ES2316625T3 - Nueva diana molecular de la neurotoxicidad. - Google Patents
Nueva diana molecular de la neurotoxicidad. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2316625T3 ES2316625T3 ES02777405T ES02777405T ES2316625T3 ES 2316625 T3 ES2316625 T3 ES 2316625T3 ES 02777405 T ES02777405 T ES 02777405T ES 02777405 T ES02777405 T ES 02777405T ES 2316625 T3 ES2316625 T3 ES 2316625T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- pde4b
- pyrazolo
- baselineskip
- methyl
- pyridine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Psychology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
Abstract
Uso de al menos un compuesto inhibidor de PDE4B que pertenece a la familia de las pirazolopiridinas para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de ELA.
Description
Nueva diana molecular de la neurotoxicidad.
La presente invención se refiere al campo de la
biología, la genética y la medicina. Se refiere especialmente a
nuevos procedimientos para el tratamiento (o la gestión) de
patologías neurodegenerativas, y particularmente de esclerosis
lateral amiotrófica. La invención resulta especialmente de la
identificación del papel de la fosfodiesterasa 4B en estas
patologías y describe su uso como diana o marcador terapéutico,
diagnóstico o experimental de estos trastornos.
Se han descrito numerosas patologías
neurodegenerativas que tienen un componente o una etapa ligado al
fenómeno de la excitotoxicidad. Es el caso de enfermedad de
Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple y corea de
Huntington. Para la esclerosis múltiple, se describe especialmente
en la patente US 6060501 un tratamiento preventivo o curativo
mediante la administración de una combinación de inhibidores de PDE4
y agentes antiinflamatorios o inmunomoduladores.
La esclerosis lateral amiotrófica (ELA o ALS por
"Amyotrophic Lateral Sclerosis") es una enfermedad
neurodegenerativa asociada a diferentes tipos de inclusiones tales
como cuerpos de Lewis y caracterizada por una apoptosis de las
motoneuronas espinales y corticales cuyo resultado mortal está
asociado a veces a una demencia frontal. Las formas esporádicas,
sin ninguna mutación descrita, coexisten con las formas familiares
(ELAF) asociadas a mutaciones en el gen SOD1 que codifica la
superóxido dismutasa. La mayoría de casos son esporádicos, las
formas familiares (ELAF) son muy raras. Es probable que un largo
periodo asintomático preceda la aparición de síntomas clínicos, que
son variados y cuya clasificación es compleja. Los futuros
desarrollos terapéuticos sustituirán a los tratamientos de la
sintomatología con estrategias basadas en las causas moleculares de
la patología. Al nivel celular, estos síntomas están asociados a la
muerte de motoneuronas corticales y motoneuronas espinales. Esta
muerte neuronal se ha conectado con diferentes fenómenos que
constituyen la base de varias patologías neurodegenerativas. Este
es el caso de la excitotoxicidad ligada al glutamato, del estrés
oxidativo, de una cierta autoinmunidad dirigida contra marcadores
neuronales (los canales cálcicos en el caso de ELA), así como
anomalías del citoesqueleto. Aunque estos fenómenos están descritos,
la o las causas de estas enfermedades, entre ellas la ELA, son
desconocidas. Aunque las ELAF están ligadas a mutaciones en el gen
SOD1 que codifica la superóxido dismutasa, los mecanismos que
comprometen a las neuronas a la muerte celular, de la que al menos
un componente es la apoptosis, son desconocidos.
La identificación de los eventos moleculares
implicados en los diferentes fenómenos implicados en la muerte
celular permitirá establecer nuevas estrategias terapéuticas. El
estudio de estos eventos es difícilmente realizable a partir de
biopsias humanas. Estas biopsias proceden evidentemente de muestras
post-mortem cuya calidad es difícilmente
controlable y sólo representan estados patológicos representativos
de fases tardías de la enfermedad.
Los modelos animales dan acceso a muestras
biológicas que permiten analizar diferentes etapas del desarrollo
de una patología y comparar estas etapas con sujetos sanos. A este
respecto, están disponibles ratones transgénicos que expresan el
gen humano SOD1 que porta una de las mutaciones prevalentes en ELAF
(mutación G93A) en el Jackson Laboratory, a condición de una
concesión de licencia de uso por la NorthWestern University. Este
modelo reproduce en 120 días el resultado mortal de la enfermedad
con síntomas comparables a los de la enfermedad humana. La
aparición de síntomas de ELA ligados a la mutación G93A en SOD1 no
es la consecuencia de una reducción de la actividad superóxido
dismutasa, sino de una ampliación de función que aumenta la
capacidad de la enzima de generar radicales libres. A pesar de
estas informaciones, los eventos moleculares que presiden las
diferentes etapas de la ELA son mal conocidos. La complejidad de
estos eventos moleculares refleja la evolución de la patología: en
el modelo transgénico estudiado, no se ha reseñado ninguna
desregulación neuronal ni manifestación clínica a los 30 días. Los
60 días corresponden a una etapa que precede por poco a los primeros
síntomas pero que se caracteriza ya a nivel cerebral por cambios en
la fisiología celular tales como una alteración del metabolismo
mitocondrial, un estrés y una muerte celular asociados a un fenómeno
de excitotoxicidad. A los 90 días, el 50% de las motoneuronas
corticales y espinales han muerto y se ha iniciado un proceso activo
de apoptosis neuronal paralelamente a una activación astrocítica.
El fenómeno de excitotoxicidad no se observa ya en esta etapa. La
muerte neuronal está asociada a la activación de caspasas que no
parecen implicadas en las fases tempranas de la patología.
Identificar los diferentes eventos moleculares
específicos de las diferentes fases de la patología debe permitir
identificar nuevas dianas terapéuticas así como nuevos marcadores
diagnósticos. Uno de los enfoques más eficaces para realizar esta
identificación consiste en identificar los genes y las proteínas
cuya expresión caracteriza un estado fisiopatológico.
La presente invención describe ahora la
identificación de eventos genéticos implicados en los fenómenos de
excitotoxicidad y muerte neuronal. La presente invención proporciona
así nuevos enfoques terapéuticos y diagnósticos de patologías
asociadas a estos fenómenos, así como nuevas dianas para la
identificación de compuestos activos.
Más particularmente, se ha efectuado un análisis
cualitativo diferencial a partir de ARN extraídos de muestras de
cerebro y de médula espinal, sin aislamiento previo de neuronas, con
el fin de tener en cuenta un máximo de eventos de corte y empalme
alternativos ligados al desarrollo de la patología. Este análisis se
ha efectuado mediante cribado diferencial cualitativo según la
técnica DATAS (descrita en la solicitud nº WO99/46403), que
presenta ventajas desiguales.
La presente solicitud de patente resulta
especialmente de la construcción por el solicitante de un repertorio
de alteraciones de corte y empalme en el cerebro de animales modelo
de ELA de 60 días de edad. Este repertorio, que contiene más de 200
secuencias distintas, implica los actores clave del fenómeno de
excitotoxicidad tales como los canales potásicos y el receptor de
NMDA. Las secuencias derivadas de ARN que codifican las proteínas
implicadas en la respuesta al estrés, como las proteínas de choque
térmico, forman parte igualmente de este repertorio, subrayando la
implicación de esta respuesta en las fases tempranas de ELA. Una
alteración del metabolismo energético parece afectar claramente a
las motoneuronas corticales de los animales que desarrollan la
patología. Por ejemplo, se aísla específicamente el intrón 6 de la
forma mitocondrial de creatina cinasa a partir de ARN mensajeros
expresados en condiciones patológicas en animales de 60 días de
edad. Esta interrupción de la secuencia de codificación por esta
retención de intrón desemboca en un ARN mensajero que codifica una
forma inactiva de la enzima. Esta observación está de acuerdo con
las observaciones bioquímicas que han mostrado una disminución de
la actividad creatina cinasa mitocondrial, correlacionada con una
disminución de la cantidad de esta enzima en las neuronas de
animales del mismo modelo transgénico. La especificidad de las
secuencias que constituyen este repertorio está atestiguada por el
hecho de que el mismo análisis diferencial cualitativo de la
expresión genética realizado en animales de 90 días de edad
desemboca en un repertorio diferente del que están ausentes
especialmente los diferentes marcadores de excitotoxicidad. El
análisis de las modificaciones de corte y empalme confirma que los
eventos moleculares son diferentes según la etapa de la
patología.
De manera particularmente interesante e
inesperada, la realización de DATAS sobre ARN de animales de control
y transgénicos de 60 días de edad ha permitido aislar un fragmento
de ADNc derivado de ARNm de fosfodiesterasa 4B. Este fragmento
corresponde a un fragmento de exón presente específicamente en los
animales de control y que se elimina específicamente en los
animales transgénicos de SOD1G93A en la etapa de 60 días. Este
fragmento abarca los nucleótidos 377 a 486 referidos a partir del
codón de paro de PDE4B de ratón (SEC ID Nº 1) (secuencia igualmente
accesible en GenBank, nº AF208023). Esta secuencia comprende 2912
bases, correspondiendo el fragmento eliminado a las bases 2760 a
2869. Esta región no codificante se expresa diferencialmente entre
los animales de control y los animales transgénicos, debido al uso
alternativo de un exón 3' no codificante o debido al uso de dos
sitios de poliadenilación alternativos. Esta expresión diferencial
se ha puesto en evidencia mediante experimentos de PCR TI
presentados en las figuras 1A y 1B.
La presente solicitud demuestra por tanto la
implicación de la fosfodiesterasa 4B en el desarrollo de los
procesos de excitotoxicidad y muerte neuronal. Los resultados
obtenidos muestran una expresión más pronunciada de PDE4B en los
tejidos nerviosos patológicos, ligada a una modificación estructural
del ARN correspondiente, especialmente a la deleción de una región
en la parte 3' no codificante. Este resultado es absolutamente
compatible con la presencia de secuencias de desestabilización del
ARNm en la secuencia identificada por DATAS. Su deleción del ARNm
de PDE4B mediante corte y empalme o mediante el uso de secuencias de
poliadenilación alternativas puede desembocar en una
estabilización, por tanto un aumento de la expresión de la parte
codificante de este ARN. Este evento se produce específicamente en
el cerebro de sujetos patológicos y no en sujetos de control. La
presente invención describe por tanto un evento molecular original
que desemboca en un aumento de la expresión del ARNm de PDE4B en el
cerebro de sujetos patológicos y que está correlacionado en el
tiempo con el fenómeno de excitotoxicidad y/o muerte neuronal. La
invención muestra igualmente, por primera vez, que un aumento de la
expresión de PDE4B está asociado a las etapas tempranas de ELA. La
PDE4B constituye por tanto una nueva terapéutica nueva e importante
en el desarrollo de terapias de estas patologías, utilizables
especialmente en fases tempranas de su desarrollo, y que se dirigen
a las verdaderas bases moleculares de la patología y no a los
síntomas o componentes inflamatorios asociados.
La invención describe igualmente nuevos
procedimientos de diagnóstico, cribado, detección, determinación de
una predisposición o seguimiento de la evolución o de la eficacia
del tratamiento de estas patologías.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención describe por tanto un
procedimiento de detección de una situación de excitotoxicidad o de
estrés neuronal en un sujeto, que comprende la medida in
vitro de la expresión de fosfodiesterasa 4, especialmente de
fosfodiesterasa 4B, en una muestra procedente del sujeto. El
procedimiento comprende ventajosamente una medida de la expresión
diferencial de la región 3' no codificante del gen de PDE4B y del
resto del gen, especialmente de la parte codificante.
La invención describe por tanto un procedimiento
de detección de una situación de excitotoxicidad o de estrés
neuronal en un sujeto, que comprende la detección de la presencia de
una forma mutada de ARN de fosfodiesterasa 4, especialmente de
fosfodiesterasa 4B, en una muestra procedente del sujeto,
particularmente de una forma con deleción total o parcial de la
región 3' no codificante.
La invención divulga igualmente el uso de un
ácido nucleico que comprende toda o parte de una secuencia derivada
del gen o del ARN mensajero de PDE4B para el empleo de un
procedimiento de diagnóstico o de detección de una situación de
estrés neuronal y más particularmente de la situación de
excitotoxicidad.
La invención se basa, en general, en el uso de
un ácido nucleico complementario de todo o parte del gen o del
mensajero de PDE4B para la detección de eventos patológicos de tipo
excitotoxicidad, estrés o muerte neuronal, etc. Más generalmente,
la invención se fundamenta en un procedimiento de diagnóstico,
cribado, caracterización o seguimiento de una patología
degenerativa, que comprende la puesta en evidencia de una alteración
en el gen de PDE4 o en el ARN correspondiente, típicamente de
PDE4B.
La expresión de PDE4, o la expresión
diferencial, o la presencia de una forma alterada pueden
determinarse mediante técnicas convencionales de biología molecular
como, por ejemplo, mediante secuenciación, hibridación,
amplificación, PCR-TI, migración en gel, etc. La
invención es aplicable al diagnóstico o la detección de diferentes
patologías que implican fenómenos de excitotoxicidad, tales como
enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis
múltiple, ELA, corea de Huntington o isquemia cerebral. Puede usarse
para la detección precoz, la puesta en evidencia de una
predisposición, la elección y adaptación de un tratamiento, el
seguimiento de la evolución de la patología, etc. Está
particularmente adaptada a la detección en una etapa temprana de
esclerosis múltiple o ELA.
Para el empleo de los procedimientos genéticos
de diagnóstico o de detección según la invención, se usan más
particularmente ácidos nucleicos capaces de poner en evidencia una
forma de ARNm de PDE4B con deleción, especialmente una forma
desprovista de toda o parte de la región 3' no codificante. A modo
de ejemplo específico, se usa un ácido nucleico complementario de
toda o parte de la región comprendida entre los residuos 2760 a 2869
de la secuencia SEC ID Nº 1, o de los residuos correspondientes a
la secuencia del gen o del ARNm de PDE4B humana. La secuencia de
ADNc que codifica la PDE4B humana y de la proteína correspondiente
se representan en las secuencias SEC ID Nº 3 y 4 (véase igualmente
Genbank, nº NM002600). La región 3' no codificante del ARN o del gen
de PDE4B humana corresponde a los residuos 2461 a 4068 de la SEC ID
Nº 3.
Ventajosamente, el ácido nucleico usado (como
sonda) comprende toda o parte de la secuencia codificante de la
región 3' no codificante del gen o del ARN de PDE4B comprendida
entre los nucleótidos 2384 y 2869 de la secuencia SEC ID Nº 1 o
entre los nucleótidos 2461 y 4068 de la secuencia SEC Nº ID 3, o una
secuencia complementaria de las mismas.
Según modos particulares de empleo, la invención
usa un ácido nucleico complementario de una región comprendida en
una de las siguientes secuencias:
- residuos 2384 a 2869 de la SEC ID Nº 1
- residuos 2500 a 2869 de la SEC ID Nº 1
- residuos 2760 a 2869 de la SEC ID Nº 1
- residuos 2780 a 2850 de la SEC ID Nº 1
- residuos 2790 a 2810 de la SEC ID Nº 1
- residuos 2600 a 4040 de la SEC ID Nº 3
- residuos 3000 a 4040 de la SEC ID Nº 3
- residuos 3500 a 4040 de la SEC ID Nº 3
- residuos 3900 a 4040 de la SEC ID Nº 3.
Según otro modo particular, se usa un ácido
nucleico complementario de la secuencia de la región de ARN de PDE4
resultante de la deleción de toda o parte de la parte 3' no
codificante. La eliminación de un dominio crea efectivamente nuevas
uniones en la secuencia, que son específicas de la forma con
deleción y pueden usarse para poner en evidencia la presencia de
dicha forma en una muestra.
La complementariedad entre la sonda y la
secuencia diana es preferiblemente perfecta para asegurar una mejor
especificidad de hibridación. Sin embargo, se entiende que pueden
tolerarse ciertos desapareamientos. El ácido nucleico usado para el
empleo de los procedimientos anteriores puede ser un ADN o un ARN,
preferiblemente un ADN de origen sintético. Comprende
preferiblemente de 10 a 500 bases, típicamente de 10 a 100 bases. Se
entiende que puede usarse un ácido nucleico más largo, si se desea,
aunque no sea preferible. El ácido nucleico es ventajosamente un
ADN monocatenario de 10 a 500 bases, complementario de una región al
menos de la secuencia 3' no codificante de PDE4B. El ácido nucleico
puede estar marcado, por ejemplo, por vía radiactiva, enzimática,
luminiscente, fluorescente, química, etc.
Otro enfoque para detectar la presencia de una
alteración del gen de PDE4 usa un cebador o un par de cebadores
nucleicos que permiten una amplificación selectiva de una porción
del ARN de PDE4, preferiblemente que comprende una porción de la
región 3' no codificante. Se usa típicamente un cebador que permite
la amplificación selectiva de la forma alterada del ARN de PDE4,
especialmente un cebador específico de la unión creada por la
eliminación de parte de la región 3' del ARN.
A este respecto, la invención describe un
cebador complementario de una parte de la región 3' no codificante
de PDE4B y que permite la amplificación de una parte de esta región.
El cebador comprende ventajosamente de 8 a 20 bases. Está compuesto
preferiblemente por un fragmento de 8 a 20 residuos consecutivos de
la secuencia comprendida entre los nucleótidos 2384 y 2869 de la
secuencia SEC ID Nº 1 o entre los nucleótidos 2461 y 4068 de la
secuencia SEC ID Nº 3 o de una secuencia complementaria de las
mismas. La invención describe un par de cebadores que permiten la
amplificación específica de una parte al menos de la región 3' no
codificante de PDE4, comprendiendo dicho par al menos un cebador
tal como se define anteriormente.
Para el empleo de los procedimientos descritos,
se pone en contacto in vitro una muestra biológica de un
sujeto, que contiene un ácido nucleico, con un ácido nucleico
(sonda, cebador, etc.) tal como se define anteriormente, y se
detecta la formación de un híbrido o de un producto de
amplificación. La muestra biológica puede ser una muestra de
sangre, fluido, célula, tejido, etc. El ácido nucleico puede estar
inmovilizado sobre un soporte de tipo vidrio, sílice, nailon,
etc.
El procedimiento de detección, cribado o
diagnóstico puede emplearse a partir de diferentes tipos de muestras
procedentes de un sujeto como, por ejemplo, biopsias de tejidos,
especialmente de tejido nervioso. De manera particularmente
sorprendente y ventajosa, la presente invención muestra además que
la desregulación de la expresión de PDE4, correlacionada con el
fenómeno de excitotoxicidad, puede ponerse en evidencia directamente
en el tejido muscular. Esto es particularmente notable en el caso
de patologías neurodegenerativas tales como ELA.
En el transcurso del desarrollo de ELA, los
fenómenos degenerativos se producen no sólo en el cerebro, sino
igualmente en la médula espinal, y en consecuencia en el músculo por
falta de inervación. La figura 2 presenta las modificaciones de
expresión del ARNm de PDE4B en músculos de ratones de control y
transgénicos, seguidas usando los mismos cebadores de PCR que en el
estudio del ARN de cerebros de estos mismos animales. De forma
análoga, aunque menos pronunciada, se observa una disminución de la
expresión de la región 3' no codificante de PDE4B, y no del resto
del este ARNm (especialmente la parte codificante), específicamente
en el músculo de animales al final de la fase presintomática, es
decir, de 90 días de edad.
Una de las dificultades encontradas en los
estudios y los tratamientos de ELA es la dificultad de establecer
un diagnóstico precoz. Esta observación de desregulación del ARNm de
PDE4B en el músculo de ELA permite proponer un diagnóstico precoz a
partir de biopsias musculares de pacientes. Este diagnóstico está
basado en la detección de la expresión diferencial de la región 3'
no codificante y del resto de la secuencia, especialmente
codificante, de PDE4B.
Un procedimiento particular de detección de una
situación de estrés neuronal, especialmente de excitotoxicidad,
ligada particularmente a una patología neurodegenerativa en un
sujeto, comprende la medida de la expresión del gen de PDE4B, o de
la presencia de formas con deleción del mensajero de PDE4B, en una
muestra de células musculares procedentes de dicho sujeto.
Para medir la expresión diferencial, se usa por
ejemplo una sonda correspondiente a (es decir, específica de) una
parte de la región 3' no codificante y una sonda correspondiente a
una parte de la región codificante de PDE4B. La señal detectada con
cualquiera de estas sondas permite evaluar el diferencial de
expresión. Otro enfoque usa dos pares de cebadores que permiten la
amplificación de una porción de la región 3' no codificante por un
lado y de una parte de la región codificante por otro lado.
La presente invención divulga igualmente un kit
para el análisis de la expresión de PDE4, especialmente de la
expresión diferencial entre la región 3' no codificante y la región
codificante, comprendiendo el kit una sonda nucleotídica específica
de una parte de la secuencia de la región 3' no codificante y una
sonda nucleotídica específica de una parte de la secuencia de la
región codificante.
La presente invención divulga igualmente un kit
para el análisis de la expresión de PDE4, especialmente de la
expresión diferencial entre la región 3' no codificante y la región
codificante, comprendiendo el kit un par de cebadores nucleotídicos
que permiten la amplificación específica de una parte al menos de la
región 3' no codificante de PDE4 y un par de cebadores
nucleotídicos que permiten la amplificación específica de una parte
al menos de la región codificante de PDE4.
Las fosfodiesterasas hidrolizan los ácidos
nucleicos cíclicos tales como AMPc y GMPc, regulando diferentes
cascadas de señalización. La PDE4B hidroliza el AMPc, regulando así
la concentración intracelular de este segundo mensajero. La
implicación del AMPc en el equilibrio que existe entre la viabilidad
celular y la apoptosis está bien descrita en la bibliografía.
Especialmente, la cascada de AMPc está bien integrada en las
cascadas de supervivencia celular que implican a cinasas tales como
Akt y P13K, así como en la regulación de la actividad del factor de
transcripción CREB. Ha de observarse que este factor de
transcripción está implicado en la supervivencia neuronal y el
crecimiento de neuritas. Sin embargo, el uso de inhibidores de PDE y
ventajosamente de PDE4 no se ha propuesto nunca para mejorar la
viabilidad neuronal y más particularmente su protección contra la
excitotoxicidad. Los inhibidores de PDE4, desarrollados para inhibir
los fenómenos inflamatorios, se han sugerido como potencialmente
útiles en patologías neurodegenerativas como la enfermedad de
Alzheimer. Esta sugerencia se apoya en la voluntad de reducir las
inflamaciones que se observan en el cerebro en el transcurso de los
procesos neurodegenerativos y no en un razonamiento enfocado a
inhibir directamente la muerte neuronal.
La presente invención muestra la existencia de
eventos de corte y empalme o de sitios de poliadenilación
alternativos que afectan al gen de PDE4, asociados al desarrollo de
la excitotoxicidad neuronal, y proporciona la base molecular que
justifica el uso de inhibidores de PDE4 para el tratamiento de ELA y
más generalmente para mejorar la viabilidad neuronal en los
fenómenos de excitotoxicidad, particularmente desde las fases
tempranas de estas patologías.
Un objeto de la invención se basa por tanto en
el uso de un compuesto capaz de inhibir o reducir la expresión o la
actividad de PDE4B, para la preparación de una composición destinada
al tratamiento de ELA, especialmente en fase temprana, más
preferiblemente para reducir la excitotoxicidad neuronal temprana
asociada a ELA.
Un objeto particular se basa en el uso de un
inhibidor de PDE4B para la preparación de una composición destinada
al tratamiento de ELA, especialmente para reducir la excitotoxicidad
en sujetos aquejados de ELA o para aumentar la supervivencia
neuronal en sujetos aquejados de ELA.
Otro objeto de la invención se basa en el uso de
un compuesto capaz de inhibir (preferiblemente de manera selectiva)
la expresión o la actividad de PDE4B de secuencia SEC ID Nº 2 ó 4
para la preparación de una composición destinada a reducir la
excitotoxicidad neuronal.
Otro objeto de la invención se basa en un
procedimiento de tratamiento de una patología asociada a un estrés
neuronal, especialmente a una excitotoxicidad, que comprende la
administración a un sujeto de un compuesto inhibidor de la
actividad o de la expresión de PDE4B, preferiblemente un compuesto
inhibidor selectivo de PDE4.
Otro objeto de la invención se basa en un
procedimiento de tratamiento de ELA, especialmente en un
procedimiento para aumentar la supervivencia de neuronas en
pacientes aquejados de ELA, que comprende la administración a un
sujeto de un inhibidor de PDE4B.
En el contexto de la invención, el término
"tratamiento" designa el tratamiento preventivo, curativo,
paliativo así como la gestión de pacientes (reducción del
sufrimiento, mejora de la duración de vida, ralentización de la
progresión de la enfermedad), etc. El tratamiento puede realizarse
además en combinación con otros agentes o tratamientos,
especialmente dirigidos a los eventos tardíos de la patología, tales
como inhibidores de caspasas u otros compuestos activos.
Se usa en la presente invención como inhibidor
de PDE4B un compuesto de la familia de las pirazolopiridinas, entre
las cuales figuran especialmente el etazolato.
Los compuestos de la familia de las
pirazolopiridinas se seleccionan particularmente entre los
compuestos siguientes:
el etazolato de fórmula siguiente:
éster etílico del ácido
4-butilamino-1-etil-6-metil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico
(tracazolato),
éster etílico del ácido
4-butilamino-1-etil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
1-(4-aminopirazolo[3,4-b]piridin-1-il)-\beta-D-1-desoxirribofuranosa,
éster etílico del ácido
1-etil-4-(N'-isopropilidenhidrazino)-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico
(SQ 20009),
4-amino-6-metil-1-n-pentil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina,
éster etílico del ácido
4-amino-1-etil-6-metil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico
(tracacolato de desbutilo),
4-amino-1-pentil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxamida,
éster etílico del ácido
1-etil-6-metil-4-metilamino-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
éster etílico del ácido
4-amino-6-metil-1-propil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
éster etílico del ácido
1-etil-4-etilamino-6-metil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
éster etílico del ácido
4-amino-1-butil-6-metil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
5-(4-aminopirazolo[3,4-b]piridin-1-il)-2-hidroximetiltetrahidrofuran-3-ol,
éster alílico del ácido
1-alil-4-amino-6-metil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
ácido
4-amino-6-metil-1-pentil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
éster etílico del ácido
4-amino-1-etil-3,6-dimetil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
éster etílico del ácido
4-dimetilamino-1-etil-6-metil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
éster etílico del ácido
1-etil-6-metil-4-propilamino-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
éster etílico del ácido
4-amino-1-pentil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
éster etílico del ácido
4-amino-6-metil-1-pent-4-inil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
4-amino-1-but-3-enil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-alilamida,
4-amino-1-pentil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-isopropilamida,
4-amino-1-pentil-N-n-propil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxamida,
éster alílico del ácido
4-amino-1-butil-6-metil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
éster etílico del ácido
4-amino-6-metil-1-pent-3-inil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
4-amino-1-pentil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-prop-2-inilamida,
éster alílico del ácido
4-amino-1-(3-metilbutil)-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
4-amino-1-pentil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-N-(2-propenil)carboxamida,
éster alílico del ácido
4-amino-1-pentil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
4-amino-1-pentil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-butilamida,
éster alílico del ácido
4-amino-1-but-3-inil-6-metil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
éster alílico del ácido
4-amino-1-but-3-enil-6-metil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
4-amino-6-metil-1-pentil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-alilamida,
éster alílico del ácido
4-amino-6-metil-1-pentil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
éster alílico del ácido
4-amino-6-metil-1-(3-metilbutil)-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
éster isobutílico del ácido
4-amino-6-metil-1-pentil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
4-amino-6-metil-1-pentil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-butilamida,
éster alílico del ácido
4-amino-6-metil-1-(3-metilbut-2-enil)-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
4-amino-1-pentil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-ciclopropilamida,
4-amino-1-pentil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-hidroxamato
de etilo,
éster
prop-2-inílico del ácido
4-amino-6-metil-1-pentil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
éster alílico del ácido
4-amino-6-metil-1-pent-4-inil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
éster alílico del ácido
4-amino-6-metil-1-pent-4-enil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
4-amino-1-pent-3-inil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-propilamida,
4-amino-1-pentil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-ciclopropilmetilamida,
éster 2-metilalílico del ácido
4-amino-6-metil-1-pentil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
4-amino-1-pent-3-inil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-alilamida
(ICI 190.622),
4-amino-1-pent-4-inil-N-2-propenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxamida,
4-amino-1-pent-3-inil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-prop-2-inilamida,
4-amino-1-pentil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-but-2-inilamida,
éster alílico del ácido
4-amino-6-metil-1-pent-3-inil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
éster alílico del ácido
4-amino-1-(2-ciclopropiletil)-6-metil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
éster alílico del ácido
4-amino-1-hex-5-inil-6-metil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
4-amino-1-pent-3-inil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-ciclopropilmetilamida,
éster
but-3-enílico del ácido
4-amino-6-metil-1-pentil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
ester ciclopropilmetílico del ácido
4-amino-6-metil-1-pentil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
4-butilamino-1-pentil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-alilamida,
éster 2-ciclopropiletílico del
ácido
4-amino-6-metil-1-pentil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
éster ciclopropilmetílico del ácido
4-amino-6-metil-1-pent-3-inil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
éster ciclopropilmetílico del ácido
4-amino-6-metil-1-pent-4-inil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
éster etílico del ácido
4-amino-1-bencil-6-metil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
4-amino-1-pentil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-bencilamida,
4-amino-1-pentil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-fenilamida,
éster bencílico del ácido
4-amino-6-metil-1-pentil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
4-azido-1-\beta-D-ribofuranosilpirazolo[3,4-b]piridina,
1-pent-3-inil-N-2-propenil-4-propionamido-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxamida,
2-(4-aminopirazolo[3,4-b]piridin-1-il)-5-hidroximetiltetrahidrofurano-3,4-diol,
2-(6-metil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-4-ilamino)etanol,
3-(6-metil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-4-ilamino)propan-1-ol,
éster propílico del ácido
3-(6-metil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-4-ilamino)acético,
éster etílico del ácido
2-(6-metil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-4-ilamino)propiónico,
éster etílico del ácido
2-(6-metil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-4-ilamino)pentanoico,
éster etílico del ácido
2-(6-metil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-4-ilamino)benzoico,
éster propílico del ácido
3-(6-metil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-4-ilamino)pentanoico,
N-benciliden-N'-(3-metil-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-4-il)hidrazina,
N-furan-2-ilmetilen-N'-(3-metil-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-4-il)hidrazina,
N-(4-fluorobenciliden)-N'-(3-metil-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-4-il)hidrazina,
N-(3-furan-2-ilaliliden)-N'-(3-metil-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-4-il)hidrazina,
N-(4-metoxibenciliden)-N'-(3-metil-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-4-il)hidrazina,
4-[(3-metil-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-4-il)hidrazonometil]-benzonitrilo,
N-benzo[1,3]dioxol-5-ilmetilen-N'-(3-metil-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-4-il)hidrazina,
N-(3-metil-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-4-il)-N'-(4-nitrobenciliden)-hidrazina,
N-(3-metil-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-4-il)-N'-(2-nitrobenciliden)-hidrazina,
N-(3-metil-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-4-il)-N'-(4-trifluorometil-benciliden)hidrazina,
N-(3-metil-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-4-il)-N'-(5-nitrofuran-2-ilmetilen)hidrazina,
N-(3-metil-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-4-il)-N'-(2-trifluorometil-benciliden)hidrazina,
N-(3-metil-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-4-il)-N'-(6-nitrobenzo[1,3]-dioxol-5-ilmetilen)hidrazina,
ácido
4-(3-cloro-4-metoxibencilamino)-1-etil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
4-(3-cloro-4-metoxibencilamino)-1-etil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-(piridin-4-ilmetil)amida,
4-(3-cloro-4-metoxibencilamino)-1-etil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-(tetrahidrofuran-2-ilmetil)amida,
4-(3-cloro-4-metoxibencilamino)-1-etil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-(5-hidroxipentil)amida,
4-(3-cloro-4-metoxibencilamino)-1-etil-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-[3-(2-oxopirrolidin-1-il)propil]amida,
éster etílico del ácido
4-terc-butilamino-1-(2-cloro-2-feniletil)-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
éster etílico del ácido
1-(2-cloro-2-feniletil)-4-ciclopropilamino-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
éster etílico del ácido
1-(2-cloro-2-feniletil)-4-propilamino-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
éster etílico del ácido
1-(2-cloro-2-feniletil)-4-fenilamino-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
éster etílico del ácido
4-butilamino-1-(2-cloro-2-feniletil)-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
éster etílico del ácido
1-(2-cloro-2-feniletil)-4-(2-etoxietilamino)-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
éster etílico del ácido
4-bencilamino-1-(2-cloro-2-feniletil)-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
éster etílico del ácido
1-(2-cloro-2-feniletil)-4-fenetilamino-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-5-carboxílico,
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención propone por tanto, por
primera vez, a la PDE4B como diana terapéutica para el tratamiento
de eventos moleculares asociados a la excitotoxicidad. Según los
modos de empleo particulares, la invención puede usarse para
inhibir o reducir la excitotoxicidad neuronal en fase temprana de
enfermedades neurodegenerativas. Es aplicable por tanto al
tratamiento de ELA.
Otros objetos de la invención se basan en:
- \bullet
- el uso de los compuestos indicados anteriormente, particularmente de etazolato, para el tratamiento de ELA, especialmente para reducir la excitotoxicidad neuronal temprana de ELA, o
- \bullet
- el uso de los compuestos indicados anteriormente, particularmente de etazolato, para la preparación de una composición destinada a inhibir la actividad de PDE4B en pacientes aquejados de ELA.
La invención se refiere igualmente a
procedimientos de tratamiento de ELA que comprenden la
administración de un compuesto que inhibe selectivamente la
expresión o actividad de PDE4B de secuencia SEC ID Nº 2 ó 4.
Preferiblemente, se usan los procedimientos de la invención para el
tratamiento en fase temprana de ELA.
La administración puede realizarse mediante
cualquier procedimiento conocido por el experto en la técnica,
preferiblemente por vía oral o por inyección, típicamente por vía
intraperitoneal, intracerebral, intravenosa, intraarterial o
intramuscular. Se prefiere la administración por vía oral. Las dosis
administradas pueden adaptarse por el experto en la técnica.
Típicamente, se inyectan aproximadamente de 0,01 mg a 100 mg/kg para
los compuestos inhibidores de naturaleza química. Para los
compuestos nucleicos, las dosis pueden variar, por ejemplo, entre
0,01 mg y 100 mg por dosis. Se entiende que puede realizarse
inyecciones repetidas, eventualmente en combinación con otros
agentes activos o cualquier vehículo aceptable en el plano
farmacéutico (por ejemplo, tampones, disoluciones salinas,
isotónicas, en presencia de agentes estabilizantes, etc.)
La invención es utilizable en mamíferos,
especialmente en el ser humano. Los resultados presentados en los
ejemplos ilustran la eficacia de inhibidores de PDE4B para mejorar
la viabilidad de neuronas dispuestas en condiciones de
excitotoxicidad.
La invención divulga también procedimientos de
selección, identificación o caracterización de compuestos activos
sobre las patologías asociadas a la excitotoxicidad, o al estrés
neuronal, que comprenden la puesta en contacto de compuestos de
ensayo con una célula que expresa PDE4B (especialmente, una variante
desprovista del dominio 3' no codificante) y la puesta en evidencia
de compuestos que inhiben la expresión o la actividad de esta
proteína.
Los procedimientos pueden emplearse con
diferentes poblaciones celulares tales como células primarias o
líneas de células de origen mamífero (humano, murino, etc.). Se
usan ventajosamente células que no expresan naturalmente la PDE4B,
transfectadas con un ácido nucleico que codifica la variante
deseada. De esta manera, aumenta la selectividad del procedimiento.
Se pueden usar igualmente células eucarióticas inferiores (levadura,
etc.) o células procarióticas.
Los procedimientos de cribado pueden realizarse
igualmente en un sistema acelular, mediante la medida de la
capacidad de los compuestos de ensayo de ligarse a PDE4B o una
variante o fragmento de la misma.
Otro objeto de la invención se refiere a
cualquier ácido nucleico que codifique un polipéptido tal como se
define anteriormente, a los vectores que lo contienen, células
recombinantes y usos. Los vectores pueden ser plásmidos, fagos,
cósmidos, virus, cromosomas artificiales, etc. Son vectores
preferidos, por ejemplo, vectores plasmídicos, como aquellos
derivados de plásmidos comerciales (pUC, pcDNA, pBR, etc.). Dichos
vectores comprenden ventajosamente un gen de selección y/o un
origen de replicación y/o un promotor transcripcional. Son otros
vectores particulares, por ejemplo, de virus o fagos, especialmente
de virus recombinantes defectivos de replicación tales como virus
derivados de retrovirus, adenovirus, AAV, herpesvirus, baculovirus,
etc. Los vectores pueden usarse en cualquier hospedador competente
como, por ejemplo, células procarióticas o eucarióticas. Puede
tratarse de bacterias (por ejemplo E. coli), levaduras (por
ejemplo, Saccharomyces o Kluyveromyces), células
vegetales, células de insectos, células de mamíferos, especialmente
humanas, etc. Puede tratarse de líneas, células primarias, cultivos
mixtos, etc.
Aparecerán otros aspectos y ventajas de la
presente invención tras la lectura de los ejemplos siguientes, que
deben considerarse ilustrativos y no limitantes.
Figura 1: PCR semicuantitativa de PDE4B a partir
de muestras de cerebro (1A) y de músculo (1B).
Figura 2: La pentoxifilina protege a las
neuronas primarias de gránulos cerebelosos de la excitotoxicidad
inducida por el cainato.
Figura 3: La pentoxifilina protege a las
neuronas primarias de gránulos cerebelosos de la excitotoxicidad
inducida por NMDA/serina.
Figura 4: Efecto neuroprotector del etazolato
sobre la toxicidad inducida por NMDA/serina sobre células granulares
del cerebelo.
Figura 5: Efecto neuroprotector del etazolato
sobre la toxicidad inducida por cainato sobre células granulares
del cerebelo.
Figura 6: Efecto neuroprotector de la
pentoxifilina sobre la toxicidad inducida por NMDA/serina sobre
neuronas corticales.
Figura 7: Efecto neuroprotector de la
pentoxifilina sobre la toxicidad inducida por cainato sobre neuronas
corticales.
Figura 8: Efecto neuroprotector del etazolato
sobre la toxicidad inducida por NDMA/serina sobre neuronas
corticales.
Figura 9: Efecto neuroprotector del etazolato
sobre la toxicidad inducida por cainato sobre neuronas
corticales.
Figura 10: Efecto neuroprotector del
8-bromo-AMPc sobre la toxicidad
inducida por NDMA/serina sobre células granulares del cerebelo.
Figura 11: Efecto neuroprotector del
8-bromo-AMPc sobre la toxicidad
inducida por cainato sobre células granulares del cerebelo.
Se ha efectuado el análisis cualitativo
diferencial a partir de ARN poliadenilados (poli A+) extraídos de
muestras de cerebros de animales correspondientes a las diferentes
etapas, sin aislamiento previo de neuronas con el fin de tener en
cuenta el máximo de eventos de corte y empalme alternativos ligados
al desarrollo de la patología.
Se preparan los ARN poli A+ según técnicas
conocidas por el experto en la técnica. Puede tratarse
particularmente de un tratamiento mediante agentes caotrópicos
tales como tiocianato de guanidinio seguido de una extracción del
ARN total mediante disolventes (fenol, cloroformo, por ejemplo).
Dichos procedimientos son bien conocidos por el experto en la
técnica (vénse Maniatis et al., Chomczynsli et al.,
Anal. Biochem. 162 (1987) 156), y pueden practicarse
fácilmente usando kits disponibles comercialmente. A partir de estos
ARN totales, se preparan los ARN poli A+ según procedimientos
clásicos conocidos por el experto en la técnica y propuestos por
kit comerciales.
Estos ARN poli A+ sirven de matriz a reacciones
de transcripción inversa con la ayuda de transcriptasa inversa.
Ventajosamente, se usan transcriptasas inversas desprovistas de
actividad ARNasa H, que permiten obtener las primeras cadenas de
ADN complementario de tamaños superiores a los obtenidos con
transcriptasas inversas clásicas. Dichas preparaciones de
transcriptasas inversas sin actividad ARNasa H están disponibles
comercialmente.
Para cada punto de la cinética de desarrollo de
la patología (30 días, 60 días y 90 días), se preparan ARN poli A+
así como ADNc monocatenarios a partir de animales transgénicos (T) y
animales de control singénicos (C).
Según la técnica DATAS, para cada punto de la
cinética se realizan hibridaciones de ARNm (C) con ADNc (T) e
hibridaciones recíprocas de ARNm (T) con ADNc (C).
Estos heterodúplex de ARNm/ADNc se purifican a
continuación según los protocolos de la técnica DATAS.
Las secuencias de ARN no apareadas con un ADN
complementario se liberan de estos heterodúplex bajo la acción de
la ARNasa H, degradando esta enzima las secuencias de ARN apareadas.
Estas secuencias no apareadas representan las diferencias
cualitativas que existen entre los ARN por lo demás homólogos entre
sí. Estas diferencias cualitativas pueden localizarse en cualquier
lugar sobre la secuencia de ARN, tanto en 5', 3' o en el interior
de la secuencia, y especialmente en la secuencia codificante. Según
su localización, estas secuencias pueden ser no sólo modificaciones
de corte y empalme, sino igualmente consecuencias de translocaciones
o deleciones.
Las secuencias de ARN que representan las
diferencias cualitativas se clonan a continuación según técnicas
conocidas por el experto en la técnica y especialmente aquellas
descritas en la patente de la técnica DATAS.
Estas secuencias se reagrupan dentro de los
bancos de ADNc que constituyen los bancos cualitativos
diferenciales. Uno de estos bancos contiene los exones y los
intrones específicos de la situación sana; los otros bancos
contienen los eventos de corte y empalme característicos de
condiciones patológicas.
Se ha verificado la expresión diferencial de
clones mediante hibridación con sondas obtenidas mediante
transcripción inversa a partir de ARN mensajeros extraídos de las
diferentes situaciones estudiadas. Los clones que hibridan de forma
diferencial se han retenido para análisis posterior. Las secuencias
identificadas por DATAS corresponden a intrones y/o a exones
expresados de forma diferencial mediante corte y empalme entre las
situaciones patológicas y la situación sana. Estos eventos de corte
y empalme pueden ser específicos de una etapa dada del desarrollo
de la patología o característicos del estado sano.
La comparación de estas secuencias con los
bancos de datos permite clasificar las informaciones obtenidas y
proponer una selección razonada de secuencias según su interés
diagnóstico o terapéutico.
La realización de DATAS sobre ARN de animales de
control y transgénicos de 60 días de edad ha permitido aislar un
fragmento de ADNc derivado de ARNm de fosfodiesterasa 4B. Este
fragmento corresponde a un fragmento de exón presente
específicamente en los animales de control y por tanto
específicamente eliminado en los animales transgénicos de SOD1 G93A
en la etapa de 60 días. Este fragmento abarca los nucleótidos 377 a
486 referidos a partir del codón de paro de PDE4B de ratón (SEC ID
Nº 1). Esta secuencia comprende 2912 bases, correspondiendo el
fragmento eliminado a las bases 2760 a 2869. Esta región es no
codificante y se expresa diferencialmente entre los animales de
control y los animales transgénicos, debido al uso alternativo de un
exón 3' no codificante o debido al uso de dos sitios de
poliadenilación alternativos.
Se ha verificado la expresión diferencial de
PDE4B en una situación de estrés neuronal, con relación a una
situación de referencia, mediante los experimentos de
PCR-TI presentados en la figura 1.
Estos experimentos se han realizado según
técnicas bien conocidas por el experto en la técnica y han permitido
seguir las expresiones de dos regiones distintas del ARNm de PDE4B.
Una de estas regiones abarca el codón de inicio de este ARNm (PDE4B
5'), el otro abarca en parte el fragmento identificado según la
técnica DATAS (PDE4B DATAS). Las localizaciones de los cebadores de
PCR usados se indican en la figura 1.
El ARN PO corresponde a un ARN ribosómico usado
como control interno destinado a verificar que se usa la misma
cantidad de ARN para cada punto experimental. Los análisis se han
realizado a partir de ARN extraídos de animales de control (C) y
transgénicos (T) de 30, 60 y 90 días de edad, es decir, antes de la
aparición de síntomas patológicos.
Los ARN totales de cerebro de ratones de control
o SOD1 G93A de 30, 60 y 90 días de edad se transcriben a ADNc
usando el protocolo estándar de Superscript^{TM} (Invitrogen).
Para las PCR semicuantitativas, se diluyen 10 veces los productos
de reacción de transcripción inversa. Los cebadores específicos del
fragmento DATAS corresponden para el sentido a los nucleótidos
2526-2545 (5' GCC AGG CCG TGA AGC AAA TA 3'; SEC ID
Nº 5), y para el antisentido a los 2790-2807 (5'
TCA AAG ACG CGA AAA CAT 3'; SEC ID Nº 6), y para el fragmento más
en 3' los cebadores corresponden para el sentido a los nucleótidos
145-165 (5' CCG CGT CAG TGC CTT TGC TAT 3'; SEC ID
Nº 7), y para el antisentido a los 426-404 (5' CGC
TGT CGG ATG CTT TTA TTC AC 3'; SEC ID Nº 8). Como gen de
referencia, se usa el gen PO y se amplifica mediante los cebadores,
con sentido: 5' TCG CTT TCT GGA GGG TGT C 3' (SEC ID Nº 9) y
antisentido: CCG CAG GGG CAG CAG TGG 3' (SEC ID Nº 10). La
amplificación se efectúa mediante los 30 ciclos de PCR
siguientes:
- -
- 30 segundos a 94ºC
- -
- un minuto a 57ºC
- -
- 30 segundos a 72ºC, seguido de un ciclo de 2 minutos a 72ºC.
Se ponen los diferentes productos de PCR sobre
un gel de agarosa al 1,5%. Se repite el experimento tres veces con
dos reacciones de transcripción inversa diferentes.
La figura 1 presenta los resultados obtenidos a
partir de ARN extraídos de cerebros o de músculos de animales.
Aunque que se amplifica la misma cantidad de ADNc a partir del ARN
de PO en todas las muestras, se observan variaciones para el ARNm
de PDE4B: se detectan las variaciones más significativas en los
animales de 90 días de edad; aunque se observa un aumento del nivel
de expresión del fragmento PDE4 5' en el cerebro de animales
transgénicos, se observa una muy fuerte disminución de la expresión
de PDE4B (DATAS) en el cerebro de animales transgénicos.
Este resultado establece una correlación entre
la disminución de la expresión de un fragmento 3' no codificante
del ARNm de PDE4B y el aumento de la expresión de la parte 5'
codificante de este mismo mensajero. Este resultado es
absolutamente compatible con la presencia de secuencias de
desestabilización de ARNm en la secuencia identificada por DATAS y
demuestra la correlación entre la expresión de PDE4B y el fenómeno
de excitotoxicidad.
Para este ejemplo, se han puesto en cultivo
neuronas granulares de cerebelo de rata así como neuronas corticales
de según técnicas conocidas por el experto en la técnica.
Se decapitan ratas Wistar de 7 días de edad y se
disecan sus cerebelos. Después de extirpar las meninges, se corta
el tejido en pequeños trozos y se tripsiniza durante 15 minutos a
37ºC. Se disocian las células mediante trituración y se ponen en
cultivos a una densidad de 300.000 células por cm^{2} en medio
basal Eagle suplementado con 10% de suero fetal de ternero y
glutamina 2 mM. Al día siguiente, se añade ARA-C 10
\muM, un antimicótico, para impedir la proliferación de células
gliales. Se tratan las células el día 9 de cultivo con los
inhibidores de fosfodiesterasa pentoxifilina y etazolato 3 horas
antes de la adición de los tóxicos cainato 50 \muM o
N-metil-D-asparato
100 \muM en presencia de D-serina 10 \muM. Se
añade 8-bromo-AMPc justo
antes de los tóxicos. Se efectúan todos los tratamientos como
mínimo por duplicado y en al menos dos cultivos diferentes. Después
de una incubación de 6 horas, se mide la toxicidad mediante un
ensayo MTT. Los resultados, normalizados a la media de no tratado,
se analizan estadísticamente mediante el test de Wilcoxon. Se
determina el valor significativo a p \leq 0,05.
Se extirpan embriones de rata Wistar de 16 días
de edad y se disecan los córtex. Después de la tripsinación a 37ºC
durante 25 minutos, se disocian las células mediante trituración. Se
siembran las células en medio esencial mínimo suplementado con 10%
de suero equino y 10% de suero fetal bovino y glutamina 2 mM a una
densidad de 300.000 células por cm^{2}. Después de 4 días de
cultivo, se cambia la mitad del medio por medio esencial mínimo
suplementado con 5% de suero equino y glutamina 2 mM. El mismo día,
se añaden 10 \muM de
5-fluoro-2-desoxiuridina,
un antimitótico. Después de 7 y 11 días de cultivo, se cambia la
mitad del medio por medio acondicionado. El medio acondicionado
está compuesto por MEM que contiene 5% de suero equino y glutamina 2
mM; este medio se pasa por una capa de astrocitos corticales
durante una noche antes de su uso. El día 14, se tratan las células
con los inhibidores de fosfodiesterasa pentoxifilina y etazolato una
hora antes de la adición de los tóxicos cainato 50 \muM o
N-metil-D-aspartato
20 \muM en presencia de D-serina 10
\muM. Todos los tratamientos se efectúan como mínimo por
duplicado y en al menos dos cultivos diferentes. Después de una
incubación de 6 horas, se mide la toxicidad mediante un ensayo MTT.
Se analizan estadísticamente los resultados, normalizados a la
media de no tratado, mediante el test de Wilcoxon. Se determina el
valor significativo a p \leq 0,05.
Se mide la toxicidad usando el ensayo MTT.
Después de incubación con los compuestos, se añade MTT a una
concentración final de 0,5 mg/ml por pocillo. Se incuban a
continuación las placas durante 30 minutos a 37ºC en la oscuridad.
Se aspira el medio y se resuspenden los cristales en 500 \mul de
DMSO (dimetilsulfóxido). Se lee la absorbancia a 550 nm y se
calcula el porcentaje de viabilidad.
Los resultados obtenidos se presentan en las
figuras 2-10. Estos resultados ilustran el efecto
protector de los compuestos de la invención sobre la supervivencia
neuronal. En caso de cotratamiento de neuronas con un inhibidor de
PDE4, se observa un efecto protector dependiente de la dosis en los
dos modos de inducción de la excitotoxicidad (NDMA/serina y
cainato). Se observa dicho efecto protector con la ayuda de
pentoxifilina y etazolato.
Las figuras 2 y 3 presentan los resultados
obtenidos con la ayuda de pentoxifilina sobre las células granulares
del cerebelo. Los resultados presentados muestran que la
pentoxifilina permite conseguir en las células un efecto protector
de un 43% en el caso de tratamiento con NMDA/serina, y de un 33% en
el caso de la toxicidad inducida por cainato.
Las figuras 4 y 5 presentan los resultados
obtenidos con la ayuda del etazolato sobre las células granulares
del cerebelo. Los resultados presentados muestran que el etazolato
permite conseguir en estas células un efecto protector de un 60% en
el caso de tratamiento con NMDA/Ser y de un 57% en el caso de
toxicidad inducida por cainato.
Las figuras 6 y 7 presentan los resultados
obtenidos con la ayuda de pentoxifilina sobre las neuronas
corticales. Los resultados presentados muestran que la
pentoxifilina permite conseguir en las células un efecto protector
de un 50% en el caso de tratamiento con NMDA/Ser, y de un 66% en el
caso de toxicidad inducida por cainato.
Las figuras 8 y 9 presentan los resultados
obtenidos con la ayuda del etazolato sobre las neuronas corticales.
Los resultados presentados muestran que el etazolato permite
conseguir en las células un efecto protector de un 33% en el caso
de tratamiento con NDMA/Ser, y de un 25% en el caso de toxicidad
inducida por cainato.
La pertinencia de estas protecciones está
atestiguada por los % de protección obtenidos por concentraciones
crecientes de AMPc, sustrato de PDE, dados a modo de ejemplo para
células granulares del cerebelo en las figuras 10 y 11. Estos % son
de 40% para el tratamiento con NMDA/serina y de 40% para el
tratamiento con cainato.
La presente invención documenta por tanto no
sólo la implicación de PDE4B en los mecanismos de excitotoxicidad,
especialmente en un modelo de ELA, sino igualmente la capacidad de
inhibidores de PDE4 de conservar la viabilidad neuronal en caso de
estrés ligado a la excitotoxicidad.
Este ejemplo describe las condiciones de un uso
clínico humano de un inhibidor de PDE4 en el tratamiento de ELA.
Este ejemplo ilustra el potencial terapéutico de la invención y sus
condiciones de aplicación al ser humano.
En este ensayo clínico, el tratamiento está
basado en una combinación de pentoxifilina y riluzol. La dosis de
pentoxifilina usada es de 400 mg por administración, en forma de
tres tomas diarias, o sea una dosis diaria total de 1.200 mg. La
pentoxifilina se usa en forma de comprimidos. El ensayo es
multicéntrico y se realiza con doble ciego frente a placebo en 400
pacientes. Los pacientes incluidos en el ensayo son hombres o
mujeres de 18 a 80 años de edad, aquejados de ELA esporádica o
familiar, y bajo tratamiento con riluzol (50 mg dos veces al día)
desde hace 3 meses al menos. El tratamiento con pentoxifilina se
prevé con una duración de 18 meses.
Se mide principalmente la eficacia por las tasas
de supervivencia de los pacientes, la calidad de vida y los ensayos
musculares.
Otros aspectos y aplicaciones de la invención se
basan en:
- -
- el uso de toda o parte de una secuencia derivada de ARN mensajero de PDE4B con fines de diagnóstico o cribado o de caracterización de patologías neurodegenerativas que tienen un componente o una etapa ligado al fenómeno de excitotoxicidad, tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, corea de Huntington, ELA o isquemia cerebral;
- -
- el uso de cualquier fragmento de ácido nucleico incluido en el ARN antisentido con el objeto de inhibir la expresión de PDE4B en pacientes aquejados de dichas patologías;
- -
- el uso de cualquier compuesto químico, especialmente pentoxifilina o etazolato o de cualquier composición farmacéutica que los contenga, con el objeto de inhibir la actividad de PDE4B en pacientes aquejados de dichas patologías;
- -
- el uso de toda o parte de una secuencia derivada de ARN mensajero de PDE4B con fines de caracterización del tejido y de la situación isquémica.
<110> Exonhit Therapeutics
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nueva diana molecular de la
neurotoxicidad
\vskip0.400000\baselineskip
<130> B0100WO
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patentín Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2912
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ratón
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (218)..(2383)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 721
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ratón
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4068
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (766)..(2460)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PDE4B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 564
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm18
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm19
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm20
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm21
Claims (6)
1. Uso de al menos un compuesto inhibidor de
PDE4B que pertenece a la familia de las pirazolopiridinas para la
preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento
de ELA.
2. Uso según la reivindicación 1,
caracterizado porque el compuesto es etazolato.
3. Uso según una de las reivindicaciones 1 ó 2
para inhibir o reducir la excitotoxicidad neuronal en fase temprana
de ELA.
4. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 3
para mejorar la supervivencia neuronal en pacientes aquejados de
ELA.
5. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 4
para reducir la excitotoxicidad neuronal en fase temprana de
ELA.
6. Uso de etazolato para la preparación de una
composición destinada a aumentar la supervivencia neuronal en
pacientes aquejados de ELA.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR0110819 | 2001-08-14 | ||
FR0110819A FR2828693B1 (fr) | 2001-08-14 | 2001-08-14 | Nouvelle cible moleculaire de la neurotoxicite |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2316625T3 true ES2316625T3 (es) | 2009-04-16 |
Family
ID=8866536
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES02777405T Expired - Lifetime ES2316625T3 (es) | 2001-08-14 | 2002-08-13 | Nueva diana molecular de la neurotoxicidad. |
ES08160783T Expired - Lifetime ES2348348T5 (es) | 2001-08-14 | 2002-08-13 | Nueva diana molecular de la neurotoxicidad |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES08160783T Expired - Lifetime ES2348348T5 (es) | 2001-08-14 | 2002-08-13 | Nueva diana molecular de la neurotoxicidad |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6855736B2 (es) |
EP (2) | EP1417349B1 (es) |
JP (1) | JP4527395B2 (es) |
CN (2) | CN101632663B (es) |
AT (2) | ATE414790T1 (es) |
AU (1) | AU2002339017B2 (es) |
CA (1) | CA2457611C (es) |
DE (2) | DE60229953D1 (es) |
DK (2) | DK1982704T3 (es) |
ES (2) | ES2316625T3 (es) |
FR (1) | FR2828693B1 (es) |
IL (2) | IL160141A0 (es) |
NZ (1) | NZ530939A (es) |
PT (2) | PT1982704E (es) |
WO (1) | WO2003016563A2 (es) |
Families Citing this family (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040219552A1 (en) * | 2001-08-14 | 2004-11-04 | Ali Ait Ikhlef | Novel molecular target for neurotoxicity |
GB0230045D0 (en) | 2002-12-23 | 2003-01-29 | Glaxo Group Ltd | Compounds |
AU2003283303A1 (en) * | 2002-11-08 | 2004-06-07 | Bayer Healthcare Ag | Diagnostics and therapeutics for diseases associated with human phosphodiesterase 4b (pde4b) |
FR2851247B1 (fr) * | 2003-02-19 | 2007-06-29 | Exonhit Therapeutics Sa | Methodes et compositions pour le traitement de pathologies degeneratives oculaires |
SI1477166T1 (sl) * | 2003-04-28 | 2006-12-31 | Biofrontera Bioscience Gmbh | Uporaba riluzola, kombiniranega s primernimi pomoznimi in dodatnimi snovmi, za zdravljenje bolezni,za katere je znacilna hiperproliferacija keratinocitov, se zlasti nevrodermitisa in psoriaze |
FR2856595B1 (fr) * | 2003-06-27 | 2008-05-30 | Exonhit Therapeutics Sa | Methodes et compositions pour le traitement de deficits cognitifs. |
US20050079548A1 (en) * | 2003-07-07 | 2005-04-14 | Plexxikon, Inc. | Ligand development using PDE4B crystal structures |
EP1538218A1 (en) * | 2003-12-04 | 2005-06-08 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Method to diagnose or screen for inflammatory diseases |
CA2557004A1 (en) * | 2003-12-19 | 2005-06-30 | Glaxo Group Limited | Pyrazolo [3,4-b] pyridine compounds, and their use as phosphodiesterase inhibitors |
WO2005090352A1 (en) | 2004-03-16 | 2005-09-29 | Glaxo Group Limited | Pyrazolo[3,4-b]pyridine compound, and its use as a pde4 inhibitor |
JP2008503446A (ja) * | 2004-05-06 | 2008-02-07 | プレキシコン,インコーポレーテッド | Pde4b阻害剤及びその使用 |
CA2583428A1 (en) * | 2004-09-03 | 2006-03-09 | Plexxikon, Inc. | Bicyclic heteroaryl pde4b inhibitors |
WO2007071437A2 (en) * | 2005-12-22 | 2007-06-28 | Ares Trading S.A. | Compositions and methods for treating inflammatory disorders |
ES2353093B1 (es) * | 2009-05-20 | 2012-01-03 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) | Uso de derivados de quinazolinas y sus composiciones farmacéuticas en enfermedades neurodegenerativas. |
EP3663758A1 (en) * | 2012-03-18 | 2020-06-10 | Shiseido Company, Ltd. | Apparatus, system and method for analyzing disease sample |
BR112015019276A2 (pt) | 2013-02-19 | 2017-07-18 | Pfizer | compostos de azabenzimidazol como inibidores de isoenzimas de pde4 para o tratamento de distúrbios do snc e outros distúrbios |
US10131669B2 (en) | 2014-07-24 | 2018-11-20 | Pfizer Inc. | Pyrazolopyrimidine compounds |
DK3177624T3 (da) | 2014-08-06 | 2019-07-01 | Pfizer | Imidazopyridazinforbindelser |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5977305A (en) * | 1990-04-20 | 1999-11-02 | Cold Spring Harbor Laboratories | Cloning by complementation and related processes |
US5672622A (en) † | 1994-04-21 | 1997-09-30 | Berlex Laboratories, Inc. | Treatment of multiple sclerosis |
US6060501A (en) * | 1994-06-02 | 2000-05-09 | Schering Aktiengesellschaft | Combined treatment of multiple sclerosis |
WO1996020281A1 (en) * | 1994-12-23 | 1996-07-04 | Celltech Therapeutics Limited | Human phosphodiesterase type ivc, and its production and use |
FR2775984B1 (fr) | 1998-03-11 | 2006-09-15 | Bioscreen Therapeutics Sa | Criblage differentiel qualitatif |
US6548490B1 (en) * | 1997-10-28 | 2003-04-15 | Vivus, Inc. | Transmucosal administration of phosphodiesterase inhibitors for the treatment of erectile dysfunction |
WO2000040714A2 (en) * | 1998-12-30 | 2000-07-13 | Oligos Etc. Inc. | Therapeutic phosphodiesterase inhibitors |
US6334998B1 (en) * | 1999-12-07 | 2002-01-01 | Parker Hughes Institute | Estrogens for treating ALS |
AU2433001A (en) * | 1999-12-14 | 2001-06-25 | University Of Utah Research Foundation | Two novel camp-specific phosphodiesterase (pde4b) isoforms and related technology |
US20030060487A1 (en) † | 2000-04-12 | 2003-03-27 | Bamdad R. Shoshana | Treatment of neurodegenerative disease |
JP2002020386A (ja) † | 2000-07-07 | 2002-01-23 | Ono Pharmaceut Co Ltd | ピラゾロピリジン誘導体 |
FR2856595B1 (fr) † | 2003-06-27 | 2008-05-30 | Exonhit Therapeutics Sa | Methodes et compositions pour le traitement de deficits cognitifs. |
-
2001
- 2001-08-14 FR FR0110819A patent/FR2828693B1/fr not_active Expired - Fee Related
- 2001-10-25 US US09/983,754 patent/US6855736B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-08-13 CA CA2457611A patent/CA2457611C/fr not_active Expired - Fee Related
- 2002-08-13 EP EP02777405A patent/EP1417349B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 2002-08-13 EP EP08160783.0A patent/EP1982704B2/fr not_active Expired - Lifetime
- 2002-08-13 AU AU2002339017A patent/AU2002339017B2/en not_active Ceased
- 2002-08-13 CN CN2009101342838A patent/CN101632663B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-08-13 DK DK08160783.0T patent/DK1982704T3/da active
- 2002-08-13 CN CNA028158407A patent/CN1541278A/zh active Pending
- 2002-08-13 DE DE60229953T patent/DE60229953D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-08-13 IL IL16014102A patent/IL160141A0/xx unknown
- 2002-08-13 JP JP2003521870A patent/JP4527395B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-08-13 ES ES02777405T patent/ES2316625T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-08-13 AT AT02777405T patent/ATE414790T1/de active
- 2002-08-13 NZ NZ530939A patent/NZ530939A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-08-13 AT AT08160783T patent/ATE476530T1/de active
- 2002-08-13 DK DK02777405T patent/DK1417349T3/da active
- 2002-08-13 PT PT08160783T patent/PT1982704E/pt unknown
- 2002-08-13 PT PT02777405T patent/PT1417349E/pt unknown
- 2002-08-13 WO PCT/FR2002/002861 patent/WO2003016563A2/fr active Application Filing
- 2002-08-13 ES ES08160783T patent/ES2348348T5/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-08-13 DE DE60237248T patent/DE60237248D1/de not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-01-29 IL IL160141A patent/IL160141A/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20030064374A1 (en) | 2003-04-03 |
FR2828693B1 (fr) | 2004-06-18 |
JP4527395B2 (ja) | 2010-08-18 |
PT1417349E (pt) | 2009-02-09 |
DK1417349T3 (da) | 2009-03-23 |
CN1541278A (zh) | 2004-10-27 |
US6855736B2 (en) | 2005-02-15 |
PT1982704E (pt) | 2010-10-11 |
CA2457611C (fr) | 2013-04-02 |
WO2003016563A3 (fr) | 2004-04-01 |
EP1982704B1 (fr) | 2010-08-04 |
EP1417349B1 (fr) | 2008-11-19 |
WO2003016563A2 (fr) | 2003-02-27 |
DE60237248D1 (de) | 2010-09-16 |
CA2457611A1 (fr) | 2003-02-27 |
EP1982704A3 (fr) | 2008-12-17 |
CN101632663A (zh) | 2010-01-27 |
ES2348348T5 (es) | 2013-12-04 |
DK1982704T3 (da) | 2010-10-04 |
CN101632663B (zh) | 2011-11-30 |
IL160141A (en) | 2010-12-30 |
AU2002339017B2 (en) | 2007-11-01 |
EP1417349A2 (fr) | 2004-05-12 |
EP1982704B2 (fr) | 2013-07-24 |
ATE414790T1 (de) | 2008-12-15 |
EP1982704A2 (fr) | 2008-10-22 |
ATE476530T1 (de) | 2010-08-15 |
ES2348348T3 (es) | 2010-12-03 |
IL160141A0 (en) | 2004-06-20 |
NZ530939A (en) | 2006-11-30 |
FR2828693A1 (fr) | 2003-02-21 |
DE60229953D1 (de) | 2009-01-02 |
JP2005500066A (ja) | 2005-01-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2316625T3 (es) | Nueva diana molecular de la neurotoxicidad. | |
Gorbatyuk et al. | Preservation of photoreceptor morphology and function in P23H rats using an allele independent ribozyme | |
Kramer et al. | A locus for the nystagmus-associated form of episodic ataxia maps to an 11-cM region on chromosome 19p. | |
Wang et al. | Nuclear factor Nrf2 and antioxidant response element regulate NRH: quinone oxidoreductase 2 (NQO2) gene expression and antioxidant induction | |
Ozawa et al. | No mutation in the entire coding region of the α-synuclein gene in pathologically confirmed cases of multiple system atrophy | |
JP2003510349A (ja) | 線条体機能に必要な遺伝子、その使用、およびそれを調節するための化合物 | |
CA3075656A1 (en) | Rescue of central and peripheral neurological phenotype of friedreich's ataxia by intravenous delivery | |
US20100199367A1 (en) | Manganese superoxide dismutase exon 3-deleted isoforms and nucleic acid molecules encoding the isoforms | |
JPH10513052A (ja) | ヒト・ヒスタミンh▲下2▼ レセプターの新規対立遺伝子およびh▲下2▼ レセプター変異種の検出方法 | |
Wang et al. | Altered gene expression in kidneys of mice with 2, 8-dihydroxyadenine nephrolithiasis | |
US6737506B1 (en) | Manganese superoxide dismutase exon 3-deleted isoforms and nucleic acid molecules encoding the isoforms | |
US20050043319A1 (en) | Molecular target of neurotoxicity | |
US20120202846A1 (en) | Molecular target of neurotoxicity | |
JPH09500533A (ja) | 認識障害に関するトランスジェニック動物モデル | |
ES2337255T3 (es) | Uso de pirazolopiridinas para el tratamiento de deficit cognitivos. | |
Hung et al. | Systematic search for mutations in the human tissue inhibitor of metalloproteinases‐3 (TIMP‐3) gene on chromosome 22 and association study with schizophrenia | |
JP4620042B2 (ja) | 変性性眼疾患の処置のための、pde4を伴う方法、組成物及びそのスクリーニング | |
Koukoulas et al. | Genomic organisation and nervous system expression of radial spoke protein 3 | |
US20040009899A1 (en) | Treating dominant disorders | |
JPWO2004108929A1 (ja) | 高親和性IgE受容体β鎖発現調節 |