ES2348348T5 - Nueva diana molecular de la neurotoxicidad - Google Patents

Abstract

Uso de al menos un compuesto de la familia de las pirazolopiridinas capaz de inhibir o reducir la actividad de PDE4, para la preparación de una composición farmacéutica destinada a inhibir o reducir la excitotoxicidad neuronal en fase temprana de por lo menos una enfermedad neurodegenerativa elegida entre la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson.

Description

Nueva diana molecular de la neurotoxicidad

La presente invención se refiere al campo de la biología, la genética y la medicina. Se refiere especialmente a nuevos métodos para la detección, la caracterización y/o el tratamiento (o la gestión) de patologías neurodegenerativas, y particularmente de la esclerosis lateral amiotrófica. La invención describe asimismo métodos para la identificación o cribado de compuestos activos en dichas patologías. La invención se refiere asimismo a los compuestos, genes, células, plásmidos o composiciones útiles para la implementación de dichos métodos. La invención resulta especialmente de la identificación del papel de la fosfodiesterasa 4B en estas patologías y describe su uso como diana o marcador terapéutico, diagnóstico o experimental de estos trastornos.

Se han descrito numerosas patologías neurodegenerativas que tienen un componente o una etapa ligado al fenómeno de la excitotoxicidad. Es el caso de enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple y corea de Huntington.

La esclerosis lateral amiotrófica (ELA o ALS por “Amyotrophic Lateral Sclerosis”) es una enfermedad neurodegenerativa asociada a diferentes tipos de inclusiones tales como cuerpos de Lewis y caracterizada por una apoptosis de las motoneuronas espinales y corticales cuyo resultado mortal está asociado a veces a una demencia frontal. Las formas esporádicas, sin ninguna mutación descrita, coexisten con las formas familiares (ELAF) asociadas a mutaciones en el gen SOD1 que codifica la superóxido dismutasa. La mayoría de casos son esporádicos, las formas familiares (ELAF) son muy raras. Es probable que un largo periodo asintomático preceda la aparición de síntomas clínicos, que son variados y cuya clasificación es compleja. Los futuros desarrollos terapéuticos sustituirán a los tratamientos de la sintomatología con estrategias basadas en las causas moleculares de la patología. Al nivel celular, estos síntomas están asociados a la muerte de motoneuronas corticales y motoneuronas espinales. Esta muerte neuronal se ha conectado con diferentes fenómenos que constituyen la base de varias patologías neurodegenerativas. Este es el caso de la excitotoxicidad ligada al glutamato, del estrés oxidativo, de una cierta autoinmunidad dirigida contra marcadores neuronales (los canales cálcicos en el caso de ELA), así como anomalías del citoesqueleto. Aunque estos fenómenos están descritos, la o las causas de estas enfermedades, entre ellas la ELA, son desconocidas. Aunque las ELAF están ligadas a mutaciones en el gen SOD1 que codifica la superóxido dismutasa, los mecanismos que comprometen a las neuronas a la muerte celular, de la que al menos un componente es la apoptosis, son desconocidos. Asimismo, el estudio de Block y Kosinski (Nervenartz 2001 72: 393-405) describe la implicación de los receptores del glutamato en distintas enfermedades neurodegenerativas, sin identificar las causas de la muerte de las motoneuronas en dichas patologías.

La identificación de los eventos moleculares implicados en los diferentes fenómenos implicados en la muerte celular permitirá establecer nuevas estrategias terapéuticas. El estudio de estos eventos es difícilmente realizable a partir de biopsias humanas. Estas biopsias proceden evidentemente de muestras post-mortem cuya calidad es difícilmente controlable y sólo representan estados patológicos representativos de fases tardías de la enfermedad.

Los modelos animales dan acceso a muestras biológicas que permiten analizar diferentes etapas del desarrollo de una patología y comparar estas etapas con sujetos sanos. A este respecto, están disponibles ratones transgénicos que expresan el gen humano SOD1 que porta una de las mutaciones prevalentes en ELAF (mutación G93A) en el Jackson Laboratory, a condición de una concesión de licencia de uso por la NorthWestern University. Este modelo reproduce en 120 días el resultado mortal de la enfermedad con síntomas comparables a los de la enfermedad humana. La aparición de síntomas de ELA ligados a la mutación G93A en SOD1 no es la consecuencia de una reducción de la actividad superóxido dismutasa, sino de una ampliación de función que aumenta la capacidad de la enzima de generar radicales libres. A pesar de estas informaciones, los eventos moleculares que presiden las diferentes etapas de la ELA son mal conocidos. La complejidad de estos eventos moleculares refleja la evolución de la patología: en el modelo transgénico estudiado, no se ha reseñado ninguna desregulación neuronal ni manifestación clínica a los 30 días. Los 60 días corresponden a una etapa que precede por poco a los primeros síntomas pero que se caracteriza ya a nivel cerebral por cambios en la fisiología celular tales como una alteración del metabolismo mitocondrial, un estrés y una muerte celular asociados a un fenómeno de excitotoxicidad. A los 90 días, el 50% de las motoneuronas corticales y espinales han muerto y se ha iniciado un proceso activo de apoptosis neuronal paralelamente a una activación astrocítica. El fenómeno de excitotoxicidad no se observa ya en esta etapa. La muerte neuronal está asociada a la activación de caspasas que no parecen implicadas en las fases tempranas de la patología.

Identificar los diferentes eventos moleculares específicos de las diferentes fases de la patología debe permitir identificar nuevas dianas terapéuticas así como nuevos marcadores diagnósticos. Uno de los enfoques más eficaces para realizar esta identificación consiste en identificar los genes y las proteínas cuya expresión caracteriza un estado fisiopatológico.

La presente invención describe ahora la identificación de eventos genéticos implicados en los fenómenos de excitotoxicidad y muerte neuronal. La presente invención proporciona así nuevos enfoques terapéuticos y diagnósticos de patologías asociadas a estos fenómenos, así como nuevas dianas para la identificación de compuestos activos.

Más particularmente, se ha efectuado un análisis cualitativo diferencial a partir de ARN extraídos de muestras de cerebro y de médula espinal, sin aislamiento previo de neuronas, con el fin de tener en cuenta un máximo de eventos de corte y empalme alternativos ligados al desarrollo de la patología. Este análisis se ha efectuado mediante cribado diferencial cualitativo según la técnica DATAS (descrita en la solicitud nº WO99/46403), que presenta ventajas desiguales.

La presente solicitud de patente resulta especialmente de la construcción por el solicitante de un repertorio de alteraciones de corte y empalme en el cerebro de animales modelo de ELA de 60 días de edad. Este repertorio, que contiene más de 200 secuencias distintas, implica a actores clave del fenómeno de excitotoxicidad tales como los canales potásicos y el receptor de NMDA. Las secuencias derivadas de ARN que codifican las proteínas implicadas en la respuesta al estrés, como las proteínas de choque térmico, forman parte igualmente de este repertorio, subrayando la implicación de esta respuesta en las fases tempranas de ELA. Una alteración del metabolismo energético parece afectar claramente a las motoneuronas corticales de los animales que desarrollan la patología. Por ejemplo, se aísla específicamente el intrón 6 de la forma mitocondrial de creatina cinasa a partir de ARN mensajeros expresados en condiciones patológicas en animales de 60 días de edad. Esta interrupción de la secuencia de codificación por esta retención de intrón desemboca en un ARN mensajero que codifica una forma inactiva de la enzima. Esta observación está de acuerdo con las observaciones bioquímicas que han mostrado una disminución de la actividad creatina cinasa mitocondrial, correlacionada con una disminución de la cantidad de esta enzima en las neuronas de animales del mismo modelo transgénico. La especificidad de las secuencias que constituyen este repertorio está atestiguada por el hecho de que el mismo análisis diferencial cualitativo de la expresión genética realizado en animales de 90 días de edad desemboca en un repertorio diferente del que están ausentes especialmente los diferentes marcadores de excitotoxicidad. El análisis de las modificaciones de corte y empalme confirma que los eventos moleculares son diferentes según la etapa de la patología.

De manera particularmente interesante e inesperada, la realización de DATAS sobre ARN de animales de control y transgénicos de 60 días de edad ha permitido aislar un fragmento de ADNc derivado de ARNm de fosfodiesterasa 4B. Este fragmento corresponde a un fragmento de exón presente específicamente en los animales de control y que se elimina específicamente en los animales transgénicos por SOD1 G93A en la etapa de 60 días. Este fragmento abarca los nucleótidos 377 a 486 referidos a partir del codón de parada de PDE4B de ratón (SEC ID Nº 1) (secuencia igualmente accesible en GenBank, n° AF208023). Esta secuencia comprende 2912 bases, correspondiendo el fragmento eliminado a las bases 2760 a 2869. Esta región no codificante se expresa diferencialmente entre los animales de control y los animales transgénicos, debido al uso alternativo de un exón 3’ no codificante o debido al uso de dos sitios de poliadenilación alternativos. Esta expresión diferencial se ha evidenciado mediante experimentos de PCR TI presentados en las figuras 1A y 1B.

La presente solicitud demuestra por tanto la implicación de la fosfodiesterasa 4B en el desarrollo de los procesos de excitotoxicidad y muerte neuronal. Los resultados obtenidos muestran una expresión más pronunciada de PDE4B en los tejidos nerviosos patológicos, ligada a una modificación estructural del ARN correspondiente, especialmente a la deleción de una región en la parte 3’ no codificante. Este resultado es absolutamente compatible con la presencia de secuencias de desestabilización del ARNm en la secuencia identificada por DATAS. Su deleción del ARNm de PDE4B mediante corte y empalme o mediante el uso de secuencias de poliadenilación alternativas puede desembocar en una estabilización, por tanto un aumento de la expresión de la parte codificante de este ARN. Este evento se produce específicamente en el cerebro de sujetos patológicos y no en sujetos de control. La presente invención describe por tanto un evento molecular original que desemboca en un aumento de la expresión del ARNm de PDE4B en el cerebro de sujetos patológicos y que está correlacionado en el tiempo con el fenómeno de excitotoxicidad y/o muerte neuronal. La invención muestra igualmente, por primera vez, que un aumento de la expresión de PDE4B está asociado a las etapas tempranas de ELA. La PDE4B constituye por tanto una diana terapéutica nueva e importante en el desarrollo de terapias de estas patologías, utilizables especialmente en fases tempranas de su desarrollo, y que se dirigen a las verdaderas bases moleculares de la patología y no a los síntomas

o componentes inflamatorios asociados. La invención describe igualmente nuevos procedimientos de diagnóstico, cribado, detección, determinación de una predisposición o seguimiento de la evolución o de la eficacia del tratamiento de estas patologías.

Detección, diagnóstico y cribado

La presente invención describe por tanto un procedimiento de detección de una situación de excitotoxicidad o de estrés neuronal en un sujeto, que comprende la medida in vitro de la expresión de la fosfodiesterasa 4, especialmente de la fosfodiesterasa 4B, en una muestra procedente del sujeto. El procedimiento comprende ventajosamente una medida de la expresión diferencial de la región 3’ no codificante del gen de PDE4B y del resto del gen, especialmente de la parte codificante.

La invención describe por tanto igualmente un procedimiento de detección de una situación de excitotoxicidad o de estrés neuronal en un sujeto, que comprende la detección de la presencia de una forma mutada del ARN de la fosfodiesterasa 4, especialmente de la fosfodiesterasa 4B, en una muestra procedente del sujeto, particularmente de una forma con deleción total o parcial de la región 3’ no codificante.

La invención describe igualmente el uso de un ácido nucleico que comprende toda o parte de una secuencia

derivada del gen o del ARN mensajero de la PDE4B para la implementación de un procedimiento de diagnóstico o de detección de una situación de estrés neuronal y más particularmente de la situación de excitotoxicidad.

La invención describe, en general, el uso de un ácido nucleico complementario de todo o parte del gen o del mensajero de la PDE4B para la detección de eventos patológicos de tipo excitotoxicidad, estrés o muerte neuronal, etc. Más generalmente, la invención describe un procedimiento de diagnóstico, cribado, caracterización o seguimiento de una patología degenerativa, que comprende evidenciar una alteración en el gen de PDE4 o en el ARN correspondiente, típicamente de PDE4B.

La expresión de la PDE4, o la expresión diferencial, o la presencia de una forma alterada pueden determinarse mediante técnicas convencionales de biología molecular como, por ejemplo, mediante secuenciación, hibridación, amplificación, PCR-TI, migración en gel, etc. La invención es aplicable al diagnóstico o la detección de diferentes patologías que implican fenómenos de excitotoxicidad, tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, ELA, corea de Huntington o isquemia cerebral. Puede usarse para la detección precoz, evidenciar una predisposición, la elección y adaptación de un tratamiento, el seguimiento de la evolución de la patología, etc. Está particularmente adaptada a la detección en una etapa temprana de esclerosis múltiple o ELA.

Para la implementación de los procedimientos genéticos de diagnóstico o de detección según la invención, se usan más particularmente ácidos nucleicos capaces de evidenciar una forma de ARNm de PDE4B con deleción, especialmente una forma desprovista de toda o parte de la región 3’ no codificante. A modo de ejemplo específico, se usa un ácido nucleico complementario de toda o parte de la región comprendida entre los residuos 2760 a 2869 de la secuencia SEC ID Nº 1, o de los residuos correspondientes a la secuencia del gen o del ARNm de PDE4B humana. La secuencia de ADNc que codifica la PDE4B humana y de la proteína correspondiente se representan en las secuencias SEC ID Nº 3 y 4 (véase igualmente Genbank, n° NM_002600). La región 3’ no codificante del ARN o del gen de PDE4B humana corresponde a los residuos 2461 a 4068 de la SEC ID Nº 3.

Ventajosamente, el ácido nucleico usado (como sonda) comprende toda o parte de la secuencia codificante de la región 3’ no codificante del gen o del ARN de PDE4B comprendida entre los nucleótidos 2384 y 2869 de la secuencia SEC ID Nº 1 o entre los nucleótidos 2461 y 4068 de la secuencia SEC Nº ID Nº 3, o una secuencia complementaria de las mismas.

La invención describe asimismo el uso de un ácido nucleico complementario de una región comprendida en una de las siguientes secuencias:

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residuos 2384 a 2869 de la SEC ID Nº 1

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residuos 2500 a 2869 de la SEC ID Nº 1

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residuos 2760 a 2869 de la SEC ID N° 1

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residuos 2780 a 2850 de la SEC ID N° 1

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residuos 2790 a 2810 de la SEC ID N° 1

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residuos 2600 a 4040 de la SEC ID N° 3

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residuos 3000 a 4040 de la SEC ID Nº 3

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residuos 3500 a 4040 de la SEC ID Nº 3

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residuos 3900 a 4040 de la SEC ID Nº 3.

La invención describe asimismo el uso de un ácido nucleico complementario de la secuencia de la región de ARN de PDE4 resultante de la deleción de toda o parte de la parte 3’ no codificante. La eliminación de un dominio crea efectivamente nuevas uniones en la secuencia, que son específicas de la forma con deleción y pueden usarse para evidenciar la presencia de dicha forma en una muestra.

La complementariedad entre la sonda y la secuencia diana es preferiblemente perfecta para asegurar una mejor especificidad de hibridación. Sin embargo, se entiende que pueden tolerarse ciertos desapareamientos. El ácido nucleico usado para la implementación de los procedimientos anteriores puede ser un ADN o un ARN, preferiblemente un ADN de origen sintético. Comprende preferiblemente de 10 a 500 bases, típicamente de 10 a 100 bases. Se entiende que puede usarse un ácido nucleico más largo, si se desea, aunque no sea preferible. El ácido nucleico es ventajosamente un ADN monocatenario de 10 a 500 bases, complementario de una región al menos de la secuencia 3’ no codificante de PDE4B. El ácido nucleico puede estar marcado, por ejemplo, por vía radiactiva, enzimática, luminiscente, fluorescente, química, etc.

Otro enfoque para detectar la presencia de una alteración del gen de PDE4 usa un cebador o un par de cebadores nucleicos que permiten una amplificación selectiva de una porción del ARN de PDE4, preferiblemente que comprende una porción de la región 3’ no codificante. Se usa típicamente un cebador que permite la amplificación

selectiva de la forma alterada del ARN de PDE4, especialmente un cebador específico de la unión creada por la eliminación de parte de la región 3’ del ARN.

A este respecto, la invención describe un cebador complementario de una parte de la región 3’ no codificante de PDE4B y que permite la amplificación de una parte de esta región. El cebador comprende ventajosamente de 8 a 20 bases. Está compuesto preferiblemente por un fragmento de 8 a 20 residuos consecutivos de la secuencia comprendida entre los nucleótidos 2384 y 2869 de la secuencia SEC ID Nº 1 o entre los nucleótidos 2461 y 4068 de la secuencia SEC ID Nº 3 o de una secuencia complementaria de las mismas. La invención describe un par de cebadores que permiten la amplificación específica de una parte al menos de la región 3’ no codificante de PDE4, comprendiendo dicho par al menos un cebador tal como se define anteriormente.

Para la implementación de los procedimientos descritos en la invención, se pone en contacto in vitro una muestra biológica de un sujeto, que contenga un ácido nucleico, con un ácido nucleico (sonda, cebador, etc.) tal como se ha definido anteriormente, y se detecta la formación de un híbrido o de un producto de amplificación. La muestra biológica puede ser una muestra de sangre, fluido, célula, tejido, etc. El ácido nucleico puede estar inmovilizado sobre un soporte de tipo vidrio, sílice, nailon, etc.

El procedimiento de detección, cribado o diagnóstico puede implementarse a partir de diferentes tipos de muestras procedentes de un sujeto como, por ejemplo, biopsias de tejidos, especialmente de tejido nervioso. De manera particularmente sorprendente y ventajosa, la presente invención muestra además que la desregulación de la expresión de PDE4, correlacionada con el fenómeno de excitotoxicidad, puede evidenciarse directamente en el tejido muscular. Esto es particularmente notable en el caso de patologías neurodegenerativas tales como ELA.

En el transcurso del desarrollo de ELA, los fenómenos degenerativos se producen no sólo en el cerebro, sino igualmente en la médula espinal, y en consecuencia en el músculo por falta de inervación. La figura 2 presenta las modificaciones de expresión del ARNm de PDE4B en músculos de ratones de control y transgénicos, seguidas usando los mismos cebadores de PCR que en el estudio del ARN de cerebros de estos mismos animales. De forma análoga, aunque menos pronunciada, se observa una disminución de la expresión de la región 3’ no codificante de PDE4B, y no del resto del este ARNm (especialmente la parte codificante), específicamente en el músculo de animales al final de la fase presintomática, es decir, de 90 días de edad.

Una de las dificultades encontradas en los estudios y los tratamientos de ELA es la dificultad de establecer un diagnóstico precoz. Esta observación de desregulación del ARNm de PDE4B en el músculo de ELA permite proponer un diagnóstico precoz a partir de biopsias musculares de pacientes. Este diagnóstico está basado en la detección de la expresión diferencial de la región 3’ no codificante y del resto de la secuencia, especialmente codificante, de PDE4B.

Un procedimiento particular de detección de una situación de estrés neuronal, especialmente de excitotoxicidad, ligada particularmente a una patología neurodegenerativa en un sujeto, comprende la medida de la expresión del gen de PDE4B, o de la presencia de formas con deleción del mensajero de PDE4B, en una muestra de células musculares procedentes de dicho sujeto.

Para medir la expresión diferencial, se usa por ejemplo una sonda correspondiente a (es decir, específica de) una parte de la región 3’ no codificante y una sonda correspondiente a una parte de la región codificante de PDE4B. La señal detectada con cualquiera de estas sondas permite evaluar el diferencial de expresión. Otro enfoque usa dos pares de cebadores que permiten la amplificación de una porción de la región 3’ no codificante por un lado y de una parte de la región codificante por otro lado.

La presente invención describe un kit para el análisis de la expresión de PDE4, especialmente de la expresión diferencial entre la región 3’ no codificante y la región codificante, comprendiendo el kit una sonda nucleotídica específica de una parte de la secuencia de la región 3’ no codificante y una sonda nucleotídica específica de una parte de la secuencia de la región codificante.

La presente invención describe igualmente un kit para el análisis de la expresión de PDE4, especialmente de la expresión diferencial entre la región 3’ no codificante y la región codificante, comprendiendo el kit un par de cebadores nucleotídicos que permiten la amplificación específica de una parte al menos de la región 3’ no codificante de PDE4 y un par de cebadores nucleotídicos que permiten la amplificación específica de una parte al menos de la región codificante de PDE4.

Terapia

Las fosfodiesterasas hidrolizan los ácidos nucleicos cíclicos tales como AMPc y GMPc, regulando diferentes cascadas de señalización. La PDE4B hidroliza el AMPc, regulando así la concentración intracelular de este segundo mensajero. La implicación del AMPc en el equilibrio que existe entre la viabilidad celular y la apoptosis está bien descrita en la bibliografía. Especialmente, la cascada de AMPc está bien integrada en las cascadas de supervivencia celular que implican a cinasas tales como Akt y P13K, así como en la regulación de la actividad del factor de transcripción CREB. Ha de observarse que este factor de transcripción está implicado en la supervivencia neuronal y el crecimiento de neuritas. Sin embargo, el uso de inhibidores de PDE y ventajosamente de PDE4 no se ha

propuesto nunca para mejorar la viabilidad neuronal y más particularmente su protección contra la excitotoxicidad. Los inhibidores de PDE4, desarrollados para inhibir los fenómenos inflamatorios, se han sugerido como potencialmente útiles en patologías neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer. Esta sugerencia se apoya en la voluntad de reducir las inflamaciones que se observan en el cerebro en el transcurso de los procesos neurodegenerativos y no en un razonamiento enfocado a inhibir directamente la muerte neuronal.

La presente invención muestra la existencia de eventos de corte y empalme o de sitios de poliadenilación alternativos que afectan al gen de PDE4, asociados al desarrollo de la excitotoxicidad neuronal, y proporciona la base molecular que justifica el uso de inhibidores de PDE4 para el tratamiento de ELA y más generalmente para mejorar la viabilidad neuronal en los fenómenos de excitotoxicidad, particularmente desde las fases tempranas de estas patologías.

Un objeto de la invención reside por lo tanto en el uso tal como se identifica en la reivindicación 1 o 2.

La invención describe asimismo el uso de un compuesto capaz de inhibir (preferiblemente de manera selectiva) la expresión o la actividad de la PDE4B de secuencia SEC ID Nº 2 ó 4 para la preparación de una composición destinada a reducir la excitotoxicidad neuronal.

La invención describe asimismo un procedimiento de tratamiento de una patología asociada a un estrés neuronal, especialmente a una excitotoxicidad, que comprende la administración a un sujeto de un compuesto inhibidor de la actividad o de la expresión de PDE4B, preferiblemente un compuesto inhibidor selectivo de PDE4.

La invención describe asimismo un procedimiento de tratamiento de ELA, especialmente un procedimiento para aumentar la supervivencia de neuronas en pacientes aquejados de ELA, que comprende la administración a un sujeto de un inhibidor de PDE4, preferiblemente un compuesto inhibidor selectivo de PDE4.

En el contexto de la invención, el término “tratamiento” designa el tratamiento preventivo, curativo, paliativo así como la atención de pacientes (reducción del sufrimiento, mejora de la duración de vida, ralentización de la progresión de la enfermedad), etc. El tratamiento puede realizarse además en combinación con otros agentes o tratamientos, especialmente dirigidos a los eventos tardíos de la patología, tales como inhibidores de caspasas u otros compuestos activos.

La presente divulgación describe que el compuesto utilizado puede ser cualquier compuesto capaz de inhibir la expresión de la PDE4, especialmente la PDE4B, es decir en particular cualquier compuesto que inhiba la transcripción del gen, la maduración de los ARN, la traducción del ARNm, la modificación post-traduccional de la proteína, etc. Puede tratarse de un compuesto que inhiba la modificación del ARN, especialmente la deleción de una parte de la región 3’ no codificante.

El compuesto puede ser especialmente un ácido nucleico antisentido, capaz de inhibir la transcripción del gen de la PDE4B o la traducción del mensajero correspondiente. El ácido nucleico antisentido puede incluir toda o parte de la secuencia del gen de la PDE4B, un fragmento de la misma, del mensajero de la PDE4B, o de una secuencia complementaria de éstas. El antisentido puede incluir especialmente una región complementaria de la secuencia incluida entre los residuos 218-2383 de SEC ID Nº 1 o 766-2460 de SEC ID Nº 3, e inhibir (o reducir) su traducción en proteína. El antisentido puede ser un ADN, un ARN, una ribozima, etc. Puede ser monocatenario o bicatenario. Puede tratarse asimismo de un ARN codificado por un gen antisentido. Tratándose de un oligonucleótido antisentido, comprende típicamente menos de 100 bases, por ejemplo del orden de 10 a 50 bases. Este oligonucleótido puede modificarse para mejorar su estabilidad, su resistencia a las nucleasas, su penetración celular, etc.

El compuesto puede ser asimismo un péptido, por ejemplo que comprenda una región de la proteína PDE4 (especialmente PDE4B) y capaz de antagonizar su actividad.

El compuesto según la invención es el etazolato de fórmula:

eventos moleculares asociados a la excitotoxicidad. Según los modos de empleo particulares, la invención puede usarse para inhibir o reducir la excitotoxicidad neuronal en fase temprana de enfermedades neurodegenerativas. Es aplicable especialmente al tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

La administración puede realizarse mediante cualquier procedimiento conocido por el experto en la técnica, preferiblemente por vía oral o por inyección, típicamente por vía intraperitoneal, intracerebral, intravenosa, intraarterial o intramuscular. Se prefiere la administración por vía oral. Las dosis administradas pueden adaptarse por el experto en la técnica. Típicamente, se inyectan aproximadamente de 0,01 mg a 100 mg/kg para los compuestos inhibidores de naturaleza química. Para los compuestos nucleicos, las dosis pueden variar, por ejemplo, entre 0,01 mg y 100 mg por dosis. Se entiende que puede realizarse inyecciones repetidas, eventualmente en combinación con otros agentes activos o cualquier vehículo aceptable en el plano farmacéutico (por ejemplo, tampones, disoluciones salinas, isotónicas, en presencia de agentes estabilizantes, etc.).

La invención es utilizable en mamíferos, especialmente en el ser humano. Los resultados presentados en los ejemplos ilustran la eficacia de inhibidores de PDE4B para mejorar la viabilidad de neuronas dispuestas en condiciones de excitotoxicidad.

Procedimientos de selección y herramientas

La invención describe también procedimientos de selección, identificación o caracterización de compuestos activos sobre las patologías asociadas a la excitotoxicidad, o al estrés neuronal, que comprenden la puesta en contacto de compuestos de ensayo con una célula que expresa PDE4B (especialmente, una variante desprovista del dominio 3’ no codificante) y la puesta en evidencia de compuestos que inhiben la expresión o la actividad de esta proteína.

Los procedimientos pueden implementarse con diferentes poblaciones celulares tales como células primarias o líneas de células de origen mamífero (humano, murino, etc.). Se usan ventajosamente células que no expresan naturalmente la PDE4B, transfectadas con un ácido nucleico que codifica la variante deseada. De esta manera, aumenta la selectividad del procedimiento. Se pueden usar igualmente células eucariotas inferiores (levadura, etc.) o células procariotas.

Los procedimientos de cribado pueden realizarse igualmente en un sistema acelular, mediante la medida de la capacidad de los compuestos de ensayo de ligarse a la PDE4B o una variante o fragmento de la misma.

La invención describe igualmente cualquier ácido nucleico que codifique un polipéptido tal como se define anteriormente, los vectores que lo contienen, células recombinantes y usos. Los vectores pueden ser plásmidos, fagos, cósmidos, virus, cromosomas artificiales, etc. Son vectores preferidos, por ejemplo, vectores plasmídicos, como aquellos derivados de plásmidos comerciales (pUC, pcDNA, pBR, etc.). Dichos vectores comprenden ventajosamente un gen de selección y/o un origen de replicación y/o un promotor transcripcional. Son otros vectores particulares, por ejemplo, virus o fagos, especialmente virus recombinantes defectivos de replicación tales como virus derivados de retrovirus, adenovirus, AAV, herpesvirus, baculovirus, etc. Los vectores pueden usarse en cualquier hospedador competente como, por ejemplo, células procariotas o eucariotas. Puede tratarse de bacterias (por ejemplo E. coli), levaduras (por ejemplo, Saccharomyces o Kluyveromyces), células vegetales, células de insectos, células de mamíferos, especialmente humanas, etc. Puede tratarse de líneas, células primarias, cultivos mixtos, etc.

Aparecerán otros aspectos y ventajas de la presente invención tras la lectura de los ejemplos siguientes, que deben considerarse ilustrativos y no limitativos.

LEYENDA DE LAS FIGURAS

Figura 1: PCR semicuantitativa de PDE4B a partir de muestras de cerebro (1A) y de músculo (1B).

Figura 2: La pentoxifilina protege a las neuronas primarias de gránulos cerebelosos de la excitotoxicidad inducida por el cainato.

Figura 3: La pentoxifilina protege a las neuronas primarias de gránulos cerebelosos de la excitotoxicidad inducida por NMDA/serina.

Figura 4: Efecto neuroprotector del etazolato sobre la toxicidad inducida por NMDA/serina sobre las células granulares del cerebelo.

Figura 5: Efecto neuroprotector del etazolato sobre la toxicidad inducida por el cainato sobre las células granulares del cerebelo.

Figura 6: Efecto neuroprotector de la pentoxifilina sobre la toxicidad inducida por NMDA/serina sobre las neuronas corticales.

Figura 7: Efecto neuroprotector de la pentoxifilina sobre la toxicidad inducida por el cainato sobre las neuronas corticales.

Figura 8: Efecto neuroprotector del etazolato sobre la toxicidad inducida por NDMA/serina sobre las neuronas corticales.

Figura 9: Efecto neuroprotector del etazolato sobre la toxicidad inducida por el cainato sobre las neuronas corticales.

Figura 10: Efecto neuroprotector del 8-bromo-AMPc sobre la toxicidad inducida por NDMA/serina sobre las células granulares del cerebelo.

Figura 11: Efecto neuroprotector del 8-bromo-AMPc sobre la toxicidad inducida por el cainato sobre las células granulares del cerebelo.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Identificación de la PDE4 como diana molecular de la excitotoxicidad

El análisis cualitativo diferencial se ha efectuado a partir de ARN poliadenilados (poli A+) extraídos de muestras de cerebros de animales correspondientes a las diferentes etapas, sin aislamiento previo de neuronas con el fin de tener en cuenta el máximo de eventos de corte y empalme alternativos ligados al desarrollo de la patología.

Los ARN poli A+ se preparan según técnicas conocidas por el experto en la técnica. Puede tratarse particularmente de un tratamiento mediante agentes caotrópicos tales como tiocianato de guanidinio seguido de una extracción del ARN total mediante disolventes (fenol, cloroformo, por ejemplo). Dichos procedimientos son bien conocidos por el experto en la técnica (véanse Maniatis et al., Chomczynsli et al., Anal. Biochem. 162 (1987) 156), y pueden practicarse fácilmente usando kits disponibles comercialmente. A partir de estos ARN totales, se preparan los ARN poli A+ según procedimientos clásicos conocidos por el experto en la técnica y propuestos por kit comerciales.

Estos ARN poli A+ sirven de matriz a reacciones de transcripción inversa con la ayuda de transcriptasa inversa. Ventajosamente, se usan transcriptasas inversas desprovistas de actividad ARNasa H, que permiten obtener las primeras cadenas de ADN complementario de tamaños superiores a los obtenidos con transcriptasas inversas clásicas. Dichas preparaciones de transcriptasas inversas sin actividad ARNasa H están disponibles comercialmente.

Para cada punto de la cinética de desarrollo de la patología (30 días, 60 días y 90 días), se preparan ARN poli A+ así como ADNc monocatenarios a partir de animales transgénicos (T) y animales de control singénicos (C).

Según la técnica DATAS, para cada punto de la cinética se realizan hibridaciones de ARNm (C) con ADNc (T) e hibridaciones recíprocas de ARNm (T) con ADNc (C).

Estos heterodúplex de ARNm/ADNc se purifican a continuación según los protocolos de la técnica DATAS.

Las secuencias de ARN no apareadas con un ADN complementario se liberan de estos heterodúplex bajo la acción de la ARNasa H, degradando esta enzima las secuencias de ARN apareadas. Estas secuencias no apareadas representan las diferencias cualitativas que existen entre los ARN por lo demás homólogos entre sí. Estas diferencias cualitativas pueden localizarse en cualquier lugar sobre la secuencia de ARN, tanto en 5’, 3’ o en el interior de la secuencia, y especialmente en la secuencia codificante. Según su localización, estas secuencias pueden ser no sólo modificaciones de corte y empalme, sino igualmente consecuencias de translocaciones o deleciones.

Las secuencias de ARN que representan las diferencias cualitativas se clonan a continuación según las técnicas conocidas por el experto en la técnica y especialmente aquellas descritas en la patente de la técnica DATAS.

Estas secuencias se reagrupan dentro de los bancos de ADNc que constituyen los bancos cualitativos diferenciales. Uno de estos bancos contiene los exones y los intrones específicos de la situación sana; los otros bancos contienen los eventos de corte y empalme característicos de condiciones patológicas. Se ha verificado la expresión diferencial de clones mediante hibridación con sondas obtenidas mediante transcripción inversa a partir de ARN mensajeros extraídos de las diferentes situaciones estudiadas. Los clones que hibridan de forma diferencial se han retenido para análisis posterior. Las secuencias identificadas por DATAS corresponden a intrones y/o a exones expresados de forma diferencial mediante corte y empalme entre las situaciones patológicas y la situación sana. Estos eventos de corte y empalme pueden ser específicos de una etapa dada del desarrollo de la patología o característicos del estado sano.

La comparación de estas secuencias con los bancos de datos permite clasificar las informaciones obtenidas y proponer una selección razonada de secuencias según su interés diagnóstico o terapéutico.

La realización de DATAS sobre ARN de animales de control y transgénicos de 60 días de edad ha permitido aislar un fragmento de ADNc derivado de ARNm de la fosfodiesterasa 4B. Este fragmento corresponde a un fragmento de exón presente específicamente en los animales de control y por tanto específicamente eliminado en los animales transgénicos por SOD1 G93A en la etapa de 60 días. Este fragmento abarca los nucleótidos 377 a 486 referidos a partir del codón de parada de PDE4B de ratón (SEC ID Nº 1). Esta secuencia comprende 2912 bases,

correspondiendo el fragmento eliminado a las bases 2760 a 2869. Esta región es no codificante y se expresa diferencialmente entre los animales de control y los animales transgénicos, debido al uso alternativo de un exón 3’ no codificante o debido al uso de dos sitios de poliadenilación alternativos.

Ejemplo 2: Experimentos de PCR-TI: confirmación de la expresión diferencial:

Se ha verificado la expresión diferencial de PDE4B en una situación de estrés neuronal, con relación a una situación de referencia, mediante los experimentos de PCR-TI presentados en la figura 1.

Estos experimentos se han realizado según técnicas bien conocidas por el experto en la técnica y han permitido seguir las expresiones de dos regiones distintas del ARNm de PDE4B. Una de estas regiones abarca el codón de inicio de este ARNm (PDE4B 5’), el otro abarca en parte el fragmento identificado según la técnica DATAS (PDE4B DATAS). Las localizaciones de los cebadores de PCR usados se indican en la figura 1.

El ARN PO corresponde a un ARN ribosómico usado como control interno destinado a verificar que se usa la misma cantidad de ARN para cada punto experimental. Los análisis se han realizado a partir de ARN extraídos de animales de control (C) y transgénicos (T) de 30, 60 y 90 días de edad, es decir, antes de la aparición de síntomas patológicos.

Los ARN totales de cerebro de ratones de control o SOD1 G93A de 30, 60 y 90 días de edad se transcriben a ADNc usando el protocolo estándar de Superscript™ (Invitrogen). Para las PCR semicuantitativas, se diluyen 10 veces los productos de reacción de transcripción inversa. Los cebadores específicos del fragmento DATAS corresponden para el sentido a los nucleótidos 2526-2545 (5’ GCC AGG CCG TGA AGC AAA TA 3’; SEC ID Nº 5), y para el antisentido a los 2790-2807 (5’ TCA AAG ACG CGA AAA CAT 3’; SEC ID Nº 6), y para el fragmento más en 3’ los cebadores corresponden para el sentido a los nucleótidos 145-165 (5’ CCG CGT CAG TGC CTT TGC TAT 3’; SEC ID Nº 7), y para el antisentido a los 426-404 (5’ CGC TGT CGG ATG CTT TTA TTC AC 3’; SEC ID Nº 8). Como gen de referencia, se usa el gen PO y se amplifica mediante los cebadores, con sentido: 5’ TCG CTT TCT GGA GGG TGT C 3’ (SEC ID Nº 9) y antisentido: CCG CAG GGG CAG CAG TGG 3’ (SEC ID Nº 10). La amplificación se efectúa mediante los 30 ciclos de PCR siguientes:

-

30 segundos a 94°C

-

un minuto a 57°C

-

30 segundos a 72°C, seguido de un ciclo de 2 minutos a 72ºC.

Se ponen los diferentes productos de PCR sobre un gel de agarosa al 1,5%. Se repite el experimento tres veces con dos reacciones de transcripción inversa diferentes.

La figura 1 presenta los resultados obtenidos a partir de ARN extraídos de cerebros o de músculos de animales. Aunque que se amplifica la misma cantidad de ADNc a partir del ARN de PO en todas las muestras, se observan variaciones para el ARNm de PDE4B: se detectan las variaciones más significativas en los animales de 90 días de edad; aunque se observa un aumento del nivel de expresión del fragmento PDE4 5’ en el cerebro de animales transgénicos, se observa una muy fuerte disminución de la expresión de PDE4B (DATAS) en el cerebro de animales transgénicos.

Este resultado establece una correlación entre la disminución de la expresión de un fragmento 3’ no codificante del ARNm de PDE4B y el aumento de la expresión de la parte 5’ codificante de este mismo mensajero. Este resultado es absolutamente compatible con la presencia de secuencias de desestabilización de ARNm en la secuencia identificada por DATAS y demuestra la correlación entre la expresión de PDE4B y el fenómeno de excitotoxicidad.

Ejemplo 3: Inhibición de la excitotoxicidad mediante inhibidores de PDE4

Para este ejemplo, se han puesto en cultivo neuronas granulares de cerebelo de rata así como neuronas corticales según técnicas conocidas por el experto en la técnica.

Cultivo primario de células granulares de cerebelo:

Se decapitan ratas Wistar de 7 días de edad y se disecan sus cerebelos. Después de extirpar las meninges, se corta el tejido en pequeños trozos y se tripsiniza durante 15 minutos a 37ºC. Se disocian las células mediante trituración y se ponen en cultivos a una densidad de 300.000 células por cm2 en medio basal Eagle suplementado con 10% de suero fetal de ternero y glutamina 2 mM. Al día siguiente, se añade ARA-C 10 μM, un antimicótico, para impedir la proliferación de células gliales. Se tratan las células el día 9 de cultivo con los inhibidores de fosfodiesterasa, pentoxifilina y etazolato tres horas antes de la adición de los tóxicos cainato 50 μM o N-metil-D-asparato 100 μM en presencia de D-serina 10 μM. Se añade 8-bromo-AMPc justo antes de los tóxicos. Se efectúan todos los tratamientos como mínimo por duplicado y en al menos dos cultivos diferentes. Después de una incubación de seis horas, se mide la toxicidad mediante un ensayo MTT. Los resultados, normalizados a la media de no tratado, se analizan estadísticamente mediante el test de Wilcoxon. Se determina el valor significativo a p inferior o igual a 0,05.

Cultivos primarios de células corticales:

Se extirpan embriones de rata Wistar de 16 días de edad y se disecan los córtex. Después de la tripsinación a 37ºC durante 25 minutos, se disocian las células mediante trituración. Se siembran las células en medio esencial mínimo suplementado con 10% de suero equino y 10% de suero fetal bovino y glutamina 2 mM a una densidad de 300.000 células por cm2. Después de 4 días de cultivo, se cambia la mitad del medio por medio esencial mínimo suplementado con 5% de suero equino y glutamina 2 mM. El mismo día se añaden 10 μM de 5-fluoro-2desoxiuridina, un antimitótico. Después de siete y once días de cultivo, se cambia la mitad del medio por medio acondicionado. El medio acondicionado está compuesto por MEM que contiene 5% de suero equino y glutamina 2 mM; este medio se pasa por una capa de astrocitos corticales durante una noche antes de su uso. El día 14, se tratan las células con los inhibidores de fosfodiesterasa, pentoxifilina y etazolato, una hora antes de la adición de los tóxicos cainato 50 μM o N-metil-D-aspartato 20 μM en presencia de D-serina 10 μM. Todos los tratamientos se efectúan como mínimo por duplicado y en al menos dos cultivos diferentes. Después de una incubación de seis horas, se mide la toxicidad mediante un ensayo MTT. Se analizan estadísticamente los resultados, normalizados a la media de no tratado, mediante el test de Wilcoxon. Se determina el valor significativo a p inferior o igual a 0,05.

MTT:

Se mide la toxicidad usando el ensayo MTT. Después de incubación con los compuestos, se añade MTT a una concentración final de 0,5 mg/ml por pocillo. Se incuban a continuación las placas durante 30 minutos a 37ºC en la oscuridad. Se aspira el medio y se resuspenden los cristales en 500 μl de DMSO (dimetilsulfóxido). Se lee la absorbancia a 550 nm y se calcula el porcentaje de viabilidad.

Resultados:

Los resultados obtenidos se presentan en las figuras 2-10. Estos resultados ilustran el efecto protector de los compuestos de la invención sobre la supervivencia neuronal. En caso de cotratamiento de neuronas con un inhibidor de PDE4, se observa un efecto protector dependiente de la dosis en los dos modos de inducción de la excitotoxicidad (NDMA/serina y cainato). Se observa dicho efecto protector con la ayuda de pentoxifilina y etazolato.

Las figuras 2 y 3 presentan los resultados obtenidos con la ayuda de pentoxifilina sobre las células granulares del cerebelo. Los resultados presentados muestran que la pentoxifilina permite conseguir en las células un efecto protector de un 43% en el caso de tratamiento con NMDA/serina, y de un 33% en el caso de la toxicidad inducida por cainato.

Las figuras 4 y 5 presentan los resultados obtenidos con la ayuda del etazolato sobre las células granulares del cerebelo. Los resultados presentados muestran que el etazolato permite conseguir en estas células un efecto protector de un 60% en el caso de tratamiento con NMDA/serina y de un 57% en el caso de toxicidad inducida por cainato.

Las figuras 6 y 7 presentan los resultados obtenidos con la ayuda de pentoxifilina sobre las neuronas corticales. Los resultados presentados muestran que la pentoxifilina permite conseguir en las células un efecto protector de un 50% en el caso de tratamiento con NMDA/Ser, y de un 66% en el caso de toxicidad inducida por cainato.

Las figuras 8 y 9 presentan los resultados obtenidos con la ayuda del etazolato sobre las neuronas corticales. Los resultados presentados muestran que el etazolato permite conseguir en las células un efecto protector de un 33% en el caso de tratamiento con NDMA/Ser, y de un 25% en el caso de toxicidad inducida por cainato.

La pertinencia de estas protecciones está atestiguada por los % de protección obtenidos por concentraciones crecientes de AMPc, sustrato de PDE, dados a modo de ejemplo para células granulares del cerebelo en las figuras 10 y 11. Estos % son de 40% para el tratamiento con NMDA/serina y de 40% para el tratamiento con cainato.

La presente invención documenta por tanto no sólo la implicación de PDE4B en los mecanismos de excitotoxicidad, especialmente en un modelo de ELA, sino igualmente la capacidad de inhibidores de PDE4 de conservar la viabilidad neuronal en caso de estrés ligado a la excitotoxicidad.

Ejemplo 4: Uso clínico en el hombre

Este ejemplo describe las condiciones de un uso clínico humano de un inhibidor de PDE4 en el tratamiento de ELA. Este ejemplo ilustra el potencial terapéutico de la invención y sus condiciones de aplicación al ser humano.

En este ensayo clínico, el tratamiento está basado en una combinación de pentoxifilina y riluzol. La dosis de pentoxifilina usada es de 400 mg por administración, en forma de tres tomas diarias, es decir una dosis diaria total de 1.200 mg. La pentoxifilina se usa en forma de comprimidos. El ensayo es multicéntrico y se realiza con doble ciego frente a placebo en 400 pacientes. Los pacientes incluidos en el ensayo son hombres o mujeres de 18 a 80 años de edad, aquejados de ELA esporádica o familiar, y bajo tratamiento con riluzol (50 mg dos veces al día) desde hace 3 meses al menos. El tratamiento con pentoxifilina se prevé con una duración de 18 meses.

Se mide principalmente la eficacia por las tasas de supervivencia de los pacientes, la calidad de vida y los ensayos musculares.

Otros aspectos y aplicaciones de la invención consisten en:

-

el uso de toda o parte de una secuencia derivada de ARN mensajero de PDE4B con fines de diagnóstico o cribado o de caracterización de patologías neurodegenerativas que tienen un componente o una etapa ligado al 5 fenómeno de excitotoxicidad, tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, corea de Huntington, ELA o isquemia cerebral;

-

el uso de cualquier fragmento de ácido nucleico incluido en el ARN antisentido con el objeto de inhibir la expresión de PDE4B en pacientes aquejados de dichas patologías;

-

el uso de cualquier compuesto químico, especialmente pentoxifilina o etazolato o de cualquier composición 10 farmacéutica que los contenga, con el fin de inhibir la actividad de PDE4B en pacientes aquejados de dichas patologías;

-

el uso de toda o parte de una secuencia derivada de ARN mensajero de PDE4B con fines de caracterización del tejido y de la situación isquémica.

LISTADO DE SECUENCIAS

15 <110> Exonhit Therapeutics

<120> Nueva diana molecular de la neurotoxicidad

<130> B0100EPPC2

<140>

<141> 20 <160> 10

<170> PatentIn ver. 2.1

<210> 1

<211> 2912

<212> ADN 25 <213> ratón

<220>

<221> CDS

<222> (218)..(2383)

<400> 1

<210>

2

<211>

721

<212>

PRT

5

<213> ratón

<400>

2

<210>

3

<211>

4068

<212>

ADN

5

<213> Homo sapiens

<220>

<221>

CDS

<222>

(766)..(2460)

<223>

PDE4B

<400>

3

<210>

4

<211>

564

<212>

PRT

5

<213> Homo sapiens

<400>

4

<210> 5

<211> 20

<212>

ADN

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Descripción de la secuencia artificial: cebador

5

<400>

5

<210>

6

<211>

18

<212>

ADN

10

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Descripción de la secuencia artificial: cebador

<400>

6

15

<210> 7

<211>

21

<212>

ADN

<213>

Secuencia artificial

<220>

20

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

<400>

7

<210>

8

<211>

23

25

<212> ADN

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Descripción de la secuencia artificial: cebador

<400>

8

<210>

9

<211>

19

<212>

ADN

<213>

Secuencia artificial

35

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

<400> 9

<210>

10

5

<211> 18

<212>

ADN

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Descripción de la secuencia artificial: cebador

10

<400>

10

Claims (4)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Uso del etazolato para la preparación de una composición farmacéutica destinada a inhibir o reducir la excitotoxicidad neuronal en fase temprana de la enfermedad de Alzheimer.

2. 2.

   Uso de etazolato para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

3. 3.

   Etazolato para uso en un procedimiento destinado a inhibir o reducir la excitotoxicidad neuronal en fase temprana de la enfermedad de Alzheimer.

4. 4.

   Etazolato para uso en un procedimiento de tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.