PT1417349E

PT1417349E - Novo alvo molecular da neurotoxicidade

Info

Publication number: PT1417349E
Application number: PT02777405T
Authority: PT
Inventors: Ali Ait Ikhlef; Annelies Resink; Fabien Schweighoffer
Original assignee: Exonhit Therapeutics Sa
Priority date: 2001-08-14
Filing date: 2002-08-13
Publication date: 2009-02-09
Also published as: EP1982704A2; PT1982704E; JP2005500066A; EP1417349A2; DE60229953D1; ATE414790T1; EP1982704B1; DK1417349T3; JP4527395B2; CN1541278A; CA2457611C; CN101632663A; US20030064374A1; EP1982704B2; CA2457611A1; NZ530939A; IL160141A; FR2828693B1; FR2828693A1; WO2003016563A3

Description

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DESCRIÇÃO "NOVO ALVO MOLECULAR DA NEUROTOXICIDADE" A presente invenção relaciona-se com a área da biologia, da genética e da medicina. Refere-se nomeadamente a novos procedimentos para o tratamento (ou a gestão) de patologias neurodegenerativas, e particularmente da esclerose lateral amiotrófica. A invenção resulta nomeadamente da identificação do papel da fosfodiesterase 4B nestas patologias e descreve o seu uso como alvo ou marcador terapêutico, diagnóstico ou experimental destes transtornos.

Foram descritas numerosas patologias neurodegenerativas que têm um componente ou uma etapa ligado (a) ao fenómeno da excitotoxicidade. É o caso da doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose múltipla e coreia de Huntington. No caso da esclerose múltipla, está nomeadamente descrito na patente US 6060501 um tratamento preventivo ou curativo mediante a administração de uma combinação de inibidores de PDE4 e agentes anti-inflamatórios ou imunomoduladores. A esclerose lateral amiotrófica (ELA ou ALS por "Amyotrophic Lateral Sclerosis") é uma doença neurodegenerativa associada a diferentes tipos de inclusões tais como os corpos de Lewis e caracterizada por uma apoptose dos motoneurónios espinhais e corticais cujo resultado mortal por vezes está associado a uma demência frontal. As formas esporádicas, sem qualquer mutação descrita, coexistem com as formas familiares (ELAF) associadas a mutações no gene SOD1 que codifica o superóxido-dismutase. Na maioria dos casos são esporádicas, 2 sendo as formas familiares (ELAF) muito raras. É provável que um longo periodo assintomático preceda o aparecimento de sintomas clínicos, que são variados e de classificação complexa. Os futuros desenvolvimentos terapêuticos substituirão os tratamentos da sintomatologia com estratégias baseadas nas causas moleculares da patologia. Ao nível celular, estes sintomas estão associados à morte de motoneurónios corticais e motoneurónios espinhais. Ligou-se esta morte neuronal a diferentes fenómenos que constituem a base de várias patologias neurodegenerativas. É este o caso da excitotoxicidade ligada ao glutamato, do stress oxidativo, de uma certa auto-imunidade dirigida contra marcadores neuronais (os canais de cálcio no caso da ELA), assim como anomalias do citosqueleto. Embora estes fenómenos estejam descritos, a(s) causa(s) destas doenças, entre elas a ELA, são desconhecidas. Embora as ELAF estejam ligadas a mutações no gene S0D1 que codifica o superóxido-dismutase, os mecanismos que levam os neurónios à morte celular, da qual pelo menos um componente é a apoptose, são desconhecidos. A identificação dos eventos moleculares envolvidos nos diferentes fenómenos envolvidos na morte celular permitirá o estabelecimento de novas estratégias terapêuticas. 0 estudo destes eventos é dificilmente realizável a partir de biópsias humanas. Estas biópsias provêm evidentemente de amostras post mortem cuja qualidade é dificilmente controlável e só representam estados patológicos representativos de fases tardias da doença.

Os modelos animais dão acesso a amostras biológicas que permitem a análise de diferentes etapas do desenvolvimento de uma patologia e a comparação destas etapas com sujeitos sãos. A este respeito, encontram-se 3 disponíveis ratos transgénicos que expressam o gene humano S0D1 que porta uma das mutações prevalentes na ELAF (mutação G93A) no Jackson Laboratory, sob a condição de uma concessão de licença de uso pela Northwestern University. Este modelo reproduz em 120 dias o resultado mortal da doença com sintomas comparáveis aos da doença humana. O aparecimento de sintomas da mesma ligados à mutação G93A em SOD1 não é consequência de uma redução da actividade superóxido-dismutase, mas sim de uma ampliação de função que aumenta a capacidade da enzima para gerar radicais livres. Apesar destas informações, os eventos moleculares que presidem às diferentes etapas da ELA são mal conhecidos. A complexidade destes eventos moleculares reflecte a evolução da patologia: no modelo transgénico estudado, não se notou qualquer desregulação neuronal nem manifestação clínica ao fim de 30 dias. Os 60 dias correspondem a uma etapa que precede ligeiramente os primeiros sintomas mas que se caracteriza, já a nível cerebral, por alterações da fisiologia celular tais como uma alteração do metabolismo mitocondrial, um stress e uma morte celular associados a um fenómeno de excitotoxicidade. Ao fim de 90 dias, 50% dos motoneurónios corticais e espinhais morreram e iniciou-se um processo activo de apoptose neuronal paralelamente a uma activação astrocíticas. O fenómeno de excitotoxicidade já não se observa nesta etapa. A morte neuronal está associada à activação de caspases que não parecem envolvidas nas fases precoces da patologia. A identificação dos diferentes eventos moleculares específicos das diferentes fases da patologia deve permitir a identificação de novos alvos terapêuticos assim como novos marcadores diagnósticos. Uma das focagens mais 4 eficazes para a execução desta identificação consiste em identificar os genes e as proteínas cuja expressão caracterize um estado fisiopatológico. A presente invenção descreve agora a identificação de eventos genéticos envolvidos nos fenómenos de excitotoxicidade e morte neuronal. Desta forma, a presente invenção proporciona novas focagens terapêuticas e diagnósticas de patologias associadas a estes fenómenos, assim como novos alvos para a identificação de compostos activos.

Mais particularmente, foi efectuada uma análise qualitativa diferencial a partir de ARN extraídos de amostras de cérebro e de espinal medula, sem isolamento prévio dos neurónios, com o objectivo de se ter em conta um máximo de eventos de corte e junção alternativos ligados ao desenvolvimento da patologia. Esta análise foi efectuada mediante despistagem diferencial qualitativa de acordo com a técnica DATAS (descrita no pedido n° WO99/46403), que apresenta vantagens desiguais. 0 presente pedido de patente resulta nomeadamente da construção pelo solicitante de um repertório de alterações de corte e junção no cérebro de animais-modelo de ELA com 60 dias de idade. Este repertório, que contém mais de 200 sequências diferentes, envolve os intervenientes fundamentais do fenómeno de excitotoxicidade tais como os canais de potássio e o receptor de NMDA. As sequências derivadas de ARN que codificam as proteínas envolvidas na resposta ao stress, tais como as proteínas de choque térmico, fazem igualmente parte deste repertório, sublinhando o envolvimento desta resposta nas fases precoces da ELA. Uma alteração do metabolismo energético parece afectar claramente os motoneurónios corticais dos 5 animais que desenvolvem a patologia. Por exemplo, o intrão 6 da forma mitocondrial de creatina-cinase é especificamente isolado a partir de ARN mensageiros expressos em condições patológicas em animais com 60 dias de idade. Esta interrupção da sequência de codificação por esta retenção de intrão desemboca num ARN mensageiro que codifica uma forma inactiva da enzima. Esta observação está de acordo com as observações bioquímicas que demonstraram uma diminuição da actividade creatina-cinase mitocondrial, correlacionada com uma diminuição da quantidade desta enzima nos neurónios de animais do mesmo modelo transgénico. A especificidade das sequências que constituem este repertório é atestada pelo facto de a mesma análise diferencial qualitativa da expressão genética efectuada em animais com 90 dias de idade desembocar num repertório diferente de que estão ausentes nomeadamente os diferentes marcadores de excitotoxicidade. A análise das modificações de corte e junção confirma que os eventos moleculares são diferentes, dependendo da etapa da patologia.

De forma particularmente interessante e inesperada, a execução de DATAS sobre ARN de animais de controlo e transgénicos com 60 dias de idade permitiu o isolamento de um fragmento de ADNc derivado de ARNm de fosfodiesterase 4B. Este fragmento corresponde a um fragmento de exão presente especificamente nos animais de controlo e que é eliminado especificamente nos animais transgénicos de SOD1G93A na etapa de 60 dias. Este fragmento abrange os nucleótidos 377 a 486 referidos a partir do códão de paragem de PDE4B de rato (SEC ID N° 1) (sequência igualmente acessível no GenBank, n° AF208023). Esta sequência compreende 2912 bases, correspondendo o fragmento eliminado às bases 2760 a 2869. Esta região não codificante 6 expressa-se diferenciadamente entre os animais de controlo e os animais transgénicos, devido ao uso alternativo de um exão 3' não codificante ou devido ao uso de dois sítios de poliadenilação alternativos. Esta expressão diferencial foi detectada mediante experiências de PCR TI apresentadas nas figuras IA e 1B.

Por isso, o presente pedido demonstra o envolvimento da fosfodiesterase 4B no desenvolvimento dos processos de excitotoxicidade e morte neuronal. Os resultados obtidos demonstram uma expressão mais pronunciada de PDE4B nos tecidos nervosos patológicos, ligada a uma modificação estrutural do respectivo ARN, nomeadamente à delecção de uma região na parte 3' não codificante. Este resultado é absolutamente compatível com a presença de sequências de desestabilização do ARNm na sequência identificada pela DATAS. A sua delecção do ARNm de PDE4B mediante corte e junção ou mediante o uso de sequências de poliadenilação alternativas pode desembocar numa estabilização e, por conseguinte, num aumento da expressão da parte codificante deste ARN. Este evento verifica-se especificamente no cérebro de sujeitos patológicos e não em sujeitos de controlo. Por isso, a presente invenção descreve um evento molecular original que desemboca num aumento da expressão do ARNm de PDE4B no cérebro de sujeitos patológicos e que está correlacionado no tempo com o fenómeno da excitotoxicidade e/ou morte neuronal. A invenção mostra igualmente, pela primeira vez, que um aumento da expressão de PDE4B está associado às etapas precoces da ELA. Por isso, a PDE4B constitui um alvo terapêutico novo e importante no desenvolvimento de terapias destas patologias, utilizáveis nomeadamente em fases precoces do seu desenvolvimento, e que se dirigem às verdadeiras bases 7 moleculares da patologia e não aos sintomas ou componentes inflamatórios a ela associados. A invenção descreve igualmente novos procedimentos de diagnóstico, despistagem, detecção, determinação de uma predisposição ou seguimento da evolução ou da eficácia do tratamento destas patologias.

Detecção, diagnóstico e despistagem

Por isso, a presente invenção descreve um procedimento de detecção de uma situação de excitotoxicidade ou de stress neuronal num sujeito, que compreende a medição in vitro da expressão de fosfodiesterase 4, nomeadamente de fosfodiesterase 4B, numa amostra proveniente do sujeito. 0 procedimento compreende vantajosamente uma medida da expressão diferencial da região 3' não codificante do gene de PDE4B e do resto do gene, nomeadamente da parte codificante.

Por isso, a invenção descreve um procedimento de detecção de uma situação de excitotoxicidade ou de stress neuronal num sujeito, que compreende a detecção da presença de uma forma mutada de ARN de f osf odiesterase 4, nomeadamente de fosfodiesterase 4B, numa amostra proveniente do sujeito, particularmente de uma forma com delecção total ou parcial da região 3' não codificante. A invenção divulga igualmente o uso de um ácido nucleico que compreende toda ou parte de uma sequência derivada do gene ou do ARN mensageiro de PDE4B para a utilização de um procedimento de diagnóstico ou de detecção de uma situação de stress neuronal e mais particularmente da situação de excitotoxicidade. A invenção baseia-se, em geral, no uso de um ácido nucleico complementar de todo ou parte do gene ou do mensageiro de PDE4B para a detecção de eventos patológicos do tipo de excitotoxicidade, stress ou morte neuronal, etc. Mais geralmente, a invenção fundamenta-se num procedimento de diagnóstico, despistagem, caracterização ou seguimento de uma patologia degenerativa, que compreende a detecção de uma alteração no gene de PDE4 ou no respectivo ARN, tipicamente de PDE4B. A expressão de PDE4, ou a expressão diferencial, ou a presença de uma forma alterada podem ser determinadas mediante técnicas convencionais de biologia molecular como, por exemplo, mediante sequenciação, hibridação, amplificação, PCR-TI, migração em gel, etc. A invenção é aplicável ao diagnóstico ou à detecção de diferentes patologias que envolvem fenómenos de excitotoxicidade, tais como a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose múltipla, ELA, coreia de Huntington ou isquemia cerebral. Pode ser usada para a detecção precoce, a detecção de uma predisposição, a escolha e adaptação de um tratamento, o seguimento da evolução da patologia, etc. Está particularmente adaptada à detecção numa fase precoce da esclerose múltipla ou da ELA.

Para a utilização dos procedimentos genéticos de diagnóstico ou de detecção de acordo com a invenção, usam-se mais particularmente ácidos nucleicos capazes de detectarem uma forma de ARNm de PDE4B com delecção, nomeadamente uma forma desprovida de toda ou parte da região 3' não codificante. Como forma de exemplo especifico, usa-se um ácido nucleico complementar de toda ou parte da região compreendida entre os residuos 2760 a 2869 da sequência SEC ID N° 1, ou dos residuos correspondentes à sequência do gene ou do ARNm da PDE4B 9 humana. A sequência de ADNc que codifica a PDE4B humana e da respectiva proteína estão representadas nas sequências SEC ID N° 3 e 4 (veja igualmente Genbank, n° NM002600). A região 3' não codificante do ARN ou do gene de PDE4B humana corresponde aos resíduos 2461 a 4068 da SEC ID N° 3.

Vantajosamente, o ácido nucleico usado (como sonda) compreende toda ou parte da sequência codificante da região 3' não codificante do gene ou do ARN da PDE4B compreendida entre os nucleótidos 2384 e 2869 da sequência SEC ID N° 1 ou entre os nucleótidos 2461 e 4068 da sequência SEC N° ID 3, ou uma sequência complementar das mesmas.

De acordo com modos específicos de utilização, a invenção usa um ácido nucleico complementar de uma região compreendida numa das sequências seguintes: resíduos 2384 a 2869 da SEC ID N° 1 resíduos 2500 a 2869 da SEC ID N° 1 resíduos 2760 a 2869 da SEC ID N° 1 resíduos 2780 a 2850 da SEC ID N° 1 resíduos 2790 a 2810 da SEC ID N° 1 resíduos 2600 a 4040 da SEC ID N° 3 resíduos 3000 a 4040 da SEC ID N° 3 resíduos 3500 a 4040 da SEC ID N° 3 resíduos 3900 a 4040 da SEC ID N° 3.

De acordo com outro modo particular, usa-se um ácido nucleico complementar da sequência da região de ARN da PDE4 resultante da delecção de toda ou parte da parte 3' não codificante. A eliminação de um domínio cria efectivamente novas uniões na sequência, que são específicas da forma com delecção e podem ser usadas para se detectar a presença de tal forma numa amostra. 10 A complementaridade entre a sonda e a sequência-alvo é preferivelmente perfeita para se garantir uma melhor especificidade de hibridação. No entanto, entende-se que se podem tolerar certos desemparelhamentos. O ácido nucleico usado para a utilização dos procedimentos anteriores pode ser um ADN ou um ARN, preferivelmente um ADN de origem sintética. Compreende preferivelmente de 10 a 500 bases, tipicamente de 10 a 100 bases. Entende-se que se pode usar um ácido nucleico mais longo, se se desejar, embora tal não seja preferível. O ácido nucleico é vantajosamente um ADN monocatenário de 10 a 500 bases, complementar de uma região pelo menos da sequência 3' não codificante da PDE4B. O ácido nucleico pode ser marcado, por exemplo, por via radioactiva, enzimática, luminescente, fluorescente, quimica, etc.

Outra focagem para a detecção da presença de uma alteração do gene de PDE4 usa um iniciador ou um par de iniciadores nucleicos que permitem uma amplificação selectiva de uma porção do ARN de PDE4, que compreende preferivelmente uma porção da região 3' não codificante. Usa-se tipicamente um iniciador que permite a amplificação selectiva da forma alterada do ARN de PDE4, nomeadamente um iniciador especifico da união criada pela eliminação de parte da região 3' do ARN. A este respeito, a invenção descreve um iniciador complementar de uma parte da região 3' não codificante de PDE4B e que permite a amplificação de uma parte desta região. O iniciador compreende vantajosamente de 8 a 20 bases. É composto preferivelmente por um fragmento de 8 a 20 resíduos consecutivos da sequência compreendida entre os nucleótidos 2384 e 2869 da sequência SEC ID N° 1 ou entre os nucleótidos 2461 e 4068 da sequência SEC ID N° 3 ou de 11 uma sequência complementar das mesmas. A invenção descreve um par de iniciadores que permitem a amplificação especifica, pelo menos de uma parte, da região 3' não codificante de PDE4, compreendendo tal par pelo menos um iniciador tal como anteriormente definido.

Para a utilização dos procedimentos descritos, coloca-se in vitro uma amostra biológica de um sujeito, que contém um ácido nucleico, em contacto com um ácido nucleico (sonda, iniciador, etc.) tal como anteriormente definido, e detecta-se a formação de um hibrido ou de um produto de amplificação. A amostra biológica pode ser uma amostra de sangue, fluido, célula, tecido, etc. 0 ácido nucleico pode ser imobilizado sobre um suporte do tipo vidro, sílica, nylon, etc. 0 procedimento de detecção, despistagem ou diagnóstico pode ser utilizado a partir de diferentes tipos de amostras provenientes de um sujeito como, por exemplo, biópsias de tecidos, nomeadamente de tecido nervoso. De forma particularmente surpreendente e vantajosa, a presente invenção mostra, além disso, que a desregulação da expressão de PDE4, correlacionada com o fenómeno da excitotoxicidade, pode ser detectada directamente no tecido muscular. Isto é particularmente notável no caso de patologias neurodegenerativas tais como a ELA.

No decurso do desenvolvimento da ELA, os fenómenos degenerativos ocorrem não só no cérebro, mas também na espinal medula, e como consequência no músculo por falta de inervação. A figura 2 apresenta as modificações de expressão do ARNm da PDE4B em músculos de ratos de controlo e transgénicos, seguidas usando os mesmos iniciadores de PCR que no estudo do ARN de cérebros destes mesmos animais. De forma análoga, embora menos pronunciada, observa-se uma 12 diminuição da expressão da região 3' não codificante da PDE4B, e não do resto deste ARNm (nomeadamente a parte codificante) , isto é, nos músculos de animais no fim da fase pré-sintomática, isto é, com 90 dias de idade.

Uma das dificuldades encontradas nos estudos e os tratamentos da ELA é a dificuldade de se estabelecer um diagnóstico precoce. Esta observação de desregulação do ARNm da PDE4B no músculo da ELA permite a proposta de um diagnóstico precoce a partir de biópsias musculares de doentes. Este diagnóstico baseia-se na detecção da expressão diferencial da região 3' não codificante e da restante sequência, nomeadamente codificante, da PDE4B.

Um procedimento especifico de detecção de uma situação de stress neuronal, nomeadamente de excitotoxicidade, ligada particularmente a uma patologia neurodegenerativa num sujeito, compreende a medição da expressão do gene de PDE4B, ou da presença de formas com delecção do mensageiro de PDE4B, numa amostra de células musculares provenientes de tal sujeito.

Para a medição da expressão diferencial usa-se, por exemplo, uma sonda correspondente a (isto é, especifica de) uma parte da região 3' não codificante e uma sonda correspondente a uma parte da região codificante de PDE4B. O sinal detectado com qualquer uma destas sondas permite a avaliação do diferencial de expressão. Outra focagem usa dois pares de iniciadores que permitem a amplificação de uma porção da região 3' não codificante por um lado e de uma parte da região codificante por outro lado. A presente invenção divulga igualmente um kit para a análise da expressão de PDE4, nomeadamente da expressão diferencial entre a região 3' não codificante e a região codificante, compreendendo o kit uma sonda de nucleótidos 13 específica de uma parte da sequência da região 3' não codificante e uma sonda de nucleótidos específica de uma parte da sequência da região codificante. A presente invenção divulga igualmente um kit para a análise da expressão de PDE4, nomeadamente da expressão diferencial entre a região 3' não codificante e a região codificante, compreendendo o kit um par de iniciadores de nucleótidos que permitem a amplificação específica, pelo menos de uma parte, da região 3' não codificante de PDE4 e um par de iniciadores de nucleótidos que permitem a amplificação específica, pelo menos de uma parte da região codificante de PDE4.

Terapia

As fosfodiesterases hidrolisam os ácidos nucleicos cíclicos tais como o AMPc e o GMPc, regulando diferentes cascatas de sinalização. A PDE4B hidrolisa o AMPc, regulando desta forma a concentração intracelular deste segundo mensageiro. 0 envolvimento do AMPc no equilíbrio existente entre a viabilidade celular e a apoptose está bem descrito na bibliografia. Nomeadamente a cascata do AMPc está bem integrada nas cascatas de sobrevivência celular que envolvem cinases tais como a Akt e a P13K, assim como na regulação da actividade do factor de transcrição CREB. Deve-se observar que este factor de transcrição está envolvido na sobrevivência neuronal e no crescimento de axónios. No entanto, o uso de inibidores de PDE e vantajosamente de PDE4 nunca foi proposto para o melhoramento da viabilidade neuronal e mais especificamente a sua protecção contra a excitotoxicidade. Os inibidores de PDE4, desenvolvidos para a inibição dos fenómenos 14 inflamatórios, foram sugeridos como potencialmente úteis no caso de patologias neurodegenerativas como a doença de Alzheimer. Esta sugestão apoia-se na vontade de se reduzirem as inflamações observadas no cérebro no decurso dos processos neurodegenerativos e não num raciocínio focado na inibição directa da morte neuronal. A presente invenção mostra a existência de eventos de corte e junção ou de sítios de poliadenilação alternativos que afectam o gene de PDE4, associados ao desenvolvimento da excitotoxicidade neuronal, e proporciona a base molecular que justifica o uso de inibidores de PDE4 para o tratamento da ELA, e mais geralmente para melhorar a viabilidade neuronal nos fenómenos de excitotoxicidade, particularmente desde as fases precoces destas patologias.

Por isso, um objecto da invenção baseia-se, no uso de um composto capaz de inibir ou reduzir a expressão ou a actividade da PDE4B, para a preparação de uma composição destinada ao tratamento da ELA, nomeadamente numa fase precoce, mais preferivelmente para reduzir a excitotoxicidade neuronal precoce associada à ELA.

Um objecto particular baseia-se no uso de um inibidor da PDE4B para a preparação de uma composição destinada ao tratamento da ELA, nomeadamente para reduzir a excitotoxicidade em sujeitos afectados pela ELA ou para aumentar a sobrevivência neuronal em sujeitos afectados pela ELA.

Outro objecto da invenção baseia-se no uso de um composto capaz de inibir (preferivelmente de forma selectiva) a expressão da actividade da PDE4B de sequência SEC ID N° 2 ou 4 para a preparação de uma composição destinada a reduzir a excitotoxicidade neuronal.

Outro objecto da invenção baseia-se num procedimento 15 de tratamento de uma patologia associada a um stress neuronal, nomeadamente a uma excitotoxicidade, que compreende a administração a um sujeito de um composto inibidor da actividade ou da expressão de PDE4B, preferivelmente um composto inibidor selectivo de PDE4.

Outro objecto da invenção baseia-se num procedimento de tratamento da ELA, nomeadamente num procedimento para o aumento da sobrevivência de neurónios em doentes afectados pela ELA, que compreende a administração a um sujeito de um inibidor de PDE4B.

No contexto da invenção, o termo "tratamento" designa o tratamento preventivo, curativo, paliativo e igualmente a gestão de doentes (redução do sofrimento, aumento da duração da vida, abrandamento da progressão da doença), etc. Além disso, o tratamento pode ser efectuado em combinação com outros agentes ou tratamentos, nomeadamente orientados para eventos tardios da patologia, tais como os inibidores de caspases ou outros compostos activos.

Usa-se na presente invenção como inibidor da PDE4B um composto da família das pirazolopiridinas, entre as quais figura nomeadamente o etazolato.

Os compostos da família das pirazolopiridinas são particularmente seleccionados de entre os compostos seguintes: 0 etazolato com a fórmula seguinte:

16 Éster etilico do ácido 4-butilamino-l-etil-6-metil-lH-pirazolo[3,4-£>]piridin-5-carboxílico (tracazolatos), Éster etílico do ácido 4-butilamino-l-etil-lH-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico, 1- (4-aminopirazolo [3,4-£>] piridin-l-il) - -D-l-desoxirribofuranose,

Éster etílico do ácido l-etil-4-(Ν'-isopropiliden-hidrazino)-lH-pirazolo[S^-blpiridin-S-carboxílico (SQ 20009), 4-amino-6-metil-l-n-pentil-lH-pirazolo[3,4-blpiridina, Éster etílico do ácido 4-amino-l-etil-6-metil-líí-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico (tracazolato de desbutilo), 4- amino-l-pentil-lí/-pirazolo [3, í-blpiridin-S-carboxamida, Éster etílico do ácido l-etil-6-metil-4-metilamino-lH-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico, Éster etílico do ácido 4-amino-6-metil-l-propil-líí-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico, Éster etílico do ácido l-etil-4-etilamino-6-metil-lH-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico, Éster etílico do ácido 4-amino-l-butil-6-metil-lH-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico, 5- (4-aminopirazolo[3,4-b]piridin-l-il)-2-hidroximetiltetrahidrofurano-3-ol, Éster alílico do ácido l-alil-4-amino-6-metil-lH-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico, Ácido 4-amino-6-metil-l-pentil-lH-pirazolo[3,4- blpiridin-5-carboxílico, Éster etílico do ácido 4-amino-l-etil-3,6-dimetil-lH-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico, Éster etílico do ácido 4-dimetilamino-l-etil-6-metil- 17 lfí-pirazolo [3, 4-Jb]piridin-5-carboxílico, Éster etílico do ácido l-etil-6-metil-4-propilamino-lfí-pirazolo [3, 4-Jb]piridin-5-carboxílico, Éster etílico do ácido 4-amino-l-pentil-lfí-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico, Éster etílico do ácido 4-amino-6-metil-l-pent-4-inil-lfí-pirazolo [3, á-blpiridin-S-carboxílico, 4-amino-l-but-3-enil-lfí-pirazolo [3, í-blpiridin-S-alilamida, 4-amino-l-pentil-lfí-pirazolo [3, í-blpiridin-S-isopropilamida, 4-amino-l-pentil-fí-n-propil-lfí-pirazolo [3,4-blpiridin-5-carboxamida, Éster alílico do ácido 4-amino-l-butil-6-metil-lfí-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico, Éster etílico do ácido 4-amino-6-metil-l-pent-3-inil-lfí-pirazolo[3,í-blpiridin-S-carboxílico, 4-amino-l-pentil-lfí-pirazolo [3,4-jb]piridin-5-prop-2-inilamida, Éster alílico do ácido 4-amino-l-(3-metilbutil)-lfí- pirazolo [3,4-jb] piridin-5-carboxílico, 4-amino-l-pentil-lfí-pirazolo [3,4-£>] piridin-5-i\f- (2-propenil)carboxamida, Éster alílico do ácido 4-amino-l-pentil-lfí-pirazolo[3,á-blpiridin-S-carboxílico, 4-amino-l-pentil-lfí-pirazolo [3, í-blpiridin-S-butilamida, Éster alílico do ácido 4-amino-l-but-3-inil-6-metil- lfí-pirazolo [3, í-blpiridin-S-carboxílico, Éster alílico do ácido 4-amino-l-but-3-enil-6-metil- lfí-pirazolo [3, í-blpiridin-S-carboxílico, 4-amino-6-metil-l-pentil-lfí-pirazolo [3, í-bJpiridin-S- 18 alilamida, Éster alílico do ácido 4-amino-6-metil-l-pentil-lH pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico, Éster alílico do ácido 4-amino-6-metil-l- (3 metilbutil)-lH-pirazolo[3,í-blpiridin-S-carboxílico, Éster isobutílico do ácido 4-amino-6-metil-l-pentil Ιϋ-pirazolo[3,á-blpiridin-S-carboxílico, 4-amino-6-metil-l-pentil-lH-pirazolo [3,4-Jb]piridin-5-butilamida, Éster alílico do ácido 4-amino-6-metil-l-(3-metilbut 2-enil)-Ιϋ-pirazolo[3,á-blpiridin-S-carboxílico, 4-amino-l-pentil-lH-pirazolo [3,4-Jb]piridin-5-ciclopropilamida, 4-amino-1-pentil-lfí-pirazolo [3,4-Jb]piridin-5-hidroxamato de etilo, Éster prop-2-inílico do ácido 4-amino-6-metil-l pentil-lH-pirazolo[3,í-blpiridin-S-carboxílico, Éster alílico do ácido 4-amino-6-metil-l-pent-4-inil lH-pirazolo[3,í-blpiridin-S-carboxílico, Éster alílico do ácido 4-amino-6-metil-l-pent-4-enil lfí-pirazolo[3,í-blpiridin-S-carboxílico, 4-amino-l-pent-3-inil-lH-pirazolo [3,4-Jb]piridin-5-propilamida, 4-amino-l-pentil-lH-pirazolo[3,í-blpiridin-S-ciclopropilmetilamida, Éster 2-metilalílico do ácido 4-amino-6-metil-l pentil-lH-pirazolo[3,í-blpiridin-S-carboxílico, 4-amino-l-pent-3-inil-lH-pirazolo[3,í-blpiridin-S-alilamida (ICI 190.622), 4-amino-l-pent-4-inil-I\/-2-propenil-lJí-pirazolo [3,4-b]piridin-5-carboxamida, 4-amino-l-pent-3-inil-lfí-pirazolo[3,í-blpiridin-S- 19 prop-2-inilamida, 4-amino-l-pentil-lH-pirazolo[3,4-b]piridin-5-but-2-inilamida, Éster alílico do ácido 4-amino-6-metil-l-pent-3-inil-lH-pirazolo [3, 4-Jb]piridin-5-carboxílico, Éster alílico do ácido 4-amino-l-(2-ciclopropiletil)-6-metil-líí-pirazolo [3, 4-jb]piridin-5-carboxílico, Éster alílico do ácido 4-amino-l-hex-5-inil-6-metil-lH-pirazolo[3,4-£>] piridin-5-carboxílico, 4-amino-l-pent-3-inil-lH-pirazolo[3,4-£>] piridin-5-ciclopropilmetilamida, Éster but-3-enílico do ácido 4-amino-6-metil-l-pentil-lH-pirazolo[3,4-£>] piridin-5-carboxílico, Éster ciclopropilmetílico do ácido 4-amino-6-metil-l-pentil-lH-pirazolo[3,4-£>] piridin-5-carboxílico, 4-butilamino-l-pentil-lH-pirazolo[3,4-£>] piridin-5-alilamida, Éster 2-ciclopropiletílico do ácido 4-amino-6-metil-l-pentil-lH-pirazolo[3,4-£>] piridin-5-carboxílico, Éster ciclopropilmetílico do ácido 4-amino-6-metil-l-pent-3-inil-lí/-pirazolo [3, 4-£>] piridin-5-carboxílico, Éster ciclopropilmetílico do ácido 4-amino-6-metil-l-pent-4-inil-líí-pirazolo[3,4-£>] piridin-5-carboxílico, Éster etílico do ácido 4-amino-l-bencil-6-metil-lH-pirazolo[3,4-jb]piridin-5-carboxílico, 4-amino-l-pentil-lH-pirazolo[3,4-£>] piridin-5-benzilamida, 4-amino-l-pentil-lH-pirazolo[3,4-£>] piridin-5-fenilamida, Éster benzílico do ácido 4-amino-6-metil-l-pentil-lH-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico, 4-azido-l- -D-ribofuranosilpirazolo[3,4-b]piridina, 20 1- pent-3-inil-W-2-propenil-4-propionamido-lH-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxamida, 2- (4-aminopirazolo[3,4-blpiridin-l-il) - 5-hidroximetiltetrahidrofurano-3,4-diol, 2- (6-metil-lH-pirazolo[3,4-b]piridin-4-ilamino)etanol, 3- (6-metil-lH-pirazolo [3,4-£>] piridin-4-ilamino) propam- l-ol, Éster propilico do ácido 3-(6-metil-lH-pirazolo[3,4-b]piridin-4-ilamino)acético, éster etilico do ácido 2-(6-metil-lH-pirazolo[3,4- b]piridin-4-ilamino)propiónico, Éster etilico do ácido 2-(6-metil-lH-pirazolo[3,4- b]piridin-4-ilamino)pentanóico, Éster etilico do ácido 2-(6-metil-lH-pirazolo[3,4- b] piridin-4-ilamino)benzóico, Éster propilico do ácido 3-(6-metil-lH-pirazolo[3, 4-b]piridin-4-ilamino)pentanóico, W-benziliden-W' -(3-metil-l-fenil-lH-pirazolo[3,4-Jb]piridin-4-il)hidrazina, i\/'-furan-2-ilmetilen-i\/', - (3-metil-l-fenil-lH-pirazolo [3,4-jb]piridin-4-il)hidrazina, N- (4 — fluorobenziliden)-N' -(3-metil-l-fenil-lH-pirazolo [3,4-jb]piridin-4-il)hidrazina, N- (3-furan-2-ilaliliden)-N'-(3-metil-l-fenil-lH-ρίη3ζο1ο[3,4-ώ]ρίηίάίη-4-ί1)hidrazina, N- (4-metoxibenziliden)-N'-(3-metil-l-fenil-lH-pirazolo [3,4-jb]piridin-4-il)hidrazina, 4- [ (3-metil-l-fenil-lH-pirazolo [3,4-jb]piridin-4-il)hidrazonometil]-benzonitrilo, W-benzo[1,3]dioxol-5-ilmetilen-W'-(3-metil-l-fenil-lH- pirazolo[3,4-jb]piridin-4-il) hidra zina, N- (3-metil-l-fenil-lH-pirazolo [3,4-jb]piridin-4-il) -N' - 21 (4-nitrobenziliden)-hidrazina, N- (3-metil-l-fenil-lfí-pirazolo [3, 4-b] piridin-4-il)-Af'-(2-nitrobenziliden)-hidrazina, N- (3-metil-l-fenil-lfí-pirazolo [3,4-b]piridin-4-il) -N' -(4-trifluorometil-benziliden)hidrazina, N- (3-metil-l-fenil-lfí-pirazolo[3,4-b]piridin-4-il)-N' -(5-nitrofuran-2-ilmetilen)hidrazina, N- (3-metil-l-fenil-lfí-pirazolo [3,4-b]piridin-4-il) -N' -(2-trifluorometil-benziliden)hidrazina, N- (3-metil-l-fenil-lfí-pirazolo [3,4-b]piridin-4-il) -N' -(6-nitrobenzo[1,3]-dioxol-5-ilmetilen)hidrazina, Ácido 4-(3-cloro-4-metoxibenzilamino)-1-etil-lH- pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxilico, 4-(3-cloro-4-metoxibenzilamino)-1-etil-lH-pirazolo[3,4-jb]piridin-5- (piridin-4-ilmetil) amida, 4-(3-cloro-4-metoxibenzilamino)-1-etil-lH-pirazolo[3,4-b]piridin-5-(tetrahidrofurano-2-ilmetil)amida, 4-(3-cloro-4-metoxibenzilamino)-1-etil-lH-pirazolo[3,4-b]piridin-5-(5-hidroxipentil)amida, 4-(3-cloro-4-metoxibenzilamino)-1-etil-lH-pirazolo[3,4-b]piridin-5-[3-(2-oxopirrolidin-l-il)propilamida, Éster etilico do ácido 4-terc-butilamino-1-(2-cloro-2-feniletil) -lfí-pirazolo [3,4-b] piridin-5-carboxilico, Éster etilico do ácido l-(2-cloro-2-feniletil)-4- ciclopropilamino-lH-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico, Éster etilico do ácido 1-(2-cloro-2-feniletil)-4- propilamino-lH-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxilico, Éster etilico do ácido l-(2-cloro-2-feniletil)-4- fenilamino-lH-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxilico, Éster etilico do ácido 4-butilamino-l-(2-cloro-2- feniletil) -lfí-pirazolo [3,4-b] piridin-5-carboxilico, 22 Éster etilico do ácido 1- (2-cloro-2-feniletil)-4-(2-etoxie ti lamino) -lH-pirazolo [3,4 —io] piridin-5-carboxilico, Éster etilico do ácido 4-benzilamino-l-(2-cloro-2-feniletil) -lH-pirazolo [3,4 —io] piridin-5-carboxilico, Éster etilico do ácido l-(2-cloro-2-feniletil)-4-fenetilamino-lH-pirazolo[3,4-jb]piridin-5-carboxilico,

Por isso, a presente invenção propõe pela primeira vez a PDE4B como alvo terapêutico para o tratamento de eventos moleculares associados à excitotoxicidade. Dependendo dos modos de utilização específicos, a invenção pode ser usada para inibir ou reduzir a excitotoxicidade neuronal na fase precoce de doenças neurodegenerativas. Por isso, é aplicável ao tratamento da ELA.

Outros objectos da invenção baseiam-se em: • o uso dos compostos anteriormente indicados, particularmente do etazolato, para o tratamento da ELA, nomeadamente para reduzir a excitotoxicidade neuronal precoce da ELA, ou • o uso dos compostos anteriormente indicados, particularmente do etazolato, para a preparação de uma composição destinada a inibir a actividade da PDE4B em doentes afectados pela ELA. A invenção refere-se igualmente a procedimentos de tratamento da ELA que compreendem a administração de um composto que inibe selectivamente a expressão ou actividade da PDE4B de sequência SEC ID N° 2 ou 4. Preferivelmente, os procedimentos da invenção são usados para o tratamento na fase precoce da ELA. A administração pode ser efectuada mediante qualquer procedimento conhecido pelas pessoas especializadas na técnica, preferivelmente por via oral ou por injecção, 23 tipicamente por via intraperitoneal, intracerebral, intravenosa, intra-arterial ou intramuscular. Dá-se preferência à administração por via oral. As dose administradas podem ser adaptadas pelas pessoas especializadas na técnica. Tipicamente, injectam-se de 0,01 mg a 100 mg/kg no caso dos compostos inibidores de natureza química. No caso dos compostos nucleicos, as doses podem variar, por exemplo, entre 0,01 mg e 100 mg por dose. Entende-se que se podem efectuar injecções repetidas, eventualmente em combinação com outros agentes activos ou qualquer veículo aceitável ao nível farmacêutico (por exemplo, tampões, dissoluções salinas, isotónicas, na presença de agentes estabilizantes, etc.) etc.). A invenção é utilizável em mamíferos, nomeadamente no ser humano. Os resultados apresentados nos exemplos ilustram a eficácia de inibidores da PDE4B para o melhoramento da viabilidade de neurónios dispostos em condições de excitotoxicidade.

Procedimentos de selecção e ferramentas A invenção também divulga procedimentos de selecção, identificação ou caracterização de compostos activos sobre as patologias associadas à excitotoxicidade, ou ao stress neuronal, que compreendem a colocação de compostos de ensaio em contacto com uma célula que exprima a PDE4B (nomeadamente uma variante desprovida do domínio 3' não codificante) e a detecção de compostos que inibem a expressão ou a actividade desta proteína.

Os procedimentos podem ser utilizados com diferentes espécies celulares tais como células primárias ou linhas de 24 células de origem mamífera (humana, murina, etc.). Usam-se vantajosamente células que não expressam naturalmente a PDE4B, transfectadas com um ácido nucleico que codifica a variante desejada. Desta forma, a selectividade do procedimento é aumentada. Podem-se usar igualmente células eucarióticas inferiores (levedura, etc.) ou células procarióticas.

Os procedimentos de despistagem podem igualmente ser efectuados num sistema acelular, mediante a medição da capacidade dos compostos de ensaio para se ligarem à PDE4B ou a uma variante ou fragmento da mesma.

Outro objecto da invenção refere-se a qualquer ácido nucleico que codifique um polipéptido, tal como anteriormente definido, os vectores que o contêm, células recombinantes e usos. Os vectores podem ser plasmídeos, fagos, cosmídeos, vírus, cromossomas artificiais, etc. São vectores preferidos, por exemplo, vectores plasmídicos, tais como os derivados de plasmídeos comerciais (pUC, pcDNA, pBR, etc.). Tais vectores compreendem vantajosamente um gene de selecção e/ou uma origem de replicação e/ou um promotor de transcrição. Outros vectores particulares são, por exemplo, vírus ou fagos, nomeadamente de vírus recombinantes defectivos de replicação tais como os vírus derivados de retrovírus, adenovírus, AAV, herpesvírus, baculovírus, etc. Os vectores podem ser usados em qualquer hospedeiro competente como, por exemplo, células procarióticas ou eucarióticas. Pode-se tratar de bactérias (por exemplo E. coli), leveduras (por exemplo, Saccharomyces ou Kluyveromyces), células vegetais, células de insectos, células de mamíferos, nomeadamente humanas, etc. Pode-se tratar de linhas, células primárias, cultivos mistos, etc. 25

Aparecerão outros aspectos e vantagens da presente invenção após a leitura dos exemplos seguintes, que devem ser considerados como ilustrativos e não limitativos.

LEGENDAS DAS FIGURAS

Figura 1: PCR semi-quantitativa de PDE4B a partir de amostras de cérebro (IA) e de músculo (1B).

Figura 2: A pentoxifilina protege os neurónios primários contra grânulos cerebelosos da excitotoxicidade induzida pelo cainato.

Figura 3: A pentoxifilina protege os neurónios primários contra grânulos cerebelosos da excitotoxicidade induzida por NMDA/serina.

Figura 4: Efeito neuroprotector do etazolato sobre a toxicidade induzida por NMDA/serina sobre células granulares do cerebelo.

Figura 5: Efeito neuroprotector do etazolato sobre a toxicidade induzida pelo cainato sobre células granulares do cerebelo.

Figura 6: Efeito neuroprotector da pentoxifilina sobre a toxicidade induzida por NMDA/serina sobre os neurónios corticais.

Figura 7: Efeito neuroprotector da pentoxifilina sobre a toxicidade induzida pelos cainato sobre os neurónios corticais.

Figura 8: Efeito neuroprotector do etazolato sobre a toxicidade induzida por NDMA/serina sobre os neurónios corticais.

Figura 9: Efeito neuroprotector do etazolato sobre a toxicidade induzida pelo cainato sobre os neurónios corticais. 26

Figura 10: Efeito neuroprotector do 8-bromo-AMPc sobre a toxicidade induzida por NDMA/serina sobre células granulares do cerebelo.

Figura 11: Efeito neuroprotector do 8-bromo-AMPc sobre a toxicidade induzida pelo cainato sobre células granulares do cerebelo.

Exemplo 1: Identificação de PDE4 como alvo molecular da excitotoxicidade

Foi efectuada a análise qualitativa diferencial a partir de ARN poliadenilados (poli A+) extraídos de amostras de cérebros de animais correspondentes às diferentes etapas, sem o isolamento prévio dos neurónios, para se ter em conta o máximo de eventos de corte e junção alternativos ligados ao desenvolvimento da patologia.

Preparam-se os ARN poli A+ de acordo com técnicas conhecidas pelas pessoas especializadas na técnica. Pode-se tratar particularmente de um tratamento mediante agentes caotrópicos tais como o tiocianato de guanidino seguido de uma extracção do ARN total mediante solventes (fenol, clorofórmio, por exemplo). Tais procedimentos são bem conhecidos pelas pessoas especializadas na técnica (veja Maniatis et al., Chomczynsli et al., Anal. Biochem. 162 (1987) 156), e podem ser facilmente postos em prática usando kits disponíveis no comércio. A partir destes ARN totais, preparam-se os ARN poli A+ de acordo com procedimentos clássicos conhecidos pelas pessoas especializadas na técnica e propostos por kits comerciais.

Estes ARN poli A+ servem de matriz para reacções de 27 transcrição inversa com a ajuda de transcriptase inversa. Vantajosamente, usam-se transcriptases inversas desprovidas de actividade ARNase H, que permitem a obtenção das primeiras cadeias de ADN complementar de tamanhos superiores aos obtidos com transcriptases inversas clássicas. Tais preparados de transcriptases inversas sem actividade ARNase H estão disponíveis no comércio.

Para cada ponto da cinética de desenvolvimento da patologia (30 dias, 60 dias e 90 dias), preparam-se ARN poli A+ assim como ADNc monocatenários a partir de animais transgénicos (T) e de animais de controlo singénicos (C).

De acordo com a técnica DATAS, para cada ponto da cinética efectuam-se hibridações de ARNm (C) com ADNc (T) e hibridações reciprocas de ARNm (T) com ADNc (C).

Estes heterodúplices de ARNm/ADNc são em seguida purificados de acordo com os protocolos da técnica DATAS.

As sequências de ARN não emparelhadas com um ADN complementar libertam-se destes heterodúplices sob a acção da ARNase H, sendo esta enzima degradada pelas sequências de ARN emparelhadas. Estas sequências não emparelhadas representam as diferenças qualitativas existentes entre os ARN, aliás homólogos entre si. Estas diferenças qualitativas podem ser localizadas em qualquer lugar sobre a sequência de ARN, tanto em 5' como em 3' ou no interior da sequência, e nomeadamente na sequência codificante. Dependendo da sua localização, estas sequências podem ser não só modificações de corte e junção, mas também consequências de translocações ou delecções.

As sequências de ARN que representam as diferenças qualitativas são em seguida clonadas de acordo com técnicas conhecidas pelas pessoas especializadas na técnica e nomeadamente as que estão descritas na patente da técnica 28 DATAS .

Estas sequências reagrupam-se nos bancos de ADNc que constituem os bancos qualitativos diferenciais. Um destes bancos contém os exões e os intrões específicos da situação sã; os outros bancos contêm os eventos de corte e junção caracteristicos de condições patológicas.

Verificou-se a expressão diferencial de clones mediante hibridação com sondas obtidas mediante transcrição inversa a partir de ARN mensageiros extraídos das diferentes situações estudadas. Os clones que hibridam de forma diferencial foram retidos para análise posterior. As sequências identificadas pela técnica DATAS correspondem a intrões e/ou a exões expressos de forma diferencial mediante corte e junção entre as situações patológicas e a situação sã. Estes eventos de corte e junção podem ser específicos de uma determinada etapa do desenvolvimento da patologia ou caracteristicos do estado são. A comparação destas sequências com os bancos de dados permite a classificação das informações obtidas e a proposta de uma selecção raciocinada de sequências de acordo com o seu interesse diagnóstico ou terapêutico. A execução da DATAS sobre ARN de animais de controlo e transgénicos com 60 dias de idade permitiu o isolamento de um fragmento de ADNc derivado de ARNm de fosfodiesterase 4B. Este fragmento corresponde a um fragmento de exão especificamente presente nos animais de controlo e, por isso, especificamente eliminado nos animais transgénicos de SOD1 G93A na etapa de 60 dias. Este fragmento abrange os nucleótidos 377 a 486 referidos a partir do códão de paragem da PDE4B de rato (SEC ID N° 1) . Esta sequência compreende 2912 bases, correspondendo o fragmento eliminado às bases 2760 a 2869. Esta região não é codificante e 29 expressa-se diferenciadamente entre os animais de controlo e os animais transgénicos, devido ao uso alternativo de um exão 3' não codificante ou devido ao uso de dois sitios de poliadenilação alternativos.

Exemplo 2: Experiências de PCR-TI: confirmação da expressão diferencial:

Verificou-se a expressão diferencial da PDE4B numa situação de stress neuronal, relativamente a uma situação de referência, mediante as experiências de PCR-TI apresentadas na figura 1.

Estas experiências foram efectuadas de acordo com técnicas bem conhecidas pelas pessoas especializadas na técnica e permitiram que se seguissem as expressões de duas regiões diferentes do ARNm da PDE4B. Uma destas regiões abrange o códão de inicio deste ARNm (PDE4B 5' ) , a outra abrange em parte o fragmento identificado de acordo com a técnica DATAS (PDE4B DATAS). As localizações dos iniciadores de PCR usados estão indicadas na figura 1. 0 ARN PO corresponde a um ARN ribossómico usado como controlo interno destinado a verificar se é usada a mesma quantidade de ARN para cada ponto experimental. As análises foram efectuados a partir de ARN extraídos de animais de controlo (C) e transgénicos (T) com 30, 60 e 90 dias de idade, isto é, antes do aparecimento de sintomas patológicos.

Os ARN totais de cérebro de ratos de controlo ou SOD1 G93A com 30, 60 e 90 dias de idade transcrevem-se para ADNc usando o protocolo Standard Superscript™ (Invitrogene). Para as PCR semi-quantitativas, diluem-se 10 vezes os produtos de reacção de transcrição inversa. Os iniciadores 30

específicos do fragmento DATAS correspondem para o sentido aos nucleótidos 2526-2545 (5' GCC AGG CCG TGA AGC AAA TA 3'; SEC ID N° 5), e para o anti-sentido aos 2790-2807 (5' TCA AAG ACG CGA AAA CAT 3'; SEC ID N° 6), e para O fragmento mais em 3' os iniciadores correspondem para o sentido aos nucleótidos 145-165 (5' CCG CGT CAG TGC CTT TGC TAT 3'; SEC ID N° 7), e para o anti-sentido aos 426-404 (5' CGC TGT CGG ATG CTT TTA TTC AC 3'/ SEC ID N° 8). Como gene de referência, usa-se o gene PO e amplifica-se mediante os iniciadores, com sentido: 5' TCG CTT TCT GGA GGG TGT C 3' (SEC ID N° 9) e anti-sentido: CCG CAG GGG CAG CAG TGG 3' (SEC ID N° 10). A amplificação é efectuada mediante os 30 ciclos de PCR seguintes:

- 30 segundos a 94°C

- um minuto a 57°C - 30 segundos a 72°C, seguido de um ciclo de 2 minutos a 72 °C.

Colocam-se os diferentes produtos de PCR sobre um gel de agarose a 1,5%. Repete-se a experiência três vezes com duas reacções de transcrição inversa diferentes. A figura 1 apresenta os resultados obtidos a partir de ARN extraídos de cérebros ou de músculos de animais. Embora se amplifique a mesma quantidade de ADNc a partir do ARN de PO em todas as amostras, observam-se variações no caso do ARNm da PDE4B: detectam-se as variações mais significativas nos animais com 90 dias de idade; embora se observe um aumento do nível de expressão do fragmento PDE4 5' no cérebro de animais transgénicos, observa-se uma redução muito forte da expressão de PDE4B (DATAS) no cérebro de animais transgénicos.

Este resultado estabelece uma correlação entre a redução da expressão de um fragmento 3' não codificante do 31 ARNm de PDE4B e o aumento da expressão da parte 5' codificante deste mesmo mensageiro. Este resultado é absolutamente compatível com a presença de sequências de desestabilização de ARNm na sequência identificada pela DATAS e demonstra a correlação existente entre a expressão da PDE4B e o fenómeno de excitotoxicidade.

Exemplo 3: Inibição da excitotoxicidade mediante inibidores de PDE4

Para este exemplo, foram colocados em cultivo neurónios granulares de cerebelo de ratazana assim como neurónios corticais seguindo técnicas conhecidas pelas pessoas especializadas na técnica.

Cultivo primário de células granulares de cerebelo:

Decapitam-se ratazanas Wistar com 7 dias de idade e dissecam-se os seus cerebelos. Depois de se extirparem as meninges, corta-se o tecido em bocados e tripsiniza-se durante 15 minutos a 37°C. Dissociam-se as células mediante trituração e colocam-se em cultivos a uma densidade de 300.000 células por cm2 no meio basal Eagle complementado com 10% de soro fetal de vitelo e glutamina 2 mM. No dia seguinte, adiciona-se ARA-C 10 μΜ, um antimicótico, para se impedir a proliferação de células gliais. No dia 9 de cultivo tratam-se as células com os inibidores de fosfodiesterase pentoxifilina e etazolato 3 horas antes da adição dos tóxicos cainato 50 μΜ ou N-metil-D-asparato 100 μΜ na presença de D-serina 10 μΜ. Acrescenta-se 8-bromo-AMPc imediatamente antes dos tóxicos. Efectuam-se todos os tratamentos no mínimo em duplicado e pelo menos em dois cultivos diferentes. Depois de uma incubação de 6 horas, mede-se a toxicidade mediante um ensaio MTT. Os resultados, 32 normalizados à média do não tratado, analisam-se estatisticamente mediante o teste de Wilcoxon. Determina-se o valor significativo a p ^ 0,05.

Cultivos primários de células corticais:

Extirpam-se embriões de ratazana Wistar com 16 dias de idade e dissecam-se os córtexes. Depois da tripsinização a 37°C durante 25 minutos, dissociam-se as células mediante trituração. Semeiam-se as células no meio essencial mínimo complementado com 10% de soro equino e 10% de soro fetal bovino e glutamina 2 mM a uma densidade de 300.000 células por cm2. Depois de 4 dias de cultivo, substitui-se metade do meio por meio essencial mínimo complementado com 5% de soro equino e glutamina 2 mM. No mesmo dia, adicionam-se 10 μΜ de 5-fluoro-2-desoxiuridina, um antimitótico. Decorridos 7 e 11 dias de cultivo, substitui-se metade do meio por meio acondicionado. O meio acondicionado é composto por MEM que contém 5% de soro equino e glutamina 2 mM; passa-se este meio por uma camada de astrócitos corticais durante uma noite antes do seu uso. No dia 14, tratam-se as células com os inibidores de fosfodiesterase pentoxifilina e etazolato uma hora antes da adição dos tóxicos cainato 50 μΜ ou N-metil-D-aspartato 20 μΜ na presença de D-serina 10 μΜ. Todos os tratamentos são efectuados no mínimo em duplicado e pelo menos em dois cultivos diferentes. Depois de uma incubação de 6 horas, mede-se a toxicidade mediante um ensaio MTT. Analisam-se estatisticamente os resultados, normalizados à média do não tratado, mediante o teste de Wilcoxon. Determina-se o valor significativo a p ^ 0,05. MTT:

Mede-se a toxicidade usando o ensaio MTT. Depois da incubação com os compostos, adiciona-se MTT a uma concentração final de 0,5 mg/ml por chávena. Incubam-se em 33 seguida as placas durante 30 minutos a 37°C na escuridão. Aspira-se o meio e suspendem-se novamente os cristais em 500 μΐ de DMSO (dimetilssulfóxido) . Lê-se a absorvância a 550 nm e calcula-se a percentagem de viabilidade.

Resultados:

Os resultados obtidos estão apresentados nas figuras 2-10. Estes resultados ilustram o efeito protector dos compostos da invenção sobre a sobrevivência neuronal. No caso de co-tratamento de neurónios com um inibidor de PDE4, observa-se um efeito protector dependente da dose nos dois modos de indução da excitotoxicidade (NDMA/serina e cainato). Observa-se tal efeito protector com a ajuda de pentoxifilina e etazolato.

As figuras 2 e 3 apresentam os resultados obtidos com a ajuda de pentoxifilina sobre as células granulares do cerebelo. Os resultados apresentados mostram que a pentoxifilina permite que se consiga nas células um efeito protector de 43% no caso do tratamento com NMDA/serina, e de 33% no caso da toxicidade induzida pelo cainato.

As figuras 4 e 5 apresentam os resultados obtidos com a ajuda do etazolato sobre as células granulares do cerebelo. Os resultados apresentados mostram que o etazolato permite que se consiga nestas células um efeito protector de 60% no caso do tratamento com NMDA/Ser e de 57% no caso da toxicidade induzida pelo cainato.

As figuras 6 e 7 apresentam os resultados obtidos com a ajuda de pentoxifilina sobre as neurónios corticais. Os resultados apresentados mostram que a pentoxifilina permite que se consiga nas células um efeito protector de 50% no caso do tratamento com NMDA/Ser, e de 66% no caso da toxicidade induzida pelo cainato.

As figuras 8 e 9 apresentam os resultados obtidos com 34 a ajuda do etazolato sobre as neurónios corticais. Os resultados apresentados mostram que o etazolato permite que se consiga nas células um efeito protector de 33% no caso do tratamento com NDMA/Ser, e de 25% no caso da toxicidade induzida pelo cainato. A pertinência destas protecções é atestada pelas % de protecção obtidas com concentrações crescentes de AMPc, substrato de PDE, apresentados a titulo de exemplo para células granulares do cerebelo nas figuras 10 e 11. Estas % são de 40% no caso do tratamento com NMDA/serina e de 40% no caso do tratamento com cainato.

Por isso, a presente invenção documenta não só o envolvimento da PDE4B nos mecanismos de excitotoxicidade, nomeadamente num modelo de ELA, mas também a capacidade de inibidores de PDE4 para conservarem a viabilidade neuronal no caso do stress ligado à excitotoxicidade.

Exemplo 4: Uso clinico no homem

Este exemplo descreve as condições de um uso clinico humano de um inibidor de PDE4 no tratamento da ELA. Este exemplo ilustra o potencial terapêutico da invenção e as suas condições de aplicação ao ser humano.

Neste ensaio clinico, o tratamento baseia-se numa combinação de pentoxifilina e riluzol. A dose de pentoxifilina usada é de 400 mg por administração, em forma de três aplicações diárias, isto é, uma dose diária total de 1.200 mg. A pentoxif ilina é usada em forma de comprimidos. O ensaio é multicêntrico e é efectuado com duplo cego face a placebo em 400 doentes. Os doentes incluídos no ensaio são homens ou mulheres de 18 a 80 anos de idade, afectados por ELA esporádica ou familiar, e sob 35 tratamento com riluzol (50 mg duas vezes por dia) há pelo menos 3 meses. O tratamento com pentoxifilina está previsto para uma duração de 18 meses.

Mede-se principalmente a eficácia pelas taxas de sobrevivência dos doentes, qualidade de vida e ensaios musculares.

Outros aspectos e aplicações da invenção baseiam-se em: - uso de toda ou parte de uma sequência derivada de ARN mensageiro de PDE4B com fins de diagnóstico ou despistagem ou de caracterização de patologias neurodegenerativas que tenham um componente ou uma etapa ligados ao fenómeno da excitotoxicidade, tais como a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose múltipla, coreia de Huntington, ELA ou isquemia cerebral; - uso de qualquer fragmento de ácido nucleico incluído no ARN anti-sentido tendo por objectivo inibir a expressão da PDE4B em doentes afectados por tais patologias; - uso de qualquer composto químico, nomeadamente da pentoxifilina ou do etazolato, ou de qualquer composição farmacêutica que os contenha, tendo por objectivo inibir a actividade da PDE4B em doentes afectados por tais patologias; - uso de toda ou parte de uma sequência derivada de ARN mensageiro da PDE4B com fins de caracterização do tecido e da situação isquémica. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Exonhit Therapeutics <120> Novo alvo molecular da neurotoxicidade <130>

BOIOOWO 36 <140> <141> <160> 10 <17 0> Patentln Ver. <210> 1 <211> 2912 <212> ADN <213> rato <220> <221> CDS <222> (218) . . (2383) <400> 1 aaaggeagrcc fcgataasgcfc. ccttftgaca gsfcfcgtctfcg eeagtctecc agfcafcgctcc 60 tcfefcgefccfcg aagrfcgefcsea ggâttgaaac cacagcttcc caaattagcc tgggaagagt 120 gtgoggaccc sgcagcctfcfc taaoccgcgt cagtgcofcfct gcfcafcgttea agaetgetgt 180 tfcfcggatggt gaafcgctagc tagc&ctcca fccgagac afcg aca gca aaa Mt tct 235

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<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 48

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<212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: iniciador <4 0 0> 7 cçgcg;i.csg:l: gccttlgda t 21 <210> 8 <211> 23

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<212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: iniciador <4 0 0> 10

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REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte da patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado na sua concepção, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o EPO não assume nenhuma responsabilidade.

Patentes de invenção citadas na descrição: • US 6060501 A [0002] · WO 9946403 A [0008]

Literatura não relacionada com patentes citada na descrição: • CHOMCZYNSLI et al. Anal. Biochem., 1987, vol. 162, 156 [0053]

Lisboa, 28/01/2009

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uso de pelo menos um composto inibidor de PDE4B que pertence à família das pirazolopiridinas para a preparação de uma composição farmacêutica destinada ao tratamento da ELA.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o composto ser etazolato.

3. Uso de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2 para inibir ou reduzir a excitotoxicidade neuronal na fase precoce da ELA.

4. Uso de acordo com uma das reivindicações 1 a 3 para melhorar a sobrevivência neuronal em doentes afectados pela ELA.

5. Uso de acordo com uma das reivindicações 1 a 4 para reduzir a excitotoxicidade neuronal na fase precoce da ELA.

6. Uso de etazolato para a preparação de uma composição destinada a aumentar a sobrevivência neuronal em doentes afectados pela ELA. Lisboa, 28/01/2009