여, VEGF-유도 HUVEC의 운동성 및 침습성에 대한 P2의 영향을 확인하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, P2 처리 시 HUVEC의 VEGF-유도 이동이 유의하게 감소되었으며, 또한 도 5에 나타낸 바와 같이, 마트리겔을 통한 HUVEC의 VEGF에 의한 침입은 P2가 있을 때 차단되었다.

이러한 결과는, P2가 VEGF-유도 HUVEC에서의 콜로니 관 형성, 이동 및 침입의 억제에 효과적이라는 것을 시사한다.

실시예 5. NMSSV에 의한 생체 외 ( ex vivo ) VEGF -유도 혈관형성 및 생체 내 ( in vivo ) 혈관신생 억제 효과 확인

상기 실시예 결과를 바탕으로, ex vivo에서 VEGF-유도 혈관신생에 대한 P2의 영향을 확인하였는바, VEGF의 존재 하에서 미세혈관의 형성에 대한 P2의 효과를 확인하기 위하여 대동맥 고리 분석을 실시하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, P2가 마우스 대동맥 고리에서 VEGF-유도 혈관 형성을 유의하게 억제함을 확인하였다.

이에, 추가적으로 in vivo 마트리겔 플러그 분석을 통하여, 생체 내 혈관신생에 대한 P2의 효과를 확인하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, VEGF를 함유한 마트리겔은 암적색을 나타내었고 대조구와 비교하여 혈관으로 가득 차 있었던 반면, 마트리겔에 P2를 첨가하면 옅은 노란색으로 변하고, VEGF 단독과 비교하여 새로운 혈관 형성이 감소됨을 알 수 있었다. 또한, 마트리겔 플러그의 혈관 형성을 헤모글로빈 함량으로 정량화한 결과, P2는 VEGF로 처리한 마트리겔 플러그의 헤모글로빈 함량을 지속적으로 억제함을 알 수 있었다.

이러한 결과는 P2가 생체 외 (ex vivo) 및 생체 내 (in vivo) 모두에서 VEGF에 의해 유도된 혈관신생을 억제 할 수 있음을 시사한다.

실시예 6. NMSSV에 의한 생체 내 ( in vivo ) 맥락막 신생혈관 억제 효과 확인

상기 실시예 1-9의 방법으로 레이저를 조사하여 혈관신생을 유도한 CNV 모델에서 NMSSV 투여에 따른 혈관신생 억제 효과를 조영술과 염색을 통한 이미징으로 확인하였다.

보다 구체적으로, 레이저를 조사하여 맥락막 신생혈관을 유도한 마우스는 blood-retinal barrier 파괴로 망막혈관에서 조영제가 혈관 밖으로 누출되거나, 망막색소상피층의 이상으로 맥락막에서 망막으로 조영제가 누출되는데, 이러한 손상에 의해 누출된 조영제가 조직이나 세포간극 등 일정한 공간에 고이거나 조직에 색소가 느슨하게 붙어서, 염색되는 형광이 비정상적으로 감소되어 있거나 소실된 상태(fluorescein leakage)를 나타내게 된다. 따라서, 상기 실시예 1-9의 방법으로 제작한 동물모델에서 NMSSV 투여에 따른 조영제 누출 정도를 대조군과 비교하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 대조군에 비해 NMSSV를 투여한 군에서 염색되는 형광이 보다 뚜렷하게 관찰되는바, 이는 NMSSV 투여에 의해 CNV 병변 면적이 감소되어 fluorescein leakage가 감소됨을 의미한다.

또한, 상기에서 확인된 NMSSV 투여에 따른 CNV 병변 감소 효과를 확인하기 위하여 혈관내피세포 마커인 isolectin B4 면역염색 실험을 실시하였다. 레이저로 CNV를 유도한 후 2주가 지났을 때 NMSSV를 투여한 안구와 투여하지 않은 대조군 안구를 적출하여 수정체와 유리체를 제거하고 망막색소상피-맥락막-공막 (retinal pigment epithelium-choroid-sclera) 조직을 획득하였다. 혈관내피세포 특이적인 마커로 알려진 isolectin B4로 염색된 면적을 측정하여 대조군과 NMSSV 투여군에서 CNV 면적을 측정하였다. 각 군의 모든 CNV 병변의 면적을 측정하여 그룹별로 평균을 내어 CNV 면적에 차이가 있는지 확인하였다.

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, CNV가 유도된 대조군의 병변 면적에 비해 CNV 유도 후 NMSSV를 투여한 군에서 유의적으로 병변 면적이 감소된 것을 확인하였다.

상기 결과로 확인되는 바와 같이, CNV mouse 모델을 이용한 혈관형성억제 실험결과로 감자에서 분리된 펩티드인 NMSSV가 황반변성 관련 신생혈관을 억제할 수 있는 질환 치료제로 활용할 수 있다는 유의적인 잠재성을 제시하고 있다는 것을 확인할 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (7)

1. 하기 화학식 1의 고리형 펜타뎁시펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 (Angiogenesis) 에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
   상기 질환은 당뇨병성 망막증 (diabetic retinopathy), 조숙아 망막증, 신생혈관성 녹내장, 신생혈관에 의한 각막질환, 황반변성 (macular degeneration), 반점의 변성, 익상편, 망막변성, 홍색증, 증식성 망막증, 후수정체 섬유증식증, 및 과립성 결막염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   상기 화학식 1의 고리형 펜타뎁시펩타이드는 혈관내피세포의 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 화학식 1의 고리형 펜타뎁시펩타이드는 혈관내피세포에서 ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinases 1/2), AKT(Protein Kinase B) 또는 eNOS (endothelial nitric oxide synthase)의 인산화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 화학식 1의 고리형 펜타뎁시펩타이드는 혈관내피세포의 세포 이동을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 화학식 1의 고리형 펜타뎁시펩타이드는 혈관내피세포 분화에 의한 튜브 형성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.

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