PT1109453E - Composições e métodos para tratamento de doenças mitocondriais - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA TRATAMENTO DE DOENÇAS MITOCONDRIAIS"

Campo da Invenção

Esta invenção refere-se, em geral, a compostos úteis para tratamento e prevenção de doenças, atrasos de desenvolvimento e sintomas relacionados com disfunção mitocondrial. São administrados precursores de nucleótidos de pirimidina a um mamífero, incluindo um humano, com a finalidade de compensar a disfunção mitocondrial e para melhorar as funções mitocondriais.

Antecedentes da Invenção

As mitocôndrias são organelos celulares presentes na maioria das células eucarióticas. Uma das suas principais funções é a fosforilação oxidativa, um processo através do qual a energia derivada do metabolismo de combustíveis, como glucose ou ácidos gordos, é convertida para ATP, que é, depois, utilizada para conduzir várias reacções biossintéticas que necessitam de energia e outras actividades metabólicas. As mitocôndrias possuem os seus próprios genomas, separados do ADN nuclear, compreendendo anéis de ADN com cerca de 16000 pares de bases em células humanas. Cada mitocôndria pode possuir várias cópias do seu genoma e as células individuais podem possuir centenas de mitocôndrias. 1 A disfunção mitocondrial contribui para vários estados de doença. Algumas doenças mitocondriais são devidas a mutações ou delecções no genoma mitocondrial. As mitocôndrias dividem-se e proliferam com uma velocidade de renovação mais rápida do que as suas células hospedeiras e a sua replicação está sob controlo do genoma nuclear. Se uma proporção limiar de mitocôndrias numa célula for defeituosa e se uma proporção limiar dessas células dentro de um tecido possuir mitocôndrias defeituosas, pode resultar em sintomas de disfunção de tecido ou órgão. Praticamente qualquer tecido pode ser afectado e pode estar presente uma grande variedade de sintomas, dependendo da extensão para a qual estão envolvidos diferentes tecidos.

Um óvulo fecundado pode conter mitocôndrias geneticamente defeituosas e normais. A segregação de mitocôndrias defeituosas nos diferentes tecidos durante a divisão deste óvulo é um processo estocástico, como o será a razão de mitocôndrias defeituosas para normais dentro de um dado tecido ou célula (embora possa existir selecção positiva ou negativa para genomas mitocondriais defeituosos durante a renovação mitocondrial dentro de células) . Deste modo, podem emergir uma variedade de diferentes fenótipos patológicos de uma mutação pontual particular em ADN mitocondrial. Por outro lado, podem emergir fenótipos semelhantes de mutações ou delecções que afectam diferentes genes dentro de ADN mitocondrial. Os sintomas clínicos em doenças mitocondriais congénitas manifestam-se, frequentemente, em tecidos pós-mitóticos com elevadas exigências de energia, como cérebro, músculo, nervo óptico e miocárdio, mas estão também envolvidos outros tecidos incluindo glândulas endócrinas, fígado, tracto gastrointestinal, rim e tecido hematopoiético, dependendo novamente, em parte, da segregação de 2 mitocôndrias durante o desenvolvimento e das dinâmicas de renovação mitocondrial ao longo do tempo.

Além dos distúrbios congénitos que envolvem mitocôndrias defeituosas hereditárias, a disfunção mitocondrial adquirida contribui para doenças, particularmente distúrbios neurodegenerativos associados com o envelhecimento, como Doenças de Parkinson, Alzheimer, Huntington. A incidência de mutações somáticas em ADN mitocondrial aumenta exponencialmente com a idade; a actividade de cadeia respiratória diminuída encontra-se, de um modo geral, em pessoas mais velhas. A disfunção mitocondrial está, também, implicada na lesão neuronal excitotóxica, tal como a associada com convulsões ou isquemia. 0 tratamento de doenças que envolvem disfunção mitocondrial tem, até à data, envolvido a administração de vitaminas e de co-factores utilizados por elementos particulares da cadeia respiratória mitocondrial. A coenzima Q (ubiquinona), nicotinamida, riboflavina, carnitina, biotina e ácido lipóico são utilizados em doentes com doença mitocondrial, com benefício ocasional, especialmente em distúrbios directamente provenientes de deficiências primárias de um destes co-factores. No entanto, embora úteis em casos isolados, nenhum dos co-factores metabólicos ou vitaminas mostrou possuir utilidade geral, na prática clínica, em tratar doenças mitocondriais. Do mesmo modo, tem sido utilizado ácido dicloroacético (DCA) para tratar citopatias mitocondriais, tal como MELAS; o DCA inibe a formação de lactato e é principalmente útil em casos de doenças mitocondriais, em que a própria acumulação de lactato excessiva contribui para os sintomas. No entanto, o DCA não resolve sintomas relacionados com a insuficiência mitocondrial per se e 3 pode ser tóxico para alguns doentes, dependendo dos defeitos moleculares subjacentes.

As doenças mitocondriais compreendem distúrbios provocados por uma enorme variedade de lesões ou defeitos moleculares, com a expressão fenotípica de doença complicada ainda por distribuições estocásticas de mitocôndrias defeituosas em diferentes tecidos. A Patente dos Estados Unidos 5583117 do mesmo requerente divulga derivados acilados de citidina e uridina. 0 pedido PCT/US 96/10067 do mesmo requerente divulga a utilização de nucleósidos de pirimidina acilados para reduzir a toxicidade de análogos de nucleósidos de pirimidina quimioterapêuticos e antivirais.

Objectivos da Invenção É um objectivo da invenção proporcionar composições úteis para tratar distúrbios ou consequências patofisiológicas associados com disfunção mitocondrial ou disfunção de cadeia respiratória mitocondrial num mamífero, incluindo um humano. É um objectivo da invenção proporcionar compostos e composições que melhoram a resistência de tecido à disfunção mitocondrial in vivo. É um objectivo da invenção proporcionar composições úteis para tratamento de doenças mitocondriais. 4 É um objectivo da invenção proporcionar agentes que compensem largamente os défices mitocondriais que envolvem uma vasta variedade de patologias moleculares uma vez que, em muitos casos, é difícil um diagnóstico preciso de lesões moleculares em distúrbios mitocondriais. É um objectivo da invenção proporcionar compostos para utilização no tratamento de doenças mitocondriais que são benéficos no caso de défices de cadeia de transporte electrónico mitocondrial independentemente dos défices moleculares específicos.

Sumário da Invenção A presente invenção proporciona compostos para utilização num método para tratar consequências patofisiológicas de deficiência de cadeia respiratória mitocondrial num mamífero, compreendendo administrar, a esse mamífero em necessidade desse tratamento, uma quantidade de um precursor de nucleótido de pirimidina eficaz na redução das consequências patofisiológicas. Além disso, a invenção proporciona compostos para utilização num método de prevenção de consequências patofisiológicas de deficiência de cadeia respiratória mitocondrial, compreendendo administrar, a um mamífero, uma quantidade de um precursor de nucleótido de pirimidina eficaz na prevenção das consequências patofisiológicas.

Na doença mitocondrial, os compostos e composições da invenção são úteis para atenuar sequelas clínicas provenientes de deficiências de cadeia respiratória. As deficiências de cadeia respiratória subjacentes a doença mitocondrial são 5 provocadas por vários factores incluindo mutações e delecções congénitas ou hereditárias no ADN mitocondrial, défices em proteínas codificadas nucleares que afectam a actividade de cadeia respiratória, assim como mutações somáticas, cálcio intracelular elevado, excitotoxicidade, óxido nítrico, hipoxia e defeitos de transporte axonal. A presente invenção proporciona compostos, composições, para utilização em métodos para prevenir ou reduzir morte e disfunção de células pós-mitóticas que suportam défices de cadeia respiratória mitocondrial.

Além disso, a presente invenção proporciona compostos, composições, para utilização em métodos para tratar atrasos de neurodesenvolvimento na linguagem, motor, de função executiva, cognitivos e de aptidões sociais neurofisiológicas. A presente invenção também se refere ao tratamento de distúrbios e estados que são aqui divulgados como estados para os quais contribuem defeitos mitocondriais e que são, portanto, submetidos a tratamento com compostos e composições da invenção. Estes incluem efeitos secundários de quimioterapia de cancro, como neuropatias periféricas, nefropatias, fadiga e menopausa precoce, assim como anomalias ovulatórias e a própria menopausa normal. A invenção, assim como outros seus objectivos, características e vantagens, serão entendidos mais clara e totalmente a partir da descrição detalhada, quando lida com referência aos resultados anexos das experiências discutidas nos exemplos abaixo. 6

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção refere-se a compostos, composições para utilização em métodos para tratar ou prevenir uma variedade de distúrbios clínicos secundários a disfunção mitocondrial, especialmente défices na actividade de componentes da cadeia respiratória mitocondrial. Tais distúrbios incluem citopatias mitocondriais congénitas, atrasos de neurodesenvolvimento e disfunções de cadeia respiratória provocados pela administração de quimioterapia de cancro citotóxica. A. Definições "Doença mitocondrial" refere-se a distúrbios para os quais os défices na actividade de cadeia respiratória mitocondrial contribuem no desenvolvimento de patofisiologia desses distúrbios num mamífero. Esta categoria inclui 1) deficiências genéticas congénitas na actividade de um ou mais componentes da cadeia respiratória mitocondrial; 2) deficiências adquiridas na actividade de um ou mais componentes da cadeia respiratória mitocondrial, em que tais deficiências são provocadas por, inter alia, a) dano oxidativo durante envelhecimento; b) cálcio intracelular elevado; c) exposição de células afectadas a óxido nítrico; d) hipoxia ou isquemia; e) défices associados a microtúbulos no transporte axonal de mitocôndrias ou f) expressão de proteínas desacopladoras mitocondriais. A cadeia respiratória mitocondrial (também conhecida como a cadeia de transporte electrónico) compreende 5 complexos principais: 7

Complexo I NADH:ubiquinona redutase Complexo II Succinato:ubiquinona redutase Complexo III ubiquinol:citocromo c redutase Complexo IV citocromo c oxidase Complexo V ATP sintase

Os complexos I e II realizam a transferência de electrões de combustíveis metabólicos, como produtos de glicólise e ácidos gordos, para ubiquinona (Coenzima Q), convertendo-a a ubiquinol. 0 ubiquinol é de novo convertido para ubiquinona por transferência de electrões para o citocromo c no Complexo III. 0 citocromo c é reoxidado em Complexo IV por transferência de electrões para oxigénio molecular, - produzindo água. 0 complexo V utiliza energia potencial do gradiente protónico produzida através da membrana mitocondrial por estas transferências electrónicas, convertendo ADP em ATP, a qual proporciona, então, energia para reacções metabólicas na célula. A desidrogenase di-hidro-orotato (DHODH) é uma enzima envolvida na síntese de novo de nucleótidos de uridina. A actividade DHODH está acoplada à cadeia respiratória através da transferência de electrões de di-hidro-orotato para ubiquinona; estes electrões são, então, passados para o citocromo c e oxigénio através dos Complexos III e IV, respectivamente. Apenas os Complexos III e IV estão directamente envolvidos na biossíntese de pirimidina. 0 orotato produzido pela acção de DHODH é convertido a uridina monofosfato por fosforribosilação e descarboxilação. "Precursores de nucleótidos de pirimidina" no contexto da invenção são intermediários nas vias de salvamento ou de novo de síntese de nucleótido de pirimidina que entra para - síntese de pirimidina distai para DHODH (e. g., orotato) ou a qual não necessita de actividade de DHODH para conversão a nucleótidos de pirimidina (e. g. citidina, uridina ou derivados acilo de citidina ou uridina). Estão também incluídos dentro do âmbito da invenção fosfatos de nucleósidos de pirimidina (e. g. nucleótidos, citidina difosfocolina, uridina difosfoglucose); estes compostos são degradados ao nível de uridina ou citidina antes de entrarem nas células e anabolismo. Os derivados acilo de citidina e uridina possuem melhor biodisponibilidade oral do que os nucleósidos ou nucleótidos progenitores. 0 ácido orótico e seus ésteres são convertidos a nucleótidos de uridina e são também úteis para atingir os objectivos da invenção. B. Compostos da Invenção

Uma característica principal da presente invenção é a verificação inesperada que a administração de precursores de nucleótidos de pirimidina é eficaz no tratamento de uma grande variedade de sintomas e estados de doença relacionados com disfunção mitocondrial.

Os níveis de nucleótido de pirimidina tecidular são aumentados por administração de qualquer de vários precursores. A uridina e citidina são incorporadas em agrupamentos de nucleótidos celulares por fosforilação na posição 5'; os nucleótidos de citidina e uridina são interconvertíveis através de reacções de aminação e desaminação enzimática. 0 ácido orótico é um intermediário chave na biossíntese de novo de nucleótidos de pirimidina. A incorporação de ácido orótico em agrupamentos de nucleótidos necessita de fosforribosilpirofosfato (PRPP) celular. De um modo alternativo 9 (ou além da disposição de precursores de nucleótidos exógenos), a disponibilidade de uridina para tecidos é aumentada por administração de compostos que inibem a uridina fosforilase, a primeira enzima na via para degradação de uridina. Os compostos da invenção úteis no tratamento de doenças mitocondriais e distúrbios relacionados incluem uridina, citidina, orotato, derivados acilo oralmente biodisponiveis ou ésteres destes precursores de nucleótidos de pirimidina e inibidores da enzima uridina fosforilase.

Com referência aos derivados acilo de citidina e uridina, pertencem as seguintes definições: A expressão "derivado acilo", como aqui utilizada, significa um derivado de um nucleósido de pirimidina no qual um substituinte acilo orgânico substancialmente não tóxico, derivado de um ácido carboxilico, se liga a um ou mais dos grupos hidroxilo livres da unidade ribose do nucleósido de oxi-purina com uma ligação éster e/ou quando tal substituinte está ligado ao substituinte amina no anel purina de citidina, com uma ligação amida. Tais substituintes acilo são derivados de ácidos carboxilicos que incluem, mas não estão limitados a compostos seleccionados do grupo consistindo em um ácido gordo, um aminoácido, ácido nicotinico, ácidos dicarboxílicos, ácido láctico, ácido p-aminobenzóico e ácido orótico. Os substituintes acilo vantajosos são compostos que estão normalmente presentes no organismo, como constituintes da dieta ou como metabolitos intermediários. A expressão "sais farmaceuticamente aceitáveis", como aqui utilizada, significa sais com sais de adição ácida ou básica farmaceuticamente aceitáveis dos derivados que incluem, mas não 10 estão limitados a ácidos sulfúrico, clorídrico ou fosfórico ou no caso de orotato, hidróxidos de sódio ou cálcio e aminoácidos catiónicos, especialmente lisina. A expressão "aminoácidos", como aqui utilizada, inclui, mas não está limitada a glicina, as formas L de alanina, valina, leucina, isoleucina, fenil-alanina, tirosina, prolina, hidroxiprolina, serina, treonina, cisteína, cistina, metionina, triptofano, ácido aspártico, ácido glutâmico, arginina, lisina, histidina, ornitina, hidroxilisina, carnitina, e outros aminoácidos que ocorrem naturalmente. A expressão "ácidos gordos", como aqui utilizada, significa ácidos carboxílicos alifáticos possuindo 2-22 átomos de carbono. Tais ácidos gordos podem ser saturados, parcialmente saturados ou poli-insaturados. A expressão "ácidos dicarboxílicos", como aqui utilizada, significa ácidos gordos com um segundo substituinte de ácido carboxílico.

Os compostos da invenção possuem as seguintes estruturas:

Em todos os casos, excepto quando indicado, as letras e letras com subscritos que simbolizam substituintes variáveis nas estruturas químicas dos compostos da invenção são aplicáveis apenas à estrutura imediatamente anterior à descrição do símbolo. 11 (1) Um derivado acilo de uridina possuindo a fórmula: o R,0

r2o or3 em que Rl, R2, R3 e R4 são iguais ou diferentes e cada é hidrogénio ou um radical acilo de um metabolito, desde que, pelo menos, um dos referidos substituintes R não seja hidrogénio, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. (2) Um derivado acilo de citidina possuindo a fórmula: NHR«

R20 or3 em que Rl, R2, R3 e R4 são iguais ou diferentes e cada é hidrogénio ou um radical acilo de um metabolito, desde que, pelo menos, um dos referidos substituintes R não seja hidrogénio, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

Os compostos da invenção úteis no tratamento de doenças mitocondriais incluem: (3) Um derivado acilo de uridina possuindo a fórmula: 12

em que Rl, R2, e R3 sao iguais, ou diferentes, e cada é hidrogénio ou um radical acilo de a. um ácido gordo de cadeia linear com 2 a 22 átomos de carbono, b. um aminoácido seleccionado do grupo consistindo de glicina, as formas L de alanina, valina, leucina, isoleucina , tirosina, prolina, hidroxiprolina, serina, treonina, cistina, cisteina, ácido aspártico, ácido glutâmico, arginina, lisina, histidina, carnitina e ornitina, c. um ácido dicarboxilico possuindo 3-22 átomos de carbono, d. um ácido carboxilico seleccionado de um ou mais do grupo consistindo de ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido láctico, ácido enolpirúvico, ácido lipóico, ácido pantoténico , ácido acetoacético, ácido p-aminoben zóico, ácido beta-hidroxibutírico, ácido orótico e creatina. a fórmula: (4) Um derivado acilo de citidina possuindo nhr4 o

N ou diferentes e cada é em que Rl, R2, R3 e R4 são iguais hidrogénio ou um radical acilo de a. um ácido gordo de cadeia linear com 2 a 22 átomos de carbono, b. um aminoácido seleccionado do grupo consistindo de glicina, as formas L de alanina, valina, leucina, isoleucina, tirosina, prolina, hidroxiprolina, serina, treonina, cistina, cisterna, ácido aspártico, ácido glutâmico, arginina, lisina, histidina, carnitina e ornitina, c. um ácido dicarboxilico possuindo 3-22 átomos de carbono, d. um ácido carboxilico seleccionado de um ou mais do grupo consistindo de ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido láctico, ácido enolpirúvico, ácido lipóico, ácido pantoténico, ácido acetoacético, ácido p-aminobenzóico, ácido beta-hidroxibutírico, ácido orótico e creatina. (5) Um derivado acilo de uridina possuindo a fórmula:

em que, pelo menos um de Rl, R2 ou R3 é uma unidade hidrocarbiloxicarbonilo contendo 2-26 átomos de carbono e os substituintes R remanescentes são independentemente uma unidade hidrocarbiloxicarbonilo ou hidrocarbilcarbonilo ou H ou fosfato. 14 (6) Um derivado acilo de citidina possuindo a fórmula: MHR,

R,0

RjO OR3 em que, pelo menos um de Rl, R2, R3 ou R4 é uma unidade hidrocarbiloxicarbonilo contendo 2-26 átomos de carbono e os substituintes R remanescentes são independentemente uma unidade hidrocarbiloxicarbonilo ou hidrocarbilcarbonilo ou H ou fosfato. (7) Ácido orótico ou seus sais:

O

Os sais farmaceuticamente aceitáveis de ácido orótico incluem aqueles em que o componente catiónico do sal é sódio, potássio, um aminoácido básico, tal como arginina ou lisina, metilglucamina, colina ou qualquer outro catião hidrossolúvel substancialmente não tóxico, com um peso molecular inferior a cerca de 1000 daltons. 8) Derivados orotato substituídos com álcool:

15 em que RI é um radical de um álcool contendo 1 a 20 átomos de carbono ligados a orotato através de uma ligação éster. São também abrangidos pela invenção os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos acima indicados.

Os compostos vantajosos da invenção são ésteres de ácidos gordos de cadeia curta (2 a 6 átomos de carbono) de uridina ou citidina. Os compostos particularmente vantajosos são triacetiluridina ou triacetilcitidina. Tais compostos possuem melhor biodisponibilidade oral do que os nucleósidos progenitores e são rapidamente desacilados seguindo-se absorção após administração oral. 0 ácido pirúvico é útil para o tratamento de células com função mitocondrial defeituosa. As células com capacidade reduzida para fosforilação oxidativa mitocondrial devem depender da glicólise para a produção de ATP. A glicólise é regulada pelo estado redox das células. De um modo específico, é necessário NAD+ para fluxo de glucose óptimo, que produz NADH no processo. De modo a maximizar a produção de energia de glicólise, o NADH deve ser reoxidado a NAD+. O piruvato exógeno pode reoxidar NADH, em parte através de uma enzima de membrana plasmática, NADH Oxidase. A uridina tripiruvato (2',3',5'-tri-O-piruviluridina) proporciona os benefícios de pirimidinas e piruvato, distribuindo ambos com uma entidade química única e evitando a carga de sódio, cálcio ou de outros catiões nos sais correspondentes de ácido pirúvico. 16 C. Composições da Invenção

Numa forma de realização da invenção, novas composições farmacêuticas compreendem, como agente activo, um ou mais precursores de nucleótidos de pirimidina seleccionados do grupo consistindo de uridina, citidina, ácido orótico ou seus sais ou ésteres e derivados acilo destes precursores de nucleótidos de pirimidina, em conjunto com um veiculo farmaceuticamente aceitável.

As composições, dependendo da utilização pretendida e da via de administração, são fabricadas na forma de um liquido, uma suspensão, aspersões, microcápsulas, um comprimido, uma cápsula, uma drageia, uma solução injectável ou um supositório (ver discussão da formulação abaixo). D. Utilizações Terapêuticas dos Compostos e Composiçoes da Invenção

As doenças relacionadas com disfunção de cadeia respiratória mitocondrial podem ser divididas em várias categorias com base na origem dos defeitos mitocondriais.

As doenças mitocondriais congénitas são as relacionas com mutações, delecções ou outros defeitos hereditários no ADN mitocondrial ou em genes nucleares que regulam a integridade de ADN mitocondrial ou em genes nucleares que codificam proteínas que são críticas para a função mitocondrial de cadeia respiratória. 17

Os defeitos mitocondriais adquiridos compreendem, principalmente, 1) dano a ADN mitocondrial devido a processos oxidativos ou de envelhecimento; 2) disfunção mitocondrial devida a acumulação excessiva de cálcio intracelular e intramitocondrial; 3) inibição de complexos de cadeia respiratória com inibidores de cadeia respiratória endógenos ou exógenos; 4) deficiência de oxigénio aguda ou crónica; e 5) interacções nucleares-mitocondriais alteradas, e. g., inversão alterada de mitocôndrias em axónios grandes devida a defeitos microtubulares e 6) expressão de proteínas desacopladoras mitocondriais em resposta a lípidos, dano oxidativo ou inflamação.

Os mecanismos mais fundamentais envolvidos em defeitos mitocondriais adquiridos e os quais estão subjacentes a patógenese de uma variedade de formas de disfunção de órgão e tecido, incluem:

Acumulação de Cálcio: Um mecanismo fundamental de lesão celular, especialmente em tecidos excitáveis, envolve entrada excessiva de cálcio nas células, como resultado de fuga através da membrana plasmática ou de defeitos nos mecanismos de manuseamento de cálcio intracelular. As mitocôndrias são os principais locais de captura de cálcio e, de um modo preferido, utilizam energia da cadeia respiratória para receber cálcio em vez de para síntese de ATP, o que resulta numa espiral descendente de insuficiência mitocondrial, uma vez que a captação de cálcio em mitocôndrias resulta em capacidades diminuídas para transdução de energia. 18

Excitotoxicidade: A estimulação excessiva de neurónios com aminoácidos excitatórios é um mecanismo comum de morte ou lesão celular no sistema nervoso central. A activação de receptores de glutamato, especialmente do subtipo designado receptores de NMDA, resulta em disfunção mitocondrial, em parte, através da elevação de cálcio intracelular durante estimulação excitotóxica. Por outro lado, défices na respiração mitocondrial e fosforilação oxidativa sensibilizam as células para estímulos excitotóxicos resultando na morte ou lesão celular durante exposição a níveis de neurotransmissores excitotóxicos ou toxinas que seriam inócuos para células normais.

Exposição a óxido nítrico: 0 óxido nítrico (~1 micromolar) inibe a citocromo oxidase (Complexo IV) e, deste modo, inibe a respiração mitocondrial (Brown GC, Mol. Cell. Biochem. 174:189-192, 1997); além disso, a exposição prolongada a NO reduz, de modo irreversível, a actividade de Complexo I. As concentrações fisiológicas ou patofisiológicas de NO inibem, deste modo, a biossíntese de pirimidina. 0 óxido nítrico está implicado numa variedade de distúrbios neurodegenerativos incluindo doenças inflamatórias e auto-imunes do sistema nervoso central e está envolvido na mediação de dano excitotóxico e pós-hipóxico para neurónios.

Hipoxia: 0 oxigénio é o aceitador electrónico terminal na cadeia respiratória. A deficiência em oxigénio altera a actividade de cadeia de transporte electrónico, resultando em síntese de pirimidina diminuída assim como síntese de ATP diminuída através de fosforilação oxidativa. As células humanas proliferam e mantêm a viabilidade sob condições virtualmente anaeróbias, se proporcionadas com uridina e 19 piruvato (ou um agente igualmente eficaz para oxidar NADH para optimizar a produção de ATP glicolitico).

Interacções nucleares-mitocondriais: A transcrição de ADN mitocondrial que codifica componentes de cadeia respiratória necessita de factores nucleares. Em axónios neuronais, as mitocôndrias devem mover-se para a frente e para trás no núcleo de modo a manter a actividade de cadeia respiratória. Se o transporte axonal for alterado por hipoxia ou por fármacos tipo taxol que afectam a estabilidade microtubular, as mitocôndrias distantes do núcleo sofrem perda de actividade de citocromo oxidase.

Proteínas Desacopladoras Mitocondriais: As mitocôndrias são a fonte principal de radicais livres e de espécies de oxigénio reactivo devido ao transbordamento da cadeia respiratória mitocondrial, especialmente quando defeitos de um ou mais componentes de cadeia respiratória alteram, ordenadamente, a transferência de electrões de intermediários metabólicos para oxigénio molecular. Para reduzir o dano oxidativo, as células podem compensar expressando proteínas desacopladoras mitocondriais (UCP), das quais foram identificadas várias. A UCP-2 é transcrita em resposta a dano oxidativo, citocinas inflamatórias ou cargas lipídicas excessivas, e. g., fígado gordo e esteato-hepatite. As UCP reduzem o transbordamento de espécies de oxigénio reactivo de mitocôndrias descarregando gradientes protónicos através da membrana mitocondrial interna, na prática, desperdiçando energia produzida por metabolismo e tornando as células vulneráveis a tensão energética como um equilíbrio para lesão oxidativa reduzida. 20

No sistema nervoso, especialmente, os défices de cadeia respiratória mitocondrial possuem duas consequências generalizáveis: 1) desenvolvimento atrasado ou aberrante de circuitos neuronais dentro do sistema nervoso; e 2) degeneração acelerada de neurónios e de circuitos neurais, intensamente ou ao longo de um período de ano, dependendo da gravidade dos défices mitocondriais e de outros factores de precipitação. Padrões análogos de desenvolvimento alterado e de degeneração acelerada pertencem a tecidos e sistemas não neurais.

Disfunção mitocondrial e biossintese de pirimidina

As células com mitocôndrias gravemente danificadas (incluindo delecção total de ADN mitocondrial, com um consequente desligamento de actividade de cadeia respiratória) podem sobreviver em cultura se proporcionadas com dois agentes que compensem para funções mitocondriais críticas: uridina e piruvato. A uridina é necessária in vitro devido a uma enzima limitante para síntese de novo de nucleótidos de uridina, a desidrogenase di-hidro-orotato (DHODH), estar acoplada à cadeia respiratória mitocondrial, através de ubiquinona como um aceitador electrónico proximal, citocromo c como um intermediário e oxigénio como um aceitador electrónico terminal (Loffler et ai., Mol. Cell. Biochem.-174:125-129, 1997). A DHODH é necessária para síntese de orotato, que é, então fosforribosilado e descarboxilado para produzir uridina monofosfato (UMP). Todas as outras pirimidinas em células são derivadas de UMP. As células de doentes com doença mitocondrial devido aos defeitos no ADN mitocondrial necessitam de uridina exógena de modo a sobreviverem fora do meio do organismo, em que as pirimidinas, derivadas de outras células ou da dieta e 21 transportadas através da circulação, são prima facie suficientes para suportar a sua viabilidade (Bourgeron, et al., Neuromusc. Disord. 3:605-608, 1993). De um modo significativo, a inibição intencional de DHODH com fármacos como Brequinar ou Leflunomida resulta em dano citotóxico limitante por dose ao sistema hematopoiético e mucosa gastrointestinal, em contraste com o envolvimento predominante de tecidos pós-mitóticos, como o sistema nervoso e músculos em doença mitocondrial clinica.

Consequências pato fisiológicas de disfunção de cadeia respiratória

As mitocôndrias são críticas para a sobrevivência e função apropriada de quase todos os tipos de células eucarióticas. As mitocôndrias, em virtualmente qualquer tipo de célula, podem possuir defeitos congénitos ou adquiridos que afectam a sua função. Deste modo, os sinais e sintomas clinicamente significativos de defeitos mitocondriais que afectam a função de cadeia respiratória são heterogéneos e variáveis dependendo da distribuição de mitocôndrias defeituosas entre as células e da gravidade dos seus défices e sobre necessidades fisiológicas aquando das células afectadas. Os tecidos que não se dividem com requisitos de energia elevada, e. g., tecido nervoso, músculo esquelético e músculo cardíaco são particularmente susceptíveis para disfunção de cadeia respiratória mitocondrial, mas pode ser afectado qualquer sistema de órgãos.

As doenças e sintomas listados abaixo compreendem consequências patofisiológicas conhecidas de disfunção de cadeia respiratória mitocondrial e, como tal, são distúrbios em que os 22 compostos e composiçoes da invenção possuem utilidade terapêutica.

Os sintomas de doença secundários para disfunção mitocondrial são geralmente atribuídos a 1) transbordamento de radicais livres da cadeia respiratória; 2) défices na síntese de ATP levando a insuficiência de energia celular, ou 3) apoptose despoletada por libertação de sinais mitocondriais, como citocromo c gue inicia ou media apoptose em série. Uma característica inesperada da presente invenção é a observação que os precursores de nucleótidos de pirimidina da invenção possuem actividade terapêutica contra uma grande variedade de sintomas em doentes com doença mitocondrial, como mostrado nos Exemplos. Isto constitui uma importante alteração de paradigma no entendimento de patogénese de doenças que envolvem disfunção mitocondrial e no entendimento de como tratar tais distúrbios.

Tratamento de citopatias mitocondriais congénitas

Defeitos de ADN mitocondrial

Uma série de síndromes clínicos estão ligados a mutações ou delecções no ADN mitocondrial. 0 ADN mitocondrial é maternalmente hereditário, com virtualmente todas as mitocôndrias no organismo derivadas das proporcionadas pelo oócito. Se existir uma mistura de mitocôndrias defeituosas e normais num oócito, a distribuição e segregação de mitocôndrias é um processo estocástico. Deste modo, doenças mitocondriais são, frequentemente, distúrbios multi-sistema e uma mutação pontual particular em ADN mitocondrial, por exemplo, pode resultar em conjuntos dissemelhantes de sinais e sintomas em 23 diferentes doentes. Por outro lado, as mutações em dois genes diferentes no ADN mitocondrial podem resultar em complexos de sintomas semelhantes.

Contudo, alguns padrões de sintomas consistentes emergem em conjunto com defeitos de ADN mitocondrial identificados e estes compreendem as "doenças mitocondriais" clássicas, algumas das quais são listadas imediatamente abaixo. Contudo, um aspecto importante da presente invenção é o reconhecimento de que o conceito de doença mitocondrial e do seu tratamento com compostos e composições da invenção se estende a muitos outros estados de doença que são também aqui divulgados.

Alguns dos fenótipos clássicos das principais doenças mitocondriais associadas com mutações ou delecções de ADN mitocondrial incluem: MELAS: (Acidemia Láctica de Encefalomiopatia Mitocondrial, e episódios semelhantes a Apoplexia. MERRF: Epilepsia Mioclónica com Fibras "Vermelhas Rasgadas" (músculo) MNGIE: Encefalomiopatia neurogastrointestinal mitocondrial NARP: Fraqueza muscular neurogénica, Ataxia e Retinite

Pigmentosa LHON: Neuropatia Óptica Hereditária de Leber

Sindrome de Leigh (Encefalomiopatia Necrotizante Subaguda) PEO: Oftalmoplegia Externa Progressiva Síndrome de Kearns-Sayres (PEO, retinopatia pigmentária, ataxia e bloqueio cardíaco)

Outros sintomas comuns de doenças mitocondriais que podem estar presentes isolados ou em conjunto com estes síndromes incluem cardiomiopatia, fraqueza e atrofia muscular, atrasos de desenvolvimento (envolvendo função motora, de linguagem, cognitiva ou executiva), ataxia, epilepsia, acidose tubular renal, neuropatia periférica, neuropatia óptica, neuropatia autónoma, disfunção de intestino neurogénico, surdez sensorioneural, disfunção de bexiga neurogénica, cardiomiopatia dilatada, enxaqueca, insuficiência hepática, acidemia láctica e diabetes mellitus.

Além dos produtos génicos e de ARNt codificado por ADN mitocondrial, muitas proteínas envolvidas em, ou que afectam, a respiração mitocondrial e fosforilação oxidativa são codificadas por ADN nuclear. De facto, aproximadamente 3000 proteínas ou 20% de todas as proteínas codificadas pelo genoma nuclear, estão fisicamente incorporadas em, ou associadas com, mitocôndrias e funções mitocondriais ou biogénese, embora apenas cerca de 100 estejam directamente envolvidas como componentes estruturais da cadeia respiratória. Portanto, as doenças mitocondriais não envolvem apenas produtos génicos de ADN mitocondrial, mas também proteínas codificadas no núcleo que afectam a função de cadeia respiratória e estrutura mitocondrial.

Os agentes de tensão metabólicos como infecções podem não mascarar defeitos mitocondriais que não produzam, necessariamente, sintomas sob condições normais. As quebras 25 neuromusculares ou neurológicas durante a infecção são uma marca de doença mitocondrial. Por outro lado, a disfunção de cadeia respiratória mitocondrial pode tornar as células vulneráveis a agentes de tensão que, de outro modo, seriam inócuos. 0 diagnóstico de doença mitocondrial congénita é desafiante devido à heterogeneidade de sintomas, mesmo entre doentes afectados com o mesmo defeito molecular. Os défices na função celular e tecidual devidos a disfunção mitocondrial podem imitar a disfunção tecidual provocada por problemas que não envolvem directamente defeitos mitocondriais. São conhecidos, na técnica, vários esquemas práticos e clinicamente úteis para diagnóstico de doenças mitocondriais; estes envolvem, tipicamente, vários critérios principais (e. g., fenótipos clínicos clássicos como MELAS, NARP ou Síndrome de Leigh, depressões de actividade complexa de cadeia respiratória em amostras de tecido fresco extremas (>80%)) com um bom nível de certeza em estabelecer o papel da disfunção de cadeia respiratória na patogénese de doença e um grande número de critérios menores (e. g., anomalias bioquímicas moderadas características de defeitos de cadeia respiratória, sintomas característicos de doenças mitocondriais sem total apresentação de um dos fenótipos clássicos listados acima) que individualmente são menos convincentes do que os critérios principais únicos, mas que, cumulativamente, proporcionam forte evidência para a contribuição de défices de cadeia respiratória a uma apresentação clínica do doente particular, como descrito em Walker et al., (Eur Neurol., 36:260-7, 1996), aqui incorporado por referência.

Como demonstrado nos Exemplos, os compostos e composições da invenção são úteis para o tratamento de um espectro muito vasto de sinais e sintomas em doenças mitocondriais com 26 diferentes patologias moleculares subjacentes. As melhorias observadas nestes e noutros doentes adicionais incluem, mas não são limitadas a redução da frequência e gravidade de convulsões, enxaquecas e episódios semelhantes a apoplexia, melhoria de ganho de peso em crianças com "insuficiência no desenvolvimento", melhoria de acidose tubular renal com redução simultânea na necessidade de bicarbonato suplementar, melhoria de resistência muscular, melhoria de aquisição de discurso, melhoria de ataxia, redução da frequência e gravidade de infecções do sinus e do ouvido, melhoria de memória e melhoria de sintomas de neuropatia autónoma e periférica. As melhorias observadas num vasta variedade de sintomas que eram basicamente não sensíveis a outras formas de suporte metabólico, e. g., vitaminas e co-factores, conhecidos por serem necessários para função mitocondrial apropriada (que argumentam contra a atribuição de benefícios a um efeito de placebo, uma vez que há recorrência de sintomas quando é retirado o suporte de pirimidina) demonstra uma visão principal inesperada da invenção, que a deficiência de pirimidina funcional ou condicional subentende uma vasta variedade de sintomas dominantes em doentes com doenças mitocondriais e que a suplementação de pirimidina é suficiente para melhorar ou aperfeiçoar uma vasta variedade de sintomas nesses doentes. Até agora, os sintomas de doença mitocondrial foram atribuídos a deficiência de ATP, espécies de oxigénio reactivo produzidas pela cadeia respiratória defeituosa ou a morte celular despoletada por componentes mitocondriais da apoptose em série. A dose que limita a toxicidade de inibidores de síntese de pirimidina de novo são, tipicamente, devido a inibição de proliferação de tipos de células que se dividem rapidamente, como células de medula óssea e estaminais de mucosa do apêndice. De um modo inesperado, os benefícios terapêuticos de compostos e 27 métodos da invenção em doentes e animais experimentais foram demonstrados em tecidos compreendendo células pós-mitóticas que não se dividem, e. g. neurónios centrais e periféricos e músculo esquelético e cardíaco.

Uma característica importante da presente invenção é o resultado inesperado que o tratamento de doentes com doença mitocondrial provocada por uma variedade de defeitos moleculares subjacentes resulta numa melhoria clínica numa escolha diversa de sintomas in vivo em doentes (Exemplos 1-4). É siqnificativo e ainda inesperado que o benefício clínico tenha sido observado mesmo em doentes com actividade normal dos dois complexos (III e IV) de cadeia respiratória que estão directamente envolvidos nas transferências electrónicas, especificamente necessárias para biossíntese de pirimidina.

Além disso, é um aspecto importante e inesperado da invenção que doses superiores de precursores de nucleótidos de pirimidina da invenção sejam, tipicamente, necessárias para efeitos de tratamento óptimos em doentes com citopatias mitocondriais em vez de serem necessárias para tratamento adequado de doentes com um bloco virtualmente completo na síntese de pirimidina de novo, e. g., homozigotos para aciduria orótica de Tipo I. As doses óptimas de um composto da invenção, e. g., triacetiluridina (que é eficazmente absorvida após administração oral), para tratamento de doença mitocondrial congénita em crianças estão na gama de 1 a 6 gramas por m2 de área de superfície corporal (50 a 300 mg/kg, vantajosamente 100 a 300 mg/kg), enquanto o total diário de síntese de novo de pirimidinas é, aproximadamente, uma grama por dia em adultos (cerca de 0,5 g/m2) . 28 A vasta aplicabilidade dos métodos da invenção é inesperada e separa os compostos e composições da invenção de outras terapias de doença mitocondrial que foram tentadas, e. g., Coenzima Q, vitaminas B, carnitina e ácido lipóico, que, em geral, direccionam radiações muito especificas e co-factores envolvidos na função mitocondrial e que são, portanto, apenas úteis em casos isolados. No entanto, tais intervenções metabólicas com antioxidantes e co-factores de complexos de cadeia respiratória são compatíveis com tratamento simultâneo com compostos e composições da invenção e, de facto, são utilizadas para a sua melhor vantagem em combinação com compostos e composições da invenção.

Mitocôndrias e quimioterapia de cancro 0 ADN mitocondrial é, tipicamente, mais vulnerável a dano do que o ADN nuclear por várias razões: 1. 0 ADN mitocondrial possui um sistema de reparação menos sofisticado do que possui o ADN nuclear. 2. Virtualmente todas as cadeias de ADN mitocondrial codificam proteínas importantes, de modo que qualquer defeito irá potencialmente afectar a função mitocondrial. 0 ADN nuclear contém grandes regiões que não codificam proteínas, em que as mutações ou danos são essencialmente inconsequentes. 3. As mitocôndrias defeituosas possuem, frequentemente, uma vantagem de selecção sobre as activas, normais durante a proliferação e renovação. 29 4. 0 ADN mitocondrial nao está protegido por histonas

Empiricamente, o dano de ADN mitocondrial á mais extenso e persiste mais do que o dano de ADN em células submetidas a stress oxidativo ou a agentes quimioterápicos de cancro, como cisplatina, devido a superior vulnerabilidade e recuperação menos eficaz de ADN mitocondrial. Embora o ADN mitocondrial possa ser mais sensível a dano do que o ADN nuclear, é relativamente resistente, em algumas situações, para mutagénese por carcinógenos químicos. Isto deve -se às mitocôndrias responderem a alguns tipos de dano de ADN mitocondrial destruindo os seus genomas defeituosos em vez de tentarem repará-los. Isto resulta em disfunção mitocondrial global durante um período após quimioterapia citotóxica. A utilização clínica de agentes quimioterápicos, como cisplatina, mitomicina e citoxano é, frequentemente, acompanhada por "fadiga quimioterápica" debilitante, períodos prolongados de fraqueza e intolerância ao exercício que pode persistir mesmo após recuperação de toxicidades hematológicas e gastrointestinais de tais agentes.

Os compostos e composições da invenção são úteis para tratamento e prevenção de disfunção mitocondrial provocada por administração de quimioterapia de cancro citotóxica. Esta utilização de precursores de nucleótidos de pirimidina é mecânica e bioquimicamente distinta da redução de toxicidade de análogos de pirimidina anticancerígenos citotóxicos por precursores de nucleótidos de pirimidina, que é mediada apesar da competição bioquímica ao nível de antimetabolitos de nucleótido. 30 0 exemplo 5 ilustra o efeito protector de triacetiluridina oral na protecção contra neuropatia induzida por taxol.

Além disso, o estado redox mitocondrial hepático é uma contribuição para regulação do apetite. Os doentes de cancro apresentam, frequentemente, "saciedade antecipada", contribuindo para anorexia, perda de peso e caquexia. 0 metabolismo de energia é, frequentemente, gravemente interrompido em doentes de cancro, com ciclos infrutíferos de desperdício de energia de glicólise tumoral hiperactiva produzindo lactato circulante, que é convertido pelo fígado novamente a glucose. A lesão mitocondrial induzida por quimioterapia contribui, ainda, para interrupção metabólica.

Como indicado no Exemplo 2, o tratamento com um composto da invenção resultou em apetite melhorado num doente com doença mitocondrial.

Mltocôndrias e função ovariana

Uma função crucial do ovário é manter a integridade do genoma mitocondrial em oócitos, uma vez que as mitocôndrias passadas para um feto são todas derivadas das presentes nos oócitos no momento da concepção. As delecções no ADN mitocondrial tornam-se detectáveis em torno da idade da menopausa e estão, também, associadas com ciclos menstruais anormais. Uma vez que as células não podem detectar e responder directamente a defeitos no ADN mitocondrial, mas podem apenas detectar efeitos secundários que afectam o citoplasma, como respiração alterada, estado redox ou défices em síntese de pirimidina, tais produtos de função mitocondrial participam como 31 um sinal para selecção de oócito e atresia folicular, despoletando, ultimamente, a menopausa quando não pode mais ser garantida a manutenção de fidelidade genómica mitocondrial e a actividade funcional. Isto é análogo a apoptose em células com dano de ADN, que sofrem um processo activo de suicídio celular quando não pode ser mais conseguida fidelidade genómica por processos de reparação. Mulheres com citopatias mitocondriais que afectam os gónadas sofrem, frequentemente, de menopausa prematura ou apresentam anomalias de ciclo principal. A quimioterapia de cancro citotóxica induz, frequentemente, a menopausa prematura, com um consequente risco aumentado de osteoporose. A amenorreia induzida por quimioterapia é, em geral, devida a insuficiência ovariana principal. A incidência de amenorreia induzida por quimioterapia aumenta como uma função da idade em mulheres pré-menopausa que recebem quimioterapia, apontando em direcção ao envolvimento mitocondrial. Os inibidores de respiração mitocondrial ou de síntese proteica inibem a ovulação induzida por hormonas e, além disso, inibem a produção de hormonas esteróides ovarianas em resposta a gonadotropinas pituitárias. Mulheres com síndrome de Down, tipicamente, sofrem de menopausa prematuramente e estão, também, submetidas ao surgimento precoce de demências tipo Alzheimer. A baixa actividade de citocromo oxidase é consistentemente encontrada em tecidos de doentes de Down e em surgimento tardio de doença de Alzheimer. 0 suporte apropriado de função mitocondrial ou compensação para disfunção mitocondrial é, portanto, útil para protecção contra menopausa relacionada com a idade ou induzida por quimioterapia ou irregularidades do ciclo menstrual ou de ovulação. Os compostos e composições da invenção, incluindo também antioxidantes e co-factores mitocondriais, são úteis para 32 tratar e prevenir amenorreia, ovulação irregular, menopausa ou consequências secundárias de menopausa.

No Exemplo 1, o tratamento com um composto da invenção resultou em encurtamento do ciclo menstrual. Uma vez que o doente estava numa fase lútea permanente, a sua resposta indica que o precursor de nucleótido de pirimidina administrado inverteu a hiporreacção a gonadotropinas pituitárias, que eram presumivelmente elevadas para compensar para a hiporreacção ovariana de origem mitocondrial.

Diagnóstico de doença mitocondrial A resposta surpreendente de doentes com doença mitocondrial a administração de compostos da invenção indica que uma resposta clínica a um precursor de nucleótido de pirimidina administrado de acordo com os métodos da presente invenção, possui utilidade de diagnóstico para detectar possível doença mitocondrial. 0 diagnóstico molecular de lesões moleculares subjacentes a disfunção mitocondrial é difícil e dispendioso, especialmente quando o defeito não é uma das mutações ou delecções de ADN mitocondrial mais comuns. 0 diagnóstico definitivo de doença mitocondrial necessita, frequentemente, de biópsias musculares, mas mesmo esta medida invasiva apenas funciona se os defeitos mitocondriais estiverem presentes no músculo. Uma vez que os compostos e composições da invenção são seguros quando administrados de acordo com os métodos da presente invenção, o desafio terapêutico com um precursor de nucleótido de pirimidina é uma investigação de diagnóstico importante para presumível doença mitocondrial, especialmente quando utilizada em conjunto 33 com ensaios para vários outros aspectos de disfunção mitocondrial.

Para diagnóstico de citopatia mitocondrial congénita, são administradas doses diárias de 50 a 300 mg/kg de um precursor de nucleótido de pirimidina da invenção a um doente durante um período de uma a doze semanas e são monitorados sinais e sintomas clínicos para alterações. As melhorias observadas nos doentes descritos nos Exemplos e doentes adicionais incluem, mas não estão limitados a, redução de frequência e gravidade de convulsões, enxaquecas e episódio semelhantes a apoplexia, melhoria de ganho de peso em crianças com "insuficiência de desenvolvimento", melhoria de acidose tubular renal com redução simultânea na necessidade para bicarbonato suplementar, melhoria de resistência muscular, melhoria de aquisição de discurso, melhoria de ataxia, melhoria de hipotonia, redução da frequência e gravidade de infecções do sinus e de ouvido, melhoria de memória e melhoria de sintomas de neuropatia autónoma e periférica. Numa forma de realização da invenção, são também utilizados outros ensaios de função mitocondrial para proporcionar evidência para diagnóstico de doença mitocondrial. Tipicamente, o diagnóstico necessita de consideração cumulativa de uma série de ensaios corroborantes com diferentes graus de fiabilidade, como descrito em Walker et al., (Eur Neurol., 36:260-7, 1996). A reacção terapêutica a um precursor de nucleótido de pirimidina da invenção é principalmente útil como um critério menor adicional neste esquema de diagnóstico, uma vez que é possível que possam ocorrer benefícios terapêuticos após administração de precursores de nucleótidos de pirimidina que não sejam apenas mediados por compensação para défices de cadeia respiratória. Uma vez que a natureza e gravidade de sintomas de doenças mitocondriais são heterogéneas e variáveis 34 entre doentes, a eficácia de precursores de nucleótidos de pirimidina exógenos é, tipicamente, avaliada seleccionando sintomas dominantes num doente e monitorando a sua gravidade com uma escala tanto quantitativa como fiável durante um decurso de terapia. Se for presumível um possível efeito de placebo, a mudança cega do doente de fármaco para um placebo apropriado é, de um modo opcional, utilizado num individual doente. A avaliação de benefício clínico pode necessitar de experiência e aptidão considerável, mas tal aptidão está no campo dos praticantes da técnica de tratar doentes com doenças metabólicas multi-sistema e, como tal, não constitui experimentação indevida, com vista à gravidade desta classe de doenças. Os exemplos citados abaixo de tratamento clínico de doentes com doenças mitocondriais com triacetiluridina, um composto da invenção, exemplificam a possibilidade de determinar benefícios clínicos em doentes individuais. E. Administração e Formulação de Compostos e Composiçoes da

Invenção

No caso de todos os alvos terapêuticos específicos para terapia de precursor de nucleótido de pirimidina de doença mitocondrial, os compostos da invenção são, tipicamente, administrados uma a três vezes ao dia. Os derivados acilo de uridina e citidina são administrados oralmente em doses de 10 a 500 mg/kg de peso corporal por dia, com variações dentro desta gama dependendo da quantidade necessária para benefício clínico óptimo. Em geral, as doses óptimas estão entre 50 e 300 mg/kg/dia (vantajosamente, 100 a 300 mg/kg/dia), divididas em duas ou três doses separadas, tomadas separadas 6 a 12 horas. A uridina e a citidina são absorvidas menos eficazmente do que 35 são os derivados acilo deste dois nucleósidos, de modo que são necessárias doses superiores para beneficio terapêutico comparável ao conseguido com derivados acilo. A diarreia osmótica limita a quantidade de uridina ou citidina (ou de outros derivados como citidina difosfocolina) que pode ser administrada a um doente, de modo que, em muitos casos, os derivados acilo de citidina e uridina são mais eficazes do que os compostos progenitores, com poucos efeitos secundários. As doses de citidina e uridina utilizadas para atingir as finalidades da invenção variam de 50 a 1000 mg/kg/dia, vantajosamente, de 100 a 1000 mg/kg/dia, dependendo do equilíbrio entre eficácia e tolerabilidade terapêutica. O orotato ou ésteres alcoólicos de orotato são administrados oralmente em doses que variam de 20 a 200 mg/kg/dia, dependendo novamente da quantidade necessária para conseguir um efeito terapêutico óptimo num estado de doença particular envolvendo disfunção de cadeia respiratória mitocondrial. A dose de precursor de nucleótido de pirimidina da invenção necessária para uma doença ou doente particular irá também depender, em parte, da gravidade da doença.

Em qualquer doente individual com uma doença caracterizada ou provocada por disfunção mitocondrial é, tipicamente, determinada, de modo empírico, uma dose eficaz de um precursor de nucleótido de pirimidina da invenção. Em doenças mitocondriais congénitas, também conhecidas como citopatias mitocondriais ou encefalomiopatias mitocondriais, a apresentação clínica de sinais e sintomas é, em geral, heterogénea e variável entre doentes. O benefício clínico seguinte à administração de um composto da invenção é determinado monitorando um conjunto de sintomas e avaliando a sua gravidade ao longo do tempo, e. g., em intervalos mensais. São seleccionados três a cinco sintomas 36 dominantes para esta finalidade e o grau de melhoria apreciado para constituir benefício clínico é, frequentemente, um assunto de apreciação clínica. No tratamento de doentes com distúrbios metabólicos complexos, tal avaliação não constitui carga de experimentação indevida, especialmente dada a gravidade (muitas vezes, potencialmente fatal) de citopatias mitocondriais e a natureza dispendiosa do seu cuidado. A compensação para defeitos mitocondriais ou outros metabólicos, tão cedo quanto possível, na vida dos doentes pode fazer uma grande diferença versus intervenção após desenvolvimento do cérebro e do corpo atinge estase após puberdade. Portanto, vale a pena ser dispendido um esforço considerável no diagnóstico e tratamento de doenças metabólicas complexas, especialmente no desenvolvimento de crianças. Os exemplos citados abaixo de melhoria clínica seguinte à administração de um composto da invenção a doentes com doenças mitocondriais demonstra a tolerabilidade e valor de tal tratamento e avaliação.

No caso de muitas doenças com menos heterogeneidade na apresentação clínica do que a doença mitocondrial, existem, na técnica, escalas de avaliação validadas apropriadas para determinar a eficácia de tratamentos de fármacos. Antes de realizar estudos clínicos para determinar as doses de precursores de nucleótidos de pirimidina da invenção para tratamento dos estados de doença divulgados na presente descrição, são determinadas doses apropriadas para doentes individuais avaliando a resposta clínica (incluindo imagens RM cerebrais e outros índices, e. g., medições biomédicas, que podem não ser necessariamente clinicamente evidentes por observação dos sintomas do doente) de acordo com as escalas de avaliação de doença quantitativas. Em todos os casos, os sintomas dominantes de um estado de doença particular são 37 monitorados ao longo do tempo para determinar se ocorre uma melhoria de sinais e sintomas ou atenuação de agravamento clinico, uma vez gue é comum na prática de medicina. Antes da determinação de dose em estudos clinicos cegos, a resposta de um dado doente a um precursor de nucleótido de pirimidina da invenção é ser diferenciado de um possivel efeito de placebo simplesmente por mudança cega de fármaco para placebo durante um período de várias semanas.

No caso de doentes incapazes de receber medicações orais, podem ser administrados os compostos da invenção, especialmente uridina, citidina e ésteres de orotato, como necessário, por infusão intravenosa prolongada, distribuindo doses diárias de 10 a 500 mg/kg/dia.

Os compostos farmacologicamente activos são, de um modo opcional, combinados com veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados compreendendo excipientes e auxiliares que facilitam o processamento de compostos activos. Estes são administrados como comprimidos, suspensões, soluções, drageias, cápsulas ou supositórios. As composições são administradas, por exemplo, oralmente, rectalmente, vaginalmente ou libertadas através da bolsa bucal da boca e podem ser aplicadas em forma de solução por injecção, oralmente ou por administração tópica. As composições podem conter de cerca de 0,1 a 99 por cento, de um modo preferido, de cerca de 50 a 90 por cento do(s) composto(s) activo(s), em conjunto com o(s) excipiente (s) .

Para administração parentérica por injecção ou infusão intravenosa, os compostos activos são suspensos ou dissolvidos em meio aquoso, tais como água estéril ou solução salina. As soluções ou suspensões injectáveis contêm, de um modo opcional, 38 um agente tensioactivo, tais como ésteres de polioxietilenossorbitano, ésteres de sorbitano, éteres de polioxietileno ou agentes de solubilização, como propilenoglicol ou etanol. Tipicamente, a solução contém 0,01 a 5% dos compostos activos.

Os excipientes adequados incluem enchimento, tais como açúcares, por exemplo, lactose, sacarose, manitol ou sorbitol, preparações celulósicas e/ou fosfatos de cálcio, por exemplo, fosfato tricálcico ou hidrogenofosfato de cálcio, assim como ligantes, tais como pasta de amido, utilizando, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz ou amido de batata, gelatina, tragacanto, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, carboximetilcelulose sódica e/ou polivinilpirrolidona.

Os auxiliares incluem agentes reguladores de fluxo e lubrificantes, por exemplo, sílica, talco, ácido esteárico ou seus sais, tais como estearato de magnésio ou estearato de cálcio e/ou polietilenoglicol. Os núcleos de drageias são proporcionados com revestimentos adequados que, se desejado, são resistentes a sucos gástricos. Para esta finalidade, são utilizadas soluções de açúcar concentradas que contêm, de um modo opcional, goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, polietilenoglicol e/ou dióxido de titânio, soluções de verniz e solventes orgânicos ou misturas de solventes adequados. De modo a produzir revestimentos resistentes a sucos gástricos, são utilizadas soluções de preparações celulósicas adequadas, tais como ftalato de acetilcelulose ou ftalato de hidroxipropilmetilcelulose. Os corantes ou pigmentos são, de um modo opcional, adicionados aos revestimentos de comprimidos ou 39 para identificação ou de modo a drageias, por exemplo, caracterizar diferentes doses de composto.

As preparações farmacêuticas da presente invenção são fabricadas de um modo que é, ele próprio, conhecido, por exemplo, por meio de processos de mistura convencional, de granulação, de fabrico de drageias, de dissolução ou de liofilização. Deste modo, as preparações farmacêuticas para utilização oral são obtidas combinando o(s) composto(s) activo(s) com excipientes sólidos, de um modo opcional, moendo a mistura resultante e processando a mistura de grânulos, após adicionar auxiliares adequados, se desejado ou necessário, para obter núcleos de comprimidos ou drageias.

Outras preparações farmacêuticas que são úteis para distribuição oral incluem cápsulas duras feitas de gelatina, assim como cápsulas moles feitas de gelatina e de um agente plasticizante, tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas duras contêm o(s) composto(s) activo(s) na forma de grânulos que, de um modo opcional, são misturados com enchimentos, tais como lactose, ligantes, tais como amidos e/ou lubrificantes, tais como talco ou estearato de magnésio e, de um modo opcional, estabilizantes. Em cápsulas moles, os compostos activos são, de um modo preferido, dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, tais como óleos gordos, parafina líquida ou polietilenoglicóis. Além disso, de um modo opcional, são adicionados estabilizantes.

As preparações farmacêuticas que são utilizadas rectalmente incluem, por exemplo, supositórios que consistem de uma combinação de compostos activos com uma base de supositório. As bases de supositório adequadas são, por exemplo, triglicéridos 40 naturais ou sintéticos, hidrocarbonetos de parafina, polietilenoglicóis ou alcanóis superiores. Além disso, são úteis cápsulas de gelatina rectais que consistem de uma combinação dos compostos activos com uma base. Os materiais de base incluem, por exemplo, triglicéridos líquidos, polietilenoglicóis ou hidrocarbonetos de parafina. Noutra forma de realização da invenção, é utilizada uma formulação de clister que contém, de um modo opcional, excipientes que aumentam a viscosidade, como metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, carboximeticelulose, carbopol, poliacrilatos de glicerina ou outros hidrogéis.

As formulações adequadas para administração parentérica incluem soluções aquosas dos compostos activos em forma hidrossolúvel, por exemplo, sais hidrossolúveis.

Além disso, são administradas suspensões dos compostos activos, como apropriadas, em suspensões de injecção oleosa. Os solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos gordos, por exemplo, óleo de sésamo ou ésteres de ácido gordo sintéticos, por exemplo, oleato de etilo ou triglicéridos. As suspensões de injecção aquosa incluem, de um modo opcional, substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão que incluem, por exemplo, carboximetilcelulose sódica, sorbitol e/ou dextrano. De um modo opcional, a suspensão contém estabilizantes. F. Síntese dos Compostos da Invenção

Os derivados acilo de citidina e uridina são, tipicamente, sintetizados, por métodos de acilação envolvendo reacção de cloretos ácidos ou anidridos ácidos com citidina ou uridina. 41 A síntese de 2 ', 3 ', 5 '-tri-O-piruviluridina é mostrada no Exemplo 6.

Os seguintes exemplos são ilustrativos dos métodos e composições da presente invenção. Outras modificações e adaptações adequadas de uma variedade de estados e parâmetros normalmente encontrados na terapia clínica que são óbvias para o especialista na técnica estão dentro do espírito e âmbito desta invenção.

Exemplos

Exemplo 1: Tratamento de um distúrbio mitocondrial de multi-sistema com triacetiluridina

Uma mulher de 29 anos de idade com uma deficiência parcial de Complexo I e cujo filho foi diagnosticado com doença mitocondrial levando a episódios semelhantes a apoplexia, ataxia e encefalopatia, apresentados com um distúrbio mitocondrial de multi-sistema. Os sinais e sintomas incluíam enxaquecas hemiplégicas/afásicas, convulsões tipo grande mal, disfunção de bexiga e de intestino neurogénicos, necessitando de cateterização, aproximadamente, quatro vezes por dia, disfagia, polineuropatia autónoma e periférica produzindo dores parestesiais, síndrome de taquicardia/bradicardia e capacidade funcional fraca com incapacidade para subir um lance de escadas sem parar para descansar e desempenho cognitivo diminuído com episódios de sensorium nebuloso e fraca memória que dura de horas a dias. 42

Após iniciar o tratamento com 0,05 mg/kg/dia de triacetiluridina oral e durante uma duração de, pelo menos, 6 meses, esta doente não teve convulsões ou enxaquecas; as suas parestesias relacionadas com neuropatia periférica foram resolvidas. Ela está apta para anular espontaneamente na maioria dos dias, necessitando de cateterização apenas uma ou duas vezes por semana. Após 6 semanas de tratamento com triacetiluridina, este doente estava apto para caminhar uma milha inteira, a qual era incapaz de fazer durante os últimos dois anos devido a capacidade funcional inadequada. Os seus episódios de bradicardia durante o sono e taquicardia durante o esforço foram reduzidos em frequência; antes do tratamento, a taquicardia com uma batida cardíaca superior a 140 bpm ocorria após um simples levantar e, após 6 semanas de triacetiluridina, a taquicardia ocorreu apenas em subidas e escadas. O seu sensorium foi eliminado e os défices de memória melhoraram marcadamente.

Durante o tratamento, os ciclos menstruais desta doente encurtaram de 4 semanas para duas semanas e ela apresentou uma fase lútea permanente como avaliada por medições de estradiol, progesterona, FSH e LH. Após vários meses, o seu ciclo normalizou para 4 semanas.

Esta doente demonstrou características importantes da presente invenção, em que 1) o composto da invenção provocou melhorias em, virtualmente, todas as caracteristicas de uma doença de multi-sistema complexa doença relacionada com disfunção mitocondrial numa variedade de tecidos e 2) os compostos da invenção são, de um modo inesperado, úteis para tratar estados de doença relacionados com uma deficiência parcial de Complexo I, que afecta uma parte da cadeia respiratória mitocondrial que está fora da sequência de 43 transferências electrónicas directamente envolvida na biossintese de pirimidina de novo. 0 encurtamento temporário do ciclo menstrual desta doente é interpretado como uma melhoria na função ovariana provocada pela uridina triacetilo face a estimulação hormonal excessiva pela qual o sistema neuroendócrino tentou compensar a disfunção ovariana. A regeneração entre os ovários e o hipotálamo levou à normalização gradual do tempo de ciclo.

Exemplo 2: Tratamento de epilepsia refractária

Um rapaz de 11 anos de idade tinha epilepsia refractária desde os 4,5 anos de idade, aparentemente devido a um síndrome de delecção de ADN mitocondrial múltiplo. Em Dezembro de 1997, o seu estado deteriorou-se, incluindo duas entradas numa unidade de cuidados intensivos para epilepsia crescendo. Mesmo com regimes agressivos de terapia anticonviulsiva padrão, este doente estava a ter 8 a 10 convulsões tipo grande mal por noite, deixando-o incapaz de frequentar regularmente a escola ou de participar em actividades desportivas. Ele também desenvolveu automatismo de lábio superior.

Nos primeiros três dias após iniciar o tratamento com triacetiluridina oral (inicialmente numa dose de 0,05 g/kg/dia, e aumentando, incrementalmente, para 0,1 e depois 0,24 g/kg/dia ao longo do decurso de várias semanas), não existiram convulsões e cessaram os movimentos de lábio involuntários. Subsequentemente, existe alguma recorrência de convulsões especialmente durante episódios de infecção, embora numa frequência muito menor do que antes do tratamento com 44 triacetiluridina. Este doente foi capaz de voltar à escola e de breve participação activa em desportos. 0 seu apetite, função cognitiva e coordenação motora fina melhoraram durante a terapia, resultando em desempenho académico melhorado e num desempenho notável em actividades desportivas, como basebol.

Exemplo 3: Tratamento de acidose tubular renal

Uma menina de dois anos de idade, com Sindrome de Leigh (encefalopatia necrotizante subaguda) associado com grave deficiência de Complexo I, apresentou acidose tubular renal necessitando de administração intravenosa de 25 mEq por dia de bicarbonato de sódio. Várias horas após iniciar o tratamento intragástrico com triacetiluridina a 0,1 g/mg/dia, a sua acidose tubular renal resolveu-se e não foi mais necessário bicarbonato suplementar para normalizar o pH sanguíneo. A triacetiluridina também resultou em rápida normalização de concentrações de aminoácidos circulantes elevadas e manteve-se o ácido láctico a baixos níveis após supressão de tratamento de dicloroacetato, o qual foi anteriormente necessário para prevenir acidose láctica.

Exemplo 4: Tratamento de atraso de desenvolvimento

Uma menina de 4,5 anos de idade com epilepsia, ataxia, atraso na linguagem e intolerância a gordura e acidúria dicarboxílica foi tratada com triacetiluridina numa dose diária de 0,1 a 0,3 g/kg/dia. Tal tratamento resultou num declínio de 50% na frequência de convulsões, melhoria de ataxia e de coordenação motora, recuperação da tolerância a gordura 45 alimentar e desenvolvimento rapidamente acelerado de capacidades de linguagem expressivas.

Exemplo 5: Prevenção de neuropatia induzida por taxol A neuropatia periférica é um efeito secundário frequente e, frequentemente, limitante de dose, de agentes anticancerígenos importantes como cisplatina e taxol. No caso do taxol, a neuropatia sensorial ocorre vários dias após administração. 0 mecanismo de acção do Taxol envolve estabilização de microtúbulos, o que é útil para tratar cancros mas é prejudicial para neurónios periféricos. A estabilização de microtúbulos altera o transporte axonal de componentes celulares. As mitocôndrias alternam entre o organismo celular e os terminais de neurónios, de modo que pode ser regulada a expressão de componentes de cadeia respiratória mitocondrial por factores de transcrição nuclear. Durante a inibição de inversão mitocondrial, as mitocôndrias distantes do núcleo sofrem diminuição na expressão de subunidades de cadeia respiratória codificadas pelo genoma mitocondrial, devido a exposição inadequada a factores de transcrição de ADNmt, resultando numa insuficiência de energia neuronal regional e noutras consequências de disfunção mitocondrial.

Trataram-se dois grupos de 10 ratos cada com taxol, 21,6 mg/kg/dia, durante 6 dias consecutivos, por injecção intraperitoneal. Um grupo adicional de 10 ratos recebeu injecçóes de veiculo isolado. Um dos grupos de ratos tratados com taxol recebeu triacetiluridina oral, 4000 mg/kg b.i.d. Nove dias após a iniciação de tratamentos de taxol, foram testados défices sensoriais nociceptivos determinando a latência de 46 estímulo de cauda após exposição da ponta da cauda a radiação térmica focada com uma lâmpada de calor infra—vermelha. Neste sistema, correlacionam—se atrasos na resposta de estímulo de cauda a calor radiante com défices nervosos sensoriais.

Grupo: Controlo (sem taxol) Taxol Taxol + triacetiluridina

Latência de estimulo de cauda 10.8 ± 0,5 segundos 16,0 ±3,1 segundos 11.9 ± 0,7 segundos O tratamento de taxol alterou respostas a estímulos de dor como um índice de neuropatia sensorial tóxica. O tratamento de triacetiluridina oral atenua, de um modo significativo, as alterações induzidas por taxol na latência de estímulo de cauda.

Exemplo 6: Síntese de Uridina Piruvato A. A preparação de cloreto de piruvilo foi conseguida pela reacção de éter metílico alfa, alfa-diclorometílico e ácido pirúvico utilizando o processo de Ottenheum e Man (Synthesis, 1975, p. 163) . B. Secou-se Uridina (3,0 g, 12 mmol) por azeótropo de tolueno sob vácuo (3x) e, em seguida, dissolveu-se em DMF (20 mL) e piridina (20 mL). A solução resultante foi arrefecida para -10 graus °C e adicionaram-se, gota a gota, 6,0 mL de cloreto de piruvilo (produzido no passo A acima). A mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente sob árgon, durante 24 horas. A análise por TLC (5% MeOH/CH2Cl2) mostrou o consumo de uridina. A mistura reaccional foi evaporada até secar e dividida em partes 47 entre CH2CI2 e bicarbonato de sódio aquoso. A camada orgânica foi lavada com água, HC1 aquoso (pH 3,0) e água; secou-se sobre sulfato de sódio; concentrou-se; e purificou-se utilizando cromatografia flash (silicagel, 5% MeOH/CH2Cl2) para produzir 1,4 g de piruvato de uridina ou 2',3',5'-tri-O-piruviluridina.

Exemplo 7: Efeito terapêutico de triacetiluridina oral no modelo MPTP de doença de Parkinson (PD) e disfunção mitocondrial A neurotoxina 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetra-hidropiridina (MPTP) é um inibidor de cadeia respiratória mitocondrial de complexo I (NADH desidrogenase) que é utilizada para induzir perda celular dopaminérgica (Varastet et al., Neuroscience, 63: 47-56,1994). Esta toxina é, actualmente, vastamente utilizada como um modelo animal para PD (Bezard et al., Exp Neurol, 148: 288-92, 1997) .

Utilizaram-se ratos macho C57/BL6 que tinham 6-9 meses de idade pesando 30-40 g de Taconic Farms nos estudos de MPTP (n=7/grupo). A MPTP (30 mg/kg i.p.) foi dada b.i.d. durante 1,5 dias. O TAU foi administrado b.i.d. 4g/kg p.o. em veiculo de hidroxipropilmetilcelulose a 0,75% a 200 mg TAU/mL de solução, 2 horas antes da administração de toxina e até ao dia antes da morte.

Oito dias após para a injecção de MPTP, os ratos foram mortos por C02 e dissecaram-se os estriados de ambos os lados em superfície fria. O estriado foi congelado em gelo seco. A sobrevivência neuronal dopaminérgica foi avaliada pelo teor de dopamina estriatal (DA) . O teor de dopamina foi avaliado por um método radioenzimático sob condições GLP, mas a DA pode também 48 ser medida utilizando cromatografia liquida de alta eficiência com delecção electroquímica como anteriormente descrito (Friedemann & Gerhardt, Neurobiol Aqinq, 13: 325-32, 1992). Existe uma mortalidade diminuída nos ratos tratados com MPTP devido ao tratamento de TAU. A mortalidade nos ratos controlo + MPTP foi de 71,4% comparada com 28,6% no grupo de tratamento TAU + MPTP. Existe também um efeito neuroprotector de tratamento PN401 na diminuição em teor de DA devido a MPTP. são representados como ng de proteína (média ± SEM).

Efeito de TAU na diminuição estriatal

Tratamento Controlo + Controlo TAU + Controlo Controlo + MPTP TAU + MPTP *0s dados DA/ mg

induzida por MPTP no teor de DA DA Estriatal * 147 ± 13,0 93,8± 10,7 9,2 ± 2,2 37,9 ± 7,4

Realizou-se um segundo estudo utilizando MPTP (25 mg/kg i.p. b.i.d. durante 2 dias). Utilizaram-se ratos macho C57/BL6 que tinham 6-9 meses de idade pesando 30-40 g de Taconic Farms nos estudos de MPTP (n=6/grupo). A MPTP (30 mg/kg i.p.) foi dada b.i.d. durante 2 dias. O TAU foi administrado b.i.d. 4g/kg p.o. em veículo de hidroxipropilmetilcelulose a 0,75% a 200 mg TAU/mL de solução, 2 horas antes da administração de toxina e até ao dia antes da morte. O TAU ou veículo foi dado oralmente (dose de TAU = 4g/kg em peso b.i.d.) iniciando no dia antes da administração de MPTP e terminando no dia 8. Os ratos foram mortos no dia 9. Este estudo também demonstrou que o TAU mostrou 49 efeitos protectores nos neurónios dopaminérgicos como indicado por uma diminuição atenuada na perda de DA estriatal devida a MPTP. representados (média ± SEM).

Efeito de TAU na diminuição estriatal

Tratamento Controlo + Controlo TAU + Controlo Controlo + MPTP TAU + MPTP *os dados são proteína DA/mg

induzida por MPTP no teor de DA DA Estriatal * 71.0 ± 10,6 52.0 ±3,0 15,9 ± 2,2 26,7 ± 0,9 como ng de

Exemplo Ilustrativo 8: Efeito terapêutico de TAU no modelo de ácido 3-nitropropiónico (3NP) de doença de Huntington (HD) A HD é caracterizada por uma perda neuronal progressiva especialmente no estriado. Os doentes com HD possuem uma actividade diminuída de actividade de succinato desidrogenase (complexo II) - ubiquinol oxiredutase (complexo III). Browne, Mithocondria & Free Radicais in Neurodegenerative Diseases, 361-380 (1997). Um modelo vastamente utilizado de HD emprega um inibidor de succinato desidrogenase, ácido 3-nitropropiónico (3NP). (Ferrante et al., Mithocondria & Free Radicais in Neurodegenerative Diseases, 229-244, 1997). Ο 3NP induz dano ao estriado, em particular. (Brouillet et ai., J Neurochem, 60: 356-9, 1993) . 50

Trataram-se ratos Suíços machos de 6-8 meses de idade (National Câncer Institute; NCI, Frederick, MD) com 3NP (65 mg/kg i.p.) diariamente, durante 4 dias, para induzir mortalidade, perda celular neuronal e alteração de comportamento com n=8/grupo. 0 TAU foi administrado b.i.d. 4 g/kg p.o. em veículo de hidroxipropilmetilcelulose a 0,75% a 200 mg TAU/mL foi dado aos ratos um dia antes e todos os dias até ao dia 8. No dia 9, os ratos foram fixados por perfusão com formalina tamponada a 10% e processados para coloração prata para detectar dano neuronal. Existe uma mortalidade diminuída devido a 3NP nos ratos tratados com TAU comparado aos controlos como mostrado abaixo. Não existe mortalidade no grupo 3NP + TAU, mas morreram 3 de 8 ratos no grupo veículo + 3NP. A classificação do comportamento dos ratos tratados com 3NP foi para determinar se existia qualquer alteração motora em qualquer momento durante o estudo. Existiam 88% dos ratos tratados com controlo + 3NP com alteração comportamental indicada por observação total. Verificou-se uma incidência diminuída de alteração de apenas 50% nos ratos tratados com TAU + 3NP. A coloração prata foi analisada por um patologista desconhecedor da identidade das amostras de tecido. Não existem sinais claros de dano neuronal detectados nos ratos tratados com TAU + 3NP. No entanto, nos ratos tratados com controlo + 3NP, era pronunciada a coloração prata dos terminais sinápticos na área estriatal (área de cauda/putamen) e substantia nigra. A impregnação prata de terminais de axónios e/ou sinápticos no tálamo, mesencéfalo profundo e/ou formação reticular (medula) foi também verificada em 80% dos ratos tratados com controlo + 3NP. A substantia nigra projecta para o estriado e 51 estas áreas são especialmente vulneráveis a dano por 3NP. 0 dano à substantia nigra e estriado foi prevenido por TAU.

Exemplo Ilustrativo 9: Efeito terapêutico de TAU no modelo ácido 3-nitropropiónico (3NP) de epilepsia 0 ácido 3-nitropropiónico (3NP) é uma toxina mitocondrial que actua inibindo o Complexo II da cadeia respiratória; é utilizado para induzir lesões cerebrais semelhantes às caracteristicas da doença de Huntington. As convulsões podem também ser induzidas pela utilização do 3NP como um modelo de epilepsia e disfunção mitocondrial. Urbanska et al., Eur J Pharmacol, 359: 55-8 (1998). Os ratos macho CD-I (National Câncer Institute, NCI, Frederick. MD) pesando entre 26-40 g foram utilizados por completo. Os ratos foram divididos em grupos de 5 e foram aleatoriamente escolhidos, de diferentes gaiolas, animais para cada grupo, para evitar possível influência da idade. Os animais foram mantidos num ciclo claro escuro de 12 h com livre acesso a água e comida. Todas as experiências foram realizadas durante o período de luz entre as 9:00 e 16:00 h. Os ratos (n=17-20) receberam 160 mg/kg de 3NP e seguiram-se convulsões. O 3NP foi feito a 16 mg ou 18 mg/mL em água estéril (pH: 7,4). O 3NP foi administrado i.p. num volume de 0,1 mL/10 g de peso corporal. O TAU foi administrado 4 g/kg p.o. em veículo de hidroxipropilmetilcelulose a 0,75% 2 horas antes da administração de 3NP. As convulsões foram avaliadas semelhantes aos métodos anteriormente descritos (Roberts & Keith, J Pharmacol Exp Ther, 270: 505-11, 1994; Urbanska et al., Eur J Pharmacol, 359: 55-8, 1998). 52

Realizaram-se observações comportamentais nos 120 min seguintes à aplicação de 3-NP. Três categorias principais de resposta de epilepsia foram consideradas e registadas: 1. Movimentos clónicos: os movimentos dos membros anteriores acompanhados por espasmo facial; 2. Movimentos clónicos explosivos: o movimento de todos os quatro membros envolvendo correr, pular e saltar; 3. Resposta tónica: incluindo flexão tónica e extensão tónica de todos os quatro membros. A taxa de mortalidade foi avaliada a 120 min após injecção de 3NP. 0 3NP induziu principalmente convulsões clónicas com alguns ratos a desenvolver um comportamento de correr e pular que, em geral, resultou em mortalidade. O TAU diminui a percentagem de incidência de convulsão clónica, convulsão de corrida e mortalidade devido a 3NP. O principal objectivo foi a latência a convulsão clónica. O TAU aumentou a latência a convulsão clónica de 25,0-40,8 minutos. Os dados são representados como média ± SEM.

Controlo + 3NP 90,0 42,9 35 23,8 ±0,7 TAU + 3NP 70,6 5,9 11, 8 40,8 ± 4, 9 objectivo % de convulsões clónicas % de convulsões de corrida % Mortalidade

Latência a convulsão clónica 53

Exemplo Ilustrativo 10; Efeito terapêutico de TAU no modelo de ácido quinolínico (AQ) de excitotoxicidade O ácido quinolínico é um agonista receptor de NMDA que tem sido utilizado em modelos de doença de Huntington e dano excitotóxico (Beal et al., J Neurosci, 11: 1649-59, 1991; Beal et al. , J Neurosci, 11: 147-58, 1991; Ferrante et al., Exp

Neurol, 119: 46-71, 1993). Pode induzir-se dano grave ao SNC quando administrado directamente no estriado. O dano e/ou mortalidade devido a AQ intraestriatal é semelhante devido a uma etiologia de SNC.

Trataram-se ratos Suíços machos de 6-8 meses de idade (National Câncer Institute; NCI, Frederick, MD) com AQ (50 ou 100 nmoles dadas bilateralmente em ambos os estriados n=8/grupo. O TAU foi administrado b.i.d. 4 g/kg p.o. em veículo de hidroxipropilmetilcelulose a 0,75% a 200 mg TAU/mL foi dado aos ratos um dia antes e todos os dias até ao dia 6. No dia 7 os

ratos foram mortos. O AQ foi administrado num volume de 2 pL como anteriormente descrito (Tatter et al., Neuroreport, 6: 1125-9, 1995) .

Existiu uma mortalidade diminuída devido ao AQ no rato tratado com TAU. A percentagem de ratos que sobreviveram aos 7 dias tratados com 50 nmoles de AQ foi de 64% no AQ de controlo T e de 73% no TAU + AQ e para ratos tratados com 100 nmoles de AQ apenas 4% sobrevieram no grupo controlo + AQ, enquanto 19% sobreviveram no grupo TAU + AQ. O TAU demonstrou um efeito neuroprotector na excitotoxicidade devido a AQ.

Embora a presente invenção tenha sido descrita em termos de formas de realização preferidas, entende-se que irão ocorrer 54 variações e modificações para os especialistas na Portanto, pretende-se que as reivindicações anexas todas essas variações e modificações equivalentes que dentro do âmbito da invenção como reivindicado.

Lisboa, 25 de Outubro de 2012 técnica. abranjam estejam 55

Claims (13)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um precursor de nucleótido de pirimidina para o fabrico de um medicamento para tratar ou prevenir consequências patofisiológicas de disfunção de cadeia respiratória mitocondrial num mamífero, em que a referida disfunção de cadeia respiratória é provocada por administração de agentes quimioterapêuticos de cancro citotóxicos ao referido mamífero; em que o referido precursor de nucleótido de pirimidina é seleccionado do grupo consistindo de uridina, citidina, um derivado acilo de uridina, um derivado acilo de citidina, ácido orótico, um éster alcoólico de ácido orótico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
2. 2. Utilização de acordo com a Reivindicação 1, em que o referido medicamento é formulado para proporcionar 0,05 a 0,3 gramas do referido precursor por quilograma de peso corporal por dia.
3. 3. Utilização como precursor de nuc! de citidina.
4. 4. Utilização como precursor de nuc! de uridina.
5. 5. Utilização como derivado acilo de na reivindicação 1, eótido de pirimidina na reivindicação 1, eótido de pirimidina na reivindicação 1, uridina é 2 ',3 ',5 '-tr em que o referido é um derivado acilo em que o referido é um derivado acilo em que o referido i-O-acetiluridina. 1
6. 6. Utilização como na reivindicação 1, em que o referido derivado acilo de uridina é 2', 3', 5'-tri-O-piruviluridina.
7. 7. Utilização como na reivindicação 1, em que o substituinte alcoólico do referido éster alcoólico de ácido orótico é etanol.
8. 8. Utilização como na reivindicação 1, em que o referido precursor de nucleótido de pirimidina é citidina difosfocolina.
9. 9. Utilização como na reivindicação 1, em que o referido medicamento é formulado para administração oral.
10. 10. Utilização como na reivindicação 1, em que o referido medicamento é formulado para proporcionar uma dose de 100 a 300 miligramas do referido precursor por quilograma de peso corporal por dia.
11. 11. Composto seleccionado do grupo consistindo de 2 ',3',5'-tri-O-piruviluridina, 2',3'-di-O-piruviluridina, 2',5'-di-O- piruviluridina, 3',5'-di-O-piruviluridina, 2'-O-piruviluridina, 3'-O-piruviluridina e 5'-O-piruviluridina.
12. 12. Utilização de um precursor de nucleótido de pirimidina para o fabrico de um medicamento para tratar ou prevenir uma doença mitocondrial congénita seleccionada do grupo consistindo de MELAS, LHON, MERRF, MNGIE, NARP, PEO, Doença de Leigh e Síndrome de Keams-Sayres num mamífero, em que o referido precursor de nucleótido de pirimidina é 2 seleccionado do grupo consistindo de uridina, citidina, um derivado acilo de uridina, um derivado acilo de citidina, ácido orótico, um éster alcoólico de ácido orótico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
13. 13. Utilização como na reivindicação 12, em que o referido precursor de nucleótido de pirimidina é 2',3',5'-tri-O-acetiluridina. Lisboa, 25 de Outubro de 2012 3