SU461513A3 - Способ получени -галактозидазы - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ

св зь, вызывают образование L-галактозидазы в мицелии плесени, причем лактоза наиболее эффективна.

Пример 2. 1/10 М фосфатной буферной смеси (рН 6,0), содержащей, %: 1,5 лактозы, 1 глюкозы, 0,3 мочевины, 0,2 сульфата магни  и 0,2 хлористого кали , приготовл ют в качестве основной среды, к которой прибавл ют вещества, перечисленные в табл. 2, каждое в количестве 3% дл  приготовлени  культуральной среды, которую затем инокулируют плесенью и культивируют при 30°С в течение 72 час при встр хивании. Мицелий затем отфильтровывают , тщательно промывают водой и измельчают в ступке с морским песком в пасту. Паста превращаетс  в суспензию при добавлении дистиллированной воды, количество которой равно количеству среды. Суспензию испытывают на ферментативную активность .

Табл. 2 иллюстрирует активность L-галактозидазы в мицелии, вз том из 1 мл проб нескольких сред.

Таблица 2

Единицы

L-галактозиСырье

дазы

9453

и

276

70

32350 I738I 39616 33920 29984 365 25880

ти после замочки

Пример 3. Приготавливают порции культуральной среды из основной среды (описанной в примере 2) и следующих веществ: рисовых отрубей, отфильтрованного экстракта, приготовленного из рисовых отрубей и гор чей воды, продукта реакции между фильтратом , приготовленным по примеру 2, и бактериальной L-амилазой, котора  продолжаетс  до того момента, пока йодна  реакци  смеси не станет отрицательной.

Мицелий плесени, выросщий на трех средах аналогично описанному в примере 2, имеет значени  L-галактозидазы соответственно 32191,34495 и 38250 ед.

Пример 4. 1/10 М фосфатной буферной смеси (рН 6,0), содержащей, %: 1,5 лактозы, 3 рисовых отрубей, 0,3 мочевины, 0,2 сернистого магни  и 0,2 хлористого кальци  используют в качестве основной среды, к которой добавл ют 0,2, 0,5 и 1 % порошка солодового экстракта дл  приготовлени  культуральной

среды. Культивирование выполн ют аналогично примеру 2, и анализируют активность L-галактозидазы в мицелии. Энзиматическа  активность 27806 ед. была обнаружена в мице5 ЛИИ, выращенном на основной среде, 29634 ед. - на среде, содержащей 0,2% солодового экстракта, 35577 ед. - на среде, содержащей 0,5% солодового экстракта, и 43349 ед. - на среде, содержащей 1 % солодового экстракта соответственно.

При М е р 5. 100 г лактозы, 100 г глюкозы, 100 г экстракта жидкости от замочки зерна, 100 г сульфата аммони , 30 г КН2РО4, 30 г MgSO4-7H2O, 20 г NaCl и 100 г СаСОз раствор ют в 8 л воды. Полученный раствор помещают во встр хиваемый ферментатор и после стерилизации при 120°С в течение 30 мин его охлаждают до 30°С. Затем в раствор добавл ют стерилизованную воду до общего

0 объема 10 л и в него инокулируют споры плесени , после чего следует культивирование при 30°С с перемешиванием при 200 об/мин и с продуванием воздухом со скоростью 5 л/мин. Результаты испытаний при культивироваНИИ представлены в табл. 3.

Таблица 3

Пример 6. 1/10 М фосфатный буфер (рП 6,0), содержащий, %: 0,75 лактозы,

2 глюкозы, 1,8 пептона, 1,8 м сного экстракта, 0,2 сернокислого магни  и 0,2 хлористого кали  инкулируют плесенью, которую культивируют со встр хиванием в течение 72 час. Мицелий выдел ют фильтрацией, тщательно

промывают водой и взвешивают. Активность L-галактозидазы 3500 ед. на 1 мл фильтрата, свободного от мицели , и 28400 ед. в мицелии , собранном с 1 мл среды. Серную кислоту добавл ют к 10 г свекольной мелассы, содержащей 1,088 г раффинозы , дл  доведени  ее рН приблизительно до 5,2 с последующим добавлением фосфатного буфера (рН 5,2) и доведением водой полученного в результате раствора до 20° по Бриксу.

Мицелий затем добавл ют к приготовленному разбавленному раствору свекольной мелассы , ведут энзиматическую реакцию при 50°С в течение 24 час при перемещивании. Реакционную смесь фильтруют, и оставщуюс  рафинозу и возросшее количество сахарозы определ ют в фильтрате хроматографией на бумаге.

При добавлении мицели  с энзиматической активностью 450000 ед. расцепл етс  70,4% исходной раффинозы и образуетс  364 мг сахарозы. Соответствующие значени  после добавлени  900000 ед. энзиматической активности 81,5% и 544 мг.

Пример 7. Плесень культивируют в услови х , аналогичных примеру 6, и определенное количество полученного таким образом мицели  используют в качестве источника энзима .

Серную кислоту и фосфатный буфер (рН 5,2) добавл ют к 10 г свекольной мелассы и разбавл ют смесь водой до концентрации 36° по Бриксу. Разбавленный раствор свекольной мелассы перемешивают с 1700000 ед. энзима при 37°С в течение 24 час.

Затем реакционную смесь фильтруют и определ ют расщепление раффинозы и образование сахарозы. Отфильтрованный мицелий тщательно промывают водой и вновь используют на последующей порции по способу разбавленного раствора и повтор ют эту процедуру еще раз.

Результаты приведены в табл. 4.

Таблица 4

Таблица 5

10

Степень расщеплени  раффинозы 65,3%, а возросщее количество сахара 260 мг.

Пример 9. Среду, содержащую, %: 1,5 лактозы, 0,5 глюкозы, 1 жидкости после замочки зерна, 0,1 мочевины, 0,1 сернокислого аммони , 0,3 КН2Р04, 0,2 MgSO4-7H2O и 0,2 NaCl, инокулируют спорами плесени и культивируют при 30°С в течение 72 час. После сбора мицели  с 1 мл среды определ ют, что он содержит 28000 ед. L-галактозидазы.

10 г навески свекольной мелассы, содержащей 1,088 г раффинозы, разбавл ют водой до

концентрации 15° по Бриксу, рН довод т до 5,2 добавлением серной кислоты и смещивают с мицелием, имеющим 980000 ед. L-галактозидазной активности. Смеси хран т при 20, 30, 40, 50, 60 и 70°С соответственно в течение

24 час при встр хивании, после чего измер ют расщеплением раффинозы.

Пример 8. Плесень культивируют в среде , аналогичной описанной в примере 6. Выросший мицелий гомогенизируетс  в гомогенизаторе и подвергаетс  воздействию УЗ-генератора (10 кг цикл) в течение 1 час. Измельченный мицелий центрифугируют дл  того , чтобы отделить часть, всплывающую наверх , от осадочной фракции и дл  каждой фракции определ ют активность L-галактозидазы .

Энзиматическа  активность равна 39% в поверхностной части и 61% в осевщей фракции.

Раффинозу из свекольной сахарной мелассы расщепл ют посредством 1750000 ед. на осадочной фракции в трех последовательных опытах (как в примере 7).

Результаты представлены в табл. 5. Раффинозу также расщепл ют при помощи концентрировани  верхней всплывщей части в вакууме. Добавл ют 1750000 ед. L-талактозидазы в виде концентрата к 10 г свекольной мелассы, содержащей 1,088 г раффинозы. Довод т рН полученной в результате смеси до 5,2 и разбавл ют ее водой и серной кислотой до 36° по Бриксу, оставл   на 24 час при37°С,.

10 г навески такой же свекольной мелассы также раствор ют буферным раствором МсП vaine до 15° по Бриксу, их рН довод т до 2,2, 3,4, 5,6, 7 и 8 соответственно, после чего добавл лись 980000 ед. мицели , и полученный в результате раствор встр хивают при 50°С в течение 6 час.

Расщепление раффинозы,

рН реакционной жидкости

55

60

65

Пример 10. Юг навески свекольной мелассы разбавл ют водой до 15° по Брнксу, довод т до рН 5,2 серной кислоты и смешивают с 980000 ед. мицели , аналогично описанному в примере 9.

Смесь встр хивают при 50°С в течение 6 час.

Извлеченный мицелий тщательно промывают водой, добавл ют к другой порции разбавленной свекольной мелассы и повтор ют процедуру .

Результаты, полученные в трех опытах, представлены в табл. 6.

Таблица б

Аналогичные результаты получают в тех случа х, когда разбавленную мелассу замен ют свекольным соком, экстрагированным из свеклы или после очистки.

Активность L-галактозидазы измер ют следующим образом.

Ферментативную реакцию осуществл ют при 40°С в течение 2 час путем добавлени  I мл суспензии к смеси 0,5 мл (0,06 мол ) мелибиозы и 0,5 мл (0,1 мол ) фосфатной буферной смеси (рН 5,2). После завершени  реакции реакционную смесь выдерживают в кип щей воде в течение 5 мин дл  инактивации L-галактозидазы и к ней добавл ют 1 мл 1,8%-ного Ва(ОН)2ВН2О и 1 мл 2%-ного ZnO4-7H2O.

После центрифугировани  смеси при помощи глюкостат-метода измер ют количество глюкозы в поверхностном слое. Активность L-галактозидазы, котора  выдел ет 1 мг глюкозы в этих реакционных услови х, определ ют как одну единицу.

Поскольку количество освобожденной глюкозы и концентраци  энзима наход тс  в пр мой зависимости до количества 1000 мг глюкозы , раствор фермента разбавл ют дл  того, чтобы количество энзима стало внутри указанной выще зависимости, затем провод т ферментативную реакцию и количество освобожденной глюкозы умножают путем многократного разбавлени .

Характеристики Mortierella vinacea var raffinoseutilizer (АТСС, № 20034) следующие.

1. Микроскопическое наблюдение плодового тела, выросшего на среде агара солодового экстракта, показывает разветвленные спорангионосцы , имеющие в диаметре 3-4 мкм, спорангии бледно-коричневые, имеют почти круглую форму в диаметре 10-20 мкм и неправильно угловатые спорангиспоры-2,7-5 мкм.

2. Микроскопическое наблюдение в различных средах.

Агар солодового экстракта. Мицелий имеет толстый войлокообразный вид и измен етс  в

5 краске от белого до бледно-коричневого в зависимости от зрелости спор. В мицелии не образуетс  растворимого пигмента. Картофельно-глюкозный агар. В мицелии наблюдаетс  изменение окраски от белой до светло-коричневой в зависимости от зрелости спор. В мицелии не образуетс  растворимый пигмент.

Дрожжевой экстракт-агар солодового экстракта .

5 Мицелий обнаруживает изменение окраски от белой до бежевой в зависимости от зрелости спор. В мицелии не образуетс  растворимый пигмент. Наиболее подход щей температурой культивировани  плесени в среде  вл 0 етс  температура около 30°С. Продуцирование L-галактозидазы быстро возрастает, спуст  около 30 час и становитс  наиболее высоким примерно через 70-80 час. Так как больша  часть L-галактозидазы получаетс  в мицелии, она может повторно использоватьс  добавлением к свекловичной мелассе , подвергаетс  реакции с рафинозой, регенерируетс  и снова добавл етс  к другой свекловичной мелассе.

0 Около 80% L-галактозидазы, продуцируемой в среде, содержащей сою, становитс  неактивной , когда она поддерживаетс  при температуре 60°С в течение 15 мин. Только около 38% L-галактозидазы, продуцируемой по

5 предложенному способу, становитс  неактивной , когда она сохран етс  при температуре 60°С в течение 15 мин. Так как ферментативна  реакци  может осуществл тьс  при высокой температуре, соответственно можно со0 кратить врем  реакции.

Инвертазна  активность L-галактозидазы, чрезвычайно низка по сравнению с активностью L-галактозидазы, получаемой в среде, содержащей сою. В 1 мл ферментативного

5 раствора, полученного из среды, содержащей сою, включающего, например, 50000 ед. L-галактозидазы , получаетс  18,1 ед. инвертазы, тогда как в 1 мл энзимного раствора, полученного по предложенному способу, включающего 50000 ед. L-галактозидазы, получаетс  только 0,085 ед. инвертазы, т. е. активность инвертазы снижаетс , примерно до 1/200. Причина этого заключаетс  в том, что когда плесень культивируетс  в среде, содержащей или сою, или соевый жмых, получение инвертазы вызываетс  сахарозой, содержащейс  в сое. Так как рафиноза при добавлении L-галактозидазы к отбросной мелассе разлагаетс  на сахарозу и галактозу, можно увеличивать выход свекловичного сахара.

Предмет изобретени 

Способ получени  L-галактозидазы путем 65 выращивани  плесени Mortierella Vinacea var. 9 raffinoseutilizer (АТСС 20034) на питательной среде, содержащей индуктор галактозадазы, в присутствии источника углерода, азота и минеральных солей с последующим выделением L-галактозидазы из культуральной жидко-5 10 сти, отличающийс  тем, что, с целью повышени  активности L-галактозидазы и снижени  количества инвертазы, сопутствующей данному ферменту, в качестве индуктора используют лактозу.