PT1457551E - ''novo microrganismo'' - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "NOVO MICRORGANISMO"

Campo Técnico A presente invenção refere-se a um novo hipertermófilo derivado de adubo que se pode multiplicar a 80 °C ou superior. Técnica Antecedente

Até à data, os micróbios termofilicos foram sujeitos a actuação em resíduos orgânicos tais como fezes de animais domésticos, excrementos e urina, lama, e resíduos da cidade para fermentar aerobicamente os resíduos e torná-los sem odor e secos, preparando deste modo adubo. Adicionalmente, como tais micróbios termofilicos, foram conhecidos actinomicetas termofilicos pertencendo ao género Thermoactinomyces ou Thermomonospora (documento JP55-121992 A) , uma mistura de bactérias termofílicas, aeróbias e formadoras de esporos, tais como aquelas pertencendo ao géneros Bacillus ou Geobacillus ou bactérias produtoras de ácido láctico (documento JP51-129759 A) , Bacillus subtilis aeróbio (documento JP6-5197 A), bactérias pertencendo aos género Thermus aquaticus possuindo capacidade de solubilização da lenhina (documento JP6-105679 A), bactérias aeróbias degradadoras de celulose Clostridium thermocellum, Thermus aquaticus (documento JP6-191977) e dai em diante. 1

Contudo, em vez de utilizar estes micróbios, apesar da temperatura da fermentação ser elevada para 70 °C ou superior devido ao calor da fermentação no momento da fermentação, a temperatura é elevada para 80 °C no máximo, e assim, não podem ser extintos os saprófitas, em particular, saprófitas formadores de esporos. Adicionalmente, o número de células bacterianas úteis no fertilizante obtido é no máximo 100.000.000 por g (fertilizante seco), de modo que quando as células são utilizadas como um fertilizante, o efeito fertilizante não pode ser suficientemente exibido.

Para resolver estes problemas referentes ao acondicionamento da lama, os requerentes da presente invenção procederam a estudos intensivos para obter um produto fermentado que purifica a lama sujeitando a lama a tratamento por fermentação a elevadas temperaturas de 85 °C ou superior, de um modo mais preferido 95 °C ou superior, para extinguir saprófitas, semente de ervas daninhas, e semelhantes, e que contém uma grande quantidade de células bacterianas úteis. Como resultado, os requerentes encontraram um método de obtenção de um produto de lama fermentada contendo unicamente uma grande quantidade de células bacterianas úteis, compreendendo: adição de uma cultura de uma bactéria que cresce a temperaturas não inferiores a 85 °C, obtida a partir do solo da região vulcânica de Kirishima na jurisdição de Kagoshima, Japão, à lama em estado bruto, misturando-as; e sujeitando a mistura resultante a fermentação aeróbica para extinguir os saprófitas e sementes contidos na lama a uma temperatura de fermentação de 85 °C ou superior para purificar a lama, e obtiveram uma patente no método (documento JP3064221 B). Deste modo, a lama fermentada foi utilizada como adubo, na qual foram verificadas em grandes 2 quantidades bactérias formadoras de esporos mesofilicas, bactérias formadoras de esporos termofílicas, termófilos e semelhantes pertencendo ao género Bacillus ou Geobacillus.

Isto é, cerca de 1000000000 células bacterianas estão incluídas por g de lama fermentada, incluindo as bactérias predominantemente bactérias aeróbias, bactérias termofílicas e esporos termodúricos como apresentado na Tabela 1

Tabela 1

Tipo de bactéria Número de células bacterianas viáveis por g Bactérias aeróbias 9,9 x 10a Bactérias termofílicas 8,4 x 10' Esporos termodúricos 2,8 x 10' Enterobactérias 100 ou inferior Bactérias gram-negativas 100 ou inferior Bactérias gram-positivas 2,8 x 10b Bactérias ácido-lácticas 100 ou inferior Bactérias anaeróbias 100 ou inferior Actinomicetas mesofílicos 1,1 x 10J Actinomicetas termofílicos 6,0 x 102 Fungos filamentosos 100 ou inferior Leveduras 100 ou inferior

Por outro lado, na cultura, uma colónia que cresceu dominantemente na placa de cultura foi seleccionada para obter uma bactéria isolada, e a bactéria isolada foi sujeita a 3 observação morfológica e semelhantes de modo a pesquisar micróbios que podem estar relacionados com a fermentação. Como resultado, foi revelado que os seguintes micróbios estão relacionados com a fermentação.

Tabela 2

Grupo de bactérias isolado Número de células bacterianas viáveis por g Bacilos polimórficos, gram-positivos sem esporos 7 x 10' Bactérias aeróbias formadoras de esporos mesofilicas 3 x 10M termofilicas 8 x 10' Cocos gram-positivos, positivos para a catalase 1 x 10' Actinomicetas mesofilicas 1 x 10J termofilicas 6 x 10^

Como anteriormente descrito, foi revelado que estão envolvidos bacilos gram-positivos não formadores de esporos, bactérias aeróbias formadoras de esporos (mesofilicas e termofilicas), essencialmente polimórficas.

Por outro lado, foi realizada a medição de termófilos consultando a descrição em, "Methods for Isolating Microbes", YAMAZATO, Kazuhide e outros três, ed., publicado por R&D Planning. 0 termófilo dominante foi a bactéria aeróbia formadora de esporos (termofilica). 4

Adicionalmente, a bactéria aeróbia formadora de esporos mesofilica (bactéria a isolada), bactéria aeróbia formadora de esporos (bactéria b isolada) termofilica, e termófila (bactéria c isolada) que foram isoladas predominantemente na pesquisa anteriormente mencionada de micróbios foram submetidas a observação morfológica, testes de propriedades fisiológicas e medição do conteúdo de GC do ADN na célula bacteriana. Os resultados são apresentados na Tabela 3.

Tabela 3

Item de teste Resultado do teste Bactéria a isolada Bactéria b isolada Bactéria c isolada Morfologia bastonete bastonete bastonete Coloração de Gram + + + Esporo + + + Forma Circular a elipsoidal Elipsoidal Elipsoidal Sítio Central Quase-flagelada Quase-flagelada a flagelada Esporângio Não dilatado Dilatado Não dilatado a levemente dilatado Mobilidade - + Comportamento junto de enzimas Aeróbio Aeróbio Aeróbio Catalase + + + Crescimento sob condições anaeróbias Item de teste Resultado do teste Bactéria a isolada Bactéria b isolada Bactéria c isolada Reacção V-P - - pH do crescimento V-P 6,5 CO O 5, 6 5 (continuação)

Formação de ácido Glucose _*2 Arabinose NT* _*2 NT* Xilose NT* _*2 NT* Manitol NT* _*2 NT’ Formação de gás a partir da glucose - _ *2 - Decomposição da caseína + - NT* Salinização da gelatina + - + Decomposição do amido - - - Assimilação de citrato - _*2 - Assimilação de propionato _ *2 Decomposição da tirosina - - - Desaminação da fenilalanina - NT* NT* Reacção à gema de ovo - - - Redução de nitrato + Crescimento a pH 6,8 (caldo de nutrientes) + - + Crescimento a pH 5,7 - - - Item de teste Resultado do teste Bactéria a isolada Bactéria b isolada Bactéria c isolada Crescimento na presença de NaCl a 5% + + - 6 (continuação)

Crescimento na presença de NaCl a 7% + + - Crescimento a 10 °C - - NT* Crescimento a 30 °C + Lento - Crescimento a 40 °C + + + Crescimento a 50 °C - + NT* Crescimento a 55 °C NT* + + Crescimento a 65 °C NT* - + Crescimento a 70 °C NT* NT* + Crescimento a 71 °C NT* NT* + Crescimento a 72 °C NT* NT* - Conteúdo de GC do ADN da célula (% em mol) 52*1 52*1 40*1 *NT: nenhum teste realizado; *1 Por um método de HPLC; "*2 Meio utilizado ajustado para pH 8,0 A bactéria isolada não corresponde a qualquer das espécies no que diz respeito às propriedades uma vez que não foram identificadas as suas espécies. A bactéria b isolada apresentou bom crescimento num meio ligeiramente alcalino (pH 8,0 a 8,5) mas não cresceu num meio a pH 7,0, e os resultados dos testes em outras propriedades sugeriram que era uma espécie próxima de Bacillus badius ou B. brevis. Contudo, a bactéria b possui propriedades que não são típicas para nenhuma delas, de modo que 7 não foi alcançada a identificação das espécies. Adicionalmente, devido à bactéria c isolada ter apresentado propriedades bacteriológicas idênticas àquelas do Geobacillus stearothermophilus, pode ser identificado como a mesma espécie. Contudo, uma elevada diferença no seu conteúdo de GC sugeriu que estas são espécies proximamente relacionadas.

Estas bactérias isoladas foram depositadas na Agency of Industrial Science and Technology, National Institute of Bioscience and Human-Technology (presentemente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Microorganism Depository), em que os números de acesso foram respectivamente atribuídos: número de acesso YM-01 FERM P-15085 para a bactéria a isolada, número de acesso YM-02 FERM P-15086 para a bactéria b isolada, e número de acesso YM-03 FERM P-15087 para a bactéria c isolada.

Os requerentes da presente invenção efectuaram estudos adicionais na presença de tais micróbios que crescem a elevadas temperaturas em adubo e encontraram surpreendentemente um hipertermófilo pertencendo a um novo género que se multiplica vigorosamente a elevadas temperaturas de 75 °C ou superior, apresentando ainda a sua multiplicação a 85 °C mas não apresenta multiplicação a 50 °C ou inferior.

Divulgação da Invenção

Um objectivo da presente invenção é obter um novo termófilo, em particular, um hipertermófilo a partir do adubo obtido por fermentação da lama a 85 °C ou superior.

De modo a solucionar os problemas anteriormente mencionados, os requerentes da presente invenção tentaram pesquisar micróbios termofilicos que existem no adubo obtido fermentando a lama a 85 °C ou superior (nome comercial Satsuma Soil; fabricado pelo Bureau of Waterworks Department, Cidade de Kagoshima) e como resultado, os requerentes encontraram uma bactéria absolutamente aeróbia que não se multiplica a uma temperatura de cultura para bactérias comuns (30 a 40 °C) mas cresce vigorosamente e multiplica-se a 70 a 85 °C, em particular, a 80 °C ou superior. Os requerentes realizaram assim análise sistemática filogenética das bactérias, baseada na sequência de nucleótidos do ADNr 16S. Como resultado, os requerentes da presente invenção descobriram que apesar desta bactéria absolutamente aeróbia ser gram-negativa e não possuir capacidade de formação de esporos, está próxima das bactérias gram-positivas do solo pertencendo ao género Bacillus ou Geobacillus mas é uma bactéria que é independente destas bactérias ao nivel de pelo menos o género. Os requerentes da presente invenção denominaram a bactéria de Caldothrix satsumae YM081 e depositaram-na no International Organism Depositary, o National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, na Independent Administrative Institution sob o Ministério da Economia, Comercio e Industria e, foi-lhes atribuído um número de acesso FERM P-18598. Depois disso, a bactéria foi transferida para o depositário internacional, em que foi atribuído um número de acesso FERM BP-8233.

Isto é, a presente invenção, refere-se a um novo hipertermófilo pertencendo ao género Caldothrix que se multiplica a 80 °C ou superior. 9 A presente invenção refere-se a um novo hipertermófilo que pertence a Caldothrix satsumae.

Em particular, a presente invenção refere-se à estirpe Caldothrix satsumae YM081 (FERM BP-8233), que é um hipertermófilo novo.

Adicionalmente, a sequência de nucleótidos completa de ADNr 16S desta bactéria possui uma sequência de nucleótidos como apresentado na SEQ ID N°. 1 na listagem de sequências.

Breve Descrição dos Desenhos A Fig. 1 é uma árvore filogenética do género Caldothrix da presente invenção baseada no ADNr 16S. Saliente-se que na Fig. 1, YM081 indica a estirpe Caldothrix satsumae YM081, o hipertermófilo da presente invenção. A Fig. 2 é uma micrografia óptica da estirpe Caldothrix satsumae YM081 da presente invenção. A Fig. 3 é um micrografia electrónica de varrimento da estirpe Caldothrix satsumae YM081 da presente invenção. A Fig. 4 é uma micrografia electrónica de transmissão da estirpe Caldothrix satsumae YM081 da presente invenção. A Fig. 5 é uma micrografia electrónica (ampliada 5000 vezes) de uma secção ultrafina de uma célula da estirpe Caldothrix satsumae YM081 da presente invenção. 10 A Fig. 6 é um gráfico apresentando o tempo de geração dependente da temperatura da estirpe Caldothríx satsumae YM081 da presente invenção.

Melhor Modo para realizar a Invenção 0 hipertermófilo da presente invenção foi isolado a partir do adubo (nome comercial Satsuma Soil) obtido por fermentação de resíduos orgânicos tais como excrementos e urina da cidade de Kagoshima, jurisdição de Kagoshima, Japão, a elevadas temperaturas de acordo com o método descrito no documento JP 3064221 B. Quanto ao método de isolamento, foi utilizado o seguinte método. A 5 mL de um meio possuindo a composição descrita na Tabela 4 seguinte, foi adicionado cerca de 0,1 g do adubo anteriormente mencionado. Foi repetida a subcultura enquanto se manteve a temperatura a 80 °C para enriquecer a bactéria, e depois foi repetido o seu isolamento e purificação numa placa contendo o mesmo meio como anteriormente descrito para o qual foi adicionado goma de gelano.

Tabela 4

Amido solúvel 0,1 g Caseína 0,3 g NaCl 5 g Extracto de levedura 0,2 g Água 100 mL pH 7,2 11

As propriedades microbiológicas e posição taxonómica da bactéria assim obtidas são como de seguida. 1) Morfologicamente, é um bacilo longo possuindo uma largura de 0,5 ym e um comprimento de 3 ym. Os resultados da coloração de gram foram negativos. A observação por microscopia electrónica de uma secção ultrafina da célula microbiana também indicou que a estrutura à superfície da célula é do tipo gram-negativo, isto é, foi observada a existência de uma membrana externa além da membrana celular (membrana plasmática) e parede celular. Não tem capacidade para formação de esporos. 2) Cresce vigorosamente de 70 °C até 85 °C; não é observado crescimento a 50 °C ou inferior. A elevadas temperaturas de 75 °C ou superior, multiplica-se vigorosamente e até a 85 °C é observada multiplicação. É um aeróbio obrigatório. 3) O pH óptimo para multiplicação é neutro. O intervalo de pH no qual se pode multiplicar é de 6 a 9. Também, apresenta fraco halofilismo. 4) Apresenta assimilação de várias proteínas, tais como albumina e caseína, bem como de amido. 5) Possui produção de urease mas não possui capacidade de redução de nitrato. Não apresenta produção de sulfato de hidrogénio ou produção de indole. 6) O conteúdo de G+C do ADN é de 70,0%. 12 7) Foi realizada a análise sistemática filogenética baseada na sequência de nucleótidos de ADNr 16S. Os resultados são apresentados na Fig. 1 e Tabela 6. Adicionalmente, a sequência de nucleótidos completa de ADNr 16S foi apresentada na SEQ ID N°. 1 na listagem de sequências.

Como descrito anteriormente, a bactéria da presente invenção é próxima do género Bacillus ou Geobacillus de bactérias do solo gram-positivas possuindo capacidade de formar esporos ainda que a bactéria seja gram-negativa e não possui capacidade de formar esporos. Contudo, a bactéria é independente destas bactérias ao nivel, de pelo menos, do género. A partir destas, foi revelado que o micróbio da presente invenção pertence às Eubactérias e é um hipertermófilo. Adicionalmente, a partir da sequência de nucleótidos de ADNr 16S, foi revelado que o micróbio é próximo do Geobacillus stearothermophilus mas forma um seu género independente.

Exemplos A presente invenção será descrita a titulo de exemplos de referência e exemplos como se segue. Contudo, a presente invenção não deverá ser concebida como estando limitada a estes exemplos de referência e exemplos. 13

Exemplo de Referência 1 1. Preparação de cultura de celular

Foi misturado o solo a 37 a 40 °C de uma zona com enxofre na cintura vulcânica de Kirishima na cidade de Makizono, distrito de Aira, jurisdição de Kagoshima, Japão, com o solo num arrozal perto desse onde crescem líquenes verdes. À mistura foi adicionada uma solução aquosa de sacarose numa quantidade de 3 a 4 litros/m1 2, sendo obtida a solução de sacarose dissolvendo sacarose em água que era 500 a 1000 vezes o volume da sacarose. A mistura resultante foi cultivada sendo deixada a 40 a 50 °C durante 30 a 50 dias. Foram misturadas alíquotas da cultura com lama em bruto em vários lotes, que depois foram deixados ser fermentados sob condições aeróbicas com ventilação de ar para o seu interior. 0 lote que possuía uma temperatura de fermentação de 85 °C ou superior foi adoptado como uma cultura de células. 14 1

Tratamento de lama em bruto 2 A uma mistura de fezes de animais, lama de esgotos, resíduos de amido, e resíduo de cozinha foi adicionada cal apagada para realizar o tratamento desodorizante. A seguir, 80 partes em peso da sua alíquota foram misturas com 20 partes em peso da cultura de células obtida no passo 1 anterior e foi realizada a fermentação num tanque de fermentação sob condições aeróbicas. Procedendo assim, a temperatura do produto fermentado aumentou desde a temperatura ambiente para 85 a 95 °C no período de um dia. A esta temperatura, a fermentação foi mantida durante cerca de 3 dias, e no 5o dia desde o início da fermentação, o produto foi revolvido (misturado). Como um resultado de misturar, a temperatura do produto fermentado decresceu para cerca de 60 °C mas em cerca de 1 dia, aumentou para 85 a 95 °C. A fermentação foi continuada mantendo esta temperatura durante 5 dias. Repetindo as operações de fermentação e misturando várias vezes, a temperatura do produto fermentado no momento de misturar e a temperatura de fermentação foram decrescendo gradualmente. Foi definido como o dia final de fermentação, o dia quando a temperatura do produto fermentado no momento de misturar decresceu para cerca de 35 °C após repetir estas operações quatro vezes. O produto fermentado obtido foi seco para formar grânulos castanhos que poderão ser utilizados como um fertilizante orgânico. 3. Preparação de adubo de material em bruto

Foram misturadas 80 partes em peso de lama em bruto obtida sujeitando a lama a partir de resíduos urbanos da cidade Kagoshima, jurisdição de Kagoshima, Japão, a desidratação por compressão para reduzir o seu conteúdo em água para 68%, e 20 partes em peso da cultura de células obtida no passo 2 anterior. A mistura foi carregada numa área para fermentação em que foi ventilado ar a partir do fundo para realizar a fermentação. No 7o dia a partir do início da fermentação, a temperatura atingiu 98 °C. Após ter sido realizada a fermentação durante 10 dias, quando a temperatura de fermentação começou a decrescer a partir de 98 °C, foi realizada a mistura para permitir que a fermentação prosseguisse de novo. Após a temperatura de 99 °C ter sido alcançada pela primeira vez, i. e., no 10° dia a partir da mistura, a temperatura decresceu abruptamente para 60 a 70 °C. Neste ponto, o produto da fermentação foi espalhado na área para fermentação para 15 arrefecer rapidamente até à temperatura ambiente para obter pó de lama fermentado castanho. 0 pó de lama fermentado pode ser utilizado como adubo, ou cultura celular ou meio para realizar a fermentação anteriormente mencionada.

Exemplo 1

Isolamento do hipertermófilo

Cerca de 0,1 g do adubo obtido no Exemplo de Referência 1 foi inoculado em 5 mL de meio descrito na Tabela 4 e transferido e cultivado repetidamente a 80 °C para enriquecer a bactéria. Dai em diante, o isolamento e purificação da bactéria foi realizado repetidamente em placas contendo o meio possuindo a mesma composição, como descrito anteriormente, às quais foi adicionada goma de gelano para obter o hipertermófilo da presente invenção. É de notar que a amostra do adubo foi adicionada ao meio de extracto de peptona/levedura (peptona a 0,5%, extracto de levedura a 0,3%, pH 7,2) e a mistura resultante foi cultivada a 70 °C, seguido por isolamento das células bacterianas multiplicadas numa placa de agar (pH 7,2, 70 °C) . Como resultado, foram encontradas Geobacillus stearothermophilus que eram anteriormente reconhecidos serem responsáveis pela fermentação do adubo à temperatura de 70 °C ou superior e uma quantidade de outros novos termófilos. 16

Exemplo 2

Propriedades microbiológicas do hipertermófilo 0 hipertermófilo da presente invenção obtido no Exemplo 1 foi inoculado num meio de agar com pH 7 a 8 contendo 0,3% de caseína, 0,2% de extracto de levedura, 0,1 de amido, e 5% de NaCl, e cultivado a 80 °C durante 24 horas, seguido por examinação das propriedades microbiológicas. Os resultados obtidos são apresentados na Tabela 5.

As imagens de microscópio do hipertermófilo são apresentadas nas Figs. 2 a 5.

Tabela 5

Item de teste Resultado do teste Morfologia Bacillus longo (largura 0,5 pm, comprimento 3 pm) Coloração de Gram Negativa Capacidade de formação de esporos Não observada Mobilidade Não observada Comportamento junto de moléculas de oxigénio Aeróbio absoluto Item de teste Resultado do teste Crescimento sob condições anaeróbias Não se multiplica Dependência da Cresce vigorosamente de 70 a 85 °C 17 (continuação) temperatura do crescimento mas não é observada multiplicação a 50 °C ou inferior. A multiplicação é observada mesmo a 85 °C ou mais. pH do crescimento Neutro (a multiplicação é possível a pH de 6 a 9) Necessidades de sal para o crescimento Fracamente halofílico (concentração de NaCl óptima de 5%) Decomposição da albumina + Decomposição da caseina + Decomposição de açúcares e compostos relacionados Glicerol + Eritrol - D-Arabinose - L-Arabinose - Ribose + D-Xilose - L-Xilose - Adonitol - β-Metil-D- xilósido Galactose - Glucose + Frutose + Manose + Item de teste Resultado do teste Sorbose - Ramnose - 18 (continuação)

Dulcitol - Inositol - Manitol + Sorbitol - a-Metil-D-manósido - a-Metil-D-glucósido - N-acetilglucosamina - Amigdalina - Albutina - Esculina + Salicina - Celobiose + Maltose + Lactose - Melibiose - Sacarose + Trealose - Inulina - Melezitose ± Decomposição de açúcares e os compostos relacionados Rafinose - Amido + Item de teste Resultado do teste Glicogénio - Xilitol - Gentiobiose - D-Turanose - 19 (continuação) D-Lixose - D-Tagatose - D-Fucose - L-Fucose - D-Arabitol - L-Arabitol - Gluconato - 2-Cetogluconato - 5-Cetogluconato - Arabinose + Redução de Nitrato - Produção de acetoina - Formação de sulfito de hidrogénio Formação de índole - Conteúdo de GC do ADN cromossomal (% de mol) 70,0 Outros A sequência de nucleótidos completa de ADN 16S foi determinada e baseada nisto, foi construída uma árvore molecular filogenética. Os resultados são apresentados na Fig. 1 e na Tabela 6 20

Tabela 6 T s

Como resultado, foi clarificado que embora a bactéria da presente invenção pertença às Eubactérias, é gram-negativa e não possui capacidade de formação de esporos, o isolado está relacionado proximamente com bactérias do solo gram-positivas que possuem capacidade de formação de esporos e pertencem ao género Bacillus ou Geobacillus, contudo o isolado não é monofilético com estes, pertencendo assim a um novo género. Adicionalmente, quanto ao conteúdo de GC do ADN, não existiu bactéria que apresentasse 90% ou mais de homologia da sequência com a sequência base de ADNr 16S de C. satsumae YM801 como apresentado na Tabela 1, e a bactéria da presente invenção era equidistantemente remota (85% cada) dos dois géneros, i. e.,

Bacillus e Geobacillus, de modo que foi determinado ser um novo género (ver Tabela 6 e Fig. 1) . Assim, este género foi denominado Caldothrix. Uma vez que a temperatura de multiplicação óptima é 80 °C, esta bactéria foi revelada ser um hipertermófilo. É de notar que a comparação das propriedades bioquímicas entre Caldothrix satsumae YM801 da presente invenção e Bacillus subtilus são apresentadas na Tabela 7.

Tabela 7 YM081 B. subtilus Actividade de oxidase - - Produção de sulfito de hidrogénio - - Actividade de galactosidase + + Fermentabilidade da leucina - - Produtividade da acetoína - + Produtividade de índole - - 22 (continuação) YM081 B. subtilus Utilização de ácido cítrico + + Utilização de lisina - - Utilização de Ornitina - - Utilização de arginina - - Decomposibilidade de ureia + - Utilização de ácido malónico - - Redução de Nitrato - + A bactéria anteriormente mencionada pertencendo a um novo género da presente invenção foi denominada de estirpe de Caldothrix satsumae YM801 e depositada no Patent Microorganism Depository, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, onde foi atribuído um número de acesso FERM P-18598. Posteriormente, a bactéria foi transferida para um depositário internacional, onde foi atribuído um número de acesso FERM BP-8233.

Exemplo 3

Relacionamento entre a temperatura e crescimento da estirpe de Caldothrix satsumae YM801 A estirpe de Caldothrix satsumae YM801 foi inoculada em meio compreendendo extracto de amido/caseína/levedura e submetida a agitação da cultura a 120 rpm às respectivas temperaturas predeterminadas e foi medido o tempo de duplicação (tempo até que o número de células seja duplicado) . Os resultados são apresentados na Fig. 6. 23

Como é evidente a partir da Fig. 6, a temperatura óptima de multiplicação da bactéria foi 78 °C. 0 tempo de duplicação a 78 °C foi de cerca de 26 minutos enquanto o tempo de duplicação a 82 °C foi cerca de 55 minutos, e até a 82 °C, a bactéria continuou a multiplicar-se a metade da taxa sob a condição óptima.

Adicionalmente, a adição de solução aquosa extraída a partir do adubo para o meio permitiu a multiplicação até mesmo a 85 °C como apresentado na Tabela 8.

Tabela 8

Temperatura da Sem solução Com adição da cultura extraída solução extraída* co o o O +++ +++ 85 °C - ++ *: A solução extraída foi adicionada ao meio apresentado na Tabela 4

Aplicação Industrial

Quando a cultura da fermentação é inoculada com resíduos orgânicos tais como excrementos e urina como um material bruto para realizar fermentação, a temperatura de fermentação aumenta devido a uma quantidade de mesófilos pertencendo ao género Bacillus ou Geobacillus. Depois disso, com o aumento da temperatura da fermentação, o hipertermófilo, C. satsumae da presente invenção começa a participar na decomposição e 24 fermentação dos resíduos orgânicos. Consequentemente, o hipertermófilo da presente invenção é utilizado vantajosamente como, por exemplo, uma bactéria de arranque ou meio para decompor e fermentar os resíduos orgânicos a elevadas temperaturas para produzir adubo.

Adicionalmente, a protease e amilase produzidas pelo hipertermófilo possuem actividades a elevadas temperaturas e por isso é espectável a produção de enzimas de resistência ao calor utilizando esta propriedade.

Comentários aos Materiais Biológicos Depositados A. Nome e endereço da organização na qual os materiais biológicos foram depositados:

Nome: Patent Microorganism Depository, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Endereço: Código Postal: 305-8565, Chuo No. 6, 1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, Japão. B. Data da deposição para a organização A: 7 de Novembro de 2002 (Data do depósito original: 13 de Novembro de 2001) C. Número de depósito atribuído pela organização A: FERM BP-8233 25

Listagem de Sequências <110> KABUSHIKI KAISHA SANYU <120> Micróbio Novo <130> 46913.epOl <140> EP02790837,5 <141> 2002-12-24 <150> JP391561-2001 <151> 2001-12-25 < 16 0 > 1

<210> 1 <211> 1520 <212> ADN <213> Caldothríx satsumae < 4 0 0 > 1 26 agagtttgat cctggctcag ggggcttttc gcgtgaagcc cgtaacacgt gggcaaccta ccggatagga cggcggaccg ggatgggccc gcggcccatt gtagccggcc tgagagggtg gggaggcagc agtagggaat gagggaggaa ggccttcggg aagagggccg cgcgctgacg ccgcggtaaa acgtaggggg gcggcctctt aagtccggtg gggaggcttg agggcaggag gatcgggagg aacaccagtg gaaagcgtgg ggagcaaaca gctaggtgtg aggggcgttt ggggagtacg gccgcaaggc gagcatgtgg tttaattcga accgccccag agatggggtt ttgtcgtcag ctcgtgtcgt ccctagttgc cagcgggtga gaaggtgggg atgacgtcaa aatggccggt acaaagggtt cagttcggat tgcaggcttg gggatcagca tgccgcggtg cgagagtctg caacacccga ggtggggcag atgattgggg gacgaacgct ggcggcgcgc ctaatacatg caagtcgagc 60 ttcgggcgga tcgcggggag agcctagcgg cgaacgggtg 120 ccccgaggac cgggataact ccgggaaacc ggggctaata 180 catggtccgc cgtggaaagg cggcgcaagc tgccacctcg 240 agcttgttgg tggggtaacg gcccaccaag gcgacgatgg B00 accggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac 360 cttccgcaat gggcgaaagc ctgacggagc gacgccgcgt 420 tcgtaaacct ctgttgtcag ggacgaaccc gtgcggttcg 480 gtacctgacg aggaagcccc ggctaactac gtgccagcag 540 cgagcgttgt ccggaattac tgggcgtaaa gcgcgcgtag 600 tgaaagcccg cggctcaacc gcgggaggcc actggaaact 660 aggggagtgg aattcccggt gtagcggtga aatgcgtaga 720 gygaaggcgg ctccctggcc tgtacctgac gctgaggcgc 780 ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgggt 840 ggcccttcgt gccgaagcta acgcgataag caccccgcct 900 tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg 960 agcaacgcga agaaccttac cagggcttga catcccgctg 1020 tccctccttt cggagggcag cggtgacagg tggtgcatgg 1080 gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccctgc 1140 ggccgggcac tctaggggga ctgccggcga caagccggag 1200 atcatcatgc cccttatgcc ctgggctaca cacgtgctac 1260 gcgaacccgc gagggggagc caatcccaaa aagccggtct 1320 caactcgcct gcatgaaggc ggaatcgcta gtaaatccgc 1380 aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca 1440 agtcggtgcg ccaacccctt acggggaggc agccgccgaa 1500 1520

Lisboa, 24 de Maio de 2007 27

Claims (2)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Hipertermófilo, Caldothrix satsumae, obtenível microrganismo depositado FERM BP-8233.
2. 2. Hipertermófilo de acordo com a reivindicação 1 sequência completa de nucleótidos do ADNr 16S é na SEQ ID N°. 1 na listagem de sequências. Lisboa, 24 de Maio de 2007 a partir do , do qual a apresentada 1