JP4527395B2 - 神経毒性の新しい細胞標的 - Google Patents

Description

本発明は、生物学、遺伝学、および医学の分野に関するものである。特に、神経変性疾患、特に筋萎縮性側索硬化症の検出、キャラクタリゼーション、および／または処置（もしくは管理）のための新しい方法に関する。本発明は同様に、これらの疾患において有効である化合物を同定またはスクリーニングするための方法に関する。本発明は更に、上記の方法を実施するために有用な化合物、遺伝子、細胞、プラスミド、または組成物に関する。本発明は特に、これらの疾患におけるホスホジエステラーゼ４Ｂの役割の同定に由来し、これらの障害における標的または治療、診断、もしくは実験マーカーとしてのその使用について述べる。

多くの神経変性疾患が、興奮毒性の現象に関連する構成要素または時期を有することが述べられている。それはアルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、およびハンチントン舞踏病の症例である。

筋萎縮性側索硬化症（またはＡＬＳ）は、ルイス体などの各種の封入を伴い、その死が場合によっては前頭型痴呆と関連付けられる脊髄および皮質運動ニューロンのアポトーシスを特徴とする、神経変性疾患である。ＳＯＤ１遺伝子コード化スーパーオキシドジスムターゼでの突然変異に関連する家族型（ＦＡＬＳ）に加えて、突然変異の説明されていない散発型が存在する。症例の大多数は散発型であり、家族型（ＦＡＬＳ）は非常にまれである。変わりやすく、分類が困難である臨床症状の開始前に、長い無症候期間があることが多い。治療おける将来の進歩によって、対症処置は、疾患の分子的な原因に基づく方法によって取って代わられるであろう。細胞レベルでは、これらの症候は、皮質運動ニューロンおよび脊髄運動ニューロンの死に関連付けられる。このニューロン死は、多数の神経変性疾患の根底にある各種の現象に関連付けられてきた。それは、細胞骨格の異常と同様に、グルタメート、酸化的ストレス、ニューロンマーカーに方向付けられた自己免疫（ＡＬＳの症例におけるカルシウムチャネル）に関連する興奮毒性の症例である。そのような現象は既知であるが、ＡＬＳを含むこれらの疾患の原因または複数の原因は、不明瞭なままである。ＦＡＬＳは、スーパーオキシドジスムターゼをコード化するＳＯＤ１遺伝子の突然変異に関連付けられるにもかかわらず、少なくとも１つの構成要素がアポトーシスである細胞死に、ニューロンが関わるようになる機構は不明である。

細胞死に関わる各種の現象に関与する分子的事象を解明することによって、新たな治療方法の開発が可能となるであろう。これらの事象の研究は、ヒト生検サンプルを用いて実施することは困難である。そのような生検は明らかに、死後サンプルによるものであるため、その品質を管理することが困難であり、および疾患の後期段階で存在する病理状態のみを反映する。

動物モデルは、生物学的サンプルへのアクセスを与えるため、疾患進行の各種ステップを解析し、健常対照と比較することができる。この点では、Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙからユーザ許可を得るという条件で、ＦＡＬＳ（突然変異Ｇ９３Ａ）にて蔓延している突然変異の１つを持つヒトＳＯＤ１遺伝子を発現する遺伝子導入マウスがＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手可能である。本モデルは１２０日後に、ヒト疾患と類似の症候を伴う疾患の死亡症例を再現する。ＳＯＤ１遺伝子における突然変異Ｇ９３Ａに関連するＡＬＳ症候の開始は、スーパーオキシドジスムターゼ活性の低下から起こるのではなく、むしろフリーラジカルを発生させる酵素の能力を上昇させる機能の向上から起こる。この知識にもかかわらず、ＡＬＳの各種段階を支配する分子的事象は、あまり理解されていない。このような分子的事象の複雑さが、疾患の進行を反映している。試験を行った遺伝子導入モデルでは、３０日目にニューロン非制御または臨床発現は見られなかった。６０日は症候開始直前の段階であるが、興奮毒性現象に関連したミトコンドリア代謝の変化、ストレス、及びニューロン死などの細胞生理における変化によって脳内に既に特徴付けられる。９０日目には、皮質及び脊髄運動ニューロンの５０％は死んでおり、そしてニューロンアポトーシスの活性化方法が、星状細胞の活性化と並行して開始する。興奮毒性の現象は、この段階ではもはや見られない。ニューロン死は、疾患の初期段階では関与するように思われないカスパーゼの活性化に関連している。

疾患の各種段階に特異的の異なる分子的事象を解明することによって、新たな診断マーカーと同様に、新たな治療標的の同定が可能となるはずである。この同定を実施するための最も有効な手法の１つは、その発現が病態生理学的状態を特徴付ける遺伝子及びタンパク質を同定することである。

本発明はここで、興奮毒性およびニューロン死の現象に関与する遺伝子的事象の同定について述べる。本発明は、これらの現象に関連する疾患に対する新しい治療および診断手法はもちろんのこと、活性化合物を同定するための新しい標的も提供する。

更に詳細には、疾患発生に関連する選択的スプライシング事象を最大限に考慮するために、ニューロンの予備単離なしで、脳および脊髄サンプルから抽出されたＲＮＡに対して定性ディファレンシャル分析を実施した。本分析は、無類の利点を有するＤＡＴＡＳ法（出願、国際公開公報第９９／４６４０３号で述べられている）による定性ディファレンシャルスクリーニングによって実施した。

本特許出願は特に、ＡＬＳモデルの６０日齢動物の脳における選択的スプライシングのレパートリーの、出願人の解釈に由来する。２００超の別個の配列を含有するこのレパートリーは、カリウムチャネルやＮＭＤＡ受容体などの、興奮毒性現象における主要な要素を含む。熱ショックタンパク質を含む、ストレスへの反応に関与するタンパク質をコード化するＲＮＡに由来する配列も、本レパートリーの一部であり、ＡＬＳの初期段階ではこの後者の反応の役割が強調される。変化したエネルギー代謝は、明らかに疾患を発生させる動物の皮質運動ニューロンに影響を及ぼすように思われる。例えば、ミトコンドリアクレアチンキナーゼのイントロン６は、特に、６０日齢動物の病理状態にて発現されるメッセンジャーＲＮＡから単離される。このイントロンの保持によるコード配列の中断は、酵素の不活性形をコード化するメッセンジャーＲＮＡを生じさせる。この観察は、同じ遺伝子導入モデルの動物によるニューロン中の酵素量の低下と相関するミトコンドリアクレアチンキナーゼ活性の低下を示す生化学的発見と一致する。
このレパートリーを構成する配列の特異的は、９０日齢動物で実施される遺伝子発現の同じ定性ディファレンシャル分析が、特に、興奮毒性の異なるマーカーが欠けている異なるレパートリーに至るという事実によって確認される。スプライシング変更の分析は、疾患の段階によって、分子的事象が異なることを確認する。

特に興味深く、予想外である方法では、６０日齢遺伝子導入および対照動物によるＲＮＡに対するＤＡＴＡＳの使用は、ホスホジエステラーゼ４ＢのｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ断片の単離に至った。そのような断片は、対照動物に特に存在し、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ遺伝子導入動物において６０日段階で特に欠失した、エキソン断片に相当する。そのような断片は、マウスＰＤＥ４８停止コドンから番号付けされたヌクレオチド３７７〜４８６に及ぶ（配列番号１）（配列は、ゲンバンク番号ＡＦ２０８０２３でも入手可能）。この配列は、２９１２塩基を含み、欠失した断片は、塩基２７６０〜２８６９に相当する。これは非コード領域であり、非コード３′エキソンの選択的使用により、または２つの選択的ポリアデニル化部位の使用により、対照動物および遺伝子導入動物においてディファレンシャルに発現される。このディファレンシャル発現は、図１Ａおよび１Ｂに示すＲＴ−ＰＣＲ実験によって証明されている。

したがって本出願は、興奮毒性方法およびニューロン死の発生におけるホスホジエステラーゼ４Ｂの関与を証明する。得られた結果は、対応するＲＮＡの構造変更、詳細には３′非コード部における領域の欠失に関連した、病理神経組織におけるＰＤＥ４Ｂのより高いレベルの発現を明らかにする。この結果は、ＤＡＴＡＳによって同定された配列における、ｍＲＮＡ不安定配列の存在と完全に適合する。スプライシングによる、または選択的ポリアデニル配列による、ＰＤＥ４Ｂ ｍＲＮＡにおけるその欠失は、安定化を引き起こすことが可能であり、それゆえこのＲＮＡのコード部分の発現を上昇させる。この事象は特に、病理対象の脳で発生し、対照対象では発生しない。
したがって、本発明は、病理対象の脳におけるＰＤＥ４Ｂ ｍＲＮＡの発現上昇につながり、興奮毒性および／またはニューロン死の現象と長期にわたり相関する、最初の分子的事象について説明する。本発明は更に、初めてＰＤＥ４Ｂの発現上昇がＡＬＳの初期段階に関連していることを示す。ＰＤＥ４Ｂは、これらの疾患の処置の開発における、その発生の早期段階で特に有用な新しく重要な治療標的であり、随伴症候や炎症成分ではなく、疾患の真の分子的基礎に対処する。本発明は、素因の診断、スクリーニング、検出、判定、もしくはこれらの疾患の進行または処置の有効性を監視する新たな方法も提供する。

検出、診断、およびスクリーニング
したがって本発明の１つの目的は、対象によるサンプル中のホスホジエステラーゼ４、特にホスホジエステラーゼ４Ｂの発現をインビトロで測定することを含む、対象における興奮毒性状況またはニューロンストレスを検出するための方法を提供することである。方法は好都合に、ＰＤＥ４Ｂ遺伝子の３′非コード領域および遺伝子の残り、特にコード部分のディファレンシャル発現を測定することを含む。

したがって本発明の更なる目的は、対象からのサンプル中で、特に３′非コード領域の全部または一部を除去した形の、ホスホジエステラーゼ４、特にホスホジエステラーゼ４Ｂの突然変異体ＲＮＡの存在を検出することを含む、対象における興奮毒性状況またはニューロンストレスを検出する方法を提供することである。

本発明の別の目的は、ニューロンストレスの状況および特に興奮毒性状況の診断または検出の方法を実施するための、ＰＤＥ４Ｂ遺伝子もしくはメッセンジャーＲＮＡに由来する配列の全部または一部を含む核酸の使用である。

本発明は一般に、興奮毒性、ストレス、ニューロン死などに関連する病理事象を検出するための、ＰＤＥ４Ｂ遺伝子またはメッセンジャーの全部もしくは一部に対して相補性である核酸の使用に基づく。更に一般的には、本発明は、ＰＤＥ４遺伝子におけるもしくは対応するＲＮＡ特にＰＤＥ４Ｂにおける変化を証明することを含む、神経変性疾患の診断、スクリーニング、キャラクタリゼーション、または監視のための方法を提供する。

ＰＤＥ４の発現もしくはディファレンシャル発現、または変化形の存在は、例えば配列決定、ハイブリダイゼーション、増幅、ＲＴ−ＰＣＲ、ゲル泳動などの分子生物学の慣用な方法によって決定できる。本発明は、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、ＡＬＳ、ハンチントン舞踏病、または脳虚血などの興奮毒性現象を含む各種の病状の診断または検出に用いられる。それは、素因を証明するため、処置の選択および適応を誘導するため、および疾患の進行などを監視するための早期検出に使用できる。特に、多発性硬化症またはＡＬＳを早期段階で検出するのに適している。

本発明による診断または検出遺伝子方法を実施するためには、ＰＤＥ４Ｂ ｍＲＮＡの欠失型、特に３′非コード領域の全部または一部の欠失型を証明することのできる核酸が、特に使用される。具体的な例は、配列番号１の配列の残基２７６０〜２８６９の間に位置する領域の全部または一部、あるいはヒトＰＤＥ４Ｂ遺伝子またはｍＲＮＡの配列の対応する残基に対して相補性である核酸の使用である。ヒトＰＤＥ４Ｂをコード化するｃＤＮＡ配列および対応するタンパク質を、配列番号３および４の配列に示す（ゲンバンク番号ＮＭ_００２６００も参照）。ヒトＰＤＥ４Ｂ遺伝子もしくはＲＮＡの３′非コード領域は、配列番号３の残基２４６１〜４０６８に対応する。

好都合な方法において、（プローブとして）使用した核酸は、配列番号１の配列のヌクレオチド２３８４〜２８６９または配列番号３の配列のヌクレオチド２４６１〜４０６８またはそれに対して相補性である配列の間に位置するＰＤＥ４Ｂ遺伝子またはＲＮＡの３′非コード領域をコード化する配列の全部もしくは一部を含む。

具体的な態様により、本発明は、以下のうちの１つの配列内に位置する領域に対して相補性である核酸を使用する。
配列番号１の残基２３８４〜２８６９
配列番号１の残基２５００〜２８６９
配列番号１の残基２７６０〜２８６９
配列番号１の残基２７８０〜２８５０
配列番号１の残基２７９０〜２８１０
配列番号３の残基２６００〜４０４０
配列番号３の残基３０００〜４０４０
配列番号３の残基３５００〜４０４０
配列番号３の残基３９００〜４０４０

別の具体的な態様においては、３′非コード部の全部または一部の欠失から生じるＰＤＥ４ ＲＮＡ領域の配列に対して相補性である核酸を使用する。実際にドメインの欠失は、特異的な欠失型であり、サンプル中におけるそのような型の存在を証明するために使用できる、新しい接合点を配列中に作成する。

プローブと標的配列間の相補性度は、ハイブリダイゼーションのより高い特異的を確保するために、完全であることが好ましい。しかし、多少の誤対合が許容できることは理解される。上記の方法を実施するために使用する核酸はＤＮＡもしくはＲＮＡでよく、好ましくは合成ＤＮＡである。好ましくは１０〜５００塩基、通常は１０〜１００塩基を含む。好ましくはないが、所望される場合、より長い核酸を使用できることが理解される。核酸は好都合には、１０〜５００塩基の、少なくともＰＤＥ４Ｂの３′非コード配列の領域に対して相補性である、単鎖ＤＮＡである。核酸は例えば、放射能、酵素、発光、蛍光、化学手段などによって標識できる。

ＰＤＥ４遺伝子における変化の存在を検出するための別の手法は、好ましくは３′非コード領域の一部を含む、ＰＤＥ４ ＲＮＡの一部の選択的増幅を可能にするプライマーもしくは核酸プライマー対を利用する。通常、ＰＤＥ４ ＲＮＡの変化型の選択的増幅を可能にするプライマー、特にＲＮＡ ３′領域の部分の欠失により生成された接合点に特異的であるプライマーを使用する。

この点において、本発明の１つの目的は、ＰＤＥ４Ｂ ３′非コード領域の一部に対して相補性であり、およびこの領域の部分の増幅を可能にするプライマーに基づく。プライマーは、好都合には８〜２０塩基を含む。好ましくは、配列番号１の配列のヌクレオチド２３８４〜２８６９または配列番号３の配列のヌクレオチド２４６１〜４０６８の間に位置する配列またはそれに対して相補性である配列の８〜２０の連続した残基の断片で構成される。本発明の更なる目的は、ＰＤＥ４ ３′非コード領域の少なくとも一部の特異的増幅を可能にするプライマー対であり、上記対は、上で定義したような少なくとも１つのプライマーを含む。

本発明による方法を実施するために、核酸を含む、対象からの生物学的サンプルを上記定義したような核酸（プローブ、プライマーなど）にインビトロで接触させ、ハイブリッドまたは増幅生成物の形成を検出する。生物学的サンプルは、血液、体液、細胞、組織などのサンプルでもよい。核酸は、ガラス、二酸化ケイ素、ナイロンなどの種類の支持体に固定化できる。

検出、スクリーニング、または診断の方法は、例えば組織生検、特に神経組織などの、対象からの各種サンプルを使用することによって実施できる。本発明は更に、特に驚くべきかつ好都合な方法で、興奮毒性現象と相関するＰＤＥ４発現の非制御が筋肉組織において直接証明されることを示す。このことは、ＡＬＳなどの神経変性疾患の症例において特に顕著である。

ＡＬＳの進展の間、変性現象は脳だけでなく、脊髄にも、そして結果的には神経支配不全によって筋肉でも発生する。図２は、これらの同じ動物の脳によるＲＮＡに対する実験と同じＰＣＲプライマーを用いて検出した対照および遺伝子導入マウスの筋肉におけるＰＤＥ４Ｂ ｍＲＮＡ発現の変化を示す。類似の、しかしあまり顕著でない方法では、ＰＤＥ４Ｂの３′非コード領域の発現低下が、特に前駆症状段階の終わり、すなわち９０日齢の動物の筋肉において観察されたが、このｍＲＮＡの残りの部分（特にコード部分）では見られなかった。
ＡＬＳの試験および処置で見られた１つの困難なことは、早期診断を確立することである。ＰＤＥ４Ｂ ｍＲＮＡが、ＡＬＳ筋肉において非制御されるという観察は、患者の筋肉生検からの早期診断を確立することを可能にする。そのような診断は、ＰＤＥ４Ｂの３′非コード領域と配列の残り、特にコード部分との間のディファレンシャル発現の検出に基づいている。

対象の神経変性疾患に特に関連するニューロンストレス、特に興奮毒性の状況を検出するための方法は、前記対象による筋肉細胞のサンプルにおけるＰＤＥ４Ｂ遺伝子発現またはＰＤＥ４Ｂメッセンジャーの欠失型の存在を測定することを含む。

ディファレンシャル発現を測定するために、例えば３′非コード領域の部分に相当する（すなわち特異的である）プローブおよびＰＤＥ４Ｂのコード領域の部分に相当するプローブを使用する。これらの各プローブによって検出される信号は、ディファレンシャル発現の評価を可能にする。別の手法は、一方では３′非コード領域の一部の、およびもう一方ではコード領域の一部の増幅を可能にする２つのプライマー対を利用する。

別の目的は、ＰＤＥ４の発現、特に３′非コード領域とコード領域との間のディファレンシャル発現を分析するためのキットであって、キットは、３′非コード領域の配列の一部に特異的であるヌクレオチドプローブと、およびコード領域の配列の一部に特異的であるヌクレオチドプローブを含む。

更なる目的は、ＰＤＥ４の発現、特に３′非コード領域とコード領域との間のディファレンシャル発現を分析するためのキットであって、キットは、ＰＤＥ４の３′非コード領域の少なくとも一部の特異的増幅を可能にするヌクレオチドプライマーの対と、およびＰＤＥ４のコード領域の少なくとも一部の特異的増幅を可能にするヌクレオチドプライマーの対を含む。

治療法
ホスホジエステラーゼは、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰなどの環状核酸を加水分解し、各種の信号伝達カスケードを調節する。ＰＤＥ４ＢはｃＡＭＰを加水分解し、それによって細胞内のこの第二のメッセンジャーの濃度を調節する。細胞の生存能力とアポトーシスとのバランスにおけるｃＡＭＰの役割は、文献に十分説明されている。特にｃＡＭＰカスケードは、転写因子ＣＲＥＢの活性の調節における役割と同様に、ＡｋｔおよびＰＩ３Ｋなどのキナーゼを含む細胞生存カスケードにおいて不可欠の役割を果たす。この転写因子がニューロン生存および神経細胞突起増殖に関与していることは、注目に値する。それにも関わらず、ニューロンの生存能力を向上させ、更に詳細には興奮毒性からそれらを保護するための、ＰＤＥおよび好都合にはＰＤＥ４阻害剤の使用は考えられたことがない。炎症現象を抑制するために開発されたＰＤＥ４阻害剤が、アルツハイマー病などの神経変性疾患に有用である可能性を秘めているかもしれないということが示唆されてきた。このような示唆は、神経変性処置中に観察される炎症を削減するという目標に基づくものであり、ニューロン死を直接阻害することを狙った論拠に基づくものではない。

本発明は、ニューロン興奮毒性の発生に関連するＰＤＥ４Ｂ遺伝子に影響を及ぼす、スプライシング事象および選択的ポリアデニル化部位の存在を証明し、およびＡＬＳの処置への、および更に一般的には、特にこれらの疾患の早期段階から開始する、興奮毒性現象中のニューロン生存能力の改善のために、ＰＤＥ４阻害剤の使用を正当化する分子的基礎を提供する。

したがって本発明の別の目的は、早期段階で顕著である神経変性疾患を処置するよう設計された組成物を調製するために、更に好ましくはＡＬＳ、アルツハイマー病、またはパーキンソン病などの神経変性疾患に関連する早期ニューロン興奮毒性を低下させるために、ＰＤＥ４Ｂの発現または活性を阻害または低下させることのできる化合物の使用に基づいている。

特定の目的は、ＡＬＳを処置するために、特にＡＬＳを有する対象における興奮毒性を低下させるために、またはＡＬＳを有する対象のニューロン生存を向上させるために設計された組成物を調製するための、ＰＤＥ４阻害剤の使用である。

本発明の別の目的は、ニューロン興奮毒性を低下するように設計された組成物を調製するために、配列番号２または４の配列のＰＤＥ４Ｂの発現または活性を（好ましくは選択的方法で）阻害することのできる化合物の使用である。

本発明の更なる目的は、ＰＤＥ４Ｂ活性または発現を阻害する化合物、好ましくはＰＤＥ４を選択的に阻害する化合物を対象に投与することを含む、ニューロンストレス、特に興奮毒性と関連する疾患を処置するための方法である。

本発明の別の目的は、ＰＤＥ４阻害剤、好ましくはＰＤＥ４を選択的に阻害する化合物を対象に投与することを含む、ＡＬＳを処置するための方法、特にＡＬＳを有する対象におけるニューロン生存を向上させるための方法に基づく。

本発明の文脈内で、用語「処置」は、患者の管理（苦痛の軽減、推定寿命の向上、疾患進行の遅延）などと同様に、予防的、治癒的、緩和的処置を指す。処置は更に、カスパーゼ阻害剤または他の活性化合物などの疾患における後期事象に特に対処する、他の薬剤または処置と組合せて実施することができる。

使用する化合物は、ＰＤＥ４、特にＰＤＥ４Ｂの発現を阻害できる任意の化合物でよく、すなわち特に、遺伝子転写、ＲＮＡ成熟、ｍＲＮＡ翻訳、翻訳後タンパク質改変などを阻害する任意の化合物でよい。ＲＮＡ修飾、特に３′非コード領域の部分の欠失を阻害する化合物でもよい。

具体的な態様において、化合物は、ＰＤＥ４Ｂ遺伝子の転写または対応するｍＲＮＡの翻訳を阻害することのできるアンチセンス核酸である。アンチセンス核酸は、ＰＤＥ４Ｂ遺伝子の配列の全部または一部、その断片、ＰＤＥ４Ｂメッセンジャー、またはそれに対して相補性である配列を含んでもよい。アンチセンス核酸は特に、配列番号１の残基２１８〜２３８３または配列番号３の７６６〜２４６０の間に位置する配列に対して相補性である領域を含み、タンパク質へのその翻訳を阻害（または低減）することができる。アンチセンス核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボザイムなどでもよい。単鎖でも二重鎖でもよい。アンチセンス遺伝子によってコード化されるＲＮＡでもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドである場合、通常、１００塩基未満、例えば約１０〜５０塩基を含有する。そのようなオリゴヌクレオチドは修飾して、その安定性、ヌクレアーゼに対するその耐性、細胞へのその浸透などを改良することができる。

更なる態様により、化合物は例えば、ＰＤＥ４タンパク質の領域（特にＰＤＥ４Ｂ）を含むペプチドであり、その活性に拮抗することができる。

別の態様により、化合物は、ＰＤＥ４Ｂの発現または活性を調節できる、天然または合成起源の化学化合物、特に植物、細菌、ウィルス、動物、真核、合成、または半合成起源の有機もしくは無機分子である。

好ましい変形において、化合物は、ＰＤＥ４を阻害する合成化合物である。各種のタイプの阻害剤を使用できる。好ましくはピラゾロピリジンファミリーの化合物であり、その中でも特に具体的な例は、エタゾラート、または特にペントキシフィルリンを含む、キサンチン（または２，６−ジオキソプリン）誘導体のファミリーの化合物である。

ピラゾロピリジンファミリーの化合物は、特に以下の化合物から選択される。
以下の式を持つエタゾラート：

４−ブチルアミノ−１−エチル−６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル（トラカゾレート）、
４−ブチルアミノ−１−エチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
１−（４−アミノ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−１−イル）−β−Ｄ−１−デオキシ−リボフラノース、
１−エチル−４−（Ｎ′−イソプロピリデン−ヒドラジノ）−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル （ＳＱ ２０００９）、
４−アミノ−６−メチル−１−ｎ−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン、
４−アミノ−１−エチル−６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル（デスブチルトラカコレート）、
４−アミノ−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボキサミド、
１−エチル−６−メチル−４−メチルアミノ−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
４−アミノ−６−メチル−１−プロピル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
１−エチル−４−エチルアミノ−６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
４−アミノ−１−ブチル−６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
５−（４−アミノ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−１−イル）−２−ヒドロキシメチル−テトラヒドロ−フラン−３−オール，
１−アリル−４−アミノ−６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸アリルエステル、
４−アミノ−６−メチル−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸、
４−アミノ−１−エチル−３，６−ジメチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
４−ジメチルアミノ−１−エチル−６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
１−エチル−６−メチル−４−プロピルアミノ−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
４−アミノ−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
４−アミノ−６−メチル−１−ペンタ−４−イニル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
４−アミノ−１−ブタ−３−エニル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−アリルアミド、
４−アミノ−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−イソプロピルアミド、
４−アミノ−１−ペンチル−Ｎ−ｎ−プロピル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボキサミド、
４−アミノ−１−ブチル−６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸アリルエステル、４−アミノ−６−メチル−１−ペンタ−３−イニル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
４−アミノ−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−プロパ−２−イニルアミド、
４−アミノ−１−（３−メチル−ブチル）−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸アリルエステル、
４−アミノ−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ＜３，４−ｂ＞ピリジン−５−Ｎ−（２−プロペニル）カルボキサミド、
４−アミノ−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸アリルエステル、
４−アミノ−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−ブチルアミド、
４−アミノ−１−ブタ−３−イニル−６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸アリルエステル、
４−アミノ−１−ブタ−３−エニル−６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸アリルエステル、
４−アミノ−６−メチル−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−アリルアミド、
４−アミノ−６−メチル−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸アリルエステル、
４−アミノ−６−メチル−１−（３−メチル−ブチル）−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸アリルエステル、
４−アミノ−６−メチル−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸イソブチルエステル、
４−アミノ−６−メチル−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−ブチルアミド，
４−アミノ−６−メチル−１−（３−メチル−ブタ−２−エニル）−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸アリルエステル、
４−アミノ−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−シクロプロピルアミド、
エチル ４−アミノ−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−ヒドロオキサメート、
４−アミノ−６−メチル−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸 プロプ−２−イニルエステル、
４−アミノ−６−メチル−１−ペンタ−４−イニル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸アリルエステル、
４−アミノ−６−メチル−１−ペンタ−４−エニル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸アリルエステル、
４−アミノ−１−ペンタ−３−イニル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−プロピルアミド、
４−アミノ−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−シクロプロピルメチル−アミド、
４−アミノ−６−メチル−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸 ２−メチル−アリルエステル、
４−アミノ−１−ペンタ−３−イニル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−アリルアミド（ＩＣＩ １９０，６２２）、
４−アミノ−１−ペンタ−４−イニル−Ｎ−２−プロペニル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボキサミド、
４−アミノ−１−ペンタ−３−イニル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−プロプ−２−イニルアミド、
４−アミノ−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−ブタ−２−イニルアミド、
４−アミノ−６−メチル−１−ペンタ−３−イニル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸アリルエステル、
４−アミノ−１−（２−シクロプロピル−エチル）−６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸アリルエステル、
４−アミノ−１−ヘキサ−５−イニル−６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸アリルエステル、
４−アミノ−１−ペンタ−３−イニル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−シクロプロピルメチル−アミド、
４−アミノ−６−メチル−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸 ブタ−３−エニルエステル、
４−アミノ−６−メチル−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸シクロプロピルメチルエステル、
４−ブチルアミノ−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−アリルアミド、
４−アミノ−６−メチル−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸 ２−シクロプロピル−エチルエステル、
４−アミノ−６−メチル−１−ペンタ−３−イニル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸シクロプロピルメチルエステル、
４−アミノ−６−メチル−１−ペンタ−４−イニル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸シクロプロピルメチルエステル、
４−アミノ−１−ベンジル−６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
４−アミノ−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−ベンジルアミド、
４−アミノ−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−フェニルアミド、
４−アミノ−６−メチル−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸ベンジルエステル、
４−アジド−１−β−Ｄ−リボフラノシルピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン、
１−ペンタ−３−イニル−Ｎ−２−プロペニル−４−プロピオンアミド−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボキサミド、
２−（４−アミノ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−１−イル）−５−ヒドロキシメチル−テトラヒドロ−フラン−３，４−ジオール、
２−（６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−４−イルアミノ）−エタノール、
３−（６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−４−イルアミノ）−プロパン−１−オール、
３−（６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−４−イルアミノ）−酢酸プロピルエステル、
２−（６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−４−イルアミノ）−プロピオン酸エチルエステル、
２−（６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−４−イルアミノ）−ペンタン酸エチルエステル、
２−（６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−４−イルアミノ）−安息香酸エチルエステル、
３−（６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−４−イルアミノ）−ペンタン酸プロピルエステル、
Ｎ−ベンジリデン−Ｎ′−（３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−４−イル）−ヒドロラジン、
Ｎ−フラン−２−イルメチレン−Ｎ−（３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−４−イル）−ヒドロラジン、
Ｎ−（４−フルオロ−ベンジリデン）−Ｎ′−（３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−４−イル）−ヒドロラジン、
Ｎ−（３−フラン−２−イル−アリリデン）−Ｎ′−（３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−４−イル）−ヒドロラジン、
Ｎ−（４−メトキシ−ベンジリデン）−Ｎ′−（３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−４−イル）−ヒドロラジン、
４−〔（３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−４−イル）−ヒドラゾノメチル〕−ベンゾニトリル、
Ｎ−ベンゾ〔１，３〕ジオキソール−５−イルメチレン−Ｎ′−（３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−４−イル）−ヒドロラジン、
Ｎ−（３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−４−イル）−Ｎ′−（４−ニトロ−ベンジリデン）−ヒドロラジン、
Ｎ−（３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−４−イル）−Ｎ′−（２−ニトロ−ベンジリデン）−ヒドロラジン、
Ｎ−（３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−４−イル）−Ｎ′−（４−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−ヒドロラジン、
Ｎ−（３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−４−イル）−Ｎ′−（５−ニトロ−フラン−２−イルメチレン）−ヒドロラジン、
Ｎ−（３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−４−イル）−Ｎ′−（２−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−ヒドロラジン、
Ｎ−（３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−４−イル）−Ｎ′−（６−ニトロ−ベンゾ〔１，３〕ジオキソール−５−イルメチレン）−ヒドロラジン、
４−（３−クロロ−４−メトキシ−ベンジルアミノ）−１−エチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸、
４−（３−クロロ−４−メトキシ−ベンジルアミノ）−１−エチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−（ピリジン−４−イルメチル）−アミド、
４−（３−クロロ−４−メトキシ−ベンジルアミノ）−１−エチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−（テトラヒドロ−フラン−２−イルメチル）−アミド、
４−（３−クロロ−４−メトキシ−ベンジルアミノ）−１−エチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−（５−ヒドロキシ−ペンチル）−アミド、
４−（３−クロロ−４−メトキシ−ベンジルアミノ）−１−エチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−〔３−（２−オキソ−ピロリジン−１−イル）−プロピル〕−アミド、
４−tert−ブチルアミノ−１−（２−クロロ−２−フェニル−エチル）−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
１−（２−クロロ−２−フェニル−エチル）−４−シクロプロピルアミノ−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
１−（２−クロロ−２−フェニル−エチル）−４−プロピルアミノ−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
１−（２−クロロ−２−フェニル−エチル）−４−フェニルアミノ−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、４−ブチルアミノ−１−（２−クロロ−２−フェニル−エチル）−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
１−（２−クロロ−２−フェニル−エチル）−４−（２−エトキシ−エチルアミノ）−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
４−ベンジルアミノ−１−（２−クロロ−２−フェニル−エチル）−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
１−（２−クロロ−２−フェニル−エチル）−４−フェネチルアミノ−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、

キサンチン誘導体の中で特に、（ｉ）（ω−１）−ヒドロキシアルキル−ジアルキルキサンチン、ここで（ω−１）−ヒドロキシアルキル基は５または６個の炭素原子を含み、位置１または７にあり、もう一方の位置７または１にあるアルキル基は、１〜１２個の炭素原子を含み、位置３にあるアルキル基は、１〜４個の炭素原子を含む、（ｉｉ）（ω−１）−オキソアルキル−ジメチルキサンチン、ここで（ω−１）−オキソアルキル基は５または６個の炭素原子を含み、位置１または７にある、あるいは（ｉｉｉ）４〜１２個の炭素原子を含有するアルキル基または位置１もしくは７にあるベンジル基を有するジメチルキサンチンの誘導体を使用する。
通常、オキソアルキル−ジアルキルキサンチンは例えば、１−（５−オキソヘキシル）−３，７−および７−（５−オキソヘキシル）−１，３−ジメチルキサンチンを含む。特に、ブチル、イソアミル、ヘキシル、ラウリルまたはベンジル基によって位置１または７で置換された３，７−ジメチルキサンチンおよび１，３−ジメチルキサンチンなどの他のキサンチンも、例えば１−（４−ヒドロキシペンチル）−および１−（５−ヒドロキシヘキシル）−３，７−ジメチルキサンチン、７−（４−ヒドロキシペンチル）−および７−（５−ヒドロキシヘキシル）−１，３−ジメチルキサンチン、１−（４−オキソペンチル）−、１−（５−オキソヘキシル）−、１−（２−メチル−３−オキソブチル）−および１−（２−エチル−３−オキソブチル）−３，７−ジメチルキサンチンなどの、位置（ω−１）にヒドロキシまたはオキソ基を持つこれらの化合物の同族体ならびに位置７に（ω−１）−ヒドロキシアルキルまたは（ω−１）−オキソアルキル基を有する対応する１，３−ジメチル化合物と同様に使用できる。上記のヒドロキシアルキル−ジメチルキサンチンの同族体は、１−エチル−、１−プロピル−、１−ブチル−および１−イソブチル−３−メチル−７−（５−ヒドロキシヘキシル）−キサンチンおよび７−エチル−、７−プロピル−、７−ブチル−および７−イソブチル−１−（５−ヒドロキシへキシル）−３−メチルキサンチンなどの、ヒドロキシアルキル基によって占有されていない位置１または７に、メチル基の代わりに、２〜１２個の炭素原子を有するアルキル基を持つ化合物、ならびにメチル基の代わりに、特にエチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、イソブチル、またはｎ−ブチル基などの、２〜４個の炭素原子を有するアルキル基を所定の位置に持つ対応する化合物である。

そのようなキサンチン誘導体の中で、特に以下の式を持つペントキシフィルリンを使用する。

したがって本発明は、興奮毒性に関連する分子的事象の処置のための治療標的として、ＰＤＥ４Ｂを初めて提案する。具体的な態様により、本発明は、神経変性疾患の初期段階でのニューロン興奮毒性を阻害または低下させるために使用できる。特にアルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、ＡＬＳ、ハンチントン舞踏病、および脳虚血の処置に用途が見出される。

本発明の他の目的は、
特にＡＬＳの早期段階におけるニューロン興奮毒性を低下させるための、ＡＬＳの処置への上記の化合物、特にエタゾラートまたはペントキシフィルリンの使用、または
ＡＬＳを有する患者におけるＰＤＥ４Ｂ活性を阻害するよう設計された組成物を調製するための、上記の化合物、特にペントキシフィルリンまたはエタゾラートの使用、
に基づく。

本発明は同様に、配列番号２または４の配列のＰＤＥ４Ｂの発現または活性を選択的に阻害する化合物を投与することを含む、ＡＬＳを処置するための方法に関する。好ましくは本発明の方法は、神経変性疾患の早期段階での処置に使用される。

投与は、当業者に既知の任意の方法で実施されてもよく、好ましくは経口投与もしくは注射によって、または通常の腹腔内、脳内、静脈内、動脈内、もしくは筋肉内投与によって実施されてもよい。経口経路による投与が好ましい。投与用量は、当業者によって調整される。通常、性質上化学的である阻害剤化合物の場合は、約０．０１mg〜１００mg／kgが、注射される。核酸化合物では、用量は１回あたり、例えば０．０１mg〜１００mgの範囲である。他の活性薬剤または任意の薬学的に許容されうるビヒクル（例えば、安定剤等の存在下での、緩衝剤、等張生理的食塩水など）と組合せて、恐らく、反復注射を与えられることが理解される。

本発明は、哺乳動物、特にヒトに使用できる。実施例に示す結果は、興奮毒性状態に置かれたニューロンの生存能力を向上させる、ＰＤＥ４Ｂ阻害剤の有効性を示している。

選択の方法および用具
本発明の他の目的は、試験化合物を、ＰＤＥ４Ｂ（特に３′非コード領域を欠いた変異形）を発現する細胞と接触させることおよびこのタンパク質の発現または活性を阻害する化合物を同定することを含む、興奮毒性またはニューロンストレスに関連する疾患において有効である化合物を選択、同定、またはキャラクタリゼーションする方法に関する。

本方法は、哺乳動物起源（ヒト、ネズミなど）の一次細胞または細胞株などの、各種の細胞個体群によって使用できる。好都合には、ＰＤＥ４Ｂを自然に発現しない、所望の変異形をコード化する核酸を形質移入された細胞を使用する。本方法の選択性は、このような方法で向上させる。より低級な真核細胞（酵母など）または原核細胞も使用できる。

スクリーニング方法も、ＰＤＥ４Ｂまたはその変異形もしくは断片を結合する試験化合物の能力を測定することによって、無細胞系にて実施できる。

本発明の別の目的は、上記で定義したようなポリペプチドをコード化する任意の核酸、それを含有するベクター、組換え細胞、および利用に関する。ベクターは、プラスミド、ファージ、コスミド、ウィルス、人工染色体でもよい。好ましいベクターとしては、市販のプラスミド（ｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなど）から誘導されるような、プラスミドベクターがあげられる。そのようなベクターは好都合に、選択遺伝子および／または複製開始点および／または転写プロモータを含有する。他の具体的なベクターは例えば、ウィルスまたはファージ、特に、レトロウィルス、アデノウィルス、ＡＡＶ、ヘルペスウィルス、バキュロウィルスなどに由来するウィルスなどの、複製欠損組換えウィルスである。ベクターは、例えば原核または真核細胞などの、任意の適格性宿主において使用されてよい。これらは細菌（例えば大腸菌）、酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（サッカロミセス）またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ（クリユイベロミセス）、植物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、特にヒトなどである。これらは細胞株、一次細胞、混合培養物などである。

本発明の他の側面および利点は、例示のために与えられ、および制限されるものではない下記の例から明らかになるであろう。

実施例１： 興奮毒性の分子標的としてのＰＤＥ４の同定
疾患発生に関連付けられる最大限の選択的スプライシング事象を考慮するために、ニューロンの予備単離なしで、異なる段階の動物の脳標本から抽出したポリアデニル化（ポリＡ＋）ＲＮＡに対して、定性ディファレンシャル分析を実施した。
ポリＡ＋ＲＮＡは、当業者に既知の方法で調製する。特にこれは、グアニジンチオシアナートなどのカオトロピック剤による処置でもよく、溶媒（例えばフェノール、クロロホルム）による全ＲＮＡの抽出が続く。そのような方法は、当業者に周知であり（Maniatis et al., Chomczynsli et al., Anal. Biochem. 162 (1987) 156を参照）、市販のキットを使用して容易に実施できる。ポリＡ＋ＲＮＡは、当業者に既知の従来方法によってこれらの全ＲＮＡから調製され、至難のキットで提供される。これらのポリＡ＋ＲＮＡは、逆転写酵素を用いた逆転写反応のテンプレートとして作用する。好都合な方法において、従来の逆転写酵素で得られるよりもサイズの大きい第一の相補ＤＮＡ鎖を得るために、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を欠いた逆転写酵素が使用される。そのようなＲＮａｓｅ Ｈを含まない逆転写酵素調製物が市販されている。
疾患発生の各時点（３０、６０、および９０日）において、ポリＡ＋ＲＮＡは単鎖ｃＤＮＡと同様に、遺伝子導入動物（Ｔ）および同系対照動物（Ｃ）から調製する。
ＤＡＴＡＳ方法にしたがって、各時点で、ｃＤＮＡ（Ｔ）によるｍＲＮＡ（Ｃ）のハイブリダイゼーション、およびｃＤＮＡ（Ｃ）によるｍＲＮＡ（Ｔ）の逆ハイブリダイゼーションを実施する。
次にｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロ二重鎖は、ＤＡＴＡＳ方法のプロトコルにしたがって精製する。
相補ＤＮＡと対になっていないＲＮＡ配列は、この酵素が対のＲＮＡ配列を分解するときに、ＲＮＡｓｅ Ｈの作用を通じてこれらのヘテロ二重鎖から放出される。そのような不対配列は、ＲＮＡ間に存在する質的相違を表し、なおＲＮＡ自体は互いに相同性である。
これらの質的相違は、ＲＮＡ配列のどこにでも、５′または３′領域に、または配列内部に、特にコード化配列に位置しうる。
これらの配列はその位置によって、選択的スプライシングであってもよいだけでなく、転位置または欠失の結果であってもよい。
次に、質的相違を表すＲＮＡ配列は、当業者に既知の方法、更に詳細にはＤＡＴＡＳ法に関する特許で述べられた方法にしたがってクローニングする。
そのような配列は、質的相違バンクを構成するｃＤＮＡバンクに入れる。そのようなバンクの一方は、健常状況に特異的であるエキソンおよびイントロンを含有する。もう一方のバンクは、病理状態に特徴的なスプライシング事象を含有する。
クローンのディファレンシャル発現は、試験中の別の状況から抽出したメッセンジャーＲＮＡの逆転写によって得られたプローブを用いたハイブリダイゼーションによって確認した。ディファレンシャルハイブリダイゼーションを示すクローンは、次の分析のために保持した。ＤＡＴＡＳによって同定した配列は、病理状況と健常状況にてスプライシングにより、区別して発現させたイントロンおよび／またはエキソンに一致する。これらのスプライシング事象は、疾患の発生の所与の段階に特異的であるか、健常状態に特徴的である。

これらの配列のデータベースとの比較は、得られた情報を分類して、その診断または治療上の興味に従った配列の論理的選択を提案することができる。

６０日齢遺伝子導入および対照動物によるＲＮＡに対するＤＡＴＡＳの実施は、ホスホジエステラーゼ４Ｂ ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ断片の単離に至った。この断片は、特に対照動物に存在するエキソン断片に対応し、したがって６０日段階のＳＯＤ１Ｇ９３Ａ遺伝子導入動物で特に欠失している。断片は、ネズミＰＤＥ４Ｂの停止コドンから番号付けされたヌクレオチド３７７〜４８６を範囲とする。（配列番号１）。この配列は２９１２塩基を含み、欠失断片は、塩基２７６０〜２８６９に対応する。この領域は非コード化であり、３′非コードエキソンの選択的使用により、または２つの選択的ポリアデニル部位の使用により、対照動物と遺伝子導入動物との間でディファレンシャルに発現される。

実施例２： ＲＴ−ＰＣＲ実験：ディファレンシャル発現の確認
ニューロンストレスの状況でのＰＤＥ４Ｂのディファレンシャル発現は、参照状況と比較して、図１に示すＲＴ−ＰＣＲ実験によって検証した。
これらの実験は、当業者に周知の方法にしたがって実施し、ＰＤＥ４Ｂ ｍＲＮＡの２つの別個の領域の発現を追跡することを可能にした。そのような領域の一方は、このｍＲＮＡ（ＰＤＥ４Ｂ ５′）の開始コドンにおよび、もう一方は、ＤＡＴＡＳ法（ＰＤＥ４Ｂ ＤＡＴＡＳ）によって同定された断片に一部及んでいる。使用したＰＣＲプライマーの位置を図１に示す。
ＰＯ ＲＮＡは、同量のＲＮＡが各実験時点で使用されたことを点検するために、内部対照として作用するリボゾームＲＮＡである。３０、６０、および９０日齢の、すなわち病理症候開始前の対照（Ｃ）および遺伝子導入（Ｔ）動物から抽出したＲＮＡを用いて分析を実施した。

３０、６０、および９０日齢の対照またはＳＯＤ１ Ｇ９３Ａマウスの脳からの全ＲＮＡは、標準Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｃＤＮＡに転写した。半定量的ＰＣＲでは、逆転写反応生成物を１０倍に希釈した。ＤＡＴＡＳ断片の特異的プライマーは、センス鎖（５′ＧＣＣ ＡＧＧ ＣＣＧ ＴＧＡ ＡＧＣ ＡＡＡ ＴＡ ３′；配列番号５）ではヌクレオチド２５２６〜２５４５に、アンチセンス鎖（５′ＴＣＡ ＡＡＧ ＡＣＧ ＣＧＡ ＡＡＡ ＣＡＴ ３′；配列番号６）ではヌクレオチド２７９０〜２８０７に対応し、更に３プライム断片では、プライマーは、センス鎖（５′ＣＣＧ ＣＧＴ ＣＡＧ ＴＧＣ ＣＴＴ ＴＧＣ ＴＡＴ ３′；配列番号７）ではヌクレオチド１４５〜１６５に、アンチセンス鎖（５′ＣＧＣ ＴＧＴ ＣＧＧ ＡＴＧ ＣＴＴ ＴＴＡ ＴＴＣ ＡＣ ３′；配列番号８）ではヌクレオチド４２６〜４０４に対応する。ＰＯ遺伝子は参照として使用し、以下のプライマーによって増幅した：センス鎖：５′ＴＣＧ ＣＴＴ ＴＣＴ ＧＧＡ ＧＧＧ ＴＧＴ Ｃ ３′（配列番号９）およびアンチセンス鎖：ＣＣＧ ＣＡＧ ＧＧＧ ＣＡＧ ＣＡＧ ＴＧＧ ３′（配列番号１０）。
増幅は、以下のように３０回のＰＣＲサイクルによって実施した。
・９４℃にて３０秒
・５７℃にて１分
・７２℃にて３０秒、続いて７２℃にて２分間の２サイクル

各種のＰＣＲ生成物を１．５％アガロースゲルに装填した。実験は、２つの異なる逆転写反応を用いて３回実施した。

図１は、動物の脳または筋肉から抽出したＲＮＡから得た結果を示す。
全サンプル中のＰＯ ＲＮＡから同量のｃＤＮＡを増幅したが、ＰＤＥ４Ｂ ｍＲＮＡで変動が見られた。最も著しい変動は、９０日齢動物で検出された。ＰＤＥ４ ５′断片の発現の上昇が、遺伝子導入動物の脳で見られるのに対して、ＰＤＥ４Ｂ（ＤＡＴＡＳ）発現の非常に強力な低下が、遺伝子導入動物の脳で発生する。
この観察結果は、ＰＤＥ４Ｂの３′非コードｍＲＮＡ断片の発現の低下と、この同じメッセンジャーの５′コード領域の発現の上昇との間に相関を確立する。この結果は、ＤＡＴＡＳにより同定された配列内のｍＲＮＡ不安定化配列の存在と完全に適合し、ＰＤＥ４Ｂ発現と興奮毒性の現象との間の相関を証明する。

実施例３： ＰＤＥ４の阻害剤による興奮毒性の抑制
本実施例では、当業者に既知の技法にしたがって、ラット脳顆粒を皮質ニューロンと同様に培養した。

ラット脳顆粒細胞一次培養：
７日齢Ｗｉｓｔａｒラットを断頭し、脳を切開した。髄膜除去後、組織を小片に切断し、３７℃にて１５分間トリプシン処理した。細胞を粉砕機で分離して、１０％ウシ胎仔血清およびグルタミン２mMを添加した基礎イーグル培地に、３００，０００細胞／cm²の密度で播種した。翌日、グリア細胞の増殖を阻害するために、細胞分裂抑制剤のＡＲＡ−Ｃ １０μMを添加した。培養９日後、細胞をホスホジエステラーゼ阻害剤であるペントキシフィルリンおよびエタゾラートで処理し、３時間後に毒素であるカイニン酸 ５０μMまたはＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸 １００μMをＤ−セリン １０μM の存在下で添加した。すべての毒素の直前に、８−ブロモ−ｃＡＭＰを添加した。すべての処置は、少なくとも２回、２つの異なる培養物で実施した。６時間のインキュベーションの後、ＭＴＴ試験によって毒性を評価した。結果は、未処置対照の平均に対して正規化し、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定によって統計的に解析した。有意水準は、ｐ＜０．０５に設定した。

皮質細胞一次培養：
Ｗｉｓｔａｒラットの１６日齢胚を取り出し、皮質を切開した。３７℃にて２５分間トリプシン処理した後、細胞を粉砕機で分離して、１０％ウマ血清、１０％ウシ胎仔血清、およびグルタミン２mMを添加した最小必須培地に３００，０００細胞／cm²の密度で播種した。培養４日後、培地の半分を５％ウマ血清およびグルタミン２mMを添加した最小必須培地と交換した。同じ日に、細胞分裂阻害剤の５−フルオロ−２−デオキシウリジン １０μMを加えた。培養７および１１日後、培地の半分を、５％ウマ血清およびグルタミン２mMを添加したＭＥＭより成る調整培地と交換した。この培地は使用前に、皮質星状細胞の層を一晩通過させた。１４日目に、細胞をホスホジエステラーゼ 阻害剤のペントキシフィルリンおよびエタゾラートで処理して、１時間後に毒素であるカイニン酸５０μM またはＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸２０μMをＤ−セリン１０μMの存在下で添加した。すべての処置は、少なくとも２回、少なくとも２つの異なる培養物で実施した。６時間のインキュベーションの後、ＭＴＴ試験によって毒性を評価した。結果は未処置対照の平均に対して正規化し、Wilcoxon検定によって統計的に解析した。有意水準は、ｐ＜０．０５に設定した。

ＭＴＴ
毒素は、ＭＴＴ試験によって測定した。化合物によるインキュベーションの後、ＭＴＴをウェルあたり０．５mg／mlの最終濃度で添加した。次にプレートを暗所で３７℃にて３０分間インキュベートした。培地を吸引し、結晶をＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）５００μl中で再懸濁させた。５５０nmにおける吸収を読取り、生存能力のパーセンテージを計算した。

結果
結果を図２〜１０に示す。これらの結果は、本発明による化合物のニューロン生存に対する保護効果を示す。ニューロンをＰＤＥ４阻害剤によって同時に処理すると、両方の興奮毒性誘発剤（ＮＭＤＡ／セリンおよびカイニン酸）を用いて、用量依存性の保護効果が観察された。そのような保護効果は、ペントキシフィルリンおよびエタゾラートによって観察された。

図２および３は、ペントキシフィルリンによって得られた、脳顆粒細胞に対する結果を示す。これらは、ペントキシフィルリンが、ＮＭＤＡ／セリン処置の場合にこれらの細胞の４３％の保護を、カイニン酸誘起毒性の場合に３３％の保護を与えることを示している。

図４および５は、エタゾラートによって得られた、脳顆粒細胞に対する結果を示す。これらは、エタゾラートが、ＮＭＤＡ／セリン処置の場合にこれらの細胞の６０％の保護を、カイニン酸誘起毒性の場合に５７％の保護を与えることを示している。

図６および７は、ペントキシフィルリンによって得られた、皮質ニューロンに対する結果を示す。これらは、ペントキシフィルリンが、ＮＭＤＡ／セリン処置の場合にこれらの細胞に対する５０％の保護効果を、カイニン酸誘起毒性の場合に６６％の保護効果を与えることを示している。

図８および９は、エタゾラートによって得られた、皮質ニューロンに対する結果を示す。これらは、エタゾラートが、ＮＭＤＡ／セリン処置の場合にこれらの細胞の３３％の保護を、カイニン酸誘起毒性の場合に２５％の保護を与えることを示している。

この保護の妥当性は、図１０および１１に脳顆粒細胞の例として示したように、ＰＤＥ基質であるｃＡＭＰの濃度を上昇させることによって得られた保護パーセントによって確認される。ＮＭＤＡ／セリン処置では４０％の保護、カイニン酸処置では４０％の保護が観察された。

したがって本発明は、興奮毒性の機構、特にＡＬＳモデルにおけるＰＤＥ４Ｂの関与を証明するだけでなく、ＰＤＥ４阻害剤が興奮毒性に関連するストレスの間にニューロンの生存能力を保護する能力も証明する。

実施例４： ヒトへの臨床使用
本実施例は、ＡＬＳの処置におけるＰＤＥ４阻害剤のヒトへの臨床使用の条件について述べる。本実施例は、本発明の治療可能性およびヒトでのその実施条件を示す。

本臨床試験では、処置は、ペントキシフィルリンとリルゾールの組合せに基づき、前者は１日３回、１用量４００mg、１日の全用量が１２００mgである。ペントキシフィルリンは、錠剤形で投与する。これは、散発型または家族型ＡＬＳを示し、少なくとも３ヶ月間、リルゾールによる治療（５０mg １日２回）を受けている、１８〜８０歳の男女を含む患者４００名でのマルチセンター方式の二重盲検、プラセボ対照試験である。計画されたペントキシフィルリンによる処置期間は、１８ヶ月である。

主な有効性評価項目は、生存率、生活の質、および筋肉試験である。

本発明の他の態様および適用は、
−アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、ハンチントン舞踏病、ＡＬＳ、もしくは脳虚血などの、興奮毒性現象に関連する構成要素もしくは段階を有する神経変性疾患の診断またはスクリーニングもしくはキャラクタリゼーションを目的とするＰＤＥ４ＢメッセンジャーＲＮＡに由来する配列の全部もしくは一部の使用、
−そのような疾患を持つ患者におけるＰＤＥ４Ｂの発現を阻害する事を目的とする、アンチセンスＲＮＡを含む任意の核酸断片の使用、
−そのような疾患を持つ患者におけるＰＤＥ４Ｂ活性を阻害する事を目的とする、任意の化学化合物、特にペントキシフィルリン、エタゾラート、またはそれらを含有する任意の医薬組成物の使用、
−組織および虚血状況をキャラクタリゼーションする事を目的とする、ＰＤＥ４ＢメッセンジャーＲＮＡに由来する配列の全部または一部の使用、
に関する。

脳（１Ａ）および筋肉（１Ｂ）標本に対するＰＤＥ４Ｂの半定量ＰＣＲである。 脳（１Ａ）および筋肉（１Ｂ）標本に対するＰＤＥ４Ｂの半定量ＰＣＲである。 ペントキシフィルリンが、カイニン酸によって誘起された興奮毒性に関連する小脳顆粒の形成から一次ニューロンを保護する。 ペントキシフィルリンが、ＮＭＤＡ／セリンによって誘起された興奮毒性に関連する小脳顆粒の形成から一次ニューロンを保護する。 脳顆粒細胞に対してＮＭＤＡ／セリンによって誘起された毒性からのエタゾラートの神経保護効果を示す。 脳顆粒細胞に対してカイニン酸によって誘起された毒性からのエタゾラートの神経保護効果を示す。 皮質ニューロンに対してＮＭＤＡ／セリンによって誘起された毒性からのペントキシフィルリンの神経保護効果を示す。 皮質ニューロンに対してカイニン酸によって誘起された毒性からのペントキシフィルリンの神経保護効果を示す。 皮質ニューロンに対してＮＭＤＡ／セリンによって誘起された毒性からのエタゾラートの神経保護効果を示す。 皮質ニューロンに対してカイニン酸によって誘起された毒性からのエタゾラートの神経保護効果を示す。 脳顆粒細胞に対してＮＭＤＡ／セリンによって誘起された毒性からの８−ブロモ−ｃＡＭＰの神経保護効果を示す。 脳顆粒細胞に対してカイニン酸によって誘起された毒性からの８−ブロモ−ｃＡＭＰの神経保護効果を示す。

配列表

Claims (4)

1. 興奮毒性現象中のニューロン生存を改善するように設計された組成物を調製するための、ＰＤＥ４Ｂの発現または活性を、阻害または低下させる少なくとも１つの化合物の使用であって、化合物が、ピラゾロピリジンファミリーの化合物の中から選択される、使用。
2. 化合物がエタゾラートである、請求項１記載の使用。
3. 組成物がＡＬＳの早期段階から開始する興奮毒性現象中のニューロン生存を改善するように設計される、請求項１または２記載の使用。
4. 興奮毒性現象中のニューロン生存を向上させるように設計された組成物を調製するための、ピラゾロピリジンファミリーに属する少なくとも１つのＰＤＥ４阻害剤化合物の使用。

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