PL82362B1 - - Google Patents

Description

Uprawniony z patentu: Bayer Aktiengesellschaft, Leverkusen (Republi¬ ka Federalna Niemiec) Sposób oczyszczania i wzbogacania inhibitora kalikreintrypsyny Przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszcza¬ nia i wzbogacania inhibitora kalikreiny-trypsyny z jego izainieiozysizczoinych roztworów.Znany jest szereg sposobów ekstrakcji inhibito¬ ra kalikreiny-trypsyny z organów bydlecych, na przyklad z przyuisizniicy lub pluc. Maceracji orga¬ nów mozna dokonac na przylklad za pomoca kwa¬ sów lub organicznych rozpuszczalników, mieszaja¬ cych sie z woda, zwlaszcza za pomoca metanolu z dodatkiem róznych soli metali alkalicznych lub ziem alkalicznych (opis patentowy RFN nr 1084 433; opis patentowy RFN nr 1148 352).Dalsze oczyszczanie nastepuje przez wytracenie substancji czynnej, na przyklad acetonem (opis patentowy RFN nr 1084 433 siarczanem amonu Biochem. J. 54, 257 (1953)) lub za pomoca innych soli.Znane sa takze sposoby dokladnego oczyszczania inhibitora kalikreiny-trypsyiny za pomoca chroma¬ tografii kolumnowej. Polegaja one na chromato¬ grafii na celulozie DEAE i CM (Collection Czech.Chem. Commun. 30, 1705 (1965), C. R. Acad. Sc.Paris, 260, 3491 (1965)). Kwasne wymieniacze jo¬ nowe wiaza inhibitor kalikreiny-trypsyny jako silnie zasadowy polipeptyd.Stwierdzono, ze wiazanie inhibitora kalikreiny- -trypsyny z amfoterycznymi wymieniaczami jono¬ wymi typu polistryrenowego jest bardzo mocne, a ponadto bardzo selektywne. Dotyczy to w szcze¬ gólnosci takich amfoterycznych wymieniaczy jo- 2 nowych typu polistyrenowego, które posiadaja grupy kwasu aminooctowego i/lub kwasu imino- dwuoctowego. Tego rodzaju trwala i selektywna adsorpcja nie ma miejsca w stosunku do zanie- 5 czyszczen w roztworach inhibitora kalikreiny- -trypsyny. Sposób wedlug wynalazku nadaje sie wiec do oczyszczalnia i wzbogacania inhibitora ka¬ likreiny-trypsyny z jego zanieczyszczonych roz¬ tworów. 10 Wedlug wynalazku -wodne roztwory surowego inhibitora nanosi sie na kolumne wypelniona aim- feterycznym iwymieniaczem (jonowym i doprowa¬ dzona do stanu równowagi ibuforem fosforanowym.Nie zaadsoribowane substancje usuwa sie przez 15 przemywanie ibuforem fosfo-ranowyim lub roztwo¬ rem soli. Nastepnie przeprowadza sie eiluowanie substancji czynnej za ipomoca gradientu soli. Czyn¬ ne frakcje laczy sie i odsala znanylmi sposobami.Usuwa sie w ten prosty isposób silnie zabarwione 20 zanieczyszczenia,! j alk równiez wieksza czesc obcych antygenów.Inhibitor kalikreiny-trypsyny eluuje sie przy stezeniu 0,25 m NaCl, przy wartosciach pH=6,0— —10,0, zwlaszcza 6,2—8,0, to znaczy w lagodnych, 25 chroniacych inhibitor warunkach. Sasiedztwo za¬ sadowych i kwasnych grup w amfoterycznym wy¬ mieniaczu jonowym wplywa wiec korzystnie na zachowanie sie inhibitora kalikreiny-trypsyny pod¬ czas eluowania. Niespodziewana jest przy tym 30 znaczna zdolnosc wiazania przez wymieniacz jono- 823623 82362 4 wy substancji czynnej. Przyczyna tego zjawiska jest prawdopodobnie makroporowata struktura wymieniacza jonowego.- Sposób wedlug wynalazku umozliwia wytwarza¬ nie inhibitora kalikreiny^trypsymy o szczególnej 5 czystosci, którego znaczenie jako srodka lecznicze¬ go jest znane.Ponizsze przyklady wyjasniaja blizej sposób we¬ dlug wynalazku.Przyklad I. Amfoteryczna zywice jonowy- 10 mienna przemywa sie lrj roztworem NaOH, desty¬ lowana woda, 0,5 rj HC1 i destylowana woda i la¬ duje. Nastepnie przemywa sie 0,01 m buforem fosforanowym sodowo-potasowym o wartosci pH= =8,0. 100 ml tak przygotowanego wymieniacza 15 wprowadza sie do kolumny (2,5X20 cm). Inhibitor kaliJkreiiny-itrypsyiny o czystosci okolo 2000 KIE zaadsorbowany na ziemi okrzemkowej ekstrahuje sie woda. Roztwór ten nastawia sie na przewod¬ nictwo 0,12 mSXicm—i przez dodawanie na zmia- 20 ne wymieniaczy jonowych (w postaci H+ i OH—). 670 ml tego roztworu o czynnosci 5100 KIE/ml (calkowita czynnosc: 3,4X106 KIE) nanosi sie na kolumne z predkoscia 1,15 ml/min/cm2. Kolumne przemywa sie 0,01 m buforem fosforanowym 25 o wartosci pH=8,0 i eluuje gradientem liniowym 2 litrów 0,01 m buforu fosforanowego o wartosci pH=8,0 i 2 litrów 0,01 m buforu fosforanowego o wartosci pH=8,0+l,0 m NaCl z predkoscia 0,35 ml/min/om2. Aktywne frakcje laczy sie, odsala za pomoca wymieniaczy jonowych i liofilizuje roz¬ twór. Wydajnosc wynosi 87%, a czynnosc wlasciwa 6*ó.Xt KIE/mg.Prziyklad II. Amfotteryczny wymleniilaez jo¬ nowy laduje sie, jak opisano w przykladzie I, i doprowadza do stanu równowagi za pomoca 0,i0il m buforu fosforanowego sodowo-potasowego o wartosci pH=6,2+0,001 m kwasu etylenodwu- amlinoczterooctowelgo (EDTA). Kolumne (2,5X20 cm) na/pelnia sie 100 imil wymieniacza. Na kolumne 40 nanosi isie ,20 ml .wstepnie oozysziazonego roztworu ru inhibitora o czynnosci 110 000 KIE/ml (calkowi¬ ta czynnosc : 2,2X106 KIE) i o czystosci 4000 KIE/img, z predkoscia 0,35 mi/lmin/icm2. Kolumne przemywa sie 0,01 m buforem fosforanowym i na- 45 stepnie eluuje substancje czynna liniowym gra¬ dientem z 2 litrów 0,01 m buforu fosforanowego o wartosci pH=6,2+0,001 m EDTA i 2 litrów 30 35 0,01 m buforu fosforanowego o wartosci pH= =6,2+0,001 m EDTA+1,0 m NaCl. Aktywne frak¬ cje laczy sie, odsala wymieniaczami jonowymi i liofilizuje roztwór. Wydajnosc wynosi 86°/o, czyn¬ nosc wlasciwa 5000 KIE/mg. Immunoelektrofero- gram wykazuje jedno pasmo obok towarzyszacego antygenu, podczas, gdy material wyjisciowy wyka¬ zuje wiele pasm.Przyklad III. Amfoteryczna zywice jonowy¬ mienna laduje sie i doprowadza do stanu równo¬ wagi, jak opisano w przykladzie I, za pomoca 0,01 m buforu fosforanowego sodowo-potasowego o wartosci pH=8,0. Na kolumne (2,5X20 cm) z 100 ml wymieniacza jonowego nanosi sie 1300 ml su¬ rowego, jeszcze silnie zabarwionego roztworu inhi- tora o 7800 KIE/ml (calkowita czynnosc : 10,1X106 KIE) i o czystosci 2400 KIE/mg z szybkoscia 0,35 ml/min/cm2. Po przemyciu 0,01 m buforem fosfo¬ ranowym eluuje sie liniowym gradientem z NaCl w buforze fosforanowym. Czynne frakcje laczy sie, odsala wymieniaczami jonowymi i roztwór liofili¬ zuje. Otrzymuje sie 1,58 g substancji stalej o czyn¬ nosci wlasciwej 5500 KIE/mg (czynnosc calkowi¬ ta : 8,68 X106 KIE), co odpowiada wydajnosci 86°/o.Otrzymany produkt jest bezbarwny i calkowicie wolny od obcych antygenów. PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Claims (3)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób oczyszczania i wzbogacania inhibitora kalikreiny-trypsyny z jego zanieczyszczonych roz¬ tworów za pomoca chromatografii kolumnowej, znamienny tym, ze surowe roztwory inhibitora kalikreiny-trypsyny adsorbuje sie na amfoterycz- nej zywicy jonowymiennej na podstawie polisty¬ renu, nie zaadisorbowane substancje usuwa przez przemywanie roztworami buforu lub soli, nastep¬ nie eluuje inhibitor kalikreiny-trypsyny gradientem z soli, odsala znanymi sposobami polaczone czyn¬ ne frakcje i roztwór liofilizuje.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze eluacje gradientami prowadzi sie przy wartosciach pH=6,0—10,0, zwlaszcza 6,2—6,0.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie amfoteryczne zywice jonowymienne na podstawie polistyrenu, zawierajace grupy kwasu aminooctowego i/lub kwasu imiinodwuoctowego. DN-7 — Zam. 453/76 Cena 10 zl PL PL PL PL PL PL PL PL PL