WO2016052621A1 - 低酸素関連眼疾患のインビボ用診断薬及び治療用組成物 - Google Patents

低酸素関連眼疾患のインビボ用診断薬及び治療用組成物 Download PDF

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WO2016052621A1
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WO
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gpu
fluorescence
hypoxia
diagnostic agent
hypoxic
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PCT/JP2015/077748
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慎一 福田
哲郎 大鹿
秀子 永澤
健介 奥田
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国立大学法人筑波大学
岐阜市
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Publication date
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    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
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    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence

Definitions

  • the present invention relates to an in vivo diagnostic agent and therapeutic composition for hypoxia-related eye diseases.
  • the present application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2014-200377 filed in Japan on September 30, 2014, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • hypoxic region in living tissue is known to be related to various eye diseases, malignant transformation of cancer, and the like.
  • pimonidazole which is a 2-nitroimidazole compound
  • Detection of the hypoxic region using pimonidazole is performed by utilizing the binding of pimonidazole to hypoxic cells. More specifically, first, pimonidazole is administered to a living body. Pimonidazole then binds to hypoxic cells. Subsequently, a specimen in which the target tissue is fixed by formalin fixation or the like is prepared and stained with an anti-pimonidazole antibody to detect pimonidazole bound to hypoxic cells. This makes it possible to observe the low oxygen region. However, in order to detect a hypoxic region using pimonidazole, it is necessary to fix the target tissue, and the hypoxic region cannot be detected in vivo.
  • Patent Document 1 is characterized by comprising a near-infrared fluorescent dye, a hypoxia binding site that is activated by reductive metabolism in a low oxygen region and binds to a nucleophilic biomolecule, and a linker bond.
  • a near-infrared fluorescent probe for imaging in a low oxygen region is described.
  • Fluorescence fundus imaging is a method in which a fluorescent substance, fluorescein, is administered to a patient by infusion, and the blood vessels of the fundus are imaged with a fundus camera. This method is an old inspection method with a history of more than 50 years, but it is indispensable in ophthalmic practice due to its usefulness.
  • indocyanine green which is a fluorescent substance
  • ICG indocyanine green
  • a blood vessel in the fundus is imaged with a fundus camera.
  • indocyanine green is a fluorescent substance that emits fluorescence in the near-infrared region, it is easy to distinguish between fluorescence of indocyanine green and autofluorescence emitted by a living body.
  • near-infrared light has high biological tissue permeability, it is possible to observe deeper regions of tissues such as the choroid with indocyanine green.
  • hypoxia-related eye disease has progressed to the end stage, and capillary vessel occlusion occurs, so that an avascular field and new blood vessels are observed, and it is possible to estimate the presence of a hypoxic region. It becomes. For this reason, it is not possible to directly evaluate the hypoxic region in the early to middle stages of hypoxia-related eye diseases. Further, in the fluorescence fundus angiography, there is a serious problem that there is a serious side effect of dying due to anaphylactic shock at a rate of about 1 in 200,000 people.
  • the near-infrared fluorescent probe for imaging in the low oxygen region described in Patent Document 1 does not have a fluorescence on-off function and always emits light, so the background is high and it takes time to detect a signal. There was a case.
  • an object of the present invention is to provide a diagnostic agent capable of directly detecting a hypoxic region of an eye in vivo.
  • Another object of the present invention is to provide a therapeutic composition capable of simultaneously diagnosing and treating hypoxia-related eye diseases.
  • the present invention is as follows.
  • An in vivo diagnostic agent for hypoxia-related eye diseases comprising a hypoxia fluorescent probe as an active ingredient.
  • the diagnostic agent according to [1] which is for vitreous injection.
  • the diagnostic agent according to claim 1 or 2 wherein the low oxygen fluorescent probe is a compound represented by the following formula (1).
  • each R 1 independently represents H, COOH, SO 3 ⁇ , or an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms, and R 2 does not exist or is linear or branched having 1 to 10 carbon atoms.
  • R 3 represents an electron-withdrawing substituent
  • R 4 represents an alkyl group
  • or — (CH 2 ) Represents A 2 O ⁇
  • X ⁇ is absent or represents Cl ⁇ , Br ⁇ , I ⁇ , or PF 6—
  • n represents an integer of 1 to 4
  • A represents an integer of 1 to 6.
  • the diagnostic agent according to any one of claims 1 to 3, wherein the low oxygen fluorescent probe is a compound represented by the following formula (2).
  • a composition for treating hypoxia-related eye diseases comprising the diagnostic agent according to any one of [1] to [4] and an angiogenesis inhibitor as active ingredients.
  • angiogenesis inhibitor is a vascular endothelial growth factor (VEGF) capture substance.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • a diagnostic agent capable of directly detecting the hypoxic region of the eye in vivo can be provided.
  • the therapeutic composition which can implement simultaneously a diagnosis and treatment of a hypoxia related eye disease can be provided.
  • EPC Endothelial progenitor cells cultured in the presence of hypoxic fluorescent probes (GPU-327) at final concentrations of 0.5, 1.0 and 1.5 ⁇ M, and in environments with oxygen concentrations of 1%, 5% and 20% It is the photograph which detected the fluorescence in).
  • 1A is a graph showing the fluorescence intensity of FIG. 1A.
  • 1A is a graph showing the fluorescence intensity of FIG. 1A.
  • 1A is a graph showing the fluorescence intensity of FIG. 1A.
  • Fluorescence was detected in umbilical vein endothelial cells (HUVEC) cultured in the presence of GPU-327 at final concentrations of 0.5, 1.0 and 1.5 ⁇ M, and in environments with oxygen concentrations of 1%, 5% and 20%.
  • UUVEC umbilical vein endothelial cells
  • 1E is a graph of the fluorescence intensity of FIG. 1E.
  • 1E is a graph of the fluorescence intensity of FIG. 1E.
  • 1E is a graph of the fluorescence intensity of FIG. 1E.
  • It is a graph which shows the expression level of mRNA of VEGF.
  • 2B is a graph showing the protein expression level of FIG. 2B.
  • It is a photograph which shows a flap ischemia mouse model. It is a photograph which shows the result of the fluorescence observation in the same sample as FIG. 3A without the fluorescence filter.
  • FIG. 5 is a photograph showing the result of in vitro observation of a cross section of an eye of a model produced by the same experimental method as in FIGS.
  • 4E is a photograph showing the result of observing fluorescence of GPU-327 in the same sample as FIG. 4E. It is the photograph which integrated the fluorescence image of FIG. 4E and FIG. 4F. It is a photograph which shows the result of having observed fluorescence of GPU-327 in vivo in a mouse model of retinal vein occlusion. It is a photograph which shows the result of having observed the blood vessel structure of the retina of the eye observed in FIG. 5A in vitro.
  • 5B is a photograph showing the result of observing fluorescence of GPU-327 in the same sample as FIG. 5B. It is the photograph which integrated the fluorescence image of FIG. 5B and C.
  • FIG. 5E is a photograph showing the result of observing fluorescence of GPU-327 in the same sample as FIG. 4E. It is the photograph which integrated the fluorescence image of FIG. 5B and C.
  • FIG. 6B is a photograph showing a result of observing GPU-327 fluorescence in the same sample as FIG. 6A. It is the photograph which integrated the fluorescence image of FIG. 6A and B.
  • FIG. It is a photograph which shows the result of having observed the concentration dependence of fluorescence of GPU-327 in vivo in the mouse model of retinopathy of prematurity. It is a photograph which shows the result of having observed the time dependence of fluorescence of GPU-327 in vivo in the mouse model of retinopathy of prematurity.
  • 7B is a graph showing the fluorescence intensity detected in FIG. 7B.
  • FIG. 10C is a photograph in which the fluorescent images of FIGS. 10C and D are integrated.
  • the arrow indicates the occlusion site of the retinal vein.
  • FIG. 5 is a graph showing an electroretinogram 60 days after administration of PBS or GPU-327.
  • FIG. 5 is a graph showing the ratio of amplitude PBS administration vs. control or GPU-327 administration vs. control for a waves measured at each stimulus luminance.
  • FIG. 5 is a graph showing the ratio of amplitude PBS administration vs. control or GPU-327 administration vs. control for b waves measured at each stimulus intensity.
  • the present invention provides an in vivo diagnostic agent for hypoxia-related eye diseases, comprising a hypoxia fluorescent probe as an active ingredient.
  • hypoxic fluorescent probe to the eye to detect the hypoxic region of the eye both in vitro and in vivo and diagnose hypoxia-related eye diseases. It was revealed for the first time.
  • the hypoxic region of the eye can be directly detected not only in vitro but also in vivo.
  • a low oxygen fluorescent probe is a compound whose fluorescence characteristics change in a normal oxygen environment and a low oxygen environment.
  • the hypoxia fluorescent probe is not particularly limited as long as the toxicity to humans and animals is within an acceptable range, and examples thereof include compounds whose fluorescence characteristics are greatly changed by reductive metabolism in a living body under hypoxic conditions.
  • the wavelength of fluorescence emitted from the low oxygen fluorescent probe is not particularly limited, but is preferably fluorescence in the near infrared region (wavelength 650 to 1000 nm). Near-infrared fluorescence can be easily distinguished from autofluorescence emitted by a living body. In addition, near infrared light has high permeability to living tissue, and absorption by in-vivo substances is limited.
  • Examples of the low-oxygen fluorescent probe that emits near-infrared fluorescence include cyanine dye derivatives and BODIPY dye derivatives.
  • the change in fluorescence characteristics of the low oxygen fluorescent probe under low oxygen conditions may be reversible or irreversible.
  • the change in fluorescence characteristics of the low oxygen fluorescent probe is reversible, the hypoxic environment is improved, and the fluorescence characteristics change when approaching the normoxic environment, so monitor the change in oxygen concentration over time. Is also possible.
  • each R 1 independently represents H, COOH, SO 3 ⁇ , or an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms, and R 2 does not exist or is linear or branched having 1 to 10 carbon atoms.
  • R 3 represents an electron-withdrawing substituent
  • R 4 represents an alkyl group
  • — (CH 2 ) Represents A 2 O ⁇
  • X ⁇ is absent or represents Cl ⁇ , Br ⁇ , I ⁇ , or PF 6—
  • n represents an integer of 1 to 4
  • A represents an integer of 1 to 6.
  • Examples of the electron-withdrawing substituent include nitro group, cyano group, halogen atom, halogenated alkyl group, halogenated aryl group, halogenated heteroaryl group, nitrogen-containing heteroaryl group, carbonyl group, sulfonyl group, phosphoryl group, An alkynyl group etc. are mentioned.
  • the low oxygen fluorescent probe may be, for example, a compound represented by the following formula (2) (hereinafter sometimes referred to as “GPU-327”).
  • GPU-327 shows almost no fluorescence, but when administered to a living body, it undergoes reductive metabolism in a hypoxic region, is converted into a compound represented by the following formula (3), is activated, and emits fluorescence in the near-infrared region. It becomes like this.
  • the compound represented by the following formula (3) binds to a nucleophilic biomolecule such as a protein and stays in the low oxygen region for a while, so that the low oxygen region can be visualized.
  • the compound represented by the following formula (3) is excreted outside the body by metabolism after a certain period of time.
  • R 5 each independently represents NO 2 , NH 2 , NO, or NHOH. However, not all of R 5 become NO 2 at the same time. ]
  • GPU-327 can visualize the hypoxic region of the eye in vivo. It was also confirmed that GPU-327 can be safely administered to a living body.
  • the dose when locally administering GPU-327 may be, for example, 0.1 to 1000 ⁇ g.
  • the dose when GPU-327 is administered by vitreous injection, the dose may be, for example, 0.1-50 ⁇ g, for example, 0.1-10 ⁇ g.
  • the dose when the GPU-327 is systemically administered, the dose may be, for example, 1 to 500 mg / 60 kg body weight, for example, 1 to 200 mg / 60 kg.
  • the normoxic region means a region where oxygen in a concentration corresponding to the concentration of oxygen in contact with cells in culture in a normal atmosphere having an oxygen concentration of about 20% is present.
  • the low oxygen region means a region having a lower oxygen concentration than the normal oxygen region.
  • “hypoxic region” means a region where the amount of oxygen present is less than that required for cell survival or healthy functioning of the cell.
  • hypoxia-related eye diseases examples include diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity, retinal vascular occlusion, macular degeneration, glaucoma and the like.
  • the diagnostic agent of this embodiment may be administered systemically or locally. In the case of local administration, the amount of diagnostic agent required is small, and the risk of side effects such as anaphylactic shock can be reduced.
  • topical administration include vitreous injection. That is, the diagnostic agent of this embodiment may be for vitreous injection. As will be described later, the inventors have clarified that the hypoxic region of the eye can be detected by administering the diagnostic agent by vitreous injection.
  • the diagnostic agent of this embodiment may be a diagnostic composition mixed with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the diagnostic agent or diagnostic composition is, for example, orally in the form of tablets, coated tablets, pills, powders, granules, capsules, solutions, suspensions, emulsions, or injections, suppositories, It can be administered parenterally in the form of a skin external preparation or the like.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include excipients, binders, disintegrants, lubricants, emulsifiers, stabilizers, diluents, thickeners, wetting agents, pH adjusters, for injections A solvent etc. are mentioned.
  • excipients include organic excipients and inorganic excipients.
  • examples of the organic excipient include sugar derivatives such as lactose and sucrose; starch derivatives such as corn starch and potato starch; cellulose derivatives such as crystalline cellulose; gum arabic and the like.
  • examples of the inorganic excipient include sulfates such as calcium sulfate.
  • binder examples include the above-mentioned excipients, gelatin, polyvinyl pyrrolidone, polyethylene glycol and the like.
  • disintegrant examples include the above-mentioned excipients; starch or cellulose derivatives such as croscarmellose sodium and sodium carboxymethyl starch; and crosslinked polyvinylpyrrolidone.
  • lubricant examples include talc; stearic acid; colloidal silica; waxes such as beeswax and geirow; sulfates such as sodium sulfate; lauryl sulfates such as sodium lauryl sulfate; starch derivatives in the above-mentioned excipients and the like It is done.
  • emulsifiers include colloidal clays such as bentonite and beegum; anionic surfactants such as sodium lauryl sulfate; cationic surfactants such as benzalkonium chloride; nonionic surfactants such as polyoxyethylene alkyl ether; stearin And (poly) glyceryl fatty acid ester surfactants such as polyglyceryl acid-10, polyglyceryl-10 distearate, polyglyceryl tristearate, and polyglyceryl-10 pentastearate.
  • colloidal clays such as bentonite and beegum
  • anionic surfactants such as sodium lauryl sulfate
  • cationic surfactants such as benzalkonium chloride
  • nonionic surfactants such as polyoxyethylene alkyl ether
  • stearin And (poly) glyceryl fatty acid ester surfactants such as polyglyceryl acid-10, polyglyceryl-10 distearate, poly
  • the stabilizer examples include parahydroxybenzoates such as methylparaben and propylparaben; alcohols such as chlorobutanol; and phenols such as phenol and cresol.
  • Diluents include water, ethanol, propylene glycol and the like.
  • thickener examples include xanthan gum, sodium alginate, polyvinyl alcohol, hydroxyethyl cellulose, sodium polyacrylate, carrageenan, sodium carboxymethyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone and the like.
  • wetting agent examples include sorbit, glycerin, concentrated glycerin, ethylene glycol, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, polyethylene glycol, and polypropylene glycol.
  • pH adjuster examples include phthalic acid, phosphoric acid, citric acid, succinic acid, acetic acid, fumaric acid, malic acid, carbonic acid and their potassium salts, sodium salts or ammonium salts, sodium hydroxide and the like.
  • Examples of the solvent for injection include water, ethanol, glycerin and the like.
  • the diagnostic agent or diagnostic composition of the present embodiment contains a low oxygen fluorescent probe as an active ingredient.
  • “containing as an active ingredient” is not particularly limited as long as the diagnostic agent or diagnostic composition of the present embodiment contains a low oxygen fluorescent probe to such an extent that the effect of the present invention is exhibited. It means that the content of the low oxygen fluorescent probe contained in the diagnostic agent or diagnostic composition is 0.001 to 20% by mass, for example, 0.01 to 10% by mass.
  • the administration method of the diagnostic agent or the diagnostic composition is not particularly limited, and may be appropriately determined according to the patient's symptoms, weight, age, sex, and the like.
  • tablets, coated tablets, pills, powders, granules, capsules, solutions, suspensions, emulsions and the like are administered orally.
  • Injectables are administered alone or mixed with normal fluids such as glucose and amino acids, and administered intravenously, and further, administered as necessary, intraarterial, intramuscular, intradermal, subcutaneous, intraperitoneal, or vitreous. Is done. Suppositories are administered rectally.
  • the external preparation for skin is applied, affixed or sprayed on the affected area.
  • the dose of the diagnostic agent or diagnostic composition varies depending on the patient's symptoms, body weight, age, sex, etc., and cannot be determined unconditionally.
  • the dosage is 1 to 500 mg / 60 kg body weight per dosage unit form.
  • An active ingredient low oxygen fluorescent probe
  • an active ingredient of 1 to 500 mg / 60 kg body weight may be administered per dosage unit form.
  • an active ingredient of 1 to 500 mg / 60 kg body weight may be administered per dosage unit form.
  • 1 to 50 ⁇ g of active ingredient may be administered per dosage unit form, for example, 1 to 10 ⁇ g of active ingredient may be administered.
  • an active ingredient of 1 to 500 mg / 60 kg body weight may be administered per dosage unit form.
  • an external preparation for skin for example, an active ingredient of 1 to 500 mg / 60 kg body weight may be administered per dosage unit form.
  • composition for treatment of hypoxia-related eye diseases comprising the above-described diagnostic agent or diagnostic composition and an angiogenesis inhibitor as active ingredients.
  • the diagnosis and treatment of hypoxia-related eye diseases can be performed simultaneously by administering the therapeutic composition of this embodiment to a patient.
  • the change in fluorescence characteristics of the low oxygen fluorescent probe contained in the therapeutic composition of the present embodiment under low oxygen conditions may be reversible or irreversible.
  • the change in fluorescence characteristics of the low oxygen fluorescent probe is reversible, the hypoxic environment is improved, and the fluorescence characteristics change when approaching the normoxic environment, so monitor the change in oxygen concentration over time. Can do. Therefore, by observing the fluorescence of the hypoxic fluorescent probe, it can be evaluated whether the hypoxic environment of the patient's eye has improved, that is, whether the therapeutic effect has been achieved.
  • angiogenesis inhibitors examples include VEGF capture substances, VEGF receptor antagonists, VEGF receptor kinase inhibitors, angiostatin, endostatin, fumagillin, fumagillol derivatives, angiogenesis-inhibiting steroids, and the like.
  • VEGF-capturing substance examples include anti-VEGF antibodies such as Lucentis (ranibizumab) and Avastin (bevacizumab); aptamers such as macugen (pegaptanib sodium); fusion proteins such as Eilea and the like.
  • anti-VEGF antibodies such as Lucentis (ranibizumab) and Avastin (bevacizumab); aptamers such as macugen (pegaptanib sodium); fusion proteins such as Eilea and the like.
  • fumagillol derivatives include O-monochloroacetylcarbamoyl fumagillol, O-dichloroacetylcarbamoyl fumagillol, and the like.
  • the therapeutic composition of the present embodiment may be administered systemically or locally.
  • topical administration the amount of the therapeutic composition required is small, and the risk of side effects such as anaphylactic shock can be reduced.
  • topical administration include vitreous injection. That is, the therapeutic composition of the present embodiment may be for vitreous injection.
  • Examples of the dosage form and administration method of the therapeutic composition of this embodiment include those similar to the diagnostic agent or diagnostic composition of the above embodiment.
  • the dose of the therapeutic composition of the present embodiment can be appropriately set within the range where the effects of the contained low oxygen fluorescent probe and angiogenesis inhibitor are exerted.
  • the present invention provides a method for detecting a hypoxic region of an eye in vivo comprising administering a hypoxic fluorescent probe to the eye.
  • administration of the hypoxic fluorescent probe may be performed by vitreous injection.
  • the low oxygen fluorescent probe the same compounds as those described above can be used.
  • the present invention provides a method of diagnosing hypoxia-related eye disease in vivo comprising administering a hypoxic fluorescent probe to the eye.
  • administration of the hypoxic fluorescent probe may be performed by vitreous injection.
  • the low oxygen fluorescent probe the same compounds as those described above can be used.
  • the present invention provides a method for treating hypoxia-related eye diseases, comprising administering a hypoxia fluorescent probe and an angiogenesis inhibitor to the eye.
  • a hypoxia fluorescent probe and an angiogenesis inhibitor in the treatment method of the present embodiment, the same compound as described above can be used as the low oxygen fluorescent probe.
  • an angiogenesis inhibitor the thing similar to what was mentioned above can be used.
  • the present invention provides a hypoxic fluorescent probe for diagnosis of hypoxia-related eye diseases.
  • the same compound as described above can be used as the low oxygen fluorescent probe.
  • the present invention provides a composition for the treatment of hypoxia-related eye diseases, comprising a hypoxic fluorescent probe and an angiogenesis inhibitor as active ingredients.
  • a hypoxic fluorescent probe comprising a hypoxic fluorescent probe and an angiogenesis inhibitor as active ingredients.
  • an angiogenesis inhibitor the thing similar to what was mentioned above can be used.
  • the present invention provides the use of a hypoxic fluorescent probe to produce a diagnostic agent for hypoxia-related eye disease.
  • a hypoxic fluorescent probe to produce a diagnostic agent for hypoxia-related eye disease.
  • the same compound as described above can be used as the low oxygen fluorescent probe.
  • the present invention provides the use of a hypoxic fluorescent probe and an angiogenesis inhibitor for the manufacture of a composition for the treatment of hypoxia-related eye diseases.
  • a hypoxic fluorescent probe and an angiogenesis inhibitor for the manufacture of a composition for the treatment of hypoxia-related eye diseases.
  • the same compound as described above can be used as the low oxygen fluorescent probe.
  • an angiogenesis inhibitor the thing similar to what was mentioned above can be used.
  • GPU-327 was synthesized according to the following reaction scheme (I). Details of each synthesis step will be described below. In the following description, each compound numbered 1 to 9 corresponds to each compound numbered 1 to 9 in Reaction Scheme (I).
  • EPC Vascular endothelial progenitor cells
  • HUVEC umbilical vein endothelial cells
  • EPC was isolated from umbilical cord blood and cultured in Iskov modified Dulbecco medium (IMDM medium) containing 10% fetal bovine serum (FBS) and basic fibroblast growth factor (b-FGF).
  • IMDM medium Iskov modified Dulbecco medium
  • FBS fetal bovine serum
  • b-FGF basic fibroblast growth factor
  • GPU-327 with final concentrations of 0.5, 1.0, and 1.5 ⁇ M was added to EPC and HUVEC media, and cultured in an environment with oxygen concentrations of 1%, 5%, and 20% for 6 hours. Subsequently, each cell was washed with a phosphate buffer (PBS) to remove unbound GPU-327.
  • PBS phosphate buffer
  • FIGS. 1A is a photograph of fluorescence detected in EPC under each condition.
  • 1B to 1D are graphs showing the fluorescence intensity of FIG. 1A.
  • FIG. 1E is a photograph in which fluorescence in HUVEC was detected under each condition.
  • 1F to H are graphs showing the fluorescence intensity of FIG. 1E.
  • “*” In FIGS. 1B to 1D and F to H indicates that there is a significant difference at a risk rate of less than 5%.
  • Data were analyzed using Student's t-test and paired t-test. When comparing multiple groups, one-way analysis of variance (one-way ANOVA) and Bonferroni's multiple comparisons were used.
  • statistical analysis was performed using software (trade name “StatView ver. 5.0”, SAS). In the graph, error bars on the y axis indicate standard deviation.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • HIF hypoxia inducible factor
  • a sense primer (5′-AGATGAGCTCTCTACAGCACACAAC-3 ′, SEQ ID NO: 1) and an antisense primer (5′-AGGAACTTACCGGGATTTCTG-3 ′, SEQ ID NO: 2) were used.
  • the expression level of HIF-1 ⁇ was measured by Western blotting.
  • FIG. 2A is a graph showing the expression level of VEGF mRNA in each cell.
  • FIG. 2B is a photograph showing the results of Western blotting in which the expression of HIF-1 ⁇ protein and lamin B protein in each cell was detected.
  • FIG. 2C is a graph of the protein expression level of FIG. 2B. “*” In FIGS. 2A and 2C indicates that there is a significant difference at a risk rate of less than 5%.
  • FIG. 3A is a photograph showing a flap ischemia mouse model. As shown in FIG. 3A, peninsular incisions (3 cm ⁇ 2 cm) were made on the back surface of the mice. Thereby, blood circulation exists only on one side of the incision, and an ischemic gradient is generated. Two days after the incision, mice were administered GPU-327 by tail vein administration, and the fluorescence of GPU-327 was observed using a human fundus camera (model “RC-2”, Kowa).
  • FIG. 3B is a photograph taken without a fluorescent filter
  • FIG. 3C is a photograph showing a fluorescent image using the fluorescent filter.
  • the retinal artery can be occluded to create a local hypoxic state in the retina.
  • a retinal artery occlusion mouse model was prepared.
  • the mouse was anesthetized and the pupil was expanded. Subsequently, 40 mg / kg Rose Bengal (Nacalai Tesque) was administered into the tail vein, a glass cover was placed on the cornea, and a slit lamp krypton laser delivery system (model “MC-7000”, Nidek) was used. Laser light was irradiated to occlude the retinal artery. Rose Bengal has a maximum peak absorption wavelength of 550 nm. The size of the laser spot was about 50 ⁇ m. The laser power was about 50 mW. The interval between laser pulses was 3 seconds. In order to stop the blood flow, it was necessary to irradiate the laser beam 2 to 3 times. In each eye, one artery was occluded.
  • the nucleus of the extracted eye cell was stained with 4 ', 6'-diamino-2-phenylindole (DAPI), and the cross section was observed with a fluorescence microscope (BZX700, KEYENCE). Further, the fluorescence of GPU-327 was observed using a fluorescence microscope (BZX700, KEYENCE).
  • DAPI 6'-diamino-2-phenylindole
  • FIG. 4A is a photograph showing the results of observation of fluorescence of GPU-327 in vivo. Fluorescence enhancement was observed only around the occluded artery, and this method revealed that the hypoxic region of the eye can be directly detected in vivo.
  • FIG. 4B is a photograph showing the results of in vitro observation of the blood vessel structure of the retina of the eye observed in FIG. 4A.
  • FIG. 4C is a photograph showing the result of observation of fluorescence of GPU-327 in the same sample as FIG. 4B.
  • FIG. 4D is a photograph integrating the fluorescent images of FIGS. 4B and 4C.
  • FIG. 4E is a photograph showing the result of in vitro observation of a cross section of a model eye produced by the same experimental method as in FIGS. 4A to 4D.
  • FIG. 4F is a photograph showing the result of observation of fluorescence of GPU-327 in the same sample as FIG. 4E.
  • FIG. 4G is a photograph integrating the fluorescence images of FIGS. 4E and 4F. From this result, it was confirmed that the result of detecting the hypoxic region of the eye in vivo is consistent with the result of detecting in vitro.
  • the retinal vein of the mouse was irradiated with laser light to close the retinal vein, and a mouse model of retinal vein occlusion was prepared.
  • a mouse model of retinal vein occlusion was prepared.
  • GPU-327 was administered by vitreous injection.
  • fluorescence of GPU-327 was observed in vivo using a fundus lens (model “28D”, Volk) and a human fundus camera (model “RC-2”, Kowa).
  • the eyes were removed and observed in vitro. More specifically, the retinal vasculature of the removed eye was stained with fluorescently labeled isolectin B4, flat-mounted, and observed with a fluorescence microscope.
  • FIG. 5A is a photograph showing the results of observation of fluorescence of GPU-327 in vivo. Compared with the arterial occlusion model in which only one artery was occluded, a broader hypoxic region was observed in the venous occlusion model in which 3 to 5 veins were occluded in each eye. It has been shown that this method can directly detect the hypoxic region of the eye in vivo.
  • FIG. 5B is a photograph showing the result of in vitro observation of the blood vessel structure of the retina of the eye observed in FIG. 5A.
  • FIG. 5C is a photograph showing the result of observation of fluorescence of GPU-327 in the same sample as FIG. 5B.
  • FIG. 5D is a photograph in which the fluorescence images of FIGS. 5B and 5C are integrated. From this result, it was confirmed that the result of detecting the hypoxic region of the eye in vivo is consistent with the result of detecting in vitro.
  • GPU-327 can accurately detect the hypoxic region in the eyes of a mouse model of occlusion of the retinal vein.
  • FIG. 6A is a photograph showing the result of observing a cross section of the eye in vitro.
  • FIG. 6B is a photograph showing the result of observation of fluorescence of GPU-327 in the same sample as FIG. 6A.
  • FIG. 6C is a photograph in which the fluorescence images of FIGS. 6A and B are integrated.
  • Fluorescence intensity was increased in the eyeball on the side ligated to the internal carotid artery, but no increase in fluorescence was observed in the eyeball on the side not ligated. In the cross section, the entire eyeball was pale and fluorescence was enhanced. In particular, strong fluorescence enhancement was observed in the optic nerve. It was revealed that GPU-327 injected into the vitreous body reaches the deep part of the eyeball such as the choroid and optic nerve.
  • Example 8 (Application of GPU-327 to mouse model of retinopathy of prematurity) GPU-327 was applied to a mouse model of retinopathy of prematurity.
  • the mouse model of retinopathy of prematurity is that the growth of retinal blood vessels is stopped by rearing young mice on the 7th day of life, whose retinal blood vessels have not been completed, to the 12th day under the condition of oxygen concentration of 75%. This is a model in which relative ischemia occurs after returning to the normoxic condition again after the 12th day after birth, and then retinal neovascularization is observed.
  • a mouse model of retinopathy of prematurity 6 hours after returning to normoxic condition on the 12th day of birth was treated with 0.832, 1.664, 3.328 ⁇ g / g.
  • Body weight GPU-327 was injected into the tail vein.
  • the dose of 0.832 ⁇ g / g body weight corresponds to twice the amount of 25 mg / 60 kg body weight, which is the ICG dose in the human fluorescent fundus imaging method.
  • doses of 1.664 and 3.328 ⁇ g / g body weight correspond to 4 times and 8 times the dose of ICG in the human fluorescent fundus imaging method, respectively.
  • FIG. 7A is a photograph showing the result of fluorescence observation. As a result, an increase in fluorescence intensity was observed depending on the dose of GPU-327.
  • FIG. 7B is a photograph showing the result of fluorescence observation.
  • FIG. 7C is a graph of the fluorescence intensity detected in FIG. 7B. “*” In FIG. 7C indicates that there is a significant difference when the risk rate is less than 1%.
  • GPU-327 can accurately detect a hypoxic region in the eyes of a mouse model of retinopathy of prematurity.
  • a contact lens (trade name “transquater lens”, Volk) is used instead of the cover glass, the laser spot size is set to about 125 ⁇ m, the laser power is set to 150 to 300 mW, and the interval between the laser pulses is set.
  • a retinal vein occlusion rabbit model was prepared in the same manner as the retinal artery occlusion mouse model described above except that only one main vein was occluded for 0.5 seconds.
  • 8A, 8B and 8C are photographs obtained by photographing the fundus using a fundus camera 2 days, 1 week and 2 weeks after retinal vein occlusion.
  • 8D, 8E and 8F are photographs showing the results of observation of fluorescence of GPU-327 in vivo using a fundus camera 2 days, 1 week and 2 weeks after retinal vein occlusion.
  • FIG. 8A retinal vein angulation occurred immediately after laser irradiation, and mild retinal hemorrhage was observed 2 days after retinal vein occlusion as in human retinal vein occlusion. It was thought that. Further, as shown in FIG. 8B, whitening of the retina on the side irradiated with the laser around the optic nerve was observed one week after the retinal vein occlusion. An increase in GPU-327 fluorescence was observed only on the laser-irradiated side of the eye, and GPU-327 fluorescence was observable up to 2 weeks after retinal vein occlusion. In the vitreous cavity, no increase in GPU-327 fluorescence was observed.
  • GPU-327 has sufficient detection performance in a low oxygen region. It was also shown that GPU-327 changes to a fluorescent form after being taken into the retina.
  • Example 10 Fluorescence fundus angiography of rabbit model with occlusion of retinal vein
  • fluorescein fluorescent fundus angiography of a rabbit model of retinal vein occlusion 2 weeks after retinal vein occlusion in Experimental Example 9 was performed.
  • FIG. 9 is a photograph showing the results of fluorescence fundus imaging. As a result, neovascularization, fluorescence leakage, and avascular field were observed.
  • Example 11 Comparison between GPU-327 and pimonidazole in detection of hypoxia in the retina of a rabbit model with retinal vein occlusion
  • the hypoxic region in the eye of the rabbit model of retinal vein occlusion 2 days after the retinal vein occlusion in Experimental Example 9 was stained with GPU-327 and pimonidazole for comparison.
  • Dyeing with pimonidazole was performed as follows. First, rabbits 90 minutes before sacrifice were injected with 50 ⁇ L (60 mg / kg body weight) of 400 ⁇ M pimonidazole hydrochloride (Millipore). Subsequently, after killing the rabbit, the eyeball was removed and fixed with 4% paraformaldehyde. Subsequently, the eyeball whole mount was stained at room temperature for 1 hour using a FITC-labeled anti-pimonidazole antibody diluted 50 times with a blocking solution. Counterstaining was also performed using TRITC-labeled isolectin B4.
  • FIG. 10A is a photograph of detecting fluorescence of GPU-327 in vivo.
  • FIG. 10B is a photograph of the fundus of the eye observed in FIG. 10A.
  • FIG. 10C is a photograph of a fluorescent image showing the result of in vitro observation of the blood vessel structure of the eye retina observed in FIG. 10A by staining with isolectin B4.
  • FIG. 10D is a photograph of a fluorescent image showing the result of staining with pimonidazole in the same sample as FIG. 10C.
  • FIG. 10E is a photograph in which the fluorescence images of FIGS. 10C and 10D are integrated. The arrows in FIGS. 10C, D, and E indicate the occlusion site of the retinal vein.
  • the fluorescence of GPU-327 was observed not only in the vicinity of the retinal vein occlusion site but also in a wider range.
  • FIG. 10D in the staining with pimonidazole, only the periphery of the retinal vein occlusion site was stained.
  • Pimonidazole is said to be able to detect a hypoxic region with an oxygen concentration of about 1%.
  • the result of this Experimental Example shows that GPU-327 can detect a hypoxic region that is milder than pimonidazole. Indicates that there is.
  • the pupil was dilated, dark adaptation was performed for at least 1 hour in a state of general anesthesia and local anesthesia, and rabbit electroretinogram was measured in a dark room.
  • the electroretinogram measurement was performed as follows. First, a contact lens electrode with built-in white light emitting diode (model “LW-102”, Mayo) was attached to the cornea of both eyes, and a ground electrode was attached to the ear. Subsequently, electroretinograms of both eyes were simultaneously measured using an electroretinogram measuring apparatus (model “LE-3000”, Tome). The frequency band was set to 0.3 to 300 Hz.
  • the stimulus brightness was set at 360, 3000 and 20000 cd / m 2 and the duration was set at 1 millisecond. Electroretinogram measurements began with the weakest stimulus after at least one hour of dark adaptation. No background light was used. At each light intensity, four stimulations were performed and the average value was calculated.
  • PBS or GPU-327 was administered to only one eye of the rabbit by vitreous injection.
  • the dose of PBS was 50 ⁇ L.
  • the dosage of GPU-327 was 50 ⁇ L of a 0.2 ⁇ g / ⁇ L solution. None was administered to the other eye and served as a control.
  • FIG. 11A is a graph showing an electroretinogram 60 days after administration of PBS or GPU-327. As a result, normal electroretinogram patterns such as a wave and b wave were observed in both the PBS administration group and the GPU-327 administration group.
  • FIG. 11B is a graph showing the ratio of the amplitude of PBS administration versus control or GPU-327 administration versus control for the a wave measured at each stimulus luminance.
  • FIG. 11C is a graph showing the ratio of amplitude versus PBS or GPU-327 administration versus control for b waves measured at each stimulus luminance. There was no significant difference in electroretinogram between the PBS administration group and the GPU-327 administration group.
  • FIG. 11D is an optical micrograph of the eye of the GPU-327 administration group
  • FIG. 11E is an optical micrograph of the eye of the PBS administration group.
  • a diagnostic agent capable of directly detecting the hypoxic region of the eye in vivo can be provided.
  • the therapeutic composition which can implement simultaneously a diagnosis and treatment of a hypoxia related eye disease can be provided.

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Abstract

　低酸素蛍光プローブを有効成分として含有する、低酸素関連眼疾患のインビボ用診断薬は、インビボで眼の低酸素領域を直接検出することが可能であり有用である。

Description

低酸素関連眼疾患のインビボ用診断薬及び治療用組成物
　本発明は、低酸素関連眼疾患のインビボ用診断薬及び治療用組成物に関する。本願は、２０１４年９月３０日に、日本に出願された特願２０１４－２００３９７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　生体組織中の低酸素領域の存在は、各種の眼疾患、癌の悪性化等に関わっていることが知られている。
　生体組織中の低酸素領域の検出用試薬としては、２－ニトロイミダゾール系の化合物であるピモニダゾール（ｐｉｍｏｎｉｄａｚｏｌｅ）が広く利用されている。ピモニダゾールを用いた低酸素領域の検出は、ピモニダゾールが低酸素状態の細胞に結合することを利用して行う。より具体的には、まず、ピモニダゾールを生体に投与する。すると、ピモニダゾールが低酸素状態の細胞に結合する。続いて、対象組織をホルマリン固定等により固定した標本を作製し、抗ピモニダゾール抗体で染色し、低酸素状態の細胞に結合したピモニダゾールを検出する。これにより、低酸素領域を観察することが可能になる。しかしながら、ピモニダゾールを用いて低酸素領域を検出するためには、対象組織を固定する必要があり、インビボで低酸素領域を検出することはできない。
　そこで、インビボで低酸素領域を検出することができる蛍光プローブの開発が行われている。例えば、特許文献１には、近赤外蛍光色素と、低酸素領域で還元的代謝により活性化されて求核性の生体分子と結合する低酸素結合部位と、リンカー結合とからなることを特徴とする低酸素領域イメージング用近赤外蛍光プローブが記載されている。
　低酸素関連眼疾患における低酸素状態を推測する方法として、現在、蛍光眼底造影による間接的な評価が行われている。蛍光眼底造影は、蛍光物質であるフルオレセインを点滴で患者に投与して、眼底カメラで眼底の血管を撮影する方法である。この方法は、５０年以上の歴史のある古い検査方法であるが、その有用性により眼科診療において欠かすことのできないものとなっている。
　同様の蛍光眼底造影方法として、蛍光物質であるインドシアニングリーン（ＩＣＧ）を点滴で患者に投与して、眼底カメラで眼底の血管を撮影する方法が知られている。インドシアニングリーンは近赤外領域の蛍光を発する蛍光物質であることから、インドシアニングリーンの蛍光と生体が発する自家蛍光との区別が容易である。また、近赤外光は生体組織透過性が高いことから、インドシアニングリーンにより、脈絡膜等の組織のより深い領域を観察することが可能である。
特開２０１０－２０３９６６号公報
　しかしながら、蛍光眼底造影では、低酸素関連眼疾患が末期にまで進行し、毛細血管の閉塞が発生して初めて無血管野や新生血管が観察され、低酸素領域の存在を推測評価することが可能となる。このため、低酸素関連眼疾患の初期～中期の低酸素領域を直接評価することはできない。また、蛍光眼底造影では、約２０万人に１人の割合でアナフィラキシーショックにより死亡するという重篤な副作用が存在することが大きな問題となっている。
　また、特許文献１に記載された低酸素領域イメージング用近赤外蛍光プローブは、蛍光のｏｎ－ｏｆｆ機能を持たず常に発光していることから、バックグランドが高く、シグナル検出までに時間がかかる場合があった。
　このような背景のもと、本発明は、インビボで眼の低酸素領域を直接検出することが可能な診断薬を提供することを目的とする。本発明はまた、低酸素関連眼疾患の診断と治療を同時に実施することが可能な治療用組成物を提供することを目的とする。
　本発明は以下の通りである。
［１］低酸素蛍光プローブを有効成分として含有する、低酸素関連眼疾患のインビボ用診断薬。
［２］硝子体注射用である、［１］に記載の診断薬。
［３］前記低酸素蛍光プローブが下記式（１）で表される化合物である、請求項１又は２に記載の診断薬。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 ［式（１）中、Ｒ１はそれぞれ独立にＨ、ＣＯＯＨ、ＳＯ３ －、又は炭素数１～３のアルコキシ基を表し、Ｒ２は存在しないか又は炭素数１～１０の直鎖若しくは分岐鎖状のアルキル基を表し、Ｒ３は電子吸引性置換基を表し、Ｒ４はアルキル基、－（ＣＨ２）ＡＣＯＯ－、－（ＣＨ２）ＡＳＯ３ －、又は－（ＣＨ２）ＡＯ－を表し、Ｘ－は存在しないか又はＣｌ－、Ｂｒ－、Ｉ－、若しくはＰＦ６－を表し、ｎは１～４の整数を表し、Ａは１～６の整数を表す。］
［４］前記低酸素蛍光プローブが下記式（２）で表される化合物である、請求項１～３のいずれか一項に記載の診断薬。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 ［５］［１］～［４］のいずれかに記載の診断薬と、血管新生阻害剤とを有効成分として含有する、低酸素関連眼疾患の治療用組成物。
［６］前記血管新生阻害剤が血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）捕捉物質である、［５］に記載の治療用組成物。
［７］前記ＶＥＧＦ捕捉物質が抗ＶＥＧＦ抗体である、［６］に記載の治療用組成物。
　本発明により、インビボで眼の低酸素領域を直接検出することが可能な診断薬を提供することができる。また、低酸素関連眼疾患の診断と治療を同時に実施することが可能な治療用組成物を提供することができる。
終濃度０．５、１．０及び１．５μＭの低酸素蛍光プローブ（ＧＰＵ－３２７）の存在下、及び酸素濃度１％、５％及び２０％の環境下で培養した血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）における蛍光を検出した写真である。 図１Ａの蛍光強度をグラフにしたものである。 図１Ａの蛍光強度をグラフにしたものである。 図１Ａの蛍光強度をグラフにしたものである。 終濃度０．５、１．０及び１．５μＭのＧＰＵ－３２７の存在下、及び酸素濃度１％、５％及び２０％の環境下で培養した臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の蛍光を検出した写真である。 図１Ｅの蛍光強度をグラフにしたものである。 図１Ｅの蛍光強度をグラフにしたものである。 図１Ｅの蛍光強度をグラフにしたものである。 ＶＥＧＦのｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。 ＨＩＦ－１αタンパク質及びラミンＢタンパク質の発現を検出したウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。 図２Ｂのタンパク質発現量をグラフにしたものである。 皮弁虚血マウスモデルを示す写真である。 図３Ａと同一のサンプルにおける蛍光フィルター無しでの蛍光観察の結果を示す写真である。 図３Ａと同一のサンプルにおける蛍光フィルター付きでの蛍光観察の結果を示す写真である。 網膜動脈閉塞マウスモデルにおけるインビボでＧＰＵ－３２７の蛍光を観察した結果を示す写真である。 図４Ａで観察した眼の網膜の血管構造をインビトロで観察した結果を示す写真である。 図４Ｂと同一のサンプルにおける、ＧＰＵ－３２７の蛍光を観察した結果を示す写真である。 図４Ｂ及び図４Ｃの蛍光像を統合した写真である。 図４Ａ～Ｄと同一の実験方法で作製したモデルの眼の横断切片をインビトロで観察した結果を示す写真である。 図４Ｅと同一のサンプルにおける、ＧＰＵ－３２７の蛍光を観察した結果を示す写真である。 図４Ｅ及び図４Ｆの蛍光像を統合した写真である。 網膜静脈閉塞マウスモデルにおけるインビボでＧＰＵ－３２７の蛍光を観察した結果を示す写真である。 図５Ａで観察した眼の網膜の血管構造をインビトロで観察した結果を示す写真である。 図５Ｂと同一のサンプルにおける、ＧＰＵ－３２７の蛍光を観察した結果を示す写真である。 図５Ｂ及びＣの蛍光像を統合した写真である。 脈絡膜虚血マウスモデルにおける眼の横断切片をインビトロで観察した結果を示す写真である。 図６Ａと同一のサンプルにおける、ＧＰＵ－３２７の蛍光を観察した結果を示す写真である。 図６Ａ及びＢの蛍光像を統合した写真である。 未熟児網膜症マウスモデルにおけるインビボでＧＰＵ－３２７の蛍光の濃度依存性を観察した結果を示す写真である。 未熟児網膜症マウスモデルにおけるインビボでＧＰＵ－３２７の蛍光の時間依存性を観察した結果を示す写真である。 図７Ｂにおいて検出された蛍光強度をグラフにしたものである。 網膜静脈閉塞から２日後に眼底カメラを用いて眼底を撮影した写真である。 網膜静脈閉塞から１週間後に眼底カメラを用いて眼底を撮影した写真である。 網膜静脈閉塞から２週間後に眼底カメラを用いて眼底を撮影した写真である。 網膜静脈閉塞から２日後に眼底カメラを用いてインビボでＧＰＵ－３２７の蛍光を観察した結果を示す写真である。 網膜静脈閉塞から１週間後に眼底カメラを用いてインビボでＧＰＵ－３２７の蛍光を観察した結果を示す写真である。 網膜静脈閉塞から２週間後に眼底カメラを用いてインビボでＧＰＵ－３２７の蛍光を観察した結果を示す写真である。 網膜静脈閉塞ウサギモデルにおけるフルオレセインの蛍光眼底造影の結果を示す写真である。 網膜静脈閉塞ウサギモデルにおけるインビボでＧＰＵ－３２７の蛍光を検出した写真である。 図１０Ａで観察した眼の眼底を撮影した写真である。 図１０Ａで観察した眼の網膜の血管構造をインビトロで観察した結果を示す写真である。矢印は、網膜静脈の閉塞部位を示す。 図１０Ｃと同一のサンプルにおける、ピモニダゾールによる染色の結果を示す写真である。矢印は、網膜静脈の閉塞部位を示す。 図１０Ｃ及びＤの蛍光像を統合した写真である。矢印は、網膜静脈の閉塞部位を示す。 ＰＢＳ又はＧＰＵ－３２７の投与から６０日後の網膜電図を示すグラフである。 各刺激輝度において測定されたａ波について、振幅のＰＢＳ投与対対照、又はＧＰＵ－３２７投与対対照の比を示すグラフである。 各刺激輝度において測定されたｂ波について、振幅のＰＢＳ投与対対照、又はＧＰＵ－３２７投与対対照の比を示すグラフである。 はＧＰＵ－３２７投与群の眼の光学顕微鏡写真である。 ＰＢＳ投与群の眼の光学顕微鏡写真である。
［低酸素関連眼疾患の診断薬］
　１実施形態において、本発明は、低酸素蛍光プローブを有効成分として含有する、低酸素関連眼疾患のインビボ用診断薬を提供する。
　従来、インビボで眼の低酸素領域を可視化する手法は存在しなかった。これに対し、発明者らは、低酸素蛍光プローブを眼に適用することにより、インビトロ及びインビボの双方において、眼の低酸素領域を検出し、低酸素関連眼疾患の診断を行うことが可能であることを初めて明らかにした。
　本実施形態の診断薬によれば、インビトロだけでなく、インビボにおいても眼の低酸素領域を直接検出することができる。これにより、従来できなかった、低酸素関連眼疾患の初期～中期の低酸素領域の直接評価を実現することができる。
　例えば若年者糖尿病網膜症の場合、網膜症の活動性が高く、進行も早いため、治療のタイミングを逃すと新生血管緑内障等の重篤な合併症を生じ、視力予後が非常に不良となる。このような疾患においては、適切な活動性評価、つまり低酸素状態の評価が非常に重要である。疾患の初期～中期の低酸素領域の状態を直接評価することにより、より低侵襲の早期治療を行うことができる。
　また、近年、失明の主要な原因である緑内障や強度近視による黄斑変性症等の疾患と、血流の低下との関連が指摘されている。本実施形態の診断薬を使用して眼の低酸素領域をインビボで観察することにより、これらの疾患の原因究明にも寄与できることが期待される。
（低酸素蛍光プローブ）
　低酸素蛍光プローブとは、常酸素環境下と低酸素環境下において蛍光特性が変化する化合物である。低酸素蛍光プローブとしては、ヒトや動物に対する毒性が許容範囲内であれば特に限定されず、例えば、低酸素条件下の生体内における還元代謝によって蛍光特性が大きく変化する化合物が挙げられる。
　低酸素蛍光プローブが発する蛍光の波長は特に限定されないが、近赤外領域（波長６５０～１０００ｎｍ）の蛍光であることが好ましい。近赤外蛍光は、生体が発する自家蛍光との区別が容易である。また、近赤外光は、生体組織への透過性が高く、生体内物質による吸収も限られている。
　近赤外蛍光を発する低酸素蛍光プローブとしては、例えば、シアニン系色素誘導体、ＢＯＤＩＰＹ系色素誘導体等が挙げられる。
　低酸素蛍光プローブの低酸素条件下における蛍光特性の変化は、可逆的であっても不可逆的であってもよい。低酸素蛍光プローブの蛍光特性の変化が可逆的である場合には、低酸素環境が改善され、常酸素環境に近づくと蛍光特性が変化することから、酸素濃度の経時的な変化をモニターすることも可能になる。
　より具体的な低酸素蛍光プローブとしては、例えば、下記式（１）で表される化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 ［式（１）中、Ｒ１はそれぞれ独立にＨ、ＣＯＯＨ、ＳＯ３ －、又は炭素数１～３のアルコキシ基を表し、Ｒ２は存在しないか又は炭素数１～１０の直鎖若しくは分岐鎖状のアルキル基を表し、Ｒ３は電子吸引性置換基を表し、Ｒ４はアルキル基、－（ＣＨ２）ＡＣＯＯ－、－（ＣＨ２）ＡＳＯ３ －、又は－（ＣＨ２）ＡＯ－を表し、Ｘ－は存在しないか又はＣｌ－、Ｂｒ－、Ｉ－、若しくはＰＦ６－を表し、ｎは１～４の整数を表し、Ａは１～６の整数を表す。］
　上記の電子吸引性置換基としては、ニトロ基、シアノ基、ハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン化アリール基、ハロゲン化ヘテロアリール基、含窒素ヘテロアリール基、カルボニル基、スルホニル基、ホスホリル基、アルキニル基等が挙げられる。
　低酸素蛍光プローブは、例えば、下記式（２）で表される化合物（以下、「ＧＰＵ－３２７」という場合がある。）であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　ＧＰＵ－３２７は蛍光をほとんど示さないが、生体に投与すると、低酸素領域において還元的代謝を受けて下記式（３）に示す化合物に変化して活性化され、近赤外領域の蛍光を発するようになる。また、下記式（３）に示す化合物は、タンパク質等の求核性の生体分子と結合し、低酸素領域にしばらく留まるため、低酸素領域を可視化することができる。下記式（３）に示す化合物は、一定期間経過後、代謝により体外に排泄される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 ［式（３）中、Ｒ５はそれぞれ独立にＮＯ２、ＮＨ２、ＮＯ又はＮＨＯＨを表す。但し、Ｒ５の全てが同時にＮＯ２になることはない。］
　後述するように、発明者らは、ＧＰＵ－３２７により、眼の低酸素領域をインビボで可視化することができることを明らかにした。また、ＧＰＵ－３２７を生体に投与しても安全であることを確認した。
　ＧＰＵ－３２７を局所投与する場合の投与量は、例えば０．１～１０００μｇであってよい。特に、ＧＰＵ－３２７を硝子体注射により投与する場合の投与量は、例えば０．１～５０μｇであってよく、例えば０．１～１０μｇであってよい。また、ＧＰＵ－３２７を全身投与する場合の投与量は、例えば１～５００ｍｇ／６０ｋｇ体重であってよく、例えば１～２００ｍｇ／６０ｋｇであってよい。
（常酸素領域及び低酸素領域）
　本明細書において、常酸素領域とは、酸素濃度約２０％の通常の大気中において、培地中で培養中の細胞が接している酸素の濃度に相当する濃度の酸素が存在する領域を意味する。そして、低酸素領域とは、常酸素領域よりも酸素の濃度が少ない領域を意味する。いいかえると、「低酸素領域」とは、酸素の存在量が、細胞の生存又は細胞の健全な機能に必要な量よりも少ない領域を意味する。
（低酸素関連眼疾患）
　本実施形態の診断薬で診断可能な低酸素関連眼疾患としては、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜血管閉塞症、黄斑変性症、緑内障等が挙げられる。
（剤型及び投与方法）
　本実施形態の診断薬は、全身投与してもよく、局所投与してもよい。局所投与の場合には、必要な診断薬の量がわずかで済み、アナフィラキシーショック等の副作用の危険性も低減することができる。局所投与の例としては、例えば硝子体注射が挙げられる。すなわち、本実施形態の診断薬は、硝子体注射用であってもよい。後述するように発明者らは、診断薬を硝子体注射で投与することにより、眼の低酸素領域を検出できることを明らかにした。
　本実施形態の診断薬は、薬学的に許容される担体を混合した診断用組成物であってもよい。診断薬又は診断用組成物は、例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の形態で経口的に、あるいは、注射剤、坐剤、皮膚外用剤等の形態で非経口的に投与することができる。
　薬学的に許容される担体（添加剤）としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、乳化剤、安定剤、希釈剤、増粘剤、湿潤剤、ｐＨ調整剤、注射剤用溶剤等が挙げられる。
　賦形剤としては、有機系賦形剤、無機系賦形剤等が挙げられる。有機系賦形剤としては、乳糖、白糖等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース等のセルロース誘導体；アラビアゴム等が挙げられる。無機系賦形剤としては、硫酸カルシウム等の硫酸塩が挙げられる。
　結合剤としては、上記の賦形剤、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
　崩壊剤としては、上記の賦形剤；クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム等のデンプン又はセルロースの誘導体；架橋ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
　滑沢剤としては、タルク；ステアリン酸；コロイドシリカ；ビーズワックス、ゲイロウ等のワックス類；硫酸ナトリウム等の硫酸塩；ラウリル硫酸ナトリウム等のラウリル硫酸塩；上記の賦形剤におけるデンプン誘導体等が挙げられる。
　乳化剤としては、ベントナイト、ビーガム等のコロイド性粘土；ラウリル硫酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウム等の陽イオン界面活性剤；ポリオキシエチレンアルキルエーテル等の非イオン界面活性剤；ステアリン酸ポリグリセリル－１０、ジステアリン酸ポリグリセリル－１０、トリステアリン酸ポリグリセリル－１０、ペンタステアリン酸ポリグリセリル－１０等の（ポリ）グリセリル脂肪酸エステル界面活性剤等が挙げられる。
　安定剤としては、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラヒドロキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール等のアルコール類；フェノール、クレゾール等のフェノール類が挙げられる。
　希釈剤としては、水、エタノール、プロピレングリコール等が挙げられる。
　増粘剤としては、キサンタンガム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリル酸ナトリウム、カラギナン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
　湿潤剤としては、ソルビット、グリセリン、濃グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール、１,３－ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等が挙げられる。
　ｐＨ調整剤としては、フタル酸、リン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、フマル酸、リンゴ酸、炭酸やそれらのカリウム塩、ナトリウム塩又はアンモニウム塩、水酸化ナトリウム等が挙げられる。
　注射剤用溶剤としては、水、エタノール、グリセリン等が挙げられる。
　本実施形態の診断薬又は診断用組成物は、低酸素蛍光プローブを有効成分として含有する。ここで、「有効成分として含有する」とは、本実施形態の診断薬又は診断用組成物が、本願発明の効果を奏する程度に低酸素蛍光プローブを含有していれば特に限定されないが、例えば、診断薬又は診断用組成物中に含まれる低酸素蛍光プローブの含有量が、０．００１～２０質量％であることを意味し、例えば０．０１～１０質量％であることを意味する。
　診断薬又は診断用組成物の投与方法は特に限定されず、患者の症状、体重、年齢、性別等に応じて適宜決定すればよい。例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等は経口投与される。また、注射剤は、単独で、又はブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じて、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内又は硝子体投与される。坐剤は直腸内投与される。皮膚外用剤は、患部に塗布、貼付又はスプレーされる。
　診断薬又は診断用組成物の投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、経口投与の場合には、投与単位形態あたり１～５００ｍｇ／６０ｋｇ体重の有効成分（低酸素蛍光プローブ）を投与すればよい。また、注射剤で全身投与する場合には、例えば、投与単位形態あたり１～５００ｍｇ／６０ｋｇ体重の有効成分を投与すればよい。また、硝子体注射により投与する場合には、投与単位形態あたり、例えば１～５０μｇの有効成分を投与すればよく、例えば１～１０μｇの有効成分を投与すればよい。また、坐剤の場合には、例えば、投与単位形態あたり１～５００ｍｇ／６０ｋｇ体重の有効成分を投与すればよい。また、皮膚外用剤の場合には、例えば、投与単位形態あたり１～５００ｍｇ／６０ｋｇ体重の有効成分を投与すればよい。
［低酸素関連眼疾患の治療用組成物］
　１実施形態において、本発明は、上記の診断薬又は診断用組成物と、血管新生阻害剤とを有効成分として含有する、低酸素関連眼疾患の治療用組成物を提供する。
　本実施形態の治療用組成物を患者に投与することにより、低酸素関連眼疾患の診断と治療を同時に実施することができる。
　また、上述したように、本実施形態の治療用組成物が含有する低酸素蛍光プローブの低酸素条件下における蛍光特性の変化は、可逆的であっても不可逆的であってもよい。低酸素蛍光プローブの蛍光特性の変化が可逆的である場合には、低酸素環境が改善され、常酸素環境に近づくと蛍光特性が変化することから、酸素濃度の経時的な変化をモニターすることができる。したがって、当該低酸素蛍光プローブの蛍光を観察することにより、患者の眼の低酸素環境が改善したか否か、すなわち、治療効果が奏されたか否かを評価することもできる。
（血管新生阻害剤）
　血管新生阻害剤としては、ＶＥＧＦ捕捉物質、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、ＶＥＧＦ受容体キナーゼ阻害剤、アンジオスタチン、エンドスタチン、フマギリン、フマギロール誘導体、血管新生抑制ステロイド等が挙げられる。
　ＶＥＧＦ捕捉物質としては、例えば、ルセンティス（ラニビズマブ）、アバスチン（ベバシズマブ）等の抗ＶＥＧＦ抗体；マクジェン（ペガプタニブナトリウム）等のアプタマー；アイリーア等の融合タンパク質等が挙げられる。
　フマギロール誘導体としては、例えば、Ｏ－モノクロロアセチルカルバモイルフマギロール、Ｏ－ジクロロアセチルカルバモイルフマギロール等が挙げられる。
（剤型及び投与方法）
　本実施形態の治療用組成物は、全身投与してもよく、局所投与してもよい。局所投与の場合には、必要な治療用組成物の量がわずかで済み、アナフィラキシーショック等の副作用の危険性も低減することができる。局所投与の例としては、例えば硝子体注射が挙げられる。すなわち、本実施形態の治療用組成物は、硝子体注射用であってもよい。
　本実施形態の治療用組成物の剤型及び投与方法としては、上記実施形態の診断薬又は診断用組成物と同様のものが挙げられる。また、本実施形態の治療用組成物の投与量は、含有する低酸素蛍光プローブ及び血管新生阻害剤の効果が奏される範囲において適宜設定することができる。
　１実施形態において、本発明は、低酸素蛍光プローブを眼に投与する工程を備える、眼の低酸素領域をインビボで検出する方法を提供する。本実施形態の方法において、低酸素蛍光プローブの投与は、硝子体注射により行われてもよい。また、低酸素蛍光プローブとしては、上述したものと同様の化合物を使用することができる。
　１実施形態において、本発明は、低酸素蛍光プローブを眼に投与する工程を備える、低酸素関連眼疾患をインビボで診断する方法を提供する。本実施形態の方法において、低酸素蛍光プローブの投与は、硝子体注射により行われてもよい。また、低酸素蛍光プローブとしては、上述したものと同様の化合物を使用することができる。
　１実施形態において、本発明は、低酸素蛍光プローブ及び血管新生阻害剤を眼に投与する工程を備える、低酸素関連眼疾患の治療方法を提供する。本実施形態の治療方法において、低酸素蛍光プローブとしては、上述したものと同様の化合物を使用することができる。また、血管新生阻害剤としては、上述したものと同様のものを使用することができる。
　１実施形態において、本発明は、低酸素関連眼疾患の診断のための低酸素蛍光プローブを提供する。本実施形態において、低酸素蛍光プローブとしては、上述したものと同様の化合物を使用することができる。
　１実施形態において、本発明は、低酸素関連眼疾患の治療のための組成物であって、低酸素蛍光プローブ及び血管新生阻害剤を有効成分として含有する組成物を提供する。本実施形態の組成物において、低酸素蛍光プローブとしては、上述したものと同様の化合物を使用することができる。また、血管新生阻害剤としては、上述したものと同様のものを使用することができる。
　１実施形態において、本発明は、低酸素関連眼疾患の診断薬を製造するための低酸素蛍光プローブの使用を提供する。本実施形態において、低酸素蛍光プローブとしては、上述したものと同様の化合物を使用することができる。
　１実施形態において、本発明は、低酸素関連眼疾患の治療用組成物を製造するための、低酸素蛍光プローブ及び血管新生阻害剤の使用を提供する。本実施形態において、低酸素蛍光プローブとしては、上述したものと同様の化合物を使用することができる。また、血管新生阻害剤としては、上述したものと同様のものを使用することができる。
　以下、実験例により本発明を説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
［実験例１］
（低酸素蛍光プローブの合成）
　下記式（２）で表される低酸素蛍光プローブ（以下、「ＧＰＵ－３２７」という場合がある。）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　ＧＰＵ－３２７は、下記反応スキーム（Ｉ）にしたがって合成した。以下に各合成ステップの詳細を説明する。なお、下記の説明において１～９の数字が付された各化合物は、反応スキーム（Ｉ）において１～９の数字が付された各化合物に対応する。
（３，５－Ｄｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌ（２）の合成）
　窒素雰囲気下に３，５－ジニトロ安息香酸（１，３．１９ｇ，１５．０ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ溶液（２５ｍＬ）に氷冷下撹拌しつつ０．９５Ｍボラン－ＴＨＦ錯体のＴＨＦ溶液（２０．０ｍＬ，１９．０ｍｍｏｌ）を２０分かけて注意深く滴下した。氷冷下更に９０分撹拌後、室温にて更に２２時間撹拌した。水：酢酸（１：１，１．０ｍＬ）を注意深く反応混合物に滴下して反応を停止させ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）及び水（１０ｍＬ）を更に加えたのちにクロロホルム（３０ｍＬ×３）で抽出を行った。溶媒を減圧溜去後、オレンジ色の固体が得られ、さらにシリカゲルカラムクロマトグラフィ（酢酸エチル：ｎ－ヘキサン＝３：７）にて精製し、淡黄色固体の化合物２（２．４７ｇ，８３％）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ：８．９７（ｓ，１Ｈ），８．５９（ｓ，２Ｈ），４．９７（ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，２Ｈ），２．１８（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ）．
（３，５－Ｄｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ　ｂｒｏｍｉｄｅ（３）の合成）
　３，５－ジニトロベンジルアルコール（２，１．９７ｇ，９．９４ｍｍｏｌ）のクロロホルム（２０ｍＬ）溶液に、三臭化リン（１．７ｍＬ，１７．９ｍｍｏｌ）のクロロホルム（７．３ｍＬ）溶液を１５分間かけて滴下し、その後塩化カルシウムによる防湿下に２時間加熱還流を行った。更に１６．５時間室温で撹拌後、水（３０ｍＬ）を反応混合物に注意深く加え、クロロホルム（３５ｍＬ×６）で抽出を行った。有機層をまとめて飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２００ｍＬ）及び飽和食塩水（２００ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し溶媒を減圧溜去した。得られた黄色固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（酢酸エチル：ｎ－ヘキサン＝５：９５～２０：８０）にて精製し、淡黄色結晶の化合物３（２．２５ｇ，８７％）を得た。ｍ．ｐ．９４．０－９５．５°Ｃ；１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ：８．９９（ｔ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），８．５９（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，２Ｈ），４．６１（ｓ，２Ｈ）．
（３，５－Ｄｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ　ｉｏｄｉｄｅ（４）の合成）
　３，５－ジニトロベンジルブロミド（３，２．９２ｇ，１１．２ｍｍｏｌ）のアセトン（７５ｍＬ）溶液に１０％（ｗ／ｗ）ヨウ化ナトリウムのアセトン溶液（４３．９ｍｍｏｌ，７５．０ｍＬ）を撹拌しながら７５分かけて加え、更に４時間室温にて撹拌した。水（８０ｍＬ）を反応混合物に加え、更にクロロホルム（８０ｍＬ×３）にて抽出を行った。まとめた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）にて洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。更に溶媒を減圧溜去して淡黄色固体の化合物４（３．３９ｇ，９８％）を得た。ｍ．ｐ．９０．０－９３．０°Ｃ；１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ：８．９３（ｔ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），８．５５（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，２Ｈ），４．５７（ｓ，２Ｈ）．
（５－Ｍｅｔｈｏｘｙ－２，３，３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ－３Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ（６）の合成）
　イソプロピルメチルケトン（０．６４ｍＬ，５．９７ｍｍｏｌ）と４－メトキシフェニルヒドラジン塩酸塩（５，１．０５ｇ，６．０１ｍｍｏｌ）のエタノール（２５．７ｍＬ）溶液を３時間加熱還流した。室温まで放冷後、溶媒を減圧溜去した。残渣をクロロホルム（４０ｍＬ）に溶解し、水（３０ｍＬ×２）で洗浄後、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧溜去した。茶色半固体の化合物６（１．０５ｇ，９３％）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ，）δ：７．４３（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．８５－６．８０（ｍ，２Ｈ），３．８３（ｓ，３Ｈ），２．２４（ｓ，３Ｈ），１．２９（６Ｈ，ｓ）．
（１－（３，５－Ｄｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ）－５－ｍｅｔｈｏｘｙ－２，３，３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ－３Ｈ－ｉｎｄｏｌｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ（７）の合成）
　５－メトキシ－２，３，３－トリメチル－３Ｈ－インドール（６，１８９．３ｍｇ，１．００ｍｍｏｌ）と３，５－ジニトロベンジルヨージド（４，４６２．０ｍｇ，１．５０ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（６．０ｍＬ）溶液を窒素雰囲気下に２２時間加熱還流した。室温まで放冷後、生じた沈殿を濾取し、得られた固体をアセトン（３ｍＬ×３）及びジエチルエーテル（３ｍＬ）にて洗浄した。オレンジ色固体の化合物７（３７５．４ｍｇ，７５％）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ，４００ＭＨｚ）δ：８．９２（ｔ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），８．４７（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，２Ｈ），７．５４（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．０５（ｄｄ，Ｊ＝８．９，２．７Ｈｚ，１Ｈ），５．８４（ｓ，２Ｈ），３．８８（ｓ，３Ｈ），２．８０（ｓ，３Ｈ），１．６２（ｓ，６Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ：ＣＤ３ＯＤ：ＣＤＣｌ３，１２５ＭＨｚ，）δ：１９６．１，１６０．９，１４８．０，１４３．２，１３４．５，１３２．９，１２６．８，１１８．２，１１５．７，１１４．２，１０８．４，５５．０，５４．２，４９．０，２１．２；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ１９Ｈ２０Ｎ３Ｏ５［Ｍ－Ｉ］＋＝３７０．１４０３，Ｆｏｕｎｄ，３７０．１３８４．
（５－Ｍｅｔｈｏｘｙ－１，２，３，３－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－３Ｈ－ｉｎｄｏｌｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ（８）の合成）
　５－メトキシ－２，３，３－トリメチル－３Ｈ－インドール（６，１９３．２ｍｇ，１．０２ｍｍｏｌ）をヨウ化メチル（４．０ｍＬ）に溶解し、２時間加熱還流を行った後室温まで放冷した。生じた沈殿をｎ－ヘキサンにて処理して濾取し、得られた固体をｎ－ヘキサン（３ｍＬ×２）にて洗浄し、減圧乾燥を行って茶色粉末８（３１９．０ｍｇ，９４％）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ：７．５９（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），７．０６－７．０２（ｍ，２Ｈ），４．２３（ｓ，３Ｈ），３．９０（ｓ，３Ｈ），３．０４（ｓ，３Ｈ），１．６５（ｓ，６Ｈ）．
（５－Ｍｅｔｈｏｘｙ－１，３，３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ－２－｛６－（Ｎ－ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｈｅｘａ－１，３，５－ｔｒｉｅｎｙｌ｝－３Ｈ－ｉｎｄｏｌｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ（９）の合成）
　グルタコンアルデヒド・ジアニール塩酸塩（５７．１ｍｇ，０．２０１ｍｍｏｌ）、塩化アセチル（５６．６μＬ，０．７９７ｍｍｏｌ）及び無水酢酸（０．２ｍＬ）の混合物を１１０℃にて加熱し、ここに５－メトキシ－１，２，３，３－テトラメチル－３Ｈ－インドリウムヨージド（８，３０．１ｍｇ，０．０９０９ｍｍｏｌ）の無水酢酸（２．０ｍＬ）溶液を滴下し、さらに３０分撹拌した。溶媒を５０℃以下にて減圧溜去し、得られた残渣を塩化メチレン（０．４ｍＬ）に溶解し、ジエチルエーテル（１００ｍＬ）に激しく撹拌しつつ加えた。生じた沈殿を濾取し、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（塩化メチレン：ｎ－ヘキサン：メタノール＝２０：４：０．５～２０：４：４）により精製し、赤色個体として化合物９（１０９．２ｍｇ）を定量的に得た。１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ：８．１４（ｄ，Ｊ＝１３．８Ｈｚ，１Ｈ），７．７３（ｄｄ，Ｊ＝１５．１，１１．４Ｈｚ，１Ｈ），７．６３－７．５０（ｍ，３Ｈ），７．４４（ｓ，１Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．１９（ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．５Ｈｚ，２Ｈ），７．１１（ｂｒ　ｔ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ，１Ｈ），７．０１（ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．９８（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．８１（ｄｄ，Ｊ＝１４．５，１１．２Ｈｚ，１Ｈ），５．３８（ｄｄ，Ｊ＝１３．７，１１．４Ｈｚ，１Ｈ），４．１８（ｓ，３Ｈ），３．８９（ｓ，３Ｈ），１．９７（ｓ，３Ｈ），１．７１（ｓ，６Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ）δ：１７８．４，１６９．２，１６０．９，１５３．７，１４９．８，１４４．６，１４０．１，１３７．９，１３４．８，１３０．６，１２９．９，１２９．７，１２８．１，１１５．２，１１４．５，１１３．５，１１３．４，１０８．６，５６．１，５１．４，３５．６，２７．０，２３．３；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ２６Ｈ２９Ｎ２Ｏ２［Ｍ－Ｉ］＋＝４０１．２２２９，Ｆｏｕｎｄ，４０１．２２４８．
（２－［７－｛１－（３，５－Ｄｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ）－５－ｍｅｔｈｏｘｙ－３，３－ｄｉｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｌｉｎ－２－ｙｌｉｄｅｎｅ｝ｈｅｐｔａ－１，３，５－ｔｒｉｅｎｙｌ］－５－ｍｅｔｈｏｘｙ－１，３，３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ－３Ｈ－ｉｎｄｏｌｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ（ＧＰＵ－３２７）の合成）
　化合物９（６９．６ｍｇ，０．１３２ｍｍｏｌ），無水酢酸ナトリウム（１６．４ｍｇ，０．２００ｍｍｏｌ）及び１－（３，５－ジニトロベンジル）－５－メトキシ－２，３，３－トリメチル－３Ｈ－インドレニウムヨージド（７，４９．７ｍｇ，０．０９９９ｍｍｏｌ）をエタノール（１０ｍＬ）に加え、アルゴン雰囲気下で４５分間加熱還流した。溶媒を減圧溜去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（塩化メチレン：ｎ－ヘキサン：メタノール＝２０：４：０．３～２０：４：０．８）及びＯＤＳフラッシュクロマトグラフィ（水：アセトニトリル＝６０：４０～３６：６４）により精製し、青色粉末としてＧＰＵ－３２７（１３．８ｍｇ，１８％）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ）δ：８．９２（ｔ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），８．４４（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，２Ｈ），７．９７（ｂｒ　ｓ，１Ｈ），７．６６（ｂｒ　ｓ，１Ｈ），７．４２（ｂｒ　ｓ，１Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），７．１９（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．０８（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．０３（ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．１Ｈｚ，１Ｈ），６．９３（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．８３（ｄｄ，Ｊ＝８．６，２．５Ｈｚ，１Ｈ），６．５１（ｂｒ　ｔ，Ｊ＝１４．４Ｈｚ，２Ｈ），６．３１（ｂｒ　ｓ，１Ｈ），５．８７（ｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，１Ｈ），５．３８（ｂｒ　ｓ，２Ｈ），３．８７（ｓ，３Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），３．７３（ｓ，３Ｈ），１．７６（ｓ，６Ｈ），１．７０（ｓ，６Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，１２５ＭＨｚ）δ：１７７．１，１６７．０，１６１．２，１５８．５，１５５．６，１５４．６，１５０．３，１４６．９，１４５．３，１４２．５，１４２．０，１３７．６，１３７．１，１２８．０，１２７．７，１２６．８，１１８．９，１１５．３，１１４．４，１１４．３，１１０．６，１１０．２，１０９．７，１０８．９，１０１．６，７９．５，５６．５，５６．４，５１．８，４６．１，３２．６，２８．６，２７．３；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ３７Ｈ３９Ｎ４Ｏ６［Ｍ－Ｉ］＋＝６３５．２８６４　Ｆｏｕｎｄ，６３５．２８７５．
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
［実験例２］
（ＧＰＵ－３２７によるＥＰＣ及びＨＵＶＥＣの低酸素領域の可視化）
　ＧＰＵ－３２７の存在下で血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）及び臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を培養し、ＧＰＵ－３２７の低酸素選択性を検討した。
　ＥＰＣは、臍帯血から単離し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ－ＦＧＦ）を含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ培地）中で培養した。ＨＵＶＥＣはキャンブレックス社より購入し、説明書にしたがって培養した。
　ＥＰＣ及びＨＵＶＥＣの培地に、終濃度０．５、１．０及び１．５μＭのＧＰＵ－３２７を添加し、酸素濃度１％、５％及び２０％の環境下で６時間培養した。続いて、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で各細胞を洗浄し、結合しなかったＧＰＵ－３２７を除去した。
　続いて、ＣＣＤカメラ（型式「Ｈ６７４１ＣＥ」、Ｔｕｃｓｅｎ社）及びＩＣＧ用蛍光フィルター（オメガオプティカル社）を取り付けた蛍光顕微鏡（型式「ＢＸ５１」、オリンパス社）を用いてＧＰＵ－３２７の蛍光を検出した。
　結果を図１Ａ～Ｈに示す。図１Ａは、各条件下のＥＰＣにおける蛍光を検出した写真である。図１Ｂ～Ｄは、図１Ａの蛍光強度をグラフにしたものである。図１Ｅは、各条件下のＨＵＶＥＣにおける蛍光を検出した写真である。図１Ｆ～Ｈは、図１Ｅの蛍光強度をグラフにしたものである。図１Ｂ～Ｄ及びＦ～Ｈ中の「＊」は、危険率５％未満で有意差があることを示す。データは、スチューデントのｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ　ｔｅｓｔ）及び対応のあるｔ検定（Ｐａｉｒｅｄ　ｔ　ｔｅｓｔ）を用いて解析した。複数の群を比較する場合、一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ）及びＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較を使用した。以下、全ての実験例において、統計学的解析は、ソフトウエア（商品名「ＳｔａｔＶｉｅｗ　ｖｅｒ．５．０」、ＳＡＳ社）を使用して行った。グラフにおいて、ｙ軸のエラーバーは標準偏差を示す。
　その結果、常酸素条件下（酸素濃度２０％）と低酸素条件下（酸素濃度５％又は１％）におけるＧＰＵ－３２７の蛍光強度に有意差があることが確認された。この結果は、ＧＰＵ－３２７が低酸素領域を検出可能であることを示す。
［実験例３］
（ＥＰＣ及びＨＵＶＥＣにおけるＶＥＧＦ及びＨＩＦ－１αの発現レベルの測定）
　実験例２の各酸素条件下で培養したＥＰＣ及びＨＵＶＥＣにおける血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及び低酸素誘導因子（ＨＩＦ）－１αの発現レベルを測定した。ＶＥＧＦの発現量は定量的ＲＴ－ＰＣＲにより測定した。より具体的には、まず、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて各細胞から全ＲＮＡを抽出した。続いて、ＲｅｖｅｒＴｒａ－Ｐｌｕｓ（商標）（東洋紡社）を用いて全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、定量的ＲＴ－ＰＣＲの鋳型に使用した。ＶＥＧＦ遺伝子増幅用プライマーとして、センスプライマー（５’－ＡＧＡＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＡＣＡＧＣＡＣＡＡＣ－３’、配列番号１）及びアンチセンスプライマー（５’－ＡＧＧＡＣＴＴＡＴＡＣＣＧＧＧＡＴＴＴＣＴＴＧ－３’、配列番号２）を使用した。ＨＩＦ－１αの発現量は、ウエスタンブロッティングにより測定した。
　各細胞の核抽出物各３０μｇをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）により分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。続いて、１次抗体にウサギ抗ＨＩＦ－１α抗体（Ｎｏｖｕｓ社）を使用し、２次抗体にセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（インビトロジェン社）を使用して転写膜を染色し、ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＣＬ）システム（ＧＥヘルスケア社）で検出した。対照として、ラミンＢタンパク質を検出した。ラミンＢタンパク質の検出は、１次抗体にヤギ抗ラミンＢ抗体（サンタクルーズ社）を使用し、２次抗体にＨＲＰ標識ウサギ抗ヤギＩｇＧ（インビトロジェン社）を使用して行った。
　結果を図２Ａ～Ｃに示す。図２Ａは、各細胞におけるＶＥＧＦのｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。図２Ｂは、各細胞におけるＨＩＦ－１αタンパク質及びラミンＢタンパク質の発現を検出したウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図２Ｃは、図２Ｂのタンパク質発現量をグラフにしたものである。図２Ａ、図２Ｃ中の「＊」は、危険率５％未満で有意差があることを示す。
　その結果、ＨＵＶＥＣと比較して、ＥＰＣは低酸素条件に強く応答し、低酸素条件下でＶＥＧＦ遺伝子発現量及びＨＩＦ－１αタンパク質発現量が有意に増加したことが明らかとなった。
　一方、ＨＵＶＥＣは、低酸素条件に対する応答が弱かったにもかかわらず、実験例２においては、低酸素条件でＧＰＵ－３２７の蛍光強度の有意な増加が認められた。この結果は、ＧＰＵ－３２７が、ＶＥＧＦやＨＩＦ－１αの発現を直接検出するものではなく、低酸素条件を検出するものであることを示す。
［実験例４］
（ＧＰＵ－３２７の皮弁虚血マウスモデルへの適用）
　ＧＰＵ－３２７が、低酸素領域を正確に検出できることを確認し、ＧＰＵ－３２７を眼以外の領域への適用可能性を検討することを目的として、皮弁虚血マウスモデルを用いた検討を行った。
　図３Ａは、皮弁虚血マウスモデルを示す写真である。図３Ａに示すように、半島形の切り込み（３ｃｍ×２ｃｍ）をマウスの背表面に作製した。これにより、切り込みの１方側のみに血液循環が存在し、虚血勾配が生じる。切り込み作製の２日後のマウスに、尾静脈投与によりＧＰＵ－３２７を投与し、ヒト用の眼底カメラ（型式「ＲＣ－２」、コーワ社）を用いてＧＰＵ－３２７の蛍光を観察した。
　このモデルでは、虚血組織において酸素圧の勾配が生じる。皮弁の尾側の領域は、皮弁の頭側の領域の１／５の酸素圧となる。したがって、皮弁の尾側の縁の領域は最も酸素圧が低いため、ＧＰＵ－３２７の蛍光が最も強くなると予想された。
　図３Ｂは、蛍光フィルター無しで撮影した写真であり、図３Ｃは、蛍光フィルターを使用した蛍光像を示す写真である。その結果、ＧＰＵ－３２７が、低酸素領域を正確に検出できることが確認された。しかしながら、上記の予想に反し、ＧＰＵ－３２７の蛍光が最も強かったのは、皮弁の中央部分であった。この結果は、ＧＰＵ－３２７が皮弁の尾側の縁の領域まで到達できていないことによると考えられた。
［実験例５］
（ＧＰＵ－３２７の網膜動脈閉塞マウスモデルへの適用）
　ＧＰＵ－３２７を網膜動脈閉塞マウスモデルに適用し、低酸素領域を正確に検出できるか否かを検討した。
　マウス尾静脈にローズベンガルを投与し、レーザー光を網膜動脈に照射することにより、網膜動脈を閉塞させて網膜内に局所的な低酸素状態を作製することができる。この方法により、網膜動脈閉塞マウスモデルを作製した。
　より具体的には、まず、マウスを麻酔し、瞳を拡張させた。続いて、４０ｍｇ／ｋｇのローズベンガル（ナカライテスク社）を尾静脈内投与した後に、角膜にガラスカバーを載せ、スリットランプ　クリプトンレーザー　デリバリーシステム（型式「ＭＣ－７０００」、ニデック社）を用いて、レーザー光を照射し、網膜動脈を閉塞させた。ローズベンガルの最大ピーク吸収波長は５５０ｎｍである。レーザースポットのサイズは約５０μｍであった。レーザーパワーは約５０ｍＷであった。レーザーパルスの間隔は３秒間であった。血流を止めるために、２～３回のレーザー光の照射が必要であった。各眼において、１本の動脈を閉塞させた。
　網膜動脈閉塞マウスモデル作製の直後に、硝子体注射により０．２μｇ／μＬの濃度のＧＰＵ－３２７を１μＬ投与した。２日後、眼底レンズ（型式「２８Ｄ」、ｖｏｌｋ社）及びヒト用の眼底カメラ（型式「ＲＣ－２」、コーワ社）を用いてインビボでＧＰＵ－３２７の蛍光を観察した。その後、眼を摘出してインビトロで観察した。より具体的には、摘出した眼の網膜の血管構造を、蛍光標識されたイソレクチンＢ４で染色し、フラットマウントして蛍光顕微鏡で観察した。また、摘出した眼の細胞の核を４’，６’－ジアミノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色し、横断切片を蛍光顕微鏡（ＢＺＸ７００、ＫＥＹＥＮＣＥ社）で観察した。また、蛍光顕微鏡（ＢＺＸ７００、ＫＥＹＥＮＣＥ社）を用いてＧＰＵ－３２７の蛍光を観察した。
　図４Ａは、インビボでＧＰＵ－３２７の蛍光を観察した結果を示す写真である。閉塞した動脈周囲のみで蛍光の増強を認めており、本方法により、眼の低酸素領域をインビボで直接検出することができることが明らかとなった。
　図４Ｂは、図４Ａで観察した眼の網膜の血管構造をインビトロで観察した結果を示す写真である。図４Ｃは、図４Ｂと同一のサンプルにおける、ＧＰＵ－３２７の蛍光を観察した結果を示す写真である。図４Ｄは、図４Ｂ及び図４Ｃの蛍光像を統合した写真である。図４Ｅは、図４Ａ～Ｄと同一の実験方法で作製したモデル眼の横断切片をインビトロで観察した結果を示す写真である。図４Ｆは、図４Ｅと同一のサンプルにおける、ＧＰＵ－３２７の蛍光を観察した結果を示す写真である。図４Ｇは、図４Ｅ及び図４Ｆの蛍光像を統合した写真である。この結果から、眼の低酸素領域をインビボで検出した結果は、インビトロで検出した結果と一致することが確認された。
　以上の結果から、ＧＰＵ－３２７により、網膜動脈閉塞マウスモデルの眼における低酸素領域を正確に検出できることが示された。
［実験例６］
（ＧＰＵ－３２７の網膜静脈閉塞マウスモデルへの適用）
　ＧＰＵ－３２７を網膜静脈閉塞マウスモデルに適用し、低酸素領域を正確に検出できるか否かを検討した。
　まず、実験例５と同様にしてマウスの網膜静脈にレーザー光を照射して網膜静脈を閉塞させ、網膜静脈閉塞マウスモデルを作製した。各眼において、３～５個の静脈を閉塞させた。網膜静脈閉塞マウスモデル作製の直後に、硝子体注射によりＧＰＵ－３２７を投与した。２日後、眼底レンズ（型式「２８Ｄ」、ｖｏｌｋ社）及びヒト用の眼底カメラ（型式「ＲＣ－２」、コーワ社）を用いてインビボでＧＰＵ－３２７の蛍光を観察した。その後、眼を摘出してインビトロで観察した。より具体的には、摘出した眼の網膜の血管構造を、蛍光標識されたイソレクチンＢ４で染色し、フラットマウントして蛍光顕微鏡で観察した。
　図５Ａは、インビボでＧＰＵ－３２７の蛍光を観察した結果を示す写真である。１本の動脈のみを閉塞させた動脈閉塞症モデルと比べ、各眼３～５個の静脈を閉塞させた静脈閉塞症モデルではより広範囲の低酸素領域が認められた。本方法により、眼の低酸素領域をインビボで直接検出することができることが明らかとなった。
　図５Ｂは、図５Ａで観察した眼の網膜の血管構造をインビトロで観察した結果を示す写真である。図５Ｃは、図５Ｂと同一のサンプルにおける、ＧＰＵ－３２７の蛍光を観察した結果を示す写真である。図５Ｄは、図５Ｂ及び図５Ｃの蛍光像を統合した写真である。この結果から、眼の低酸素領域をインビボで検出した結果は、インビトロで検出した結果と一致することが確認された。
　以上の結果から、ＧＰＵ－３２７により、網膜静脈閉塞マウスモデルの眼における低酸素領域を正確に検出できることが示された。
［実験例７］
（ＧＰＵ－３２７の脈絡膜虚血マウスモデルへの適用）
　ＧＰＵ－３２７を脈絡膜虚血マウスモデルに適用し、硝子体注射により投与したＧＰＵ－３２７が網膜を通過して脈絡膜まで到達することができるか否かを検討した。脈絡膜虚血マウスモデルでは、マウスの内頸動脈を結紮して脈絡膜のみならず眼球全体を虚血にする。
　マウスを麻酔した後、片方の頸動脈を露出し内頸動脈を８－０シルク糸で２か所結紮した。内頸動脈からは眼動脈が分岐しており、結紮することにより眼球全体が虚血に陥る。臨床的には眼虚血症候群モデルであり、このモデルでは眼球全体が虚血となるため、網膜の表層のみならず脈絡膜という深層まで虚血になる。内頸動脈結紮直後に、硝子体注射により０．２μｇ／μＬの濃度のＧＰＵ－３２７を１μＬ両眼に投与した。２日後、眼底カメラを用いてインビボでＧＰＵ－３２７の蛍光を観察した。
　図６Ａは、眼の横断切片をインビトロで観察した結果を示す写真である。図６Ｂは、図６Ａと同一のサンプルにおける、ＧＰＵ－３２７の蛍光を観察した結果を示す写真である。図６Ｃは、図６Ａ及びＢの蛍光像を統合した写真である。
　内頸動脈を結紮した側の眼球では蛍光強度の増強を認めたが、結紮していない側の眼球では蛍光の増強は認めなかった。横断切片では眼球全体が淡く蛍光が増強していた。特に視神経で強い蛍光の増強が認められた。硝子体注射されたＧＰＵ－３２７は脈絡膜や視神経等の眼球の深層部分まで到達することが明らかとなった。
［実験例８］
（ＧＰＵ－３２７の未熟児網膜症マウスモデルへの適用）
　ＧＰＵ－３２７を未熟児網膜症マウスモデルに適用した。未熟児網膜症マウスモデルとは、まだ網膜血管が完成していない生後７日目の幼弱マウスを酸素濃度７５％の条件下で生後１２日目まで飼育することにより網膜血管の成長が停止し、生後１２日目以降に再度常酸素条件下に戻すことにより、相対的虚血が起こり、その後網膜新生血管を認めるモデルである。
　ＧＰＵ－３２７の最適濃度を検討するために、生後１２日目に常酸素条件下に戻してから６時間後の未熟児網膜症マウスモデルに、０．８３２、１．６６４、３．３２８μｇ／ｇ体重のＧＰＵ－３２７を尾静脈注射した。０．８３２μｇ／ｇ体重の投与量は、ヒトの蛍光眼底造影方法におけるＩＣＧの投与量である、２５ｍｇ／６０ｋｇ体重の２倍量に相当する。同様に、１．６６４及び３．３２８μｇ／ｇ体重の投与量は、それぞれ、ヒトの蛍光眼底造影方法におけるＩＣＧの投与量の４倍量及び８倍量に相当する。
　ＧＰＵ－３２７の投与から１時間後に、眼底レンズ（型式「２８Ｄ」、ｖｏｌｋ社）及びヒト用の眼底カメラ（型式「ＲＣ－２」、コーワ社）を用いて眼におけるＧＰＵ－３２７の蛍光を観察した。
　図７Ａは、蛍光観察の結果を示す写真である。その結果、ＧＰＵ－３２７の投与量依存的に蛍光強度の上昇が認められた。
　また、生後１２日目に常酸素条件下に戻してから２時間後、６時間後、１日後及び５日後の未熟児網膜症マウスモデルに、１．６６４μｇ／ｇ体重のＧＰＵ－３２７を尾静脈注射し、経時変化を観察した（ｎ＝６）。ＧＰＵ－３２７の投与から１時間後に、眼底レンズ（型式「２８Ｄ」、ｖｏｌｋ社）及びヒト用の眼底カメラ（型式「ＲＣ－２」、コーワ社）を用いて眼におけるＧＰＵ－３２７の蛍光を観察した。対照として、生後１２日目の通常のマウスに１．６６４μｇ／ｇ体重のＧＰＵ－３２７を尾静脈注射したマウスの眼におけるＧＰＵ－３２７の蛍光を観察した。
　図７Ｂは、蛍光観察の結果を示す写真である。図７Ｃは、図７Ｂにおいて検出された蛍光強度をグラフにしたものである。図７Ｃ中の「＊」は、危険率１％未満で有意差があることを示す。
　その結果、常酸素条件下に戻してから２時間後及び６時間後の未熟児網膜症マウスモデルにおいて、強い蛍光が観察された。
　以上の結果から、ＧＰＵ－３２７により、未熟児網膜症マウスモデルの眼における低酸素領域を正確に検出できることが示された。
［実験例９］
（ＧＰＵ－３２７の網膜静脈閉塞ウサギモデルへの適用）
　未熟児網膜症マウスモデルでは、網膜全体が低酸素状態になるため、網膜内の局所的な低酸素領域の検出には向いていない可能性が考えられた。そこで、ＧＰＵ－３２７を網膜静脈閉塞ウサギモデルに適用し、低酸素領域を正確に検出できるか否かを検討した。
　より具体的には、カバーガラスの代わりにコンタクトレンズ（商品名「ｔｒａｎｓｅｑｕａｔｏｒ　ｌｅｎｓ」、ｖｏｌｋ社）を使用し、レーザースポットのサイズを約１２５μｍとし、レーザーパワーを１５０～３００ｍＷとし、レーザーパルスの間隔を０．５秒間とし、１個の主要な静脈のみを閉塞させた点以外は、上述した網膜動脈閉塞マウスモデルと同様にして網膜静脈閉塞ウサギモデルを作製した。
　網膜静脈閉塞ウサギモデル作製の直後に、硝子体注射により０．２μｇ／μＬの濃度のＧＰＵ－３２７を５０μＬ投与した。続いて、網膜静脈閉塞から２日後、１週間後及び２週間後に眼底カメラを用いて眼底を撮影し、また、眼底カメラを用いてインビボでＧＰＵ－３２７の蛍光を観察した。
　図８Ａ、図８Ｂ及び図８Ｃは、網膜静脈閉塞から２日後、１週間後及び２週間後に眼底カメラを用いて眼底を撮影した写真である。また、図８Ｄ、図８Ｅ及び図８Ｆは、網膜静脈閉塞から２日後、１週間後及び２週間後に眼底カメラを用いてインビボでＧＰＵ－３２７の蛍光を観察した結果を示す写真である。
　レーザー照射直後に網膜静脈の怒張が生じ、また図８Ａに示すように、ヒトの網膜静脈閉塞症と同様に網膜静脈閉塞から２日後に軽度の網膜出血が認められたことから、モデル作製が成功したものと考えられた。また、図８Ｂに示すように、網膜静脈閉塞から１週間後に、視神経の周囲におけるレーザーを照射した側の網膜の白色化が認められた。ＧＰＵ－３２７の蛍光の増加は、眼のレーザー照射した側のみで観察され、ＧＰＵ－３２７の蛍光は、網膜静脈閉塞から２週間後まで観察可能であった。また、硝子体腔では、ＧＰＵ－３２７の蛍光の増加は観察されなかった。ウサギでは、ヒトと異なり大半の網膜が脈絡膜血流から還流されており、視神経乳頭周囲の一部の網膜のみが網膜血流から還流されている。今回の網膜静脈を閉塞されたモデルにおいても、脈絡膜血流還流領域は低酸素になっておらず、ＧＰＵ－３２７の蛍光の増加も認められていない。ＧＰＵ－３２７の蛍光の増加は、網膜動脈からの還流の領域でのみ認められた。
　以上の結果は、ＧＰＵ－３２７が十分な低酸素領域の検出性能を有していることを示す。また、ＧＰＵ－３２７は、網膜に取り込まれた後に蛍光を発する形態に変化することが示された。
［実験例１０］
（網膜静脈閉塞ウサギモデルの蛍光眼底造影）
　フルオレセインを用いて、実験例９の網膜静脈閉塞から２週間後の網膜静脈閉塞ウサギモデルの蛍光眼底造影を行った。図９は、蛍光眼底造影の結果を示す写真である。その結果、新生血管、蛍光の漏れ、及び無血管野が観察された。
［実験例１１］
（網膜静脈閉塞ウサギモデルの網膜の低酸素領域の検出におけるＧＰＵ－３２７とピモニダゾールとの比較）
　実験例９の網膜静脈閉塞から２日後の網膜静脈閉塞ウサギモデルの眼における低酸素領域をＧＰＵ－３２７及びピモニダゾールで染色して比較した。
　ピモニダゾールによる染色は次のようにして行った。まず、と殺の９０分前のウサギに、４００μＭのピモニダゾール塩酸塩（ミリポア社）５０μＬ（６０ｍｇ／ｋｇ体重）を硝子体注射した。続いて、ウサギをと殺後、眼球を摘出し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。続いて、ブロッキング溶液で５０倍に希釈したＦＩＴＣ標識抗ピモニダゾール抗体を用いて、眼球のホールマウントを室温で１時間染色した。また、ＴＲＩＴＣ標識イソレクチンＢ４を用いて対比染色も行った。
　図１０Ａは、インビボでＧＰＵ－３２７の蛍光を検出した写真である。図１０Ｂは図１０Ａで観察した眼の眼底を撮影した写真である。図１０Ｃは、図１０Ａで観察した眼の網膜の血管構造を、イソレクチンＢ４を用いた染色によりインビトロで観察した結果を示す蛍光像の写真である。図１０Ｄは、図１０Ｃと同一のサンプルにおける、ピモニダゾールによる染色の結果を示す蛍光像の写真である。図１０Ｅは、図１０Ｃ及び図１０Ｄの蛍光像を統合した写真である。図１０Ｃ、Ｄ、Ｅにおける矢印は、網膜静脈の閉塞部位を示す。
　図１０Ａに示すように、ＧＰＵ－３２７の蛍光は、網膜静脈閉塞部位の周辺のみではなく、より広い範囲で観察された。これに対し、図１０Ｄに示すように、ピモニダゾールによる染色では、網膜静脈閉塞部位の周辺のみが染色された。
　ピモニダゾールは、酸素濃度１％程度の低酸素領域を検出できるといわれている。酸素濃度５％においてＧＰＵ－３２７の蛍光が有意に上昇した実験例２の結果と合わせて解釈すると、本実験例の結果は、ＧＰＵ－３２７が、ピモニダゾールよりも軽度の低酸素領域を検出可能であることを示す。
［実験例１２］
（ＧＰＵ－３２７の安全性の検討）
　ウサギの眼に、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）又はＧＰＵ－３２７を投与して、網膜電図の測定及び網膜病理学的評価を行い、ＧＰＵ－３２７の安全性を検討した。
　まず、ＰＢＳ又はＧＰＵ－３２７の投与前に、瞳孔を拡張させ、全身麻酔及び局所麻酔を行った状態で少なくとも１時間の暗順応を行い、暗室にてウサギの網膜電図を測定した。網膜電図の測定は、次のようにして行った。まず、白色光発光ダイオード内蔵コンタクトレンズ電極（型式「ＬＷ－１０２」、メイヨー社）を両眼の角膜に装着し、接地電極を耳に取り付けた。続いて、網膜電図測定装置（型式「ＬＥ－３０００」、トーメー社）を使用して、両眼の網膜電図を同時に測定した。周波数バンドは０．３～３００Ｈｚに設定した。刺激輝度は３６０、３０００及び２００００ｃｄ／ｍ２に設定し、持続時間は１ミリ秒に設定した。網膜電図の測定は、少なくとも１時間の暗順応の後に、最も弱い刺激から始めた。バックグラウンド光は使用しなかった。各光強度において、４回の刺激を行い、平均値を算出した。
　その結果、ＰＢＳ又はＧＰＵ－３２７の投与前の網膜電図における振幅と潜時には、ウサギの右眼及び左眼で有意な差は認められなかった。
　続いて、ＰＢＳ又はＧＰＵ－３２７を、硝子体注射によりウサギの片方の眼のみに投与した。ＰＢＳの投与量は５０μＬとした。また、ＧＰＵ－３２７の投与量は０．２μｇ／μＬの溶液を５０μＬとした。もう片方の眼には何も投与せず、対照とした。
　ＰＢＳ又はＧＰＵ－３２７の投与から６０日後に、上記と同様にして網膜電図を測定し、ウサギの右眼及び左眼（ＰＢＳ投与対対照、又はＧＰＵ－３２７投与対対照）について振幅及び潜時を算出した。また、ＰＢＳ及びＧＰＵ－３２７の硝子体投与による影響の関連性を調べるために、独立ｔ検定（Ｕｎｐａｉｒｅｄ　ｔ　ｔｅｓｔ）を行った。
　図１１ＡはＰＢＳ又はＧＰＵ－３２７の投与から６０日後の網膜電図を示すグラフである。その結果、ＰＢＳ投与群、ＧＰＵ－３２７投与群共に、ａ波及びｂ波等の正常な網膜電図のパターンが観察された。また、図１１Ｂは、各刺激輝度において測定されたａ波について、振幅のＰＢＳ投与対対照、又はＧＰＵ－３２７投与対対照の比を示すグラフである。また、図１１Ｃは、各刺激輝度において測定されたｂ波について、振幅のＰＢＳ投与対対照、又はＧＰＵ－３２７投与対対照の比を示すグラフである。ＰＢＳ投与群とＧＰＵ－３２７投与群との間で網膜電図に有意な差は認められなかった。
　続いて、光学顕微鏡を用いて、ＰＢＳ投与群とＧＰＵ－３２７投与群の眼の網膜病理学的評価を行った。図１１ＤはＧＰＵ－３２７投与群の眼の光学顕微鏡写真であり、図１１ＥはＰＢＳ投与群の眼の光学顕微鏡写真である。
　その結果、いずれの群においても視細胞層の萎縮等の異常は認められず、また、網膜、色素上皮層、視神経の炎症も認められなかった。
　以上の結果から、ＧＰＵ－３２７が安全であることが示された。
　本発明により、インビボで眼の低酸素領域を直接検出することが可能な診断薬を提供することができる。また、低酸素関連眼疾患の診断と治療を同時に実施することが可能な治療用組成物を提供することができる。

Claims (7)

  1. 　低酸素蛍光プローブを有効成分として含有する、低酸素関連眼疾患のインビボ用診断薬。
  2. 　硝子体注射用である、請求項１に記載の診断薬。
  3. 　前記低酸素蛍光プローブが下記式（１）で表される化合物である、請求項１又は２に記載の診断薬。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式（１）中、Ｒ１はそれぞれ独立にＨ、ＣＯＯＨ、ＳＯ３ －、又は炭素数１～３のアルコキシ基を表し、Ｒ２は存在しないか又は炭素数１～１０の直鎖若しくは分岐鎖状のアルキル基を表し、Ｒ３は電子吸引性置換基を表し、Ｒ４はアルキル基、－（ＣＨ２）ＡＣＯＯ－、－（ＣＨ２）ＡＳＯ３ －、又は－（ＣＨ２）ＡＯ－を表し、Ｘ－は存在しないか又はＣｌ－、Ｂｒ－、Ｉ－、若しくはＰＦ６－を表し、ｎは１～４の整数を表し、Ａは１～６の整数を表す。］
  4. 　前記低酸素蛍光プローブが下記式（２）で表される化合物である、請求項１～３のいずれか一項に記載の診断薬。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  5. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の診断薬と、血管新生阻害剤とを有効成分として含有する、低酸素関連眼疾患の治療用組成物。
  6. 　前記血管新生阻害剤が血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）捕捉物質である、請求項５に記載の治療用組成物。
  7. 　前記ＶＥＧＦ捕捉物質が抗ＶＥＧＦ抗体である、請求項６に記載の治療用組成物。
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WO2023216992A1 (zh) * 2022-05-07 2023-11-16 杭州康柏睿格医药科技有限公司 花菁素-海藻糖类化合物、其制备方法及用途

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