PL91810B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza- aaia a-galaktozydazy.

Odrzucana dotychczas melasa, otrzymana po od¬ zyskaniu sacharozy z buraków cukrowych, mimo faktu, ze okolo 50% sacharozy pozostawalo nadal w melasie, byla stosowana jako surowiec do fer¬ mentacji alkoholowej lub jako karma. Przyczyna, dla której sacharoza, pozostajaca w melasie, nie moze byc odzyskana w przystepny sposób jest fakt, ze rafinoza obecna w melasie przeszkadza* normalnej krystalizacji sacharozy. Hydroliza rafi¬ nozy w melasie przy uzyciu a-galaktozydazy umoz¬ liwia wyeliminowanie dzialania rafinozy, zaklóca¬ jacego krystalizacje cukru, co powoduje wzrost wydajnosci cukru buraczanego. Ponadto, poniewaz a-galaktozydaza rozklada rafinoze na sacharoze i galaktoze, okolo 2/3 rozlozonej rafinozy odzysku¬ je sie w postaci sacharozy.

Znane sa sposoby otrzymywania a-galaktozyda¬ zy z drozdzy, lecz a-galaktozydaza, otrzymana ty¬ mi sposobami, jest droga i. zawiera inwertaze, wskutek czego produkt ten stoscwac mozna je± dynie do celów analitycznych, a nie do prze¬ myslowej produkcji cukru z buraków.

W pracach nad hydroliza rafinozy w soku lub melasie buraczanej przy zastosowaniu a-galakto¬ zydazy, wytworzonej przez mikroorganizmy, udalo sie wyodrebnic z gleby mikroorganizm, który wy¬ twarza a-galaktozydaze, a prawie zupelnie nie wytwarza inwertazy. 2 Stwierdzono równiez mozliwosc wielokrotnego zastosowania grzybni, zawierajacej a-galaktozyda¬ ze, do rozkladu rafinozy w róznych szarzach soku buraczanego lub melasy buraczanej.

Stwierdzono, ze, gdy omówiony wyzej mikro¬ organizm zaszczepi sie i hoduje wf, srodowisku syntetycznym, zawierajacym pozywke, to wytwo¬ rzona zostaje a-galaktozydaza, przy czym znacz¬ na jej czesc pozostaje w grzybni mikroorganizmu.

Opracowano sposób wytwarzania a-galaktozydazy wewnatrzkomórkowo przez dodanie do srodowiska, zawierajacego laktoze, galaktoze, melibioze lub galaktoze, otrab ryzowych, makuch rzepakowych, mielonego stodu, slodu kukurydzy, soku kukury¬ dzianego lub ich ekstraktów.

Mikroorganizm, stosowany w sposobie wedlug wynalazku, wyodrebniono z gleby w miescie Chiba w Japonii, przy czym .jego wlasnosci morfologicz¬ ne odpowiadaja wlasnosciom plesni Mortierella vi- nacea, odkrytej przez Dixona-Stewarta (Manual of Soil Fungi, Gilman, wydanie drugie, The Iowa State Collega Press-Ames, Iowa, U.S.A.), przy czym mikroorganizm wytwarza a-galaktozydaze, ale pra¬ wie nie wytwarza inwertazy. Odmianie tej na¬ dano nazwe Mortierella vinacea var. raffinoseuti- lizer i zostala ona zdeponowana w Stanach Zjed¬ noczonych Ameryki w American-Type Culture Col- lection pod numerem ATCC Nr 20034.

Wlasnosci Mortierella vinacea var. raffinoseuti- lizer przedstawiaja sie nastepujaco: 9181091810 3 Mikroskopowe obserwacje owocnika, wyhodo¬ wanego na podlozu agarowym ekstraktu slodu, ujawnily rozgalezienia zarodni o srednicy 3—4//, jasno-brazowe zarodnie prawie kuliste o srednicy —20ii i nie zawierajace szyjki slupka oraz nie- 5 regularnie kanciaste zarodniki o wymiarach 2,7— —5a.

Mikroskopowe obserwacje plesni w róznych sro¬ dowiskach agarowych pozwolily na ustalenie na¬ stepujacych cech: 10 — agar z ekstraktem slodu: grzybnia ma wyglad gestej plesni i zmienia kolor od bialego do jasno brazowego lub ciem¬ no pomaranczowego w miare dojrzewania za¬ rodników. Nie wytwarza rozpuszczalnego barw- 15 nika w srodowisku, — agar ziemniaczario-glukozowy: grzybnia zmienia kolor od bialego do jasno brazowego w miare dojrzewania zarodników.

Nie wytwarza rozpuszczalnego barwnika w sro- 20 dowisku, — agar z ekstraktem drozdzy i ekstraktem slodu: grzybnia zmienia kolor od bialego do bezowego w miare dojrzewania zarodników. Nie wytwa¬ rza rozpuszczalnego barwnika w srodowisku. 25 a-galaktozydaze wytwarza sie z dobrym wyni¬ kiem w komórce plesni Mortierella vinacea var. raffinoseutilizer jezeli plesn te zaszczepia sie w srodowisku, zawierajacym laktoze, galaktozydaze, melibioze lub rafinoze z dodatkiem otrab ryzo- 30 wych, makuch rzepakowych, mielonego slodu, slo¬ du kukurydzy lub soku z kukurydzy lub wyciagu któregos z powyzszych sladników, hodujac ja w temperaturze okolo 30°C.

Grzybnie, zawierajaca wytworzona a-galaktozy- 35 daze lub a-galaktozydaze, wydzielona i wyekstra¬ howana ze srodowiska znanym sposobem, dodaje sie do soku buraczanego lub melasy buraczanej, ustalajac wartosc pH na 3—7 i prowadzi sie fer¬ mentacje w temperaturze 20—70°C. Rafinoza, któ¬ ra hamuje formowanie sie krysztalów sacharozy, rozklada sie, i dzieki temu zwieksza sie ilosc krysztalów sacharozy. Ponadto, poniewaz rafinoza rozklada sie na galaktoze i sacharoze, wydajnosc sacharozy wydatnie zwieksza sie.

Przyklady I—V przedstawiaja sposoby wytwa¬ rzania a-galaktozydazy w plesni, a przyklady VI—X przedstawiaja sposoby rozkladu rafinozy w melasie buraczanej przy uzyciu a-galaktozydazy, wytworzonej w grzybni. 50 Pomiary aktywnosci a-galaktozydazy dokonywa¬ no wedlug nizej podanego sposobu.

Wywoluje sie enzymatyczna reakcje w tempe¬ raturze 40°C w ciagu 2 godzin przez dodanie 1 ml zawiesiny grzybni do mieszaniny 0,5 ml 0,06 M, 55 melibiozy i 0,5 ml 0,1 M fosforanowego roztworu buforowego o wartosci pH = 5,2, nastepnie otrzy¬ muje sie mieszanine reakcyjna w ciagu 5 minut we wrzacej wodzie w celu dezaktywacji a-galakto¬ zydazy i dodaje 1 ml 1,8% Ba(OH)2 * 8H20 oraz $q 1 ml 2% ZnS04 • 7H20. Po rozwarstwieniu mie¬ szaniny na wirówce ustala sie ilosciowo glukoze w cieczy. Aktywnosc a-galaktozydazy, która po¬ woduje wytworzenie 1 /ug glukozy w tych warun¬ kach reakcji, okreslona jest jako jednostka od- 65 40 45 niesienia. Poniewaz ilosc uwolnionej glukozy i ste¬ zenia enzymu sa zwiazane liniowa zaleznoscia, az do ilosci 1000 jug glukozy, koncentracje roz¬ tworu enzymu ustala sie przez rozcienczenie do ilosci enzymu w zakresie wymienionej wyzej za¬ leznosci, nastepnie przeprowadza sie reakcje enzy¬ matyczna, a w 'koncu mnozy ilosc uwolnionej glu¬ kozy przez wielokrotnosc rozcienczenia.

Przyklad I. Zarodniki plesni Mortierella vi- nacea var. raifinoseutilizer zaszczepiono w srodo¬ wisku, skladajacym sie z 0,1 M buforowego roz¬ tworu fosforanowego o wartosci pH = 6,0, hodo¬ wano w temperaturze 30°C w ciagu 72 godzin, w srodowisku nastepujacej mieszaniny; weglowo¬ dany 0,2%, peptony 0,3%, ekstrakt miesny 0,3%, KC1 0,2%, MgS04-7H20 0,2%.

Po zakonczeniu hodowli w ustalonym czasie od¬ dzielono grzybnie przez odsaczenie, przemyto ja dokladnie woda i roztarto w mozdzierzu lacznie z piaskiem morskim na paste. Nastepnie uzupel¬ niono woda destylowana do pierwotnej objetosci, to jest objetosci zawieszonej grzybni przed odsa¬ czeniem.

Aktywnosc enzymu podano w tabeli I. Dotyczy ona aktywnosci a-galaktozydazy grzybni, zebranej z 1 ml tego srodowiska w odniesieniu do róznych weglowodanów.

Tabela I Rodzaj weglowodanu Ksyloza Arabinoza Ramnoza Glukoza Mannoza Fruktoza Galaktoza Maltoza Celobioza Laktoza Melibioza Sacharoza Rafinoza f Rozpuszczalna skrobia Dekstran Jednostki a-G w grzybni 0 0 0 0 0 1013 4 0 3426 1776 0 2250 0 0 | Jak widac z powyzszej tabeli, galaktoza, rafi¬ noza, melibioza i laktoza skutecznie powodowaly tworzenie sie a-galaktozydazy w grzybni plesni Mortierella vinacea var. raffinoseutilizer.

Przyklad II. 0,1 M buforowy roztwór fosfo¬ ranowy o wartosci pH = 6,0, zawierajacy 1,5% laktozy, 1% glukozy, 0,3% mocznika, 0,2% siar¬ czanu magnezu i 0,2% chlorku potasu, przygoto¬ wano jako srodowisko zasadnicze. Do tego sro¬ dowiska w oddzielnych próbach dodano substan¬ cje wymienione w tabeli II, kazda w ilosci 3%, przygotowujac srodowisko hodowli, które nastep¬ nie zaszczepiono plesnia Mortierella vinacea var. raffinoseutilizer i prowadzono hodowle w tempe¬ raturze 30°C w ciagu 72 godzin na wstrzasarce.

Po zakonczeniu hodowli calosc produktu przesa¬ czono, oddzielajac grzybnie, która nastepnie po przemyciu woda roztarto w mozdzierzu z piaskiem91810 morskim na paste. Z pasty przygotowano zawie¬ sine przez dodanie destylowanej wody w uzupel¬ niajacej ilosci do wyjsciowej objetosci srodowiska i zawiesine zastosowano jako ciecz enzymatyczna.

Jednostki a-galaktozydazy, podane w tabeli II, przedstawiaja aktywnosc a-galaktozydazy w grzyb¬ ni, zebranej z 1 ml srodowiska.

Tabela II Substancja Otreby pszeniczne Placek rybny Makuch sojowy Otreby ryzowe Makuch rzepakowy Kukurydza Slód Mielony slód Wytloki browarnicze Namok kukurydzy Jednostki a-G 9453 276 70 32350 17381 39616 33920 29984 365 25880 Przyklad III. Do srodowiska zasadniczego, przygotowanego w sposób, jak podano w przykla¬ dzie II, dodawano przesacz, otrzymany z ekstraktu otrab ryzowych goraca woda lub tez przesacz, poddany dzialaniu amylazy i po dodaniu bakte¬ ryjnej a-arnylazy oraz po przeprowadzeniu reak¬ cji enzymatycznej do momentu uzyskania ujem¬ nej reakcji z jodem. Ilosc odpowiedniego przesa¬ czu wynosila 3% w stosunku do ilosci otrab ryzo¬ wych. Plesn Mortierella vinacea var. raffinoseuti- lizer hodowano w sposób, opisany w przykladzie II i oceniano aktywnosc enzymatyczna w grzybni.

Otrzymane wyniki przedstawia tabela III.

Tabela III Substancja Otreby ryzowe, nie poddane obróbce Przesacz, otrzymany z eks¬ traktu otrab ryzowych przy uzyciu goracej wcdy Przesacz ekstraktu otrab ry¬ zowych, poddany dzialaniu a-amylazy Jednostki a-G 32191 34495 38250 Przyklad IV. Jako zasadnicze srodowisko uzyto 0,1 M buforowy roztwór fosforanowy o war¬ tosci pH = 6,0, zawierajacy 1,5% laktozy, 3% otrab ryzowych, 0,3% mocznika, 0,2% siarczanu magnezu i 0,2% chlorku potasu, do którego do¬ dawano odpowiednio 0,2%, 0,5% i 1% proszkowa¬ nego ekstraktu slodu w celu przygotowania sro¬ dowiska hodowli. Hodowle prowadzono w sposób, jak opisano w przykladzie II i oceniano aktyw¬ nosc a-galaktozydclzy w grzybni. Aktywnosc enzy¬ matyczna wynosila: 27806 jednostek ze srodowiska zasadniczego, 29634 jednostek ze srodowiska z 0,2% ekstraktu slodu, 35577 jednostek ze srodowiska z 0,5% ekstraktu slodu oraz 43349 jednostek ze srodowiska z 1% ekstraktu slodu. 50 55 Przyklad V. W 1 1 wody rozpuszczono 100 g laktozy, 100 g glukozy, 100 g namoku kukurydzy, IDO g siarczanu amonu, 30 g KH2P04, 30 g Mg S04 • 7H20, 20 g NaCl i 100 g CaCOa. Otrzymany roztwór umieszczono w kadzi fermentacyjnej i po sterylizacji w temperaturze 120°C w ciagu 30 mi¬ nut, ochlodzono do 30°C. Nastepnie przy uzyciu sterylizowanej -wody rozcienczono roztwór do lacz¬ nej objetosci 10 1 i zaszczepiono zarodnikami plesni Mortierella yinacea var. raffinoseutilizer, prowa¬ dzac hodowle w temperaturze 30°C przy szybkosci mieszania 200 obrotów na minute i napowietrzaniu z szybkoscia 5 1 na minute. Wyniki hodowli przed¬ stawiono w tabeli IV.

Tabela IV Czas hodowli (godz.) PH Ciezar suchej grzybni mg/ /100 ml srodo¬ wiska Jednostki a-G 24 6,4 1,165 2670 48 6,3 1,539 11260 72 6,3 1,789 26600 77 6,3 1,852 33650. 90 6,5 1,801 33010 | Przyklad VI. 0,1 M fosforanowy roztwór buforowy, zawierajacy 0,75% laktozy, 2% glukozy, 1,8% peptonu, 1,8% ekstraktu miesnego, 0,2% siar¬ czanu magnezu i 0,2% chlorku potasu zaszczepiono plesnia Mortierella yinacea var. raffinoseutilizer i hodowano ja, wstrzasajac w ciagu 72 godzin.

Po zakonczeniu hodowli grzybnie odsaczono, prze¬ myto dokladnie woda i odwazono okreslona na- wazke w celu uzycia jej jako enzymu. Ilosc pow¬ stalego a-G 3500 jednostek na 1 ml przesaczu sro¬ dowiska i 28400 jednostek w grzybni, zebranej z 1 ml srodowiska.

Z drugiej ¦ strony do 10 g melasy buraczanej, o zawartosci rafinozy 1,088 g, dodano kwasu siar¬ kowego do uzyskania pH srodowiska wartosci 5,2, a nastepnie dodano 0,1 M fosforanowego roztworu buforowego o wartosci pH = 5,2 i rozcienczono woda do 20° Brixa.

Do tak przygotowanej rozcienczonej melasy bu¬ raczanej dodano grzybnie, wytworzona ze 100 ml srodowiska i przeprowadzano proces enzymatyczny w temperaturze 50°C w ciagu 24 godzin z wstrza¬ saniem. W otrzymanym przesaczu zmierzono w sposób ilosciowy- ilosc sacharozy i zwiekszona ilosc sacharozy elucyjna metoda chromatografii bibulo¬ wej. Przy uzyciu grzybni o aktywnosci enzyma¬ tycznej 450000 stopien rozkladu rafinozy i przy¬ rost ilosci sacharozy wynosily odpowiednio 70,4% i 364 mg, a przy uzyciu grzybni o aktywnosci enzymatycznej równej 900.000 jednostek, wynosily odpowiednio 81,5% i 544 mg.

Przyklad VII. Plesn hodowano w warun- 60 kach, jak opisano w przykladzie VI, stosujac ta¬ kie same ilosci grzybni jako enzym.

Z drugiej strony- do 10 g melasy buraczanej o zawartosci rafinozy, 1,088 g dodano kwasu siar¬ kowego oraz fosforanowego roztworu buforowego 65 o wartosci pH = 5,2 i rozcienczono mieszanine do91810 8 36° Brixa. Nastepnie do rozcienczonej melasy bu¬ raczanej dodano 1.700.000 jednostek enzymu i prze¬ prowadzono reakcje enzymatyczna w temperatu¬ rze 37°C, w ciagu 24 godzin z potrzasaniem. Po zakonczeniu reakcji, mieszanine reakcyjna prze¬ saczono i w przesaczu zmierzono stopien rozkladu rafinozy oraz przyrost ilosci sacharozy. Po doklad¬ nym przemyciu grzybni woda próbowano stosowac grzybnie powtórnie w róznych rozcienczonych roz¬ tworach melasy buraczanej, posiadajacej ten sam uklad. Wyniki, uzyskane po trzykrotnym uzyciu grzybni, przedstawia tabela V.

Tabela V Krotnosc stosowania grzybni 1 2 1 - ,3 Przyrost ilosci sacharozy mg 372 426 390 Rozklad rafinozy % 67,3 72,7 67,3 Koncowa aktywnosc a-G % | 98 84 55 Przyklad VIII. Plesn hodowano w srodowi¬ sku o. tym samym skladzie, jak w przykladzie VI.

Grzybnie zhomogenizowano w homogenizatorze, a nastepnie rozrywano komórki w ciagu 1 godziny przy uzyciu generatora ultradzwiekowego o cze¬ stotliwosci 10 kilocyklów. Zniszczona grzybnie od¬ wirowano w celu oddzielenia cieczy od osadu i oznaczono aktywnosc a-G w kazdej czesci.

Stwierdzono, ze aktywnosc enzymatyczna w cie¬ czy wynosila 39%, a w osadzie 61%. Nastepnie przeprowadzono rozklad rafinozy, stosujac 1.750.000 jednostek wymienionego osadu jako enzymu, w sposób, jak w przykladzie VII. Otrzymane wy¬ niki przedstawiono w tabeli VI.

Tabela VI Krotnosc 1 stosowana grzybni 1 2 1 3 Przyrost ilosci sacharozy mg 262 244 244 Rozklad rafinozy % 67,3 65,4 50,9 Koncowa aktywnosc a-G % 61 44 29 Rozklad rafinozy wykonano takze przez zateze- nie przesaczu pod zmniejszonym cisnieniem, do¬ danie 1.750.000 jednostek a-G do 10 g melasy bu¬ raczanej o zawartosci rafinozy 1,088 g nastawienie otrzymanej mieszaniny do wartosci pH = 5,2 oraz stezenie 36° Brixa,. stosujac odpowiednio wode i kwas siarkowy, a nastepnie pozostawienie mie¬ szaniny w ciagu 24 godzin, w temperaturze 37°C.

Stwierdzono, ze stopien rozkladu rafinozy wyno¬ sil 65,3%, a przyrost ilosci sacharozy 260 mg.

Przyklad IX. Przygotowano srodowisko, za¬ wierajace 1,5% laktozy, 0,5% glukozy, 1% namoku kukurydzy, 0,1% mocznika, 0,1% siarczanu amonu, 0,3% KH2P04, 0,2% MgS04-7H20 i 0,2% NaCl, na¬ stepnie po sterylizacji zaszczepiono srodowisko 40 45 56 GO zarodnikami plesni i hodowano w temperaturze °C w ciagu 72 godzin. Stwierdzono, ze liczba jednostek a-G w grzybni, zebranej z 1 ml srodo¬ wiska, wynosila 28.000.

Z drugiej strony 10 g melasy buraczanej o za¬ wartosci rafinozy 1,088 g rozcienczono woda do ° Brixa i nastawiono do wartosci pH = 5,2, sto¬ sujac kwas siarkowy. Do rozcienczonego roztworu melasy buraczanej dodano grzybnie o zawartosci 980.000 jednostek a-G i przeprowadzono reakcje enzymatyczna odpowiednio w temperaturze 20°C, °C, 40°C, 50°C, 60°C i 70°C w ciagu 24 godzin z potrzasaniem, a nastepnie mierzono stopien przemiany rafinozy. Otrzymane wyniki zestawiono w tabeli VII.

Tabela VII Temperatura reakcji | °C 40 50 60 70 Stopien rozkladu rafinozy % 42,1 * 78,2 80,1 83,5 78,0 53,9 Przeprowadzono równiez reakcje enzymatyczna rozcienczonej 10 g melasy buraczanej o zawar¬ tosci rafinozy 1.088 g roztworem Mcylvaine'a do ° Brixa, przy odpowiednich wartosciach pH = 2,2; 3; 4; 5; 6; 7 i 8, dodajac 980.000 jednostek grzybni i wytrzasajac otrzymany roztwór w temperaturze 50°C w ciagu 6 godzin. Stopien rafinozy przedsta¬ wia tabela VIII.

Tabela VIII pH mieszaniny reakcyjnej 2,2 3 4 6 7 8 Stopien rozkladu rafinozy % 11,0 61,2 80,5 80,7 51,9 38,1 12,0 Przyklad X. 10 g melasy buraczanej o za¬ wartosci rafinozy 1.088 g rozcienczono woda do ° Brixa i doprowadzono pH do wartosci 5,2 kwa¬ sem siarkowym. Do otrzymanego roztworu do¬ dano 980.000 jednostek tej samej grzybni, jaka stosowano w przykladzie IX', i przeprowadzono reakcje enzymatyczna w temperaturze 50°C w cia¬ gu 5 godzin z potrzasaniem. Nastepnie grzybnie przemyto . dokladnie woda i dodano do róznych rozcienczonych melas buraczanych, majacych ten sam sklad, jak powyzej w celu przeprowadzenia rozkladu rafinozy kilkakrotnie w warunkach ta¬ kich samych, jak powyzej. Wyniki, otrzymane podczas trzykrotnego stosowania, podano w ta¬ beli IX.91 810 9 10 Tabela IX *

Claims (2)

Zastrzezenia patentowe Krotnosc stosowania grzybni 1 2 3 Rozklad rafinozy % 77,3 74,6 65,3 Koncowa aktywnosc a-G '% 79,4 66,6 58,3

1. Sposób wytwarzania cc-galaktozydazy przez hodowle mikroorganizmu, znamienny tym, ze ho¬ duje sie plesn Mortierella vinacea var. raffinoseu- tilizer ATTCC 20034 w srodowisku, zawierajacym pozywke, w temperaturze 30°C.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako pozywke stosuje sie laktoze, galaktóze, me- libioze lub rafinoze.