Sposób rozkladu rafinozy przy pomocy a-galaktozydazy Przedmiotem wynalazku jest sposób rozkladu rafinozy na galaktoze i sacharoze przy pomocy a-galaktozydazy.Ogólnie znane jest, ze rafinoza hamuje proces krystalizacji sacharozy.Odrzucana dotychczas melasa, otrzymana po odzyskaniu sacharozy z buraków cukrowych, mi¬ mo faktu, ze okolo 50% sacharozy pozostawalo nadal w melasie, byla stosowana jako surowiec do fermentacji alkoholowej lub jako karma. Przy¬ czyna, dla której sacharoza, pozostajaca w mela¬ sie, nie moze byc odzyskana w przystepny sposób jest fakt, ze rafinoza obecna w melasie przeszka¬ dza normalnej krystalizacji sacharozy. Hydroliza rafinozy w melasie przy uzyciu a-G umozliwia usuniecie dzialania rafinozy, wstrzymujacego kry¬ stalizacje cukru, co powoduje wzrost wydajnosci cukru buraczanego. Ponadto poniewaz a-G roz¬ klada rafinoze na sacharoze i galaktoze, okolo 2/3 rozlozonej rafinozy odzyskuje sie w postaci sa¬ charozy.Znane sa sposoby otrzymywania a-G z drozdzy, lecz a-G,; otrzymana tymi sposobami, jest droga 'i zawiera inwertaze, wskutek czego produkt ten stosowac mozna jedynie do celów analitycznych a nie do przemyslowej produkcji cukru z bura¬ ków. 1 Glówny cel wynalazku to zwiekszenie wydaj¬ nosci cukru buraczanego przez rozklad rafinozy, znajdujacej sie w soku buraczanym lub w mela- 10 15 20 25 30 sie buraczanej. Cel wynalazku zostal osiagniety przez rozklad rafinozy przy uzyciu grzybni plesni Mortierella vinacea var. raffinoseutilizer, która zawiera wytworzona w niej a-G lub przy uzyciu a-G, wydzielonej z tej grzybni.W pracach nad hydroliza rafinozy w soku lub melasie buraczanej przy zastosowaniu a-G, wy¬ tworzonej przez mikroorganizmy, udalo sie wyod¬ rebnic z gleby plesn, która wytwarza a-G, a pra¬ wie zupelnie nie wytwarza inwertazy.Stwierdzono równiez mozliwosc wielokrotnego zastosowania grzybni, zawierajacej a-G do roz¬ kladu rafinozy w róznych szarzach soku bura¬ czanego lub melasy buraczanej.Stwierdzono, ze gdy omówiona wyzej plesn za¬ szczepi sie i hoduje w srodowisku syntetycznym, zawierajacym okreslona pozywke to wytworzona zostaje a-G, przy czym znaczna jej czesc pozo¬ staje w grzybni. Opracowano sposób wytwarza¬ nia a-G wewnatrzkomórkowo przez dodanie do srodowsika, zawierajacego laktoze otrab ryzo¬ wych, makuch rzepakowych, mielonego slodu, slo¬ du kukurydzy, soku kukurydzianego lub ich eks¬ traktów.Plesn stosowana w sposobie wedlug wynalazku wyodrebniono z gleby w miescie Chiba w Ja¬ ponii. Wlasnosci morfologiczne tej plesni odpo¬ wiadaja wlasnosciom plesni Mortierella vinacea okrytej przez Dixona-Stewarta (Manual of Soil Fungi, Gilman, wydanie drugie, The Iowa State 79 2873 Collega Press-Ames, Iowa, USA), przy czym plesn ta wytwarza a-G, ale prawie nie wytwarza in- wertazy. Odmianie tej nadano nazwe Mortierella vinacea var. raffinoseutilizer i zostala ona zde¬ ponowana w Stanach Zjednoczonych Ameryki w American-Type Kulture Collection pod numerem ATCC Nr 20034.Wlasnosci Mortierella vinacea var. raffinoseu¬ tilizer przedstawiaja sie nastepujaco: Mikroskopowe obserwacje owocnika wyhodowa¬ nego na podlozu agarowym ekstraktu slodu ujaw¬ nily rozgalezienia zarodni o srednicy 3—4 ja, jasno- Jbrazowe zarodnie prawie kuliste o srednicy 10— 20 \i i nie zawierajace szyjki slupka oraz niere¬ gularnie kanciaste zarodniki o wymiarach 2,7— 5 [i.Makroskopowe obserwacje plesni w róznych srodowiskach agarowych pozwolily na ustalenie nastejpiujacych cech: — agar z ekstraktem slodu: grzyibnia* ma wyglad gestej plesni i zmienia ko¬ lor c$d .bialego do jasno brazowego lub ciemno- pomaitanczowego w miare dojrzewania zarodni¬ ków. Nie wytwarza rozpuszczalnego barwnika w srodowisku, — agar ziemniaczano-glukozowy: grzybnia zmienia kolor od bialego do jasno bra¬ zowego w miare dojrzewania zarodników. Nie wytwarza rozpuszczalnego barwnika w srodo¬ wisku, — agar z ekstraktem drozdzy i ekstraktem slodu: grzybnia zmienia kolor od bialego do bezowego w miare dojrzewania zarodników. Nie wytwarza rozpuszczalnego barwnika w srodowisku.Alfa-G wytwarza sie z dobrym wynikiem w komórce plesni Mortierella vinacea var. raffino¬ seutilizer, jezeli plesn te zaszczepia sie w srodo¬ wisku, zawierajacym laktoze z dodatkiem otrab ryzowych, makuch rzepakowych, mielonego slodu, slodu kukurydzy, soku z kukurydzy lub wyciagu któregos z powyzszych skladników, hodujac ja w temperaturze okolo 30°C.Komórki, zawierajace wytwarzana a-G lub a-G z nich wydzielona i wyekstrahowana ze srodo¬ wiska znanym sposobem, dodaje sie do soku bu¬ raczanego lub melasy buraczanej, ustalajac war¬ tosc pH na 3—7 i prowadzi sie fermentacje w temperaturze 20—70°C.Czas reakcji zalezy od ilosci dodanej a-G. Jesli komórki plesni dodaje sie w takiej ilosci, ze za¬ wartosc a-G wynosi 900.000 jednostek na 1 g ra¬ finozy zawartej w soku buraczanym lub melasie buraczanej, okolo 80% rafinozy rozklada sie na galaktoze i sacharoze w ciagu 5—6 godzin.W sposobie wedlug wynalazku, rafinoza, która hamuje formowanie sie krysztalów sacharozy, rozklada sie i dzieki temu zwieksza sie ilosc krysztalów sacharozy. Ponadto, poniewaz rafinoza "rozklada sie na galaktoze i sacharoze, wydajnosc "sacharozy wydatnie zwieksza sie.Przyklady I—V przedstawiaja sposoby wytwa¬ rzania a-G w plesni, a przyklady VI—X przed¬ stawiaja sposoby rozkladu rafinozy w melasie buraczanej przy uzyciu a-G wytworzonej w grzybni. 287 4 Pomiary aktywnosci a-G dokonywano wedlug nizej podanego sposobu.Wywoluje sie enzymatyczna reakcje w tempe¬ raturze 40°C w ciagu 2 godzin przez dodanie 5 1 ml zawiesiny grzybni do mieszaniny 0,5 ml 0,06 M, melibiozy i 0,5 ml 0,1 M fosforanowego roztworu buforowego o wartosci pH = 5,2, na¬ stepnie otrzymuje sie mieszanine reakcyjna w ciagu 5 minut we wrzacej wodzie w celu dezakty- 10 wacji a-G i dodaje 1 ml l,8°/o Be(OH)2 • 8H20 oraz 1 ml 2°/o ZnSC4 • 7H2O. Po rozwarstwieniu mieszaniny na centryfudze ustala sie ilosciowo glukoze w cieczy. Aktywnosc a-G, która powo¬ duje wytworzenie 1 \ig glukozy w tych warun- 5 kach reakcji, okreslona jes£ jako jednostka od¬ niesienia. Poniewaz ilosc uwolnionej glukozy i stezenia enzymu sa zwiazane liniowa zaleznos¬ cia, az do ilosci 1000 \ig glukozy, koncentracje roztworu enzymu ustala sie przez rozcienczenie * do ilosci enzymu w zakresie wymienionej wyzej zaleznosci, nastepnie przeprowadza sie reakcje enzymatyczna, a w koncu mnozy ilosc uwolnio¬ nej glukozy przez wielokrotnosc rozcienczenia.Przyklad I. Zarodniki plesni Mortierella a5 vinacea var. raffinoseutilizer zaszczepiono w sro¬ dowisku, skladajacym sie z 0,1 M buforowego roztworu fosforanowego o wartosci pH = 6,0 i ho¬ dowano w temperaturze 30°C w ciagu 72 godzin, w srodowisku nastepujacej mieszaniny: weglo- 30 wodany 0,2%, peptony 0,3%, ekstrakt miesny 0,3% KC1 0,2%, MgS04 • 7H2O 0,2%.Po zakonczeniu hodowli w ustalonym czasie oddzielono grzybnie przez odsaczanie, przemyto ja dokladnie woda i roztarto w mozdzierzu lacz- 35 nie z piaskiem morskim na paste. Nastepnie uzu¬ pelniono woda destylowana do pierwotnej obje¬ tosci to jest objetosci zawieszonej grzybni przed odsaczeniem.Aktywnosc enzymu podano w tabeli I. Dotyczy <° ona aktywnosci a-G grzybni, zebranej z 1 ml te¬ go srodowiska w odniesieniu do róznych weglo¬ wodanów.Tabela I Rodzaj weglowodanu Ksyloza Arabinoza Ramnoza Glukoza Mannoza Fruktoza Galaktoza Maltoza Galobioza Laktoza Melibioza Sacharoza Rafinoza Rozpuszczalna skrobia Dekstran Jednostki a-G w grzybni 0 0 0 0 5 0 1013 4 0 3426 1776 0 2250 0 1 0 Jak widac z powyzszej tabeli, galaktoza, rafi¬ noza, melibioza i laktoza skutecznie powodowaly tworzenie sie a-G w grzybni plesni. Mortierella vinacea var. raffinoseutilizer.79287 Przyklad II. 0,1 M buforowy roztwór fosfo¬ ranowy o wartosci pH = 6,0, zawierajacy l,5°/o laktozy, l°/o glukozy, 0,3°/o mocznika, 0,2f/o siar¬ czanu magnezu i 0,2% chlorku potasu przygoto¬ wano jako srodowisko zasadnicze. Do tego sro¬ dowiska, w oddzielnych próbach dodano substan¬ cje, wymienione w tabeli II, kazda w ilosci 3°/o, przygotowujac srodowisko hodowli, które nastep¬ nie zaszczepiono plesnia Mortierella vinacea var. raffinoseutilizer i prowadzono hodowle w tempe¬ raturze 30°C w ciagu 72 godzin na wstrzasarce.Po zakonczeniu hodowli calosc produktu przesa¬ czono, oddzielajac grzybnie, która nastepnie po przemyciu woda roztarto w mozdzierzu z piaskiem morskim na paste. Z pasty przygotowano zawie¬ sine przez dodanie destylowanej wody w uzupel¬ niajacej ilosci do wyjsciowej objetosci srodowiska i zawiesine zastosowano jako ciecz enzymatyczna.Jednostki a-G podane w tabeli II przedstawiaja aktywnosc a-G w grzybni, zebranej z 1 ml sro¬ dowiska.Tabela II Substancja Otreby pszeniczne Placek rybny Makuch sojowy Otreby ryzowe Makuch rzepakowy Kukurydza Slód Mielony slód Wytloki browarnicze 1 Namok kukurydzy Jednostki a-G 9453 276 70 32350 17381 39616 33920 29984 365 25880 | Przyklad III. Do srodowiska zasadniczego, przygotowanego w sposób, jak podano w przy¬ kladzie Ii; dodawano przesacz otrzymany z eks¬ traktu otrab ryzowych goraca woda lub tez prze¬ sacz poddany dzialaniu amylazy i po dodaniu bakteryjnej a-amylazy oraz po przeprowadzeniu reakcji enzymatycznej do momentu uzyskania ujemnej reakcji z jodem. Ilosc odpowiedniego przesaczu wynosila 3°/o w stosunku do ilosci otrab ryzowych. Plesn Mortierella vinacea var. raffino¬ seutilizer hodowano w sposób opisany w przy¬ kladzie II i oceniano aktywnosc enzymatyczna w grzybni. Otrzymane wyniki przedstawia tabela III.Tabela III 10 15 Substancja Otreby ryzowe, nie podda¬ ne obróbce Przesacz otrzymany z eks¬ traktu otrab ryzowych przy uzyciu goracej wody Przesacz ekstraktu otrab ryzowych poddany dzialaniu 1 a-amylazy Jednostki a-G 32191 34495 38250 35 45 Przyklad IV. Jako zasadnicze srodowisko uzyto 0,1 M buforowy roztwór fosforanowy o wartosci pH — 6,0, zawierajacy 1,5^/t laktozy, 3^/t otrab ryzowych, 0,39/o mocznika, 0,2°/t siarczanu magnezu i 0,2*/e chlorku potasu, do którego do¬ dawano odpowiednio 0,2°/«, 0,59/t i l°/o proszkowa¬ nego ekstraktu slodu w celu przygotowania sro¬ dowiska hodowli. Hodowanie prowadzono w spo¬ sób, jak opisano w przykladzie II i oceniano aktywnosc a-D-G w grzybni. Aktywnosc enzyma¬ tyczna wynosila: 27806 jednostek ze srodowiska zasadniczego, 29634 jednostek ze srodowiska z a0,2°/o ekstraktu slodu, 35577 jednostek ze srodo¬ wiska z 0,5°/o ekstraktu slodu oraz 43349 jedno¬ stek ze srodowiska z l*/o ekstraktu slodu.Przyklad V. W 1 1 wody rozpuszczono 100 g laktozy, 100 g glukozy, 100 g namoku ku¬ kurydzy, 100 g siarczanu amonu, 30 g KH2PO4, 30 g MgS04 • 7H2O, 20 g NaCl i 100 g CaCOs.Otrzymany roztwór umieszczono w kadzi fermen¬ tacyjnej i po sterylizacji w temperaturze 120°C W ciagu 30 minut, ochlodzono do 30°C. Nastepnie przy uzyciu sterylizowanej wody rozcienczono roz¬ twór do lacznej objetosci 10 1 i zaszczepiono za¬ rodnikami plesni, Mortierella vinacea var. raffi¬ noseutilizer prowadzac hodowle w temperaturze 30°C przy szybkosci mieszania 200 obrotów na minute i napowietrzaniu z szybkoscia 5 1 na mi¬ nute. Wyniki hodowli przedstawiono w tabeli IV.Czas hodowli (godz.) pH Ciezar suchej grzybni, mg/100 ml srodowiska Jednostki a-G Tabela IV 24 6,4 1,165 2670 48 6,3 1,539 : 11260 72 6,3 1,789 26600 77 6,3 1,852 33650 90 6,5 1,801 33010 Przyklad VI. 0,1 M fosforanowy roztwór buforowy, zawierajacy 0,75°/o laktozy, 2!°/o gluko¬ zy, l,8°/o peptonu, 1,8% ekstraktu miesnego, 0,2d/o siarczanu magnezu i 0,2°/o chlorku potasu zaszcze¬ piono plesnia Mortierella vinacea var. raffino¬ seutilizer i hodowano ja wstrzasajac w ciagu 72 godzin. Po zakonczeniu hodowli grzybnie odsa¬ czono przemyto dokladnie woda i odwazono okreslona nawazke w celu uzycia jej jako enzy¬ mu. Ilosc powstalego a-G wynosila 3500 jedno¬ stek na 1 ml przesaczu srodowiska i 28400 jed¬ nostek w grzybni, zebranej z 1 ml srodowiska.Z drugiej strony do 10 g melasy buraczanej, 55 65 o zawartosci rafinozy 1,088 g, dodano kwasil siar¬ kowego do uzyskania pH srodowisk wartosci 5,2, a nastepnie dodano 0,1 M fosforanowego roztwo¬ ru buforowego o wartosci pH = 5,2 i rozcienczono woda do 20° Brixa.Do tak przygotowanej rozcienczonej melasy bu¬ raczanej dodano grzybnie, wytworzona ze 100 ml srodowiska, i przeprowadzono proces enzymatycz¬ ny w temperaturze 50°C w ciagu 24 godzin z wstrzasaniem. W otrzymanym przesaczu zmierzo¬ no w sposób ilosciowy ilosc sacharozy i zwiekszo¬ na ilosc sacharozy elucyjna metoda chromato¬ grafii bibulowej. Przy uzyciu grzybni o aktyw- \79287 7 8 nosci enzymatycznej 450000 stopien rozkladu ra- finozy i przyrost ilosci sacharozy wynosily odpo¬ wiednio 70,49/o i 364 mg, a przy uzyciu grzybni o aktywnosci enzymatycznej równej 900.000 jed¬ nostek, wynosily odpowiednio 81,5§/« i 544 mg.P r z y k l a kach, jak opisano w przykladzie VI, stosujac ta¬ kie same ilosci grzybni jako enzym.Z drugiej strony do 10 g melasy buraczanej o zawartosci rafinozy, 1,088 g dodano kwasu siar¬ kowego oraz fosforanowego roztworu buforowego o wartosci pH = 5,2 i rozcienczono mieszanine do 36° Brira. Nastepnie do rozcienczonej melasy bu¬ raczanej dodano 1.700.000 jednostek enzymu i prze¬ prowadzono reakcje enzymatyczna w temperatu¬ rze 37°C, w ciagu 24 godzin z potrzasaniem. Po zakonczeniu reakcji, mieszanine reakcyjna prze¬ saczono i w przesaczu zmierzono stopien rozkladu rafinozy oraz przyrost ilosci sacharozy. Po do¬ kladnym przemyciu grzybni woda próbowano sto¬ sowac grzybnie powtórnie w róznych rozcienczo¬ nych roztworach melasy buraczanej, posiadajacej ten sam uklad. Wyniki uzyskane po trzykrotnym uzyciu grzybni przedstawia tabela V.Tabela V Krotnosc stosowania grzybni ¦¦¦* 2 Przyrost ilosci sacharozy mg 372 426 aon Rozklad rafinozy •/• 67,3 72,7 «7 9 Koncowa aktywnosc a-G •/§ 98 84 Rozklad rafinozy wykonywano takze przez za- tezenie przesaczu pod zmniejszonym cisnieniem, dodanie 1.750.000 jednostek a-G do 10 g melasy buraczanej o zawartosci rafinozy 1,088 g nasta¬ wienie otrzymanej mieszaniny do wartosci pH = = 5,2 oraz stezenie 36° Brixa, stosujac odpowied¬ nio wode i kwas siarkowy, a nastepnie pozosta¬ wienie mieszaniny w ciagu 24 godzin, w tempe¬ raturze 37°C. Stwierdzono, ze stopien rozkladu rafinozy wynosil G5&ht a przyrost ilosci sacha¬ rozy 260 mg.Przyklad IX. Przygotowano srodowisko, za¬ wierajace l,5§/§ laktozy, 0,5*/o glukozy, l°/o namoku kukurydzy, 0,lf/o mocznika, 0,l°/o siarczanu amonu, 0,3*/o KH2PO4, 0,2«/t MgS04'7H20 i 0,2»/o NaCl, nastepnie po sterylizacji zaszczepiono srodowisko zarodnikami plesni i hodowano w temperaturze 30ÓC w ciagu 72 godzin. Stwierdzono, ze liczba jednostek a-G w grzybni zebranej z 1 ml srodo¬ wiska wynosila 28.000.Z drugiej strony 10 g melasy buraczanej o za¬ wartosci rafinozy 1,088 g rozcienczono woda do 15° Brixa i nastawiono do wartosci pH = 5,2, sto¬ sujac kwas siarkowy. Do rozcienczonego roztworu melasy buraczanej dodano grzybnie o zawartosci 980.000 jednostek a-G i przeprowadzono reakcje enzymatyczna odpowiednio w temperaturze 20°C, 30°C, 40°C, 50°C, 60°C i 70°C w ciagu 24 godzin z potrzasaniem, a nastepnie mierzono stopien przemiany rafinozy. Otrzymane wyniki zestawio¬ no w tabeli VII.Tabela VII Temperatura reakcji °C 20 30 40 50 60 70 Stopien rozkladu] rafinozy §/o 42,1 78,2 80,1 83,5 78,0 53,9 Przeprowadzono równiez reakcje enzymatyczna rozcienczonej 10 g melasy buraczanej o zawar¬ tosci rafinozy 1,088 g roztworem Mcllvaine'a do 15° Brixa, przy odpowiednich wartosciach pH = = 2,2; 3; 4; 5; 6; 7 i 8, dodajac 980.000 jednostek grzybni i wytrzasajac otrzymany roztwór w tem¬ peraturze 50°C w ciagu 6 godzin. Stopien rozkla¬ du rafinozy przedstawia tabela VIII.Tabela VIII pH mieszaniny 1 reakcyjnej 1 2,2 3 4 5 6 7 1 8 Stopien rozkladu rafinozy f/o 1 11,0 61,2 80,5 80,7 51,9 38,1 12,0 1 Przyklad X. 10 g melasy buraczanej o za¬ wartosci rafinozy 1,088 g rozcienczono woda do 15° Brixa i doprowadzono pH do wartosci 5,2 kwasem siarkowym. Do otrzymanego roztworu dodano 980.000 jednostek tej samej grzybni, jako stosowano w przykladzie IX, i przeprowadzono reakcje enzymatyczna w temperaturze 50°C w ciagu 5 godzin z potrzasaniem. Nastepnie grzyb¬ nie przemyto dokladnie woda i dodano do róz¬ nych rozcienczonych melas buraczanych, majacych 10 15 20 u- 25 30 35 40 45 50 55 60 • Przyklad VIII. Plesn hodowano w srodo- 35 wisku o tym samym skladzie, jak w przykladzie VI. Grzybnie zhomogenizowano w homogenizato- rze, a nastepnie rozrywano komórki w ciagu 1 go¬ dziny przy uzyciu generatora ultradzwiekowego o czestotliwosci 10 kilocyklów. Zniszczona grzyb- 40 nie odwirowano w celu oddzielenia cieczy od osa¬ du i oznaczono aktywnosc a-G w kazdej czesci.Stwierdzono, ze aktywnosc enzymatyczna w cie¬ czy wynosila 39*/o, a w osadzie 61e/o. Nastepnie przeprowadzono rozklad rafinozy, stosujac 1.750.000 45 jednostek wymienionego osadu jako enzymu, w sposób jak w przykladzie VII. Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli VI.Krotnosc stosowania grzybni 1 Tabe Przyrost ilosci sacharozy mg 5ft2 la VI Rozklad rafinozy •/o fi? a Koncowa aktywnosc a-G, •/# «1 55 Tabela VI Krotnosc stosowania grzybni 1 2 3 Przyrost ilosci sacharozy mg 262 244 244 Rozklad rafinozy •/o 67,3 65,4 50,9 Koncowa aktywnosc a-G, •/# 61 44 2970 287 9 10 ten sam sklad, jak powyzej w celu przeprowa¬ dzenia rozkladu rafinozy kilkakrotnie w warun¬ kach takich samych, jak powyzej. Wyniki otrzy¬ mane podczas trzykrotnego stosowania podano w tabeli IX.Tabela IX Krotnosc stosowana grzybni 1 2 3 Rozklad rafinozy °/o 77,3 74,6 65,3 Koncowa 1 aktywnosc a-G •/• 79,4 66,6 58,3 PL