JP7280353B2

JP7280353B2 - 黄斑変性予防又は治療用組成物

Info

Publication number: JP7280353B2
Application number: JP2021518126A
Authority: JP
Inventors: ドンホ・パク; インキュ・リ
Original assignee: キョンブクナショナルユニバーシティインダストリー－アカデミックコーオペレーションファウンデーション
Priority date: 2018-11-02
Filing date: 2019-10-30
Publication date: 2023-05-23
Anticipated expiration: 2039-10-30
Also published as: KR102384118B1; KR102384118B9; JP2023062085A; JP2022504098A; KR20210106942A; WO2020091430A1

Description

本発明は、保健福祉部の支援下で課題番号ＨＩ１６Ｃ１５０１によってなされたものであり、前記課題の研究管理専門機関は韓国保健産業振興院、研究事業名は“先導型特性化研究開発事業”、研究課題名は“糖尿病性心血管合併症治療剤及び効能評価システム開発”、主管機関はキョンブク大学校病院、研究期間は２０１６．０４．０１～２０２１．０３．３１である。

また、本発明は、教育部の支援下で課題番号２０１７Ｒ１Ｄ１Ａ１Ｂ０３０２７９６６によってなされたものであり、前記課題の研究管理専門機関は韓国研究財団、研究事業名は“理工学個人基礎研究支援事業”、研究課題名は“Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ３Ａ及びＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－ｌｉｋｅ４を標的にするｍｉｃｒｏＲＮＡ制御による脈絡膜網膜新生血管及び血管透過性亢進調節効能評価”、主管機関はキョンブク大学校産学協力団、研究期間は２０１７．０６．０１～２０２０．０５．３１である。

また、本発明は、教育部の支援下で課題番号２０１９Ｒ１Ａ２Ｃ１０８４３７１によってなされたものであり、前記課題の研究管理専門機関は韓国研究財団、研究事業名は“理工学中堅研究者支援事業”、研究課題名は“免疫細胞のミトコンドリアエネルギー代謝リプログラミング及び炎症活性化制御を用いた新生血管性加齢黄斑変性新規治療機転研究”、主管機関はキョンブク大学校産学協力団、研究期間は２０１９．０９．０１～２０２４．０２．２９である。

本特許出願は、２０１８年１１月２日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０－２０１８－０１３３６７７号に対して優先権を主張し、この特許出願の開示事項は本明細書に参照によって組み込まれる。

本発明は、黄斑変性予防又は治療用組成物に関する。より詳細には、本発明は、フルスルチアミン（ｆｕｒｓｕｌｔｉａｍｉｎｅ）又はその塩（ｓａｌｔｓ）を含む黄斑変性予防又は治療用組成物に関する。

黄斑変性（ｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）は、黄斑部分に変性が起きて視力障害を起こす眼球疾患で、発病原因は、加齢、家族力、人種、喫煙と関連があると知られている。発病初期には視野がぼやけ、近くの物が歪んで見えるが、最後には失明に至る。

加齢黄斑変性（ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ＡＭＤ）は、重症の非可逆的な視力喪失を引き起こし、５０歳以上の人口における失明の主要原因と知られている。疫学研究において有病率は、米国内５２～６４歳人口の１．２％であると報告されており、７５歳以上ではその比率が２０～３７％とより高いと報告され、平均年齢が増加するほど有病率は増加していくと考えられる。

加齢黄斑変性には２類型がある。その第一は非新生血管性加齢黄斑変性で、最も通常のものであり、全加齢黄斑変性事例の８５％を占める。このような乾性類型は、網膜色素上皮の油カスと萎縮性変化を特徴とする。その第二は新生血管性加齢黄斑変性であり、脈絡膜新生血管を特徴とする。脈絡膜新生血管は新しく形成された血管に血液と体液を流出させる傾向がある。これは、網膜組織に繊維組織が増殖し、光受容体が消失された病変の形成を誘導し、進行し続けて重症且つ非可逆的な視力喪失を招く。

特に、２０１０年に発表された韓国内加齢黄斑変性に対する基礎疫学調査によれば、加齢黄斑変性の有病率は、初期変性が２．９２％、後期変性が０．１９％であるが、後期黄斑変性のうち、非新生血管性黄斑変性は３．９％で、残りはいずれも新生血管性と観察され、新生血管性黄斑変性の頻度が海外に比べて非常に高いことが分かる。

新生血管性加齢黄斑変性の治療法には、光力学療法と血管内皮成長因子を遮断するための薬物を眼球中に注射する方法がある。しかし、多くの大規模多機関臨床研究では、光力学療法に比べて、硝子体腔内血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）注射術を施行する方がより良い結果を示した。

これによって、新生血管性加齢黄斑変性の治療のために様々な抗血管内皮成長因子薬物が開発されたが、その代表的な薬剤がラニビズマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ，Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））であり、細胞外の血管内皮成長因子と結合して活性を抑制させる。ラニビズマブは、様々な臨床研究から、新生血管性加齢黄斑変性患者にとって効果的で安全な治療であることが報告され、全世界的に広く用いられている。

しかしながら、病変がよく再発し、注射回数の増加によって患者に相当な負担を与える。一部の患者では、注射術にもかかわらず病変が好転しない場合もある。

一方、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は強力な血管拡張剤の役割を担い、心臓の冠状動脈の弛緩と血液循環を維持させる。加齢黄斑変性患者たちは高齢で、心血管疾患の危険が高い群であるため、血管内皮成長因子注射術は深刻な副作用の危険性もある。

そこで、本発明では、副作用の危険性を減らし、黄斑変性に対して効率的な治療効果をもたらす新しい治療組成物を提案しようとする。

本発明者らは、副作用の危険性が低減した黄斑変性治療剤を開発するために鋭意研究努力した。その結果、本発明者らは、フルスルチアミン（ｆｕｒｓｕｌｔｉａｍｉｎｅ）が網膜色素上皮細胞で増加したＨＩＦ－１αの発現を減少させ、脈絡膜血管内皮細胞成長を抑制することを確認し、本発明を完成するに至った。

そこで、本発明の目的は、黄斑変性（ｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）予防又は治療用薬剤学的組成物を提供することである。

本発明の他の目的は、黄斑変性予防又は改善用食品組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、新生血管性眼疾患（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｏｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅ）予防又は治療用薬剤学的組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、新生血管性眼疾患予防又は改善用食品組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、黄斑変性治療方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、新生血管性眼疾患治療方法を提供することである。

本発明の一様態は、フルスルチアミン（ｆｕｒｓｕｌｔｉａｍｉｎｅ）又はその塩（ｓａｌｔｓ）を含む黄斑変性（ｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）予防又は治療用薬剤学的組成物に関する。

本発明者らは副作用の危険性が低減した黄斑変性治療剤を開発するために鋭意研究努力した。その結果、本発明者らは、フルスルチアミンが網膜色素上皮細胞で増加したＨＩＦ－１αの発現を減少させ、脈絡膜血管内皮細胞成長を抑制することを確認した。

本発明の特徴及び利点を要約すると、次の通りである：
（ａ）本発明は、フルスルチアミン（ｆｕｒｓｕｌｔｉａｍｉｎｅ）又はその塩（ｓａｌｔｓ）を含む、黄斑変性（ｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）予防又は治療用薬剤学的組成物に関する。
（ｂ）フルスルチアミンは、網膜色素上皮細胞で増加されたＨＩＦ－１αの発現を減少させ、脈絡膜血管内皮細胞成長を抑制する。
（ｃ）本発明のフルスルチアミン又はその塩を含む薬剤学的組成物は、様々な新生血管性眼疾患の治療剤にも用いることができる。

図１は、ＡＲＰＥ－１９細胞において、フルスルチアミン（ｆｕｒｓｕｌｔｉａｍｉｎｅ）が、低酸素条件によって誘導されるＨＩＦ－１α発現を抑制する効果を示すグラフである。図２ａは、脈絡膜スプラウティングアッセイ（ｃｈｏｒｏｉｄｓｐｒｏｕｔｉｎｇａｓｓａｙ）実験結果を示す。フルスルチアミンによってスプラウティング領域が減少した。（顕微鏡倍率：４０倍）図２ｂは、図２ａのスプラウティング距離（Ｃｈｏｒｏｉｄｓｐｒｏｕｔｉｎｇｄｉｓｔａｎｃｅ）を定量分析して示すグラフである。図３は、ＡＲＰＥ－１９細胞において、フルスルチアミンが、低酸素条件で増加するＶＥＧＦ分泌を抑制することを示すグラフである。図４ａは、レーザー誘導脈絡膜新生血管モデル（ｌａｓｅｒ－ｉｎｄｕｃｅｄＣＮＶ）において、フルオレセイン血管造影法を用いて血管漏出程度を比較した結果である。フルスルチアミンによって血管漏出程度が減少したことが分かる。０：レーザー斑点がないもの、１：初期と後期間において蛍光輝度とサイズに変化がないもの、２Ａ：初期と後期間において蛍光輝度にのみ変化があるもの、２Ｂ：初期と後期間において蛍光輝度とサイズの両方に変化があるもの。図４ｂは、レーザー誘導脈絡膜新生血管モデル（ｌａｓｅｒ－ｉｎｄｕｃｅｄＣＮＶ）において、フルオレセイン血管造影法を用いて血管漏出程度を比較した結果である。フルスルチアミンによって血管漏出程度が減少したことが分かる。０：レーザー斑点がないもの、１：初期と後期間において蛍光輝度とサイズに変化がないもの、２Ａ：初期と後期間において蛍光輝度にのみ変化があるもの、２Ｂ：初期と後期間において蛍光輝度とサイズの両方に変化があるもの。図５は、レーザー誘導脈絡膜新生血管モデル（ｌａｓｅｒ－ｉｎｄｕｃｅｄＣＮＶ）において、フルスルチアミンによるＣＮＶ病変（ｌｅｓｉｏｎ）サイズが減少することを示す。白色バー（ｂａｒ）：１００μｍ。図６ａは、ＡＲＰＥ－１９細胞において、ミトコンドリアのエネルギー代謝変化を確認するための酸素消耗量変化グラフである。図６ｂは、ＡＲＰＥ－１９細胞において、ＬＰＳによって減少したミトコンドリアの代謝がフルスルチアミンによって回復することを示す予備容量（Ｓｐａｒｅｃａｐａｃｉｔｙ）グラフである。

フルスルチアミン（ｆｕｒｓｕｌｔｉａｍｉｎｅ；ｔｈｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒｆｕｒｙｌｄｉｓｕｌｆｉｄｅ，ＴＴＦＤ）は、チアミン欠乏症の治療に用いられるビタミンＢ_１の活性ビタミンであり、チアミンジスルフィド誘導体である。ビタミンＢ_１に比べて細胞内によく吸収され、多量のコカルボキシラーゼ（ｃｏ－ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）を生成して、生理学的にビタミンＢ_１の欠乏や代謝障害に関連した神経機能障害、心筋代謝障害などを改善させるものと知られている。

黄斑変性（Ｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）の発病原因は、加齢、家族力、人種、喫煙などがあるが、主に加齢によって発生する。黄斑変性では網膜色素上皮と脈絡膜との間の黄斑（網膜の一部）にドルーゼン（ｄｒｕｓｅｎ、細胞外タンパク質と脂質の蓄積）という黄色沈殿物が蓄積されていく。

年齢の増加によって発生する加齢黄斑変性（ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ＡＭＤ）は、ドルーゼンの程度（サイズ及び数）に部分的に基づいて初期（ｅａｒｌｙ）、中期（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）、及び後期（ｌａｔｅ）の３段階に分けられる。

本発明の一具現例によれば、前記黄斑変性は、加齢黄斑変性（ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ＡＭＤ）である。

本発明の他の具現例によれば、前記黄斑変性は、後期加齢黄斑変性（ｌａｔｅａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ｌａｔｅＡＭＤ）である。

後期ＡＭＤでは、網膜損傷が起き、ドルーゼンの他にも有症状の視力損失が発生する。後期ＡＭＤは、損傷類型によって乾式ＡＭＤと湿式ＡＭＤとに区別される。乾式ＡＭＤは、地図状萎縮症（Ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｔｒｏｐｈｙ）を特徴とし、非血管新生性ＡＭＤである。一方、湿式ＡＭＤは、脈絡膜新生血管が現れる血管新生性ＡＭＤ（ＮｅｏｖａｓｃｕｌａｒＡＭＤ）である。

本発明の他の具現例によれば、前記黄斑変性は、新生血管性加齢黄斑変性（Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ＮｅｏｖａｓｃｕｌａｒＡＭＤ）又は非血管新生性加齢黄斑変性（Ｎｏｎ－ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，Ｎｏｎ－ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒＡＭＤ）である。

本発明の他の具現例によれば、前記黄斑変性は、新生血管性加齢黄斑変性である。

本発明の薬剤学的組成物は、フルスルチアミン又はその塩の有効量が１００ｍｇ／６０ｋｇ／日～２４０ｍｇ／６０ｋｇ／日である。

本発明において有効成分として用いられるフルスルチアミンは、それ自体又は塩の形態、好ましくは薬剤学的に許容可能な塩の形態で用いられてよい。

前記塩としては、遊離酸（ｆｒｅｅａｃｉｄ）によって形成された酸付加塩が好ましい。

前記遊離酸は、有機酸及び／又は無機酸でよい。

前記有機酸は、クエン酸、酢酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、ギ酸、プロピオン酸、シュウ酸、トリフルオロ酢酸、ベンゾ酸、グルコン酸、メタスルホン酸、グリコール酸、コハク酸、４－トルエンスルホン酸、グルタミン酸及びアスパラギン酸などであり得るが、これに制限されない。

前記無機酸は、塩酸、臭素酸、硫酸及びリン酸などであり得るが、これに制限されない。

本発明の薬剤学的組成物は、フルスルチアミン又はその塩の他に、薬剤学的に許容される担体（ｃａｒｒｉｅｒ）を含むことができる。

前記薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されない。

本発明の薬剤学的組成物は、これらの成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。好適な薬剤学的に許容される担体及び製剤はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。

本発明の薬剤学的組成物は、経口又は非経口で投与できる。

非経口投与では、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与、眼球投与又は眼球局所投与などで投与できる。

眼球局所投与は、例えば、直接に眼球内投薬されたり、眼球周囲、眼球後ろ、網膜下（ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ）、網膜中心（ｃｅｎｔｒａｌｒｅｔｉｎａｌ）、中心窩（ｆｏｖｅａ）外部、結膜下（ｓｕｂｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｌ）、硝子体内（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅｏｕｓ）、前房内（ｉｎｔｒａｃａｍｅｒａｌ）又は脈絡膜上（ｓｕｐｒａｃｈｏｒｏｉｄａｌ）などに投与することを含む。

本発明の薬剤学的組成物は、挿入装置を介して投薬されてもよい。

本発明の薬剤学的組成物の好適な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度及び放射線反応感応性のような要因によって様々であり、通常熟練した医師は所望の治療に効果的な投与量を容易に決定及び処方できる。

本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって、単位容量形態で製造されてもよく、又は多回容量容器内に内入して製造されてもよい。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、軟膏剤、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。

本発明の他の様態は、フルスルチアミン又はその塩を含む黄斑変性（ｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）予防又は改善用食品組成物に関する。

本発明の組成物が食品組成物である場合には、粉末、顆粒、錠剤、カプセル又は飲料などの形態で製造されてよい。

本発明において、前記食品は、キャンディ類、飲料、ガム、茶、ビタミン複合剤、又は健康補助食品類でよい。

本発明の食品組成物は、有効成分としてフルスルチアミン又はその塩の他にも、食品製造時に通常添加される成分を含むことができ、例えば、タンパク質、炭水化物、脂肪、栄養素、調味剤及び香味剤を含む。上述した炭水化物の例は、モノサッカライド、例えば、ブドウ糖、果糖など；ジサッカライド、例えば、マルトース、スクロース、オリゴ糖など；及びポリサッカライド、例えば、デキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖、及びキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールである。

香味剤として天然香味剤［タウマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウジオシドＡ、グリチルリチンなど］）及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を用いることができる。

本発明の食品組成物がドリンク剤として製造される場合には、フルスルチアミン又はその塩の他に、クエン酸、液状果糖、砂糖、ブドウ糖、酢酸、リンゴ酸、果汁、杜沖抽出液、ナツメ抽出液、甘草抽出液などをさらに含むことができる。

本発明のさらに他の態様は、フルスルチアミン又はその塩を含む新生血管性眼疾患（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｏｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅ）予防又は治療用薬剤学的組成物に関する。

本発明のさらに他の態様は、フルスルチアミン又はその塩を含む新生血管性眼疾患予防又は改善用食品組成物に関する。

本発明の新生血管性眼疾患予防又は治療用薬剤学的組成物及び食品組成物は、上述した本発明の黄斑変性予防又は治療用薬剤学的組成物と同じ有効成分であるフルスルチアミン又はその塩を含むので、この両者に共通する内容は、反復記載による明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。

本明細書において用語“新生血管性眼疾患”は、眼球で発生する病理学的血管新生関連疾患であり、例えば、角膜血管新生（ｃｏｒｎｅａｌｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、網膜血管新生（ｒｅｔｉｎａｌｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、脈絡膜血管新生（ｃｈｏｒｏｉｄａｌｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、眼球内血管新生（ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、新生血管性緑内障（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｇｌａｕｃｏｍａ）、増殖性糖尿病性網膜症（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｄｉａｂｅｔｉｃｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、新生血管性黄斑変性（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、及び未熟児網膜病症（ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙｏｆｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ）を含む。

本発明のさらに他の態様は、フルスルチアミン又はその塩を含む薬剤学的組成物をそれを必要とする個体（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階を含む黄斑変性（ｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）治療方法に関する。

本発明のさらに他の態様は、フルスルチアミン又はその塩を含む薬剤学的組成物をそれを必要とする個体（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階を含む新生血管性眼疾患治療方法に関する。

本明細書において用語“投与”は、任意の適切な方法で個体に所定の物質を提供することを意味する。本発明の薬剤学的組成物の投与経路は、目的組織に到達できる限り、通常のいかなる経路を通じても経口又は非経口投与できる。また、本発明の薬剤学的組成物は、有効成分を標的細胞又は器官に伝達できる任意の装置を用いて投与されてもよい。

本明細書において用語“個体（ｓｕｂｊｅｃｔ）”は、特に限定されるものではないが、例えば、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラ、ネコ、イヌ、マウス、ネズミ、ウサギ又はギニアピッグを含み、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトを意味する。

本発明は、フルスルチアミン（ｆｕｒｓｕｌｔｉａｍｉｎｅ）又はその塩（ｓａｌｔｓ）を含む黄斑変性（ｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）予防又は治療用薬剤学的組成物に関する。

以下、本発明を下記の実施例によってさらに詳しく説明する。ただし、これらの実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものではない。

実施例１：フルスルチアミンの新生血管抑制効果－ＨＩＦ－１α減少
新生血管性加齢黄斑変性は、脈絡膜新生血管を特徴とする。網膜又は脈絡膜の低酸素（ｈｙｐｏｘｉａ）環境がＨＩＦ－１α（ｈｙｐｏｘｉａｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ１ａｌｐｈａ）を発現させ、これが血管内皮細胞因子を促進させて脈絡膜の新生血管の発生を誘導すると知られている。このような脈絡膜内新生血管の発生は、結局、視力損傷を引き起こす。

本発明では、チアミン誘導体であるフルスルチアミンによるＨＩＦ－１α抑制及びフルスルチアミンの脈絡膜内新生血管発生予防効果を確認しようとした。網膜細胞ＡＲＰＥ－１９（ＡｄｕｌｔＲｅｔｉｎａｌＰｉｇｍｅｎｔＥｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｌｉｎｅ－１９）を用いたインビトロ実験を行った。

ＡＲＰＥ－１９細胞を６０ｍｍ皿（ｄｉｓｈ）に分注し、１日程度付着するようにした。翌日、フルスルチアミン塩酸塩（Ｔｏｒｏｎｔｏｒｅｓｅａｒｃｈｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｆ８６５２３０）０μＭ、２０μＭ、５０μＭ及び１００μＭとビークル（ｖｅｈｉｃｌｅ）（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を各細胞に濃度別に処置した。１時間後に、低酸素チャンバー（ＩＮＶＩＶＯ_２４００，Ｂａｋｅｒ）に入れて１％酸素条件に露出させた。そして、４時間～６時間後に細胞を取り出してタンパク質溶解バッファー（ｐｒｏｔｅｉｎｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ）を処理し、細胞を溶解後にタンパク質を分離した。

ＢＣＡタンパク質分析キット（ＰｉｅｒｃｅＢＣＡｐｒｏｔｅｉｎａｓｓａｙｋｉｔ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてタンパク質を定量分析した後、同一のタンパク質の量のサンプルと４Ｘローディングバッファーと混ぜて加熱してタンパク質を１次構造に変性させた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに同一量のタンパク質サンプルをローディングし、ＰＶＤＦメンブレン（ｍｅｍｂｒａｎｅ）に伝達（ｔｒａｎｓｆｅｒ）させた。ＨＩＦ－１ａ抗体（Ｎｏｖｕｓ，ＮＢ１００－４７９）を５％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ）溶液に希釈して４℃で一晩インキュベートした。

翌日、メンブレンを、ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合している２次抗体とインキュベートし、ＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）溶液と反応させて化学発光を誘導した。化学蛍光イメージ分析装備（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＬＡＳ－４０００）でタンパク質の量に従う発光程度を探知し、イメージを得た。ローディングコントロール（ｌｏａｄｉｎｇｃｏｎｔｒｏｌ）遺伝子としてはβ－チューブリンを用いて同一の量のタンパク質がローディングされたことを示した。

その結果、低酸素条件（１％酸素）で増加するＨＩＦ－１αの発現がフルスルチアミン処置時に減少することを確認した（図１）。

実施例２：フルスルチアミンの新生血管抑制効果－脈絡膜血管内皮細胞成長減少
加齢黄斑変性のｅｘｖｉｖｏモデルであるマウス脈絡膜スプラウティングアッセイ（ｍｏｕｓｅｃｈｏｒｏｉｄｓｐｒｏｕｔｉｎｇａｓｓａｙ）から、脈絡膜血管内皮細胞成長に及ぼすフルスルチアミンの効果を確認した。

３週齢又は４週齢のＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ社のＣ５７ブラック／６Ｊ（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）の眼球を摘出して脈絡膜／鞏膜を分離し、１ｍｍ×１ｍｍのサイズに切断した。一方、氷で溶かして液体状態であるマトリゲル（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＢＤｍａｔｒｉｇｅｌ）を２４ウェルプレートに３００μｌずつ入れ、切断しておいた脈絡膜／鞏膜を１枚ずつ植えた。その後、３７℃インキュベーターに１０分間置いてマトリゲルを固めた後、ＥＧＭ培地（Ｌｏｎｚａ，ＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＧｒｏｗｔｈＭｅｄｉｕｍ）を５００μｌずつ入れた。

その後、３７℃インキュベーターで血管内皮細胞の成長を誘導した。２日に１回ずつ培地を交換し、この時、フルスルチアミン塩酸塩を２０μＭ又は５０μＭ濃度で処置した。脈絡膜／鞏膜を植えた日から３日～５日後に観察し、脈絡膜から生長した血管内皮細胞の成長を確認した。組織からスプラウティングした範囲までの距離を、イメージＪ（ＩｍａｇｅＪ）プログラムを用いて総４ヶ所の位置における距離を測定して平均した。統計処理は、Ｐｒｉｓｍプログラムを用いて、ｐ値０．０５以下（ｐ＜０．０５）の場合を有意性があると表示した。

その結果、血管内皮細胞成長がフルスルチアミンによって減少することを確認した（図２ａ～図２ｂ及び表１）。

実施例３：フルスルチアミンのＶＥＧＦ分泌抑制効果
ＡＲＰＥ－１９細胞を６０ｍｍ皿（ｄｉｓｈ）に分注し、１日程度付着するようにした。翌日、無血清（ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ）培地に交換した後、フルスルチアミン塩酸塩０μＭ、５０μＭ、及び１００μＭ（Ｔｏｒｏｎｔｏｒｅｓｅａｒｃｈｃｈｅｍｉｃａｌ）とビークル（ＤＭＳＯ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を各細胞に濃度別に処置し、低酸素チャンバー（ＩＮＶＩＶＯ_２４００，Ｂａｋｅｒ）に入れて１％酸素条件に露出させた。

そして、１２時間後に培地を回収し、ヒトＶＥＧＦ酵素免疫測定キット（Ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）、Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）で培地に分泌されたＶＥＧＦの量を測定した。測定方法及び濃度計算は、キットに提供されたマニュアルに従った。統計処理は、Ｐｒｉｓｍプログラムを用いて、ｐ値０．０５以下（ｐ＜０．０５）の場合を有意性があると表示した。

その結果、フルスルチアミンが低酸素条件（１％酸素）によって増加するＶＥＧＦ分泌を抑制することを確認した（図３及び表２）。

実施例４：フルオレセイン血管造影法を用いて血管漏出程度比較
黄斑変性の動物モデルであるレーザー誘導脈絡膜網膜病症モデルにおける薬物効能を調べるために、７～８週齢のＣ５７ブラック／６Ｊ（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）マウスを使用した。フルスルチアミン（Ｆｕｒｓｕｌｔｉａｍｉｎｅ）投与群と対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）をそれぞれ１０匹ずつ使用し、レーザー照射１日前からレーザー照射後１週までの総８日間フルスルチアミン５０ｍｇ／ｋｇを経口投与した。対照群は、溶媒として用いた滅菌蒸留水を同じ方法で投与した。

アバチン（Ａｖｅｒｔｉｎ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）でマウスを麻酔し、両眼に散瞳剤（ミドリンＰ、テジュン製薬）を投与して瞳孔を拡張させた。アルゴンレーザー（ＯｃｕｌｉｇｈｔＧＬ，ＩＲＩＤＥＸ）を両眼に照射して１眼球当たりに４個のレーザー斑点（ｓｐｏｔ）を作った。

１週後にマウスを麻酔後に、フルオレセイン（ＡＫ－ＦＬＵＯＲ１０％，Ａｋｏｒｎ）を腹腔に投与し、ＭＩＣＲＯＮＩＶＢａｓｉｃＳｙｓｔｅｍ（ＰｈｏｅｎｉｘＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｓ）を用いて網膜基底部及びフルオレセイン血管造影イメージを撮影した。

フルオレセイン注射後、３分以内に現れる初期（ｅａｒｌｙｐｈａｓｅ）と７分程度で現れる後期（ｌａｔｅｐｈａｓｅ）に血管漏出（ｖａｓｃｕｌａｒｌｅａｋａｇｅ）程度を撮影し、両時期間に見られる蛍光輝度とサイズの変化程度を確認した。

斑点の蛍光輝度とサイズの両方とも増加すれば２Ｂ、輝度だけ増加すれば２Ａ、差異ががなければ１、斑点が出来なければ０とスコア（ｓｃｏｒｉｎｇ）して比較した。２Ｂとスコアされた斑点が多いほど新生血管漏出が増加したことを意味する。統計処理は、Ｐｒｉｓｍプログラムを用いて、ｐ値０．０５以下（ｐ＜０．０５）の場合を有意性があると表示した。

その結果、脈絡膜網膜病症モデルにおいて、フルスルチアミン処理時に新生血管漏出程度が後期（ｌａｔｅｐｈａｓｅ）で減少し、この結果から、フルスルチアミンによって血管漏出程度が減少することを確認した（図４ａ及び図４ｂ）。

実施例５：レーザー誘導脈絡膜新生血管モデル（ｌａｓｅｒ－ｉｎｄｕｃｅｄＣＮＶ）においてフルスルチアミンによるＣＮＶ病変サイズ確認
レーザー誘導脈絡膜網膜病症モデル誘導のために、７～８週齢のＣ５７ブラック／６Ｊ（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）マウスをアバチン（Ａｖｅｒｔｉｎ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で麻酔し、両眼に散瞳剤（ミドリンＰ、テジュン製薬）を投与して瞳孔を拡張させた。アルゴンレーザー（ＯｃｕｌｉｇｈｔＧＬ，ＩＲＩＤＥＸ）を両眼に照射して１眼球当たりに４個のレーザー斑点（ｓｐｏｔ）を作った。フルスルチアミン（Ｆｕｒｓｕｌｔｉａｍｉｎｅ）投与群と対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）をそれぞれ１０匹ずつ使用し、レーザー照射１日前からレーザー照射後１週までの８日間フルスルチアミン５０ｍｇ／ｋｇを経口投与した。対照群は、溶媒として用いた滅菌蒸留水を同じ方法で投与した。

レーザー照射１週後にマウスを麻酔後、フルオレセイン血管造影撮影後に組織染色のために眼球を摘出し、４％パラホルムアルデヒド（４％ＰＦＡ，ＥＭＳ）に３０分間固定した。角膜とレンズを除去した後、網膜と脈絡膜を分離した。分離された脈絡膜をブロッキングバッファー（ｂｌｏｃｋｉｎｇｂｕｆｆｅｒ，０．２％ウシ血清アルブミン、５％正常ヤギ血清、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）に入れて１時間反応させた。血管のマーカーの一つであるイソレクチン（ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ）抗体（ＩｓｏｌｅｃｔｉｎＩＢ４－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をブロッキングバッファーに希釈した後、組織に入れて反応させた。その後、脈絡膜を扁平に展開し、その上にマウント溶液（Ｍｏｕｎｔａｎｔ，Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を置き、カバーガラスを覆って安定化させた。

翌日、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ８００，Ｚｅｉｓｓ）を用いて１００倍の倍率で撮影した。各レーザー斑点のサイズは、イメージＪ（ＩｍａｇｅＪ）プログラムを用いて定量化した。統計処理は、Ｐｒｉｓｍプログラムを用いて、ｐ値０．０５以下（ｐ＜０．０５）の場合を有意性があると表示した。

その結果、フルスルチアミンによってＣＮＶ病変サイズが減少することを確認した（図５及び表３）。

実施例６：網膜色素上皮においてフルスルチアミンによるミトコンドリア代謝変化確認
新生血管性加齢黄斑変性は炎症が主要病理的メカニズムであると知られており、フルスルチアミン処理によるミトコンドリア代謝回復の有無とこれによる炎症抑制効果を確認した。ミトコンドリアの代謝変化は炎症の誘発又は悪化を引き起こすこともあるので、フルスルチアミンがミトコンドリアの代謝を回復させる場合、それを炎症を伴う新生血管性眼疾患の予防又は治療に適用できると予測した。

具体的に、ＡＲＰＥ－１９細胞を９６ウェルＸＦプレート（ｐｌａｔｅ）に分注し、２日に１回ずつ培地を交換した。細胞を植えて５日目にＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を１０μｇ／ｍｌ処理し、６日目にフルスルチアミンを５０μＭ処理した。７日目にＸＦ培地（ＳｅａｈｏｒｓｅＸＦＤＭＥＭｍｅｄｉｕｍ，Ａｇｉｌｅｎｔ）に交換し、３７℃、Ｎｏｎ－ＣＯ_２インキュベーター（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）に３０分間置いた。

ミトコンドリア予備容量（Ｓｐａｒｅｃａｐａｃｉｔｙ）を確認するために、ミトコンドリア電子伝達抑制剤（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）及び細胞呼吸阻害剤としてオリゴマイシン（Ｏｌｉｇｏｍｙｃｉｎ）２μＭ、ＦＣＣＰ０．５μＭ、ロテノン（Ｒｏｔｅｎｏｎｅ）２μＭ、アンチマイシン（Ａｎｔｉｍｙｃｉｎ）Ａ２μＭをそれぞれ段階別に使用した。

ＳｅａｈｏｒｓｅＸＦ分析機（ＳｅａｈｏｒｓｅＸＦｅ９６ａｎａｌｙｚｅｒ，Ａｇｉｌｅｎｔ）で細胞内酸素消耗率（ＯｘｙｇｅｎＣｏｍｓｕｍｐｔｉｏｎＲａｔｅ，ＯＣＲ）を測定した。測定方法は、ＳｅａｈｏｒｓｅＸＦ分析機（ＳｅａｈｏｒｓｅＸＦｅ９６ａｎａｌｙｚｅｒ，Ａｇｉｌｅｎｔ）で提供されたマニュアルに従って行った。

その結果、ＬＰＳによって減少したミトコンドリア予備容量（Ｓｐａｒｅｃａｐａｃｉｔｙ）が、フルスルチアミン処置時に回復することを確認した。このことから、フルスルチアミンによるミトコンドリアエネルギー代謝の変化が炎症抑制効果に関与できるという点を確認した（図６ａ～図６ｂ及び表４）。

以上の結果は、新生血管性加齢黄斑変性発病メカニズムにおいてフルスルチアミンの阻害効果を示し、フルスルチアミンを含む組成物の処置時に黄斑変性の予防及び治療効果を奏することを示唆する。

Claims

フルスルチアミン（ｆｕｒｓｕｌｔｉａｍｉｎｅ）又はその塩（ｓａｌｔｓ）を含む新生血管性加齢黄斑変性（Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ＮｅｏｖａｓｃｕｌａｒＡＭＤ）予防又は治療用薬剤学的組成物（ただし、ピリドキサミン化合物と組み合わせて用いられるものを除く。）。
前記薬剤学的組成物は、眼球内（ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ）、眼球周囲（ｐｅｒｉｏｃｕｌａｒ）、眼球後ろ（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌ）、網膜下（ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ）、網膜中心（ｃｅｎｔｒａｌｒｅｔｉｎａｌ）、中心窩外部（ｐａｒａｆｏｖｅａ）、結膜下（ｓｕｂｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｌ）、硝子体内（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅｏｕｓ）、前房内（ｉｎｔｒａｃａｍｅｒａｌ）、又は脈絡膜上（ｓｕｐｒａｃｈｏｒｏｉｄａｌ）に投与される、請求項１に記載の薬剤学的組成物。
フルスルチアミン（ｆｕｒｓｕｌｔｉａｍｉｎｅ）又はその塩（ｓａｌｔｓ）を含む新生血管性加齢黄斑変性（Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ＮｅｏｖａｓｃｕｌａｒＡＭＤ）予防又は改善用食品組成物（ただし、ピリドキサミン化合物と組み合わせて用いられるものを除く。）。
フルスルチアミン（ｆｕｒｓｕｌｔｉａｍｉｎｅ）又はその塩（ｓａｌｔｓ）を含む新生血管性眼疾患（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｏｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅ）予防又は治療用薬剤学的組成物（ただし、ピリドキサミン化合物と組み合わせて用いられるものを除く。）。
前記新生血管性眼疾患は、角膜血管新生（ｃｏｒｎｅａｌｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、網膜血管新生（ｒｅｔｉｎａｌｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、脈絡膜血管新生（ｃｈｏｒｏｉｄａｌｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、眼球内血管新生（ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、新生血管性緑内障（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｇｌａｕｃｏｍａ）、増殖性糖尿病性網膜症（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｄｉａｂｅｔｉｃｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、新生血管性黄斑変性（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、又は未熟児網膜病症（ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙｏｆｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ）である、請求項４に記載の薬剤学的組成物。
フルスルチアミン（ｆｕｒｓｕｌｔｉａｍｉｎｅ）又はその塩（ｓａｌｔｓ）を含む新生血管性眼疾患（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｏｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅ）予防又は改善用食品組成物（ただし、ピリドキサミン化合物と組み合わせて用いられるものを除く。）。
前記新生血管性眼疾患は、角膜血管新生（ｃｏｒｎｅａｌｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、網膜血管新生（ｒｅｔｉｎａｌｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、脈絡膜血管新生（ｃｈｏｒｏｉｄａｌｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、眼球内血管新生（ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、新生血管性緑内障（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｇｌａｕｃｏｍａ）、増殖性糖尿病性網膜症（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｄｉａｂｅｔｉｃｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、新生血管性黄斑変性（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、又は未熟児網膜病症（ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙｏｆｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ）である、請求項６に記載の食品組成物。