PT1175221E - Bactérias lácticas com propriedades ansiolíticas e as suas utilizações - Google Patents

Description

* sasrÉM&s Mcficms com «loiáTicm :s m sms A invenção diz respeito a novas estirpes de fermentos lácticos e a sua utilização para a produção de alimentos dotados de propriedades ansioliticas. 0 stress, que é uma reacção de defesa do organismo em relação a agressões exteriores, engendra nomeadamente a nivel do sistema nervoso, algumas perturbações biológicas que podem evoluir até patologias diversas. Estas patologias podem manifestar-se directamente ao nível psicológico, nomeadamente sob a forma de ansiedade, e/ou assumir a forma de manifestações somáticas, tais como a hipertensão arterial, as úlceras gástricas, etc. Elas evoluem frequentemente até estados crónicos.

Para tratar as consequências do stress, quer se trate de ansiedade quer de manifestações somáticas, utilizam-se frequentemente fármacos ansiolíticos, e nomeadamene as benzodiazepinas. No entanto ©í£íé?s: medicamentos que podem engendrar rapidamente um fenómeno tlu habituação, podem não convir a um tratamento de longo prazo.

Por outro lado, a sua actuação ansiolítica w·®® normalmente acompanhada por propriedades sedativas quei podem levar ao aparecimento de efitos secundários incomodativos.

Determinadas investigações permitiram comprovar s. existência no leite, ou em produtos derivados deste último, de substâncias dotadas de propriedades farmacológicas em relação as patologias relacionadas com o stress. 0 pedido de PCT WO 98/05343, nomeadamente, em nome de CALPIS CO. e do GROUPE DANONE, descreve um agente que possui propriedades anti-stress que se traduzem por um efeito anti hipertensor. Este agente é obtido por fermentação do leite com uma bactéria láctica do género Lactobacillus, nomeadamente o Lactobacillus helveticus. Ele resiste a esterilização, e pode ser utilizado para preparar alimentos que participam na prevenção, e/ou no tratamento dos efeitos periféricod (somáticos) do stress, e que podem ser consumidos no quadro de uma alimentação habitual, de modo regular e ao longo de períodos longos. No Pedido de PCT WO 98/05343 não é mencionado nenhum efeito central, nomeadamente ansiolítico, proveniente da administração deste agente. O Pedido EP 95/402.697 em nome de: SOCIÉTÉ COOPÉRATIVE LAITIÈRE AGRICOLE D!ARTOIS ET DES FLANDRES, LA PROSPÉRITÉ FERMIÈRE, descreve um decapéptido proveniente da hidrólise da caseína asl com tripsina. A administração desse decapéptido por via parenterica, ou do hidrolisado -da tripsina que o inclui, induz um efeito ansiolítico e anticonvulsivo do mesmo tipo que o das benzodiazepinas. Por outro lado, este documento não contém nenhuma indicação acerca da actividade deste hidrolisado quando administrado por via oral, e a possibilidade de o incorporar em alimentos para lhes conferir propriedades anti stress.

Os Inventores provaram aqora, nos produtos leiteiros fermentados por determinadas estirpes de bactérias lácticas, a existência de um ou mais princípio (s) activo(s) capazes de induzir, quando são administrados por via oral, um efeito contra o stress, de tipo ansiolítico, sem possuir quaisquer das propriedades sedativas das benzodiazepinas. A invenção presente tem como objecto uma estirrpe de bactérias lácticas seleccionada de entre o conjunto constituído por: - a estirpe de Streptococcus thermophilus S2 42 depositada junto da CNCM (Collection Nationale de Cultures de Micro-organismesj, 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris, sob o número I-2130, a 24 de Fevereiro de 1999 de acordo com o tratado de Budapest; - a estirpe de Streptococcus thermophilus SO 0 3 depositada junto da CNCM (Collection Nationale de Cultures de Micro-organismesj, 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris, sob o número I- 2129, a 24 de Fevereiro de 1999 de acordo com o tratado de Budapest; a estirpe de Lactobacillus gasseri LO 12 depositada junto da CNCM (Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes), 28 rue du

Docteur Roux, 75724 Paris, sob o número I- 2131, a 24 de Fevereiro de 1999 de acordo com o tratado de Budapest; - a estirpe de Lactobacillus acidophilus LO 3 0 depositada junto da CNCM (Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris, sob o número I- 2132, a 24 de Fevereiro de 1999 de acordo com o tratado de Budapest. A invenção presente tem igualmente como objecto a utilização de pelo menos uma das estirpes de bactérias lácticas novas que se isolaram e caracterizaram, mencionadas acima neste documento, para a obtenção de um ansiolitico não sedativo.

As caracteristicas das estirpes de bactérias lacticas de acordo com a invenção estão resumidas £3 úts tabelas I e II adiante neste documento.

TABELA I

Estirpe S003 ·ί·. ví N° CNCM 1-2129 1-2131 Morfologia Conchas bastante grandes em maioria grandes cadeias e algumas cadeias médias e curtas ί Pequenas conchas aos pares ou em cadeias curtas Pequenos bacilos finos pouco corados amiúde tipo cocobacilos ; Bacilos de dimensão média, isolados ou em pequenas cadeias Gram + Gram + Gram t Gram +- Metabolismo Oxidase: -Catalase: -Aero-anaeróbio facultativo Oxidase: - ; Catalase: -Aero- anaeróbio j facultativo Oxidase: -Catalase: -Nitrato reductase: Nitrito reductase: Oxidase: Catalase: -Nitrato reductase: Nitrito reductase : Aero- anaeróbio Aero- anaeróbxo T °C, de crescimento "'s? . v C; V l ' 3 '.v ·. q 4 c í7.4i.c TABELA 2 p Estirpe S003 S242 L012 L030 i N° CNCM 1-2129 1-2130 1-2131 1-2132 i Galactose - ... + + f : *$· \ ! I - | .........!..................;...................~ N-Acetil- Glucosamina - >-------------------------------------- + + Amigdalina + + Arbutina - + /- + Esculina - - + + Salicina - + + Celobiose + + Maltose + + Sacarose + + + + Trehalose - ... + + β-Gentobiose — ... + + ! D-Tagatose — — + | D-Turanose - — + § Lactose + + + + j D-Rafinose + ! Melibiose + a-Metil-D- Glucósido "· - + A invenção presente diz respeito especificamenire a utilização, para a obtenção de um ansiolitico não sedativo, de pelo menos uma estirpe de Streptococcus thermophilus seleccionada de entre a estirpe S242 e a estirpe S003, associada a estirpe de Streptococcus thermophilus S147, depositada junto da CNCM a 30 de Dezembro de 1994, sob o número 1-1520. A invenção presente engloba também fermentos lácticos associando 2 ou mais destas estirpes entre si, ou que associem pelo menos uma destas estirpes com uma outra estirpe de bactérias lácticas.

De acordo com um modo de realização preferido de um fermento láctico de acordo com a invenção, ele associa pelo menos a estirpe de S. thermophilus S242 e/ou a estirrpe de S. thermophilus S003, vantajosamente associada(s) com a estirpe de S. thermophilus S147. 'Para a obtenção de um ansiolitico não sedativo, leva-se a acabo a colocação em cultura de pelo menos uma estirpe de bactéria láctica de acordo com a invenção, nomeadamente coloca-se em cultura um fermento X&©t.£ co incluindo pelo menos a estirpe de S. thermophilus S242 e/ou a estirpe de S. thermophilus S003, vantajosamente associada (s) com a estirpe de S. thermophilus S147, e eventualmente com a estirpe de L. gasseri L012 e/ou a cultura de L. acidophilus L030, num meio adequado, que seja portanto o leite ou um meio proveniente de leite. Este pode ser nomeadamente seleccionado de entre leites de diferentes espécies de mamíferos, eventualmente submetidos previamente a uma desnatação parcial ou total, os produtos resultantes da diluição ou da concentração de desses leites, tais como, por exemplo, os retentados de ultrafiltração ou de diafiltração, os meios com base em leite, tais como, por exemplo, as bases para alimentos lácteos, as bases para iogurte, etc... Estes leites podem ser suplementados para além disto, por exemplo com lactose, com minerais, com vitaminas, com materiais gordos ou não, com materiais secos, hidrófilos, do leite, com proteínas de soja, com extractos vegetais, etc.

Este meio é semeado com uma cultura que inclua pelo menos uma cultura de bactérias lácticas de acordo com a invenção, contendo de preferência entre 107 e Xff5 bactérias por mL. As condições óptimas de cultura variam de acordo com a estirpe ou com a mistura de estirpes utilizadas. Por exemplo, se a cultura utilizada n a sementeira for constituída por uma estirpe ou por uma mistura de estirpes de Streptococcus thermophllus, a cultura será levada a cabo durante cerca de 24 h e a temperatura óptima da cultura estará compreendida entre 3 0 e 44°C; se a cultura de sementeira for constituída por urna estirpe ou por uma mistura de estirpes de L. acidophilus ou de L. gasseri, a cultura será levada a cabo durante cerca de 16 h e a temperatura óptima da cultura esta xá compreendida entre 37 e 44 °C. No caso em que a cultura d sementeira associa pelo menos uma estirpe de Streptococcus thermophilus com pelo menos uma estirpe de L. acidophilu.® ou de L. gasseri, a cultura será levada a cabo durante 16 a 24 h, e 1 temperatura óptima de cultura estará cpmpreendida enter 37 e 44 °C. Os ansiolítícos não sedativos de acordo com a invenção são activos por via oral. A sua administração regular leva a, passados alguns dias, uma diminuição da ansiedade, sem uma diminuição concomitante da actividacde; esta administração pode ser prolongada durante um período muito longo, sem produzir um efeito de habituação, e sem que apareçam efeitos secundários desfavoráveis. Estas propriedades, bem como o facto de que é possível obtê-las a partir de microrganismos que pertencem a espécies que são correntemente utilizadas nas indústrias alimentares, e de matérias-primas que também têm uma utilização alimentar, permitem propor a sua utilização para o fabrico de alimentos ou de complementos alimentares, cujo consumo exerce um efeito benéfico no quadro do tratamento ou da prevenção dos estados patológicos ligados ao stress. A invenção presente tem também como objecto os produtos ou os complementos alimentares que incluam um anziolítico não sedativo de acordo com a invenção.

Estes produtos alimentares podem ser em especi produtos fermentados por pelo menos uma estirpe cit bactérias lácticas ou um fermento láctico de acordo com ·* invenção, e nomeadamente produtos que possam ser obtidos por fermentação do leite ou de um meio com base em leito, tal como os que se definiram acima neste documento no que toca a estirpe referida ou ao fermento referido. Eles podem igualmente ser preparados por adição a um alimento, de uma preparação contendo um ansiolitico não sedativo de acordo com a invenção.

Os efeitos benéficos dos alimentos de acordo com a invenção aparecem em geral a partir de uma dose de 5 mL/dia/kg de peso, no caso de um leite fermentado contendo uma população total (podendo ser constituída por uma ou mais estirpes de bactérias de acordo com a invenção) de bactérias lácticas de acordo com a invenção, a pelo menos 105 UFC/mL. Podem no entanto ser absorvidas doses muito superiores, sem efeitos secundários nefastos. A invenção presente será mais bem compreendi.da por intermédio do complemento de descrição que se seguirá, o qual se refere a exemplos não limitativos, que ilustram as propriedades ansiolíticas dos produtos lácteos fermentados de acordo com a invenção.

EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DOS DIFERENTES PRODUTOS

As estirpes e fermentos que se utilizarm nas diferentes experimentações que se seguirão são a s seguintes: - estirpe S. thermophilus S242 - estirpe S. thermophilus S147 - estirpe S. thermophilus S003 - Fermento F04 : (fermento que associa as três estirpes S242, S147, S003 de S. thermophilus) - estirpe L. gasseri L012 - estirpe L. acidophilus L030

Fabricação dos produtos:

Tratou-se a 95°C durante 10 minutos um leite UHT com 0 % de gordura, e depois arrefeceu-se quer a 37 quer a consoante a temperatura das fermentações, antes de se lhe semearem culturas activas das estirpes utilizadas para se obter a preparação pretendida.

As sementeiras com estirpes de S. thermophilus S242, S147, e S003 utilizadas individualmente, são levadas a cabo à razão de 1% (em volume) de uma cultura a entre 1 (r e 109 UFC/mL sobre o leite estéril a que se adicionou autolisado de levedura (3 h a 44°C) . A sementeira com o fermento F042 é levada a caloo à razão de 30 g/100 L de uma mistura de concentrados congelados das estirpes S242, S147 et S003 a entre 108 e 109 UFC/mL. Leva-se a cabo a liofilização a 44°C; quando α pH atinge cerca de 4,5 transfere-se a preparação para 4':? C, e conserva-se a esta temperatura até á sua utilização.

As populações bacterianas no final da fermentação, nos produtos fermentados pelas estirpes por si próprias, são: Streptococcus thermophilus S242: 1,2* 109 UFC/mL; Streptococcus thermophilus §147: 1,8*109 UFC/mL; Streptococcus thermophilus S003: 1,3*107 UFC/mL. , a

No produto final fermentado pela mistura F042 concentração em Streptococcus thermophilus ίΜΜ2*·Μ.41^Μί é de 1,9*108 UFC/mL. A sementeira com as estirpes de L. acidophi lus L012 e L030 é levada a cabo a razão de 3% (em volume) de uma cultura a entre 10B e 109 UFC/mL, em meio MRS neutro (16 h a 37 C). Leva-se a cabo a incubação a 37°C; quando o pH atinge um valor compreendido entre 4,5 e 5,9, transferre-se a preparação para 4°C, e conserva-se a esta temperatura até a sua utilização. 0 soro filtrado do leite fermentado pelo fermento F042 é preparado centrifugando 500 mL de leite fermentado a 10.000 rpm (centrifugadora SORVAL RC5B, rotor GSA) durante 15 minutos e por 2 vezes, e filtrando-se em seguida, o sobrenadante através de um filtro NALGÈNE de nitrato de celulose (HIGH-BINDING PROTEIN) 0,45 μπι, e em seguida 0, 22 μπι) . iliwg tt ΜΆΜΜφΰ m IffXfO m om

MiiTSRJL m M SSf«fSMÓflW

Os produtos testados são os seguintes: 3S: Leite fermentado com o fermento F042 (que inclui 3 S. t hermophilus, S242, S147, S003) 3S+P: Leite fermentado com o fermento F042 +

Passiflora 3ST: Leite fermentado com o fermento F042 e depois tratado termicamente a 73°C durante 30 segundos, com homogeneização a 100 bar.

L: Leite de controlo, esterilizado a 130°C durante 30 segundos.

Avalia-se o efeito ansiolitico utilizando o modelo de Enterramento Defensivo Condicionado, que foi desenvolvido a partir do procedimento de J.P. PINEL e D. TREIT (PINEL e TREIT, J. Comp. & Physiol. Psychol., 92, 708-712, 1978; TREIT et al., Pharmacol. Biochem. Behav., 15, 619-626, 1981) . Este modelo utiliza a propensão natural da maior parte dos roedores a fugir de uma fonte de estimulação stressante (TREIT, Pharmacol. Biochem. Beha\r ., 22(1) , 47-52, 1985; MEERT e COLPAERT, Psychopharmacology, 88, 445-450, 1986; CRAFT et al., Pharmacol. Biochem. Behav., 30(3), 775-780, 1988; TREIT, Pharmacol. Biochem. Behav., 36, 203 -205, 1990).

Animais

Utilizaram-se setenta e dois ratos machos

Wistar/AF EOPS (Centro de produção IFFA-CREDO, 69 St-Germain sur l'Arbresle, França) com um peso de entre 320 e 340 g. Quando foram recebidos, os ratos foram pesados, marcados e repartidos em grupos de 4 por jaulas em policarbonato do tipo F (48 x 27 x 20 cm, U.A.R., 91

Epinay-Sur-Orge, França). Os animais foram mantidos numas instalações próprias climatizadas, a uma temperatura de 2 2-24°C. Os ratos tinham acesso ad libitum a alimento (croquetes M25, Estabelecimentos PIÉTREMENT, 77 - Provins, França) e a água. Foram submetidos a um ciclo de luz e obscuridade de 12 horas (luz das 24 h as 12 h).

Depois de se familiarizarem durante uma semana com as condições do laboratório, os 72 foram repartidos aleatoriamente por 6 grupos (n = 12). Os ratos dos diversos grupos foram tratados da mesma maneira e nas mesmas condições.

Materiais

Jaulas experimentais A habituação e os testes foram realizados numa jaula transparente com dimensões de 44 x 28 x 18 cm, cujo fundo se encontrava revestido com uma altura de 5 cm de serradura. A meio de uma das faces laterais, um orifico permitia a fixação de de uma sonda 2 cm acima do nível da serradura.

Sonda eléctrica

Trata-se de uma sonda em polemetacrilato de metilo com as dimensões de 7 x 2 x 0,5 cm, recoberta com um circuito impresso em cobre no qual o espaçamento entre fios é de 1 mm, seleccionado de forma a que quando uma pata de rato de pousa sobre a sonda, se crie facilmente um contacto entre os fios, permitindo dessa forma a passagem da corrente.

Aparelhagem eléctrica A sonda encontra-se ligada a um gerador de choques eléctricos de 0 a 8 mA, dependendo da actuação manual de um interruptor (OPENSYSTEMS, 54 - Maxéville,

França).

Registo e tratamento das sequências comportamentais

Na dependência pouco iluminada em que se faz a experimentação, montou-se uma câmara de vídeo em frente da jaula, a uma distância de um metro. A câmara está ligada, s um magnetoscópio e a um monitor de controlo, colocados AOÃhã divisão adjacente com o gerador dos choques eléctricos. A experimentação foi realizada de modo duplamente cego.

Habituação

Durante os 2 dias antes do primeiro teste, transportaram-se os ratos do local de criação até a divisão na qual se fazia a experimentação, e foram introduzidos no dispositivo experimental para os habituae tanto as manipulações como a jaula com o dispositivo, na ausência do eléctrodo. Cada grupo de 4 ratos foi colocado no dispositivo durante 20 minutos. Mudou-se a serradura, aplanou-se a uma altura uniforme de 5 cm, antes do per iodo de habituação de cada um dos grupos.

Experiência

Realiza-se o teste de Enterramento Defensivo Condicionado durante as 5 primeiras horas da fase de obscuridade, fase em que os ratos estão com grau de actividade máximo.

Insere-se a soda eléctrica na jaula entes do inicio do primeiro teste. Cada rato é colocado na jaula d:? experimentação, do lado oposto ao da sonda.

Na altura do primeiro teste (teste 1 ?;· > administra-se um choque eléctrico Único, com fraca intensidade (2 mA), ao animal, no momento em que ele pousa uma pata anterior pela primeira vez sobre a sonda.

Depois do choque eléctrico, regista-se o comportamento de cada rato durante 5 minutos. Na altura dos dois testes seguintes (testes 2 e 3), volta colocar-se o rato na jaula de experimentação em presença da sonda inactiva. Limpa-se a sonda depois de cada rato e muda-se e alisa-se a serradura a uma altura uniforme de 5 cm antes da sessão do teste de cada jaula de ratos.

Administração dos produtos

Administraram-se os produtos L, 3ST, 3S et 3S+P por via oral, quotidianamente, as mesmas horas, a doses de 5 mL/kg, por intermédio de seringas munidas de sondas de alimentação forçada, intragastricas (HARVARD APPARATUS, 91 - Les Ulis, França). Os testes de enterramento (teste 1 no dia 6 e teste 2 no dia 8) foram realizados 6 horas depois da administração dos produtos). 0 controlo positivo foi o diazepam (a 3 mg/kg > > que foi colocado em suspensão numa solução aquosa d® metilcelulose a 1 % e que foi administrado quotidianamente, por via oral, durante o mesmo período. Nos dias do teste, ele foi administrado 1 hora antes do teste do enterramento.

Os quatro ratos de cada jaula receberam cada um deles um produto diferente.

Variáveis - duração do enterramento da sonda: as sequências de enterramento são notavelmente estereotipadas, depois do choque; o rato dá lugar a sonda eléctrica e projecta serradura na sua direcção com um movimento alternativo rápido das patas anteriores; - nombre d' etirements vis-a-vis de la sonde : o rato imobiliza-se a alguns centímetro da sonda e estica o pecoço para aproximar o seu focinho da sonda; número de aproximações a sonda: toda a aproximação da cabeça em direcção da sonda, a uma distância inferior a 3 cm; - número de fugas em relação a sonda: todas as fugas precipitadas do rato a seguir a uma aproximação ou a um contacto com a sonda;

- percentagem de aproximações da sonda seguidas de fugas = (úmero de fugas / número dB aproximações) x 100.

Análise estatística

Classificaram-se os dados por ordem crescente para as variáveis seguintes: duração do enterramento, número de estiragens e percentagem de aproximações seguidas de fugas. No meio das diversas variáveis, atribuiu-se u.ma classificação relativa a cada dado, e a soma das clasificações constitui a classificação total de stress de cada rato.

Utilizou-se o teste de KRUSKAL-WALLIS para por em evidência a existência de uma heterogeneidade entre os grupos. Utilizou-se o teste de MANN-WHITNEY para comparar os grupos DZP, 3ST, 3S e 3S+P com o produto de controlo L. Exprimem-se os resultados sob a forma das suas medianas e das distâncias interquartis (Quartil Inferior - Quartil Superior).

Os tratamentos estatísticos e gráficos foram realizados utilizando os programas STATVIEW 4.1 e DELTAGRAPH PRO 3.5.

Resultados

Classificação global de stress no decurso cio teste 1.

Os resultados deste teste são ilustrados pela figura 1.

Legenda da figura 1 L: leite estéril de controlo 3ST: Leite fermentado pelo fermento F042 e em seguida submetido a um tratamento térmico 3S: Leite fermentado pelo fermento F042 3S+P: Leite fermentado pelo fermento F042 +

Passiflora DZP: Diazepam

Teste de Mann-Whitney: * p<0,05 vs. L, *** p<0,005 vs. L e (T) tendência para L (p<0,0 7l .

No decurso do teste 1, os produtos 3S e 3S+P diminuem de forma significativa a clasificação global de stress em relação a obtida para o grupo de controlo L. 0 produto 3ST não difere significativamente do produto de controlo L. 0 diazepam tende a diminuir & classificação global de stress em relação ao grupo de controlo L.

Durante o decurso do teste 1, e para além diazepam, nenhum produto demonstrou um efeito sedativo.

Classificação global de stress no decurso do teste 2.

Os resultados deste teste são ilustrados pela figura 2.

Legenda da figura 2 L: leite estéril de controlo 3ST: Leite fermentado pelo fermento F042 e em seguida submetido a um tratamento térmico 3S: Leite fermentado pelo fermento F042 3S+P: Leite fermentado pelo fermento F042 +

Passiflora DZP: Diazepam

Teste de Mann-Whitney: * p<0,05 vs. L

No decurso do teste 1, os produtos 3S e 3S+P diminuem de forma significativa a clasificação global stress em relação a obtida para o grupo de controlo L.

Os efeitos do produto 3ST e os do diazepam não diferem de modo significativo dos do produto de controlo L.

Conclusões

No decurso dos testes 1 e 2, os produtos 3S e 3S+P diminuem de forma significativa a classificação global de stress, em relação a do produto de controlo L. 0 produto 3 ST não evidencia nenhuma actividade contra o stress no decurso cós dois testes, em comparação com o produto de controlo. 0 diazepam, administrado a uma dose de 3 mg /kg por via oral durante 6 dias antes do teste 1, apenas evidenciou uma tendência para diminuir a classificação global de stress em relação ao controlo. No decurso do teste 2 ele não evidenciou nenhum efeito estatisticamente diferente do efeito do controlo. Trata-se neste caso dá um fenómeno de habituação que é próprio dos produtos da família das benzodiazepinas.

Pode-se concluir que os produtos 3S e 3S+P têm uma actividade significativa contra o stress enquanto que o efeito do produto 3ST não difere de forma significativa do efeito do controlo. 0 fenómeno de tolerância observado cos® o diazepam não foi observado com os produtos 3$ e 3S+P. iSJão foi revelado nenhum problema de sedação com estes dóis produtos. EXEMPLO 3:

EFEITO ANXIOLÍTICO M LEITES FERMENTADOS COM MWfcSM BMiFÉmiAS láCTItAS,

Os produtos testados foram os seguintes: SC008 1.1: leite fermentado por S. thermoph.il us S 2 4 2; SC0081.2: leite fermentado por S. thermophilu s S14 7; 3S: leite fermentado pelo fermento F0 42 çd2i2t.2l4 It.sOOj i ; SC008 1.5: Soro filtrado do leite fermentado pelo fermento F042; L: Leite estéril de controlo 10 minutos) ; SC008 1.8: leite fermentado por L. gasseri L012; SC008 1.10: leite fermentado por L. acídophílus L 0 3 0 ; SC008 1.12: leite fermentado por S. thermophíl us S003.

Levaram-se a cabo os testes de acordo com o

protocolo descrito no exemplo 2 acima neste documento, sobre cento cinquenta e oito ratos macho Wistar/AF EOPS (Centro de produção IFFA-CREDO, 69 - St. Germain sur

Arbresles, França) com um peso de entre 260 e 280 g. Depois de se familiarizarem durante uma semana com as condições do laboratório, repartiram-se os ratos de forma aleatória por 13 grupos de tratamento. Manipularam-se os ratos de todos os grupos da mesma maneira e sob condições idênticas.

Administração dos produtos.

Todos os produtos foram administrados durante 6 dias, por via oral, quotidianamente, as mesmas horas, a doses de 5 mL/kg, por intermédio de seringas munidas de sondas de alimentação forçada intrgástrica (HARVARD APPARATUS, 91 Les Ulis, França) . No dia do teste, eles foram administrados 6 horas antes do teste de enterramento.

Quanto ao diazepam, (1 mg/kg, por via orla nos dias 1 e 2; 2 mg/kg por via oral nos dias 3 e 4 e 3 mg/Jcg, por via oral nos dias 5 e 6), ele foi suspenso num volume de 5 mL de solução aquosa de metilcelulose a 1 %. No dia do teste, o diazepam foi administrado 1 hora antes do teste de enterramento.

Para evitar interferências, todos os ratos de uma mesma jaula receberam o mesmo produto.

Variáveis

Para além das variáveis já descritas no exemplo 2, estudaram-se as seguintes variáveis do efeito sedativo: - número de posturas na vertical: o rato adopata uma posição vertical apoiando-se sobre as patas posteriores; - número de transições de um lado para o outro da jaula.

Resultados

Classificação global de stress

Quando comparados com o produto L, os produtos SC008 1.1, 3S, SC008 1.8, SC008 1.10, SC008 1.12 e o diazepam induzem classificações globais de stress que são significativamente inferiores.

As clasif icações de stress induzidas pelos produtos SC008 1.2 e SC008 1.5 não diferem significativamente da do produto de controlo. Os resultados estão ilustrados na figura 3.

Legenda da figura 3: L: Leite estéril de controlo (95°C 10 minutos); SC008 1.1: leite fermentado por S. thermopníl ^3 S 2 4 2; SCO Ο 81.2: leite fermentado por S. thermophi lus S14 7 ; 3S: leite fermentado pelo fermento F042 SC008 1.5: Soro filtrado do leite fermentado pelo fermento F042; SC008 1.8: leite fermentado por L. gasseri L012 ; SC008 1.10: leite fermentado por L. acidophilus L030; SC008 1.12: leite fermentado por S. thermophil us S 0 0 3; DZP: Diazepam.

Teste de Mann-Whitney: *** p <0,005 vs. L.

Efeito sedativo dos produtos 3S e SC0Q8 1.10 O efeito sedativo dos produtos 3S e SC008 1.10 em relação ao produto de controlo L é avaliado com base na actividade locomotora e exploratória. Número de posturas na vertical durante o decurso do teste.

Observa-se uma heterogeneidade no número de posturas na vertical observados com os produtos 3S, SCO08 1.10 e L (Teste de Kruskal-Wallis: ΜΙι.ϊΐ,τη·? = 6,170; p < 0,05). O produto 3S leva a um aumento significativo do número de posturas na vertical em relação ao produto de controlo L (Test de Mann-Whitney: U = 65; p < 0,05). O produto SC008 1.10 tende a aumentar o número de posturas na vertical, em relação ao produto de controlo L (Teste de Mann-Whitney: U= 73; p < 0,07). Número de transições d eum lado da jaula para o outro: Não se observa nenhuma diferença significativa do número de transições de um lado da jaula para o outro, no caso dos produtos 3S, SC008 1.10 e no caso do produto de controlo L (Teste de Krusdal-Wallis: = 0,9 8 3: N.S.) .

Conclusão

Nas condições experimentais, e com base na classificação global do stress, os produtos SC008 1.1, 3 S, SC008 1.8, SC008 1.10, SC008 1.12, e o diazepam evidenciam uma actividade contra o stress que é significativa «hm relação ao produto de controlo L. Os produtos SC008 1.2 ® SC008 1.5 não apresentam nenhuma actividade contra * stress, em relação ao produto de controlo L.

Com base na actividade locomotora e exploratória e em relação ao produto de controlo L, não se observou qualquer efeito sedativo com os leites fermentados que demonstravam possuir actividade contra o stress. EXEMPLO 4: DETERMINAÇÃO DA DURAÇÃO ÓPTIMA DA ADMINISTRAÇÃO DOS PRODUTOS PELA VIA ORAL.

Os produtos testados são os seguintes: 3S; leite fermentado pelo fermento F042(S242-f$M7+SQG3}; L: Leite estéril de controlo 10 minutos).

Efectuaram-se os testes de acordo com o protocolo descrito no exemplo 2 acima neste documento, sobre sessenta ratos macho Wistar/AF EOPS (Centro de produção Iffa-Credo, 69 - St Germain sur Arbresles, França) com um peso de entre 260 e 280 g. Depois de se familiarizarem os ratos com as condições do laboratório, repartiram-se aleatoriamente por 6 grupos de tratamento. Os ratos dos diversos grupos foram manipulados de forma idêntica e sob condições idênticas.

Administração dos produtos

Administraram-se os produtos quotidianamente pot via oral durante 1, 3 e 6 dias, com doses de 5 mL/kg, por intermédio de seringas munidas de sondas de alimentação forçada intragástrica (HARVARD APPARATUS, 91 Les Cl ;.La,

França). No dia do teste, os produtos foram administrados 6 horas antes do teste de enterramento.

Os quatro ratos de cada jaula receberam todos o mesmo produto.

Resultados

Classificação global de stress

Administrado em dose única quotidianamente durante 3 dias antes do teste, o produto 3S induz uma classificação global de stress estatisticamente equivalente a obtida com o produto de controlo L.

Administrado quotidianamente durante 6 dias antes do teste, o produto 3S induz uma classificação global de stress significativamente inferior a que se obtém com o produto L.

Estes resultados estão ilustrados na figura 4

Legenda da figura 4: L: Leite estéril de controlo C9S?€ 10 minutos) 3S: leite fermentado pelo fermento p < 0,005 vs. L.

Teste de Mann-Whitne :

Conclusão

Nas condições experimentais descritas acima neste documento, é necessário fazer-se uma administração quotidiana do produto 3S durante 6 dias para que seja exibida uma actividade significativa contra o stress, em relação ao produto de controlo L.

EXEMPLO 5: DETERMINAÇÃO DA HORA ÓPTIMA PARA SE ADMINISTRAREM OS PRODUTOS POR VIA ORAL

Os produtos testados são os seguintes: 3S: leite fermentado pelo fermento F0 42 L: Leite estéril de controlo f 9-5*8* 10 minutos)

Efectuaram-se os testes de acordo com o protocolo que se descreveu no exemplo 2 acima neste documento, sobre cento e oito machos Wistar/AF EOPS (Centro de produção Iffa-Credo, 69 - St Germain sur Arbresles, França) com um peso de entre 260 e 280 g. Depois de se familiarizarem os ratos com as condições do laboratório, repartiram—se aleatoriamente por 6 grupos de tratamento. Os ratos diversos grupos foram manipulados de forma idêntica e Sshfe condições idênticas.

Administração dos produtos

Anteriormente ao teste, administraram-se os produtos quotidianamente por via oral durante 6 dias, com as doses de 5 mL/kg, por intermédio de seringas munidas de sondas de alimentação forçada intragástrica (Harvard Apparatus, 91 - Les Ulis, França). A seguir a este período, o teste de enterramento é levado a cabo 1, 3 ou 6 ou 24 horas depois da última administração. 0 diazepam (1 mg/kg, por via oral nos dias 1 e 2; 2 mg/kg por via oral nos dias 3 e 4 e 3 mg/kg, por via oral nos dias 5 e 6) é administrado num volume de 5 mL de solução aquosa de metilcelulose a 1 %. A última administração é feita 1 hora antes do teste do enterramento. Os quatro ratos de uma determinada jaula receberam todos o mesmo produto.

Resultados

Classificação global de stress

Quando a administração é levada a cabo uma hora antes do teste, o produto 3S induz uma classificação global de stress equivalente a do produto de controlo L. A classificação global de stress do diazepam é significativamente inferior a obtida utilizando o produto de controlo L.

Quando a administração é levada a cabo 3 horas antes do teste, o produto 3S induz uma classificação global de stress que não difere estatisticamente da classificação obtida com o produto de controlo L.

Quando a administração é levada a cabo 6 ou 2 4 horas antes do teste, o produto 3S induz uma classificação global de stress que é significativamente inferior a classificação obtida com o produto de controlo L.

Os resultados obtidos após 1 hora e após 6 horas estão ilustrados nas figuras 5 e 6.

Legendas das figuras 5 et 6: L: Leite estéril de comtrolo 10 minutos) 3S: Leite fermentado pelo fermento F0 42 (BM2lCbl?-hSQ03;! DZP: Diazepam

Teste de Mann-Whitney: ** p < 0,01 vs. L.

Conclusão

Nas condições experimentais descritas acima neste documento, e com base na classificação global de stress actividade contra o stress manifesta-se entre 6 e 24 horas depois da administração do produto 3S.

EXEMPLO 6: PROCURA DO DECAPÉPTIDO PROVENIENTE DA HIDRÓLISE DA CASEÍNA asl COM TRIPSINA, NUM PRODUTO FERMENTADO PELA UTILIZAÇÃO DA MISTURA 3S

Foi pesquisada a presença do decapéptido descrito no Pedido de EP 95/402.697 no produto 3S. A análise foi feita por HPLC - em fase reversa sobre C18 (a separação dos peptidos é baseada na sua hidrofobicidade). A análise foi levada a cabo sobre uma "pré-coluna” NUCLEOSIL C 18-10μ - 100 mm X 4,6 mm, seguida por uma coluna analítica NUCLEOSIL C 18-3μ - 150 mm X 4,6 mm, utilizando o gradiente seguinte: A: TFA a 0,1 % em H20 B: 90 % de CH3CN + 10 % de TFA a 0,1 % em na

Tabela A eluição é levada a cabo tal como se indica docume

III adiante neste

TABELA III tempo A B 0 minutos 90 10 10 minutos 60 40 40 minutos 60 40 45 minutos 90 10 60 minutos 90 10 A detecção é feita a 215 nm.

Nestas condições, o tempo de retenção do decapéptido deposto sobre a coluna é de 29 minutos.

Preparação da amostra a testar:

Produto 3S + 20% de CH3CN; agitação e depois sentrifugação durante 20 minutos a 10.000 rpm.

Recuperação da fase solúvel e depois filtração utilizando um filtro GELMAN 0,45μ GHP-GF (de pouca ligação a proteínas) antes de se injectarem 100 μ! do filtrado sobre a coluna de HPLC.

No filtrado do produto 3S não se encontra nenhum pico correspondente ao tempo de retenção do decapéptido que se procurava.

Lisboa, 22 de Agosto de 2007

Claims (7)

1. A utilização de pelo menos uma estirpe de bactéria láctica seleccionada de entre: a estirpe de S242, depositada junto da CNCM a 24 de Fevereiro de 1999, sob o número 1-2130; a estirpe de S. thermophilus S 0 0 3 , depositada junto da CNCM a 24 de Fevereiro de 1999, sob o número 1-2129, a estirpe de L. gasseri L012, depositada junto da CNCM a 24 de Fevereiro de 1999, sob o número 1-2131; e a estirpe de L. acidophilus L030, depositada junto da CNCM a 24 de Fevereiro de 1999, sob o número 1-2132, para se obter um ansiolitico não sedativo.

2. Estirpe de bactéria láctica utilizável para a obtenção de um ansiolitico não sedativo, seleccionada d* entre: a estirpe de S242, depositada junto CNCM a 24 de Fevereiro de 1999, sob o número 1-2130; a estirpe de S. thermophilus S 0 03, depositada junto da CNCM a 24 de Fevereiro de 1999, sob o número 1-2129, a estirpe de L. gasseri LO 12, depositada junto da CNCM a 24 de Fevereiro de 1999, sob o número 1-2131; e a estirpe de L. acidophílus L030, depositada junto da CNCM a 24 de Fevereiro de 1999, sob o número 1-2132.

3. Utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por se associar pelo menos uma estirpe de S. termophíllus seleccionada de entre a estirpe S242 e a estirpe S003, com a estirpe de S. termophíllus SI 47, depositada junto da CNCM a 30 de Dezembro de 1994, sofc> 0 número 1-1520.

4. Fermento láctico incluindo pelo menos uma estirpe de S. thremophilus deleccionada de entre a estirpe S 242, depositada junto da CNCM a 24 de Fevereiro de 19 99, sob o número 1-2130, e a estirpe S003, depositada junto da CNCM a 24 de Fevereiro de 1999, sob o número 1-2129.

5. Fermento láctico de acordo com a reivindicação 4, contendo também a estirpe de S. thermophilus S147, depositada junto da CNCM a 30 de Dezembro de 1994, sob o número 1-1520.

6. Fermento láctico de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 ou 5, caracterizado por conter para além disso pelo menos uma estirpe de bactéria láctica seleccionada de entre o conjunto constituído por: a estirpe L. gasseri L012, depositada junto da CNCM a 24/02/99, sob o número 1-2131; - a estirpe L. acidophilus L030, depositada junto da CNCM a 24/02/99, sob o número 1-2132.

7. Produto ou complemento alimentar contendo um ansiolítico não sedativo, sendo o referido ansiolítico não sedativo caracterizado por conter pelo menos uma estirpe <de bactérias lácticas de acordo com a reivindicação 2, ou um fermento láctico de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, e por ser constituído por leite ou por um meio baseado em ieite, fermentado pela estirpe referida ou pelo fermento referido. Lisboa, 22 de Agosto de 2007