Przedmiotem wynalazku jest nowy sposób wytwarzania 1 la-hydroksysteroidów szeregu pregnanu o ogólnym wzo¬ rze 1 w którym: X - oznacza atom wodoru lub chlorowca np. fluoru, chloru R - oznacza atom wodoru, grupe hydroksylowa lub acyloksylowa R1R2 - oznaczaja grupe hydroksylowa lub razem wziete ugrupowanie (wzór 3), w którym R3 i R4 oznaczaja atomy wodoru lub grupy alkilowe.Sposobem wedlug wynalazku zwiazki szeregupregnanu o ogólnym wzorze 2 w którym: X - oznacza atom wodoru lub chlorowca np. fluoru, chloru R - oznacza atom wodoru, grupe hydroksylowa lub acyloksylowa R1R2- oznaczaja grupe hydroksylowa lub razem wziete ugrupowanie (wzór 3), w którym R3 i R4 oznaczaja atomy wodoru lub grupy alkilowe hydroksyluje sie w pozycji 1 la za pomoca mikroorganizmów nalezacych do rodzaju Hyp- hoderma, najkorzystniej przez gatunek Hyphoderma ro- seum, jego grzybnie wegetatywna lub zarodniki.Zadowalajace rezultaty 1la -hydroksylacji uzyskuje sie równiez przez dzialanie innymi gatunkami jak np. Hypho¬ derma argillaceum, Hyphoderma clavigerum, Hyphoder¬ ma polonense, Hyphoderma roseocremeum, Hyphoderma tenue, Hyphoderma stetigerum.Sposób ten moze byc stosowany doprodukcji terapeuty- ków lub pólfabrykatów stosowanych dalej dowytwarzania . zwiazków terapeutycznie czynnych.Selektywna 1 la-hydroksylacja wymienionych na wste¬ pie steroidów jest kluczowym zagadnieniem w funkcjona- lizacji tej pozycji. W tym wzgledzie sposoby chemiczne zawodza. Niewiele drobnoustrojów posiada te, przemyslo¬ wo oplacalna, zdolnosc i dlatego niewielejestopatentowa¬ nych sposobów. Wobec tego stwierdzenie zdolnosci mikro¬ organizmu do selektywnej lla-hydroksylacji zwiazków podanych na wstepie tego opisu jest zagadnieniem bardzo waznym w produkcji leków steroidowych pochodnych pregnanu.Znane sa sposoby 1 la -hydroksylacji steroidów, szeregu pregnanu podane w opisach patentowych Stanów Zjedno¬ czonych Ameryki Nr 3 079 384, RFN Nr 1 168 901 i Wiel¬ kiej Brytanii Nr 1 043 349. Jako mikroorganizmy stosowa¬ ne sa rodzaje Colletotrichum, Tricothecium i Fusarium.Wedlug wynalazku steroid poddaje sie dzialaniu mikro¬ organizmu Hyphoderma roseum w warunkach aerobo- wych sposobem konwencjonalnym, po czym surowy pro¬ dukt zawierajacy w pozycji lla grupe hydroksylowa wyo¬ drebnia sie w znany sposób np. przez ekstrakcje i ewentu¬ alnie oczyszcza. Steroid mozna dodawac: - do pozywki bezposrednio po wprowadzeniu inoculum i prowadzic jednoczesnie wzrost mikrorganizmu i lla hydroksylacje steroidu za pomoca rosnacego drobnous¬ troju, - do odpowiednio namnozonej kultury w brzeczce wzros¬ towej, - do uprzednio namnozonej kultury nastepnie odsaczonej lub odwirowanej, przemytej woda i zawieszonej w wo¬ dzie lub roztworze buforowym w fermentatorze.90658 Steroid dodaje sie w postaci zawiesiny w wodzie, albo w postaci roztworu w rozpuszczalnikach takich jak: meta¬ nol, aceton, dwumctyloformamid, dioksan, octan metylu, w wodnych roztworach tych rozpuszczalników lub w po¬ staci suchej, drobnosproszkowanej substancji.Wskazane jest, aby steroid byl silnie rozdrobniony dla umozliwienia maksymalnego kontaktu ze srodowiskiem 1la - hydroksylujacym.Steroid dodaje sie jednorazowo lub w kilku porcjach.Hodowle mikroorganizmu Hyphoderma roseum uzyskuje sie dodajac drobnoustrój w warunkach tlenowych w odpo¬ wiednim, plynnym podlozu zawierajacym wymaganeilosci wlasciwego zródla azotu i wegla. W celu uzyskania lepsze¬ go wzrostu hodowli dodaje sie do niej czynniki wzrostowe jak: witaminy, aminokwasy i jony metali.W czasie trwania procesu miesza sie dokladnie hodowle w celu zapewnienia odpowiedniego kontaktu miedzy ste¬ roidem a faza zawierajaca mikroorganizm i enzymy lla - hydroksylujace. Konieczne jest równiez doprowadzanie tlenu do hodowli w czasie calego przebiegu procesu oraz nieduzych ilosci srodka przeciwpiennego.Optymalne napowietrzanie kultury sterylnym powie¬ trzem wynosi ok. 0,5 do 11 powietrza na 1 litr brzeczki na 1 minute przy nadcisnieniu w tanku okolo 1 atn. lla - hydroksylacja przebiega w optymalnym zakresie tempera¬ tur 26 - 30 i przy wartosci pH 5 - 6,5.Proces wedlug wynalazku przebiega równiez z takim samym skutkiem, jezeli steroid podda sie dzialaniu samych zarodników wytworzonych przez wyzej wymienione drob¬ noustroje. Zarodniki te mozna otrzymac hodujac drobnou¬ strój na pozywce o skladzie: glikoza pepton KH2P04 MgS04-7H20 22 g 2g 1,25 g 0,75 g woda destylowana do 1000 ml, a nastepnie oddzielajac od grzybni wegetatywnej. Steroid dodaje sie do zawiesiny zarodników w wodzie albo w roz¬ tworze buforowym.Po skonczonym procesie lla -hydroksylacji produkt koncowy odzyskuje sie przez ekstrakcje rozpuszc^6rhiika- mi nie mieszajacymi sie z woda, jak na przyklad: chloro¬ form, chlorekmetylenu, butanol, octan etylu, metyloizobu- tyloketon, mieszanina chloroformbutano] itp.Ekstrakt zawierajacy steroid odparowuje sie i nastepnie steroid oczyszcza p*zez krystalizacje z rozpuszczalników lub ich wodnych roztworów jak: chlorowcopochodnych weglowodorów alifatycznych, octanu metylu, octanu ety¬ lu, metanolu, acetonu, dwumetyloformamidu, dioksanu itp. lub innymi metodami np. chromatografii kolumnowej.Przyklad I. Szczep Hyphoderma roseum hoduje sie w ciagu 7 dni w temperaturze 28°C na podlozu stalym o skladzie: glikoza pepton KH2P04 MgS04.7H20 agar woda destylowana - 2g - 2g - 1,25 g - 0,75 g - 15 g - 11 pH podloza ~ ij. Podloze sterylizuje sie 20 minut w tempe¬ raturze ok. 117°.Po uzyskaniu dobrze zarodnikujacej kultury skosy zmywa 45 50 sie 3 ml serylnej wody destylowanej. Zawiesina uzyskana z 3 skosów szczepi sie kolbe poj. 2 1 z 200 ml pozywki o skladzie: ekstrakt drozdzowy sacharoza tween 80 olej sojowy - 10g - 5g - 0,5 g - 0,2 g woda destylowana - uzupelnia sie do 1000 ml.W ten sposóbprzygotowuje sie 4 kolby.Kolby sterylizuje sie 30 minut w temperaturze 120°. pH po sterylizacji 5,2- ,4. Kolby inkubuje sie w ciagu 48 godzin w warunkach tlenowych w temperaturze 28°. Dobrze wyrosnieta kultura z 4 kolb stanowi inokulum do zaszczepienia fermentatora zawierajacego 10 1 wysterylizowanej pozywki o wyzej wymienionym skladzie. Hodowle w fermentatorze prowa¬ dzi sie przy mieszaniu i napowietrzaniu 0,6-0,8 litra po¬ wietrza na minute na 1 litr hodowli przy cisnieniu 1 atn. Po 24 godzinach wzrostu zawartosc fermentatora przeszcze¬ pia sie do nastepnego fermentatora zawierajacego 100 1 wysterylizowanej pozywki o skladzie: pepton ekstrakt drozdzowy glikoza KRPO, olej sojowy - 7,5 g - 4,5 g - 30 g - 5g - 0,2 g woda destylowana, uzupelnia sie do 1000 ml.Pozywke sterylizuje sie 30 minut w temperaturze 120°. pH po sterylizacji 5,4-5,6.Po 24 godzinach hodowli, prowadzonej w identyczny sposób jak w poprzednim fermentatorze, do rosnacej kul¬ tury dodaje sie 40 g 6a - fluoro 16a, 17a-izopropylideno- dioxy A 4-pregnen, 21-01, 3,20-dionu rozpuszczonego w acetonie.Biokonwersje prowadzi sie w takioh samych warunkach jak wzrost kultury w fermentatorach. Przebieg biokonwer- sji sprawdza sie metoda chromatografii cienkowarstwo¬ wej. Po okolo 24 godzinach proces jest zakonczony. Pro¬ dukt odzyskuje sie na drodze ekstrakcji chloroformem lub mieszanina chloroform-butanol 4:1. Ekstrakt zateza sie i otrzymany surowy produkt rekrystalizuje z acetonu lub chlorku metylenu. Otrzymuje sie okolo 20 g prawie bialego produktu o nastepujacych danych: 40 temp. topn. 262-264°, [a]|J = +97,57c = 1%, CHC13), -MnuxEtOH = 236 nm. E™ = 347, E = 15146 IR - vKBr, max = 980,1030,1060,1655,1680,3400 cm"' Przyklad II. Szczep Hyphoderma roseum hoduje sie w ciagu 7 dni w temperaturze 28° na podlozu stalym o skladzie: pepton glikoza KH2PO< MgS04.7H20 agar woda destylowana - 2g - 2g - 1,25 g - 0,75 g - 15g - 11 55 pH podloza ~~ 6. Podloze sterylizuje sie 20 minut w tempe¬ raturze ok. 117°.Po uzyskaniu dobrze zarodnikujacej kultury skos zmy¬ wa sie 3 ml wody destylowanej. Zawiesina uzyskana z trzech skosów szczepi sie kolbe pojemnosci 2 1 z 300 ml 60 pozywki o skladzie:90 658 pepton ekstrakt drozdzowy glikoza KH^O, olej sojowy - 7,5 g - 4,5 g - Mg - 5g - 0,2 g woda destylowana uzupelnia sie do 1000 ml W ten sposób przygotowuje sie 4 kolby.Kolbysterylizuje sie 30 minut w temperaturze 120°. pH po sterylizacji ,4-5,6. Kolby inkubuje sie w ciagu 48 godzin w warun¬ kach tlenowych na trzesawce w temperaturze 28°, Dobrze wyrosnieta kultura z czterech kolb stanowi ino- kulum do zaszczepienia fermentatora zawierajacego 10 1 wysterylizowanej pozywki o wyzej wymienionym skla¬ dzie. Hodowle w fermentatorze prowadzi sie przy miesza¬ niu i napowietrzaniu 0,6- 0,8 litra powietrza na minutena 1 litr hodowli, przy cisnieniu 1 atn. Po 24 godzinach wzrostu zawartosc fermentatora przeszczepiacie do naste¬ pnego fermentatora zawierajacego 100 1 uprzednio wyste¬ rylizowanej pozywki o skladzie: pepton - 10 g ekstrakt drozdzowy - 6 g glikoza - 40 g KH.PO, - 5g olejsojowy - 0,2 g woda destylowana uzupelnia sie do 1000 ml.Pozywke sterylizuje sie 30 minut w temperaturze 120°. pH po sterylizacji 5,4 - 5,6.Po 24 godzinach hodowli, prowadzonej w identyczny sposób jak w poprzednim fermentatorze, grzybnie odsacza sie, zawiesza w 100 1 wody i natychmiast dodaje sie 40 g6u-fluoro-16u, 17a-izopropylidenodioxy- A4-pregnen, 21-01, 3,20-dionu rozpuszczonego w octanie metylu. Bio- konwersje prowadzi sie w takich samych warunkach jak wzrost kultury w fermentatorach.Przebieg biokonwersji sprawdza sie chromatograficznie metoda cienkowarstwowa. Po okolo 24 godzinach proces jest zakonczony.Produkt odzyskuje sie na drodze ekstrakcji chlorofor¬ mem lub mieszanina chloroform-butanol 4:1. Ekstrakt zateza sie i otrzymany surowy produkt rekrystalizuje z chlorku metylenu. Otrzymuje sie okolo 20 g prawie bialego produktu o danych jak w przykladzie I.Przyklad III. Proces prowadzi sie identycznie jak w przykladzie I z nastepujacymi wyjatkami: Po przeszczepieniu kultury, z fermentatora zawierajace¬ go 10 1 kultury do fermentatora ze 100 1 pozywki, steroid dodaje sie w pieciu porcjach. Pierwsza porcje od razu po przeszczepieniu kultury, a nastepne w odstepach 6-cio godzinnych. Proces trwa okolo 40- 48 godzin.Uzyskuje sie podobna wydajnosc i jakosc koncowego produktu.Przyklad IV. Proces prowadzi sie identycznie jak w przykladzie I z nastepujacymi wyjatkami: Pozywka w ostatnim fermentatorze (100 1) posiada na¬ stepujacy sklad: glikoza pepton KH3PO, MgSO^H^O - 22 g - 2g - 1,25 g - 0,75 g woda destylowana - uzupelnia sie do 1000 ml.Sterylizacja 20 minut w temperaturze ok. 117°.Po 24 godzinach inkubacji otrzymuje sie hodowle roz¬ drobnionej grzybni o znacznej ilosci zarodników.Hodowle filtruje sie przez wate szklana. Rozdrobniona grzybnia zatrzymuje sie na wacie, a zarodniki przechodza do filtratu. Zarodniki odwirowuje siena wirówce, przemy¬ wa woda celem eliminacji skladników pozywki i zawiesza w buforze fosforanowym o pH 7. Nastepnie dodaje sie steroid. Biokonwersja trwa okolo 20 godzin.Wydajnosc i jakosc produktu jak w przykladzie I.Przyklad V. Sposobami podanymi w przykladach I, II, III, IV ulegaja równiez hydroksylacji w pozycji lla nastepujace steroidy: 6a-fluoro-16a-hydroksykorteksolon, 16a, 17a-dwuhydroksyprogesteron, 6a-fluoro-l6a-metylokorteksolon, 16a, 17a-izopropylidenodioxyprogesteron, korteksolon, 16u-hydroksykorteksolon, 16a, 17a-izopropylidenodioxykorteksolon. PL