PL66009B1 - - Google Patents

Description

Pierwszenstwo: 06.X.1965 Stany Zjednoczone Ameryki Opublikowano: 30.X.1972 66009 KI. 30h,6 MKP Cl2d 9/14 Wspóltwórcy wynalazku: Edward Meyers, Richard Donovick, Frank Lee Weisenborn, Felix Edward Pansy Wlasciciel patentu: E. R. Sauibb and Sons, Inc., Nowy Jork (Stany Zjednoczone Ameryki) Sposób wytwarzania nowego antybiotyku prazynomycyny Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowego antybiotyku prazynomycyny, stanowiacego mieszanine prazynomycyn A, B, C, D i E, jak rów¬ niez sposób rozdzielania tej mieszaniny na poszcze¬ gólne skladniki.Prazynomycyna, jak równiez poszczególne jej skladniki, wykazuja w szerokim zakresie aktywnosc w stosunku do bakterii Gram — dodatnich i Myco- bacterium tuberculoris oraz ograniczona aktywnosc w stosunku do bakterii Gram — ujemnych.Sposobem wedlug wynalazku prazynomycyne wy¬ twarza sie metoda fermentacji, na drodze hodowli w okreslonych warunkach pewnych mikroorgani¬ zmów. Streptomyces, a mianowicie Streptomyces prasinus ATCC 15825, Streptomyces hirsutus ATCC 19091 i Streptomyces prasmo-pilosus ATCC 19092.Streptomyces prasinus ATCC 15825 zostal wy¬ osobniony z próbek ziemi pochodzacych z Colora¬ do Springs, Stany Zjedn. Am. Wyosabnia sie go i oznacza przez wymieszanie próbki ziemi w ste¬ rylnej wodzie destylowanej i nastepnie umieszcza w srodowisku agarowym, zawierajacym nastepu¬ jace skladniki: 15 g 10 g 1,2 g 0,4 g 0,08 g 0,418 g 0,036 g agar sacharoza kwas cytrynowy (NH4)2HP04 KC1 MgCl2 • 6H20 MnCl2 • 4H2Q 10 15 20 25 30 FeCl3 • 6H20 ZnCl3 • 6H20 CoCl2 • 6H20 woda destylowana 0,023 g 0,021 g 0,004 g do 1000 ml Srodowisko doprowadza sie do wartosci pH = 7,0 i wyjalawia w autoklawie w temperaturze 121°C w ciagu 30 minut. Po 7—10 dniach inkubacji w tem¬ peraturze 25°C kolonie Streptomyces prasinus wy¬ osabnia sie z rozpostartej ziemi. Te wydzielone ko¬ lonie rozwijaja sie nastepnie w srodowisku zawie¬ rajacym: 1,5 g 3,0 g 6,0 g 1,0 g do 1000 ml ekstrakt wolowy • ekstrakt z drozdzy pepton dekstroza woda destylowana Srodowisko wprowadza sie do autoklawu o tem¬ peraturze 121°C na okres 15 minut. W srodowisku zawierajacym jako zródlo azotu siarczan amonowy, mikroorganizm ten moze wykorzystywac jako zród¬ lo wegla takie substancje jak glukoza, mannit, ino- zyt, ksyloza, arabinoza i fruktoza. Rozwoju nie pod¬ trzymuje natomiast sorbit, ramnoza i laktoza. Mi¬ kroorganizm ten jest proteolityczny na mleku i ze¬ latynie, hydrolizuje skrobie, jest negatywny w sto¬ sunku do siarkowodoru i nie redukuje azotanu.Ponizej podano opis kolonii mikroorganizmu in- kubowanego w róznych srodowiskach: 66 00966 3 Pasta pomidorowa — maka owsiana agar, grzyb¬ nia napowietrzna jest niepelnie zielona. Dolna stro¬ na grzybni ma kolor zielony bylicy M + PieE5; Drozdze — ekstrakt slodowy agar, grzybnia napo¬ wietrzna jest niepelnie zielona, a dolna strona grzyb¬ ni jest kremowo-zólta. Pigmenty rozpuszczalne nie powstaja; Syntetyczny agar z soli i skrobi, grzybnia napo¬ wietrzna jest koloru zielonej trawy, przy dojrzewa¬ niu staje sie ciemnoszarawo-zielona, a dolna strona grzybni jest czerwonawo-brazowa. Pigmenty roz¬ puszczalne nie tworza sie.Ogólne cechy charakterystyczne tego mikroorga¬ nizmu sa: zielone zabarwienie sporów, sporofory haczykowate lub prymitywne spirale i niechromo- genne w srodowisku proteinowym. Te charakte¬ rystyczne cechy zaszeregowuja organizm do grupy V viridus Waksmana.Streptomyces hirsutus ATCC 19091 hodowany w róznych srodowiskach ma nizej podane cechy.Agar syntetyczny — bezbarwny puch, grzybnia po¬ wietrzna jest poczatkowo nieznaczna, barwy mlecz- nobialej, a nastepnie zielenieje nabierajac barwy porów.Pozywka syntetyczna — osad i platki o barwie bia- lo-szarej, na powierzchni roztworu pozywki rozwija sie punktowo, tworzac powietrzna grzybnie barwy bialo-szarej.Dekstroza z agarem — rozwija sie punktowo, jest bezbarwny i nie tworzy powietrznej grzybni.Dekstroza z agarem asparaginowym — rozwój pun¬ ktowy, jest bezbarwny i nie tworzy powietrznej grzybni.Ogólna charakterystyka tego mikroorganizmu: spory z sztywnymi odnogami o dlugosci do 0,6 mi¬ krona, waskie u podstawy, grzybnia powietrzna ciemnozielona, lancuchy sposów tworza krótkie, otwarte, jednakowe spirale o 3 zwojach, przewaznie rozgalezione, nie tworzy melaminy.Streptomyces prasino-pilosus ATCC 19092 hodo¬ wany w róznych srodowiskach ma nizej podane cechy.Agar syntetyczny — puch o barwie ceglastej lub czerwono-brazowej, podstawa rózowa, grzybnia po¬ wietrzna aksamitna, barwy zielonawej, zblizonej do barwy porów, z plamami.Pozywka syntetyczna — osad, platki rózowe, pod¬ stawa rózowa, blony z grzybnia powietrzna barwy porów.Dekstroza z agarem — rozwój mierny, puch barwy ceglastej.Dekstroza z agarem asparaginowym — puch barwy ceglastej, grzybnia powietrzna aksamitna, barwy bialej do zielonawej jak pory.Ogólna charakterystyka mikroorganizmu: spory z gietkimi, kruchymi, bardzo cienkimi wlóknami o dlugosci do 2 mikronów, grzybnia powietrzna ciemnozielona, lancuchy sporów tworza krótkie, otwarte, jednolite spirale o 1—3 zwojach, nie two¬ rzy melaminy.Omówione wyzej mikroorganizmy sa opisane szczególowo na przyklad w dziele L. Ettlinger, R. Corbaz i R. Hutter, Zur Systematik der Actino- mycetin, Arkiv fur Mikrobiologie, tom 31, str. 326— —358. 009 4 W celu otrzymania prazynomycyny sposobem we¬ dlug wynalazku, szczep Streptomyces prasinus ATCC 15825, Streptomyces hirsutus ATCC 19091 lub Strep- tomyces prasino-pilosus 19092 poddaje sie hodowli 5 w wodnym srodowisku odzywczym, w warunkach aerobowych i utworzony antybiotyk wyosabnia w postaci mieszaniny na drodze ekstrakcji brzeczki pofermentacyjnej i ewentualnie rozdziela na sklad¬ niki, mianowicie prazynomycyne A, B, C, D i E, io korzystnie przez ekstrakcje w przeciwpradzie lub za pomoca chromatografii bibulowej, albo miesza¬ nine prazynomycyny lub skladniki tej mieszaniny ewentualnie poddaje sie w znany sposób reakcji z za¬ sada, wytwarzajac sole prazynomycyny lub jej 15 skladników z metalami alkalicznymi lub z metalami ziem alkalicznych.Hodowle te prowadzi sie korzystnie w tempera¬ turze 25°C, podpowierzchniowo, w srodowisku wod¬ nym zawierajacym przyswajalne weglowodany 20 i zródlo azotu. Fermentacje prowadzi sie w ciagu okolo 168 godzin. Po zakonczeniu fermentacji pra¬ zynomycyne ekstrahuje sie metanolem z grzybni lub korzystnie z calej mieszaniny pofermentacyjnej.W tym celu mieszanine zakwasza sie za pomoca 25 kwasu solnego do wartosci pH okolo 1,5—3,0, odsacza i osad ekstrahuje metanolem. Wyciag metanolowy zobojetnia sie do wartosci pH 7 i steza pod zmniej¬ szonym cisnieniem, po czym otrzymana wodna za¬ wiesine zakwasza sie kwasem mineralnym do war- 30 tosci pH 1,5 i ekstrahuje chloroformem lub butano¬ lem. Organiczny wyciag suszy sie bezwodnym siar¬ czanem sodowym i steza do malej objetosci, po czym rozciencza acetonem w ilosci 3—10 objetosci, wy¬ tracajac surowy antybiotyk. 35 Surowa prazynomycyne mozna nastepnie oczyscic tworzac z niej zawiesine w wodzie destylowanej i doprowadzajac wartosc pH zawiesiny do okolo 8,5 przez dodanie wodorotlenku sodowego. Zasa¬ dowy wodny roztwór ekstrahuje sie n-butanolem 40 w celu usuniecia substancji obojetnych, faze wod¬ na zakwasza kwasem solnym do wartosci pH 1,5 i ekstrahuje n-butanolem. Ekstrakt butanolowy za¬ geszcza sie pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymu¬ jac bezpostaciowy produkt o barwie ciemnobrazo- 45 wej.Szczególnie korzystny sposób oczyszczania suro¬ wej prazynomycyny polega na tym, ze miesza sie ja z dziesieciokrotna iloscia destylowanej wody i otrzymana zawiesine alkalizuje wodorotlenkiem 50 sodowym do wartosci pH okolo 8,5. Zasadowy roz¬ twór wodny przemywa sie n-butanolem w celu usu¬ niecia substancji obojetnych, faze wodna zakwasza sie do wartosci pH = 5 i ponownie przemywa n-bu¬ tanolem. Faze wodna zakwasza sie nastepnie do 55 wartosci pH 1,5—2,0 i ekstrahuje n-butanolem.Ekstrakt butanolowy zobojetnia sie wodorotlenkiem sodowym i mieszanine odparowuje do sucha. Otrzy¬ mana sól przeprowadza sie w wolny kwas, podda¬ jac wodny roztwór soli sodowej reakcji z zywica 60 jonitowa o charakterze silnego anionitu.Rozdzielanie otrzymanej prazynomycyny na posz¬ czególne skladniki, to jest prazynomycyne A, B, C, D i E, przeprowadza sie w przeciwpradzie w atmo- 65 sferze azotu lub metoda chromatografii bibulowej.66 009 Sole prazynomycyny wytwarza sie przez reakcje prazynomycyny lub poszczególnych prazynomycyn A, B, C, D i E z zasada. W tym celu mozna stosowac dowolne zasady, na -przyklad wodorotlenki metali alkalicznych, takie jak wodorotlenek sodowy lub potasowy, wodorotlenki metali ziem alkalicznych, takie jak wodorotlenek barowy, a takze zasady organiczne, na przyklad aminy pierwszorzedowe, drugorzedowe i trzeciorzedowe, takie jak dwuetylo- amina lub N-etylomorfolina.W tablicy 1 podano wyniki analizy elementarnej prazynomycyn A, B i C jako bezwodnych, wolnych kwasów i ich równowazniki zobojetniania, otrzy¬ mane przez miareczkowanie tych kwasów wodoro¬ tlenkiem sodowym w wodzie.Zwiazek Prazynomy¬ cyna A Prazynomy¬ cyna B Prazynomy¬ cyna C Tablica 1 Znaleziono, % 1 O 48,52' 50,72 51,36 Pn 6,51 6,70 7,53 £ ¦ 4,42 4.76 4,34 Ph 2,43 2,30 2,28 < o i 6,52 6,33 6,31 Równo¬ waznik zobo¬ jetnia¬ nia 460 430 646 Inne wlasciwosci fizyczne prazynomycyn poda¬ no w tablicy 2. Widma w podczerwieni odnosza sie do soli sodowej wskazanej prazynomycyny, a oznaczenie wykonano na pastylkach z KBr. 25 30 Wyniki dzialania prazynomycyn na rózne mikro¬ organizmy in vitro, oznaczone metoda podwójnego rozcienczania, podano w tablicy 3.Tablica Badany mikroorganizm Staphylococcus aureus 209 P *) Staphylococcus aureus SC3184 **) Staphylococcus aureus SC2406 Bacillus cereus Bacillus megaterium Streptococcus pyogenes C203.Streptococcus sp. SC3966 Micrococcus lysodeikticus Pseudomonas aeruginosa Saccharomyces cerevisiae Candida albicans Aspergillus niger 3 M.I.C. (Mg/ml) Prazynomycyna A 0,24 0,24 0,47 0,07 0,19 0,42 0,004 0,17 50 100 100 100 B 0,32 0,32 0,47 0,03 0,19 0,28 0,003 0,17 50 100 100 100 G 1 0,12 0,24 0,24 0,02 0,04 0,14 0,003 0,08 50 ioo 100 100 *) Odporny na penicyline, streptomycyne, tetracykline, 5-hydroksytetracykline, 7-chlorotetracykline, erytio- mycyne, oleandomycyne.**) Odporny na penicyline, streptomycyne, neomycyne, metylomycyne.Zwiazek Prazynomycyna A Prazynomycyna B Prazynomycyna C Prazynomycyna D Prazynomycyna E H20 [«]d wolny kwas + 0,8° + 2,8° + 4,4° T ultrafiolet 0,1 n HC1 246 (6,0) 246 (42) 244 (7,2) abli ca 2 m^ (Ei°/o) 0,ln KOH 256 (8,2) 257 (90) 257 (9,4) Rf la) 0,23 0,28 0,36 0,38 0,45 II*» 0,25 0,25 0,39 0,39 0,62 Wspól¬ czynnik rozdzialu c 0,17 0,24 0,39 0,43 0,85 Widmo w podczer¬ wieni fig. 2 fig. 3 | fig. 4 a) n-butanol, pirydyna, woda (4:1:4 objetosciowo), b) n-propanol, n-butanol, 0,2 m N-etylomorfolina (2:3:4 objetosciowo), c) n-propanol, n-butanol, 0,1 m N-etylomorfolina (2:3:6 objetosciowo).Rozdzial prowadzi sie w przeciwpradzie w atmosferze azotu.Nizej podane przyklady wyjasniaja dokladniej sposób wedlug wynalazku.Przyklad I. Skosnie ustawione próbki z aga¬ rem, pasta pomidorowa i maka owsiana zaszczepia sie Streptomyces prasinus ATCC 15825 i hoduje w ciagu 7—10 dni, po czym otrzymana hodowla zaszczepia w stozkowej kolbie 100 ml wodnego sro¬ dowiska o nastepujacym skladzie: maka sojowa 15 g odwodniane tluczone ziemniaki 15 g glukoza 50 g CoCl2 • 2H20 10 ml 0,05% roztworu CaC03 10 g agar 2,5 g woda destylowana 1 litr 55 65 Srodowisko to wyjalawia sie w ciagu 20 minut w temperaturze 121°C i pod cisnieniem pary 1,1 atm.Kolby z zaszczepionym srodowiskiem inkubuje sie w temperaturze 25°C w ciagu 72—96 godzin na wy¬ trzasarce obrotowej. 10% zawartosci kolby z zaszczepionym srodowis¬ kiem hodowlanym przenosi sie do 500 ml kolb stoz¬ kowych zawierajacych po 100 ml srodowiska o na¬ stepujacym skladzie: maka sojowa 60 g glukoza 50 g CaCOa 10 g woda destylowana 1 litr66 009 8 Kolby z srodowiskiem fermentacyjnym inkubuje sie i wstrzasa tak jak poprzednie kolby z srodo¬ wiskiem zaszczepionym. Po uplywie 3, 5 i 7 dni pobiera sie próbki, odwirowuje grzybnie i ekstra¬ huje metanolem o objetosci równej objetosci od¬ dzielonego przesaczu i w wyciagu oznacza zawartosc biologicznie aktywnej substancji w stosunku do Staphylococcus aureus 209P dyfuzyjna metoda aga¬ rowa. Wyniki podano w tablicy 4.Tablica 4 Czas trwania fermentacji (godziny) 72 .. .120 168 Aktywnosc biologiczna jednostki dy¬ fuzyjne/ml | 16,8 26,2 1 42,5 Przyklad II. Szczep Streptomyces prasinus ATCC 15825 zabezpieczony przez liofilizacje w mle¬ ku hoduje sie w ciagu 96 godzin w temperaturze 25°C na wstrzasarce obrotowej w kolbie o pojem¬ nosci 500 ml, zawierajacej 125 ml pozywki o skla¬ dzie : maka sojowa 15 g odwodnione tluczone ziemniaki 15 g glukoza 50 g CoCl2 • 2H20 10 ml 0,05% roztworu GaC03 10 g agar 2,5 g woda destylowana 1 litr 125 ml otrzymanej hodowli dodaje sie do 1000 ml pozywki o skladzie rózniacym sie od wyzej poda¬ nego skladu tylko tym, ze nie zawiera agaru i w kol¬ bie o pojemnosci 4000 ml inkubuje w ciagu 48 go¬ dzin w temperaturze 25° C w obrotowej wstrzasarce. 1000 ml otrzymanego produktu inkubuje sie na¬ stepnie w ciagu 72 godzin w 227 litrach srodowiska o nastepujacym skladzie: maka sojowa preparat zawierajacy skrobie pszeniczna, ryzowa, ziemniaczana i kukurydziana glikoza CaC03 C0CI2 • 2H20 woda destylowana 15 g 15 g 55 g 10 g 0,005 g 1 litr W czasie ' inkubacji doprowadza sie powietrze w ilosci 472 ml/sekunde i wstrzasa w ciagu 12 go¬ dzin, po czym doprowadza sie powietrze w ilosci 1416 ml/sekunde i dalej miesza. 34 litry otrzyma¬ nego produktu dodaje sie do 568 litrów srodowiska zawierajacego w 1 litrze 50 g maki sojowej, 55 g glikozy, 10 g CaC03 i 0,5 g srodka przeciwpianowe- go i inkubuje w ciagu 168 godzin stosujac napo¬ wietrzanie i wstrzasanie. Otrzymana mieszanine za¬ kwasza sie kwasem solnym do wartosci pH 1,5—3,0, dodaje 6 kg pomocniczego materialu filtracyjnego i odsacza substancje nierozpuszczalne. 10 kg otrzymanego osadu ekstrahuje sie w ciagu 1 godziny 15 litrami metanolu, odsacza i osad po¬ lo 15 20 25 30 35 40 45 50 60 65 nownie ekstrahuje 15 litrami metanolu. Polaczone wyciagi doprowadza sie do wartosci pH 6—7 za po¬ moca wodorotlenku sodowego i roztwór zageszcza pod zmniejszonym cisnieniem w celu usuniecia me¬ tanolu, otrzymujac okolo 1 litra wodnej zawiesiny.Zawiesine te zakwasza sie kwasem solnym do war¬ tosci pH 1,5 i ekstrahuje 3 razy chloroformem, sto¬ sujac kazdorazowo 0,25 litra chloroformu. Po kazdej ekstrakcji oznacza sie wartosc pH i w razie potrze¬ by ponownie zakwasza do wartosci pH 1,5. Pola¬ czone ekstrakty chloroformowe zageszcza sie pod zmniejszonym cisnieniem do konsystencji gestego syropu. Do otrzymanego syropu dodaje sie 4 litry acetonu, wytrzasa w ciagu 1 godziny i przesacza.Osad suszy sie pod zmniejszonym cisnieniem w tem¬ peraturze pokojowej. Z 555 g gestego syropu otrzy¬ muje sie 61,1 g bezpostaciowej substancji stalej o barwie zóltawo-brunatnej, nierozpuszczalnej w^ acetonie. Aktywnosc produktu wynosi 725 jed¬ nostek na mg. 60 g tego produktu rozciera sie na drobny proszek w mozdzierzu, po czym tworzy z niego zawiesine w 3,2 litrach wody (pH 3,4) i miesza z 25 ml 2.5 n roztworu wodorotlenku sodowego, alkalizujac do wartosci pH 8,6. Siady nierozpuszczalnych sub¬ stancji pomija sie i zasadowy wodny roztwór ekstra¬ huje 3 porcjami po 800 ml n-butanolu. Powstala faze wodna o barwie ciemnoczerwonej zakwasza sie do wartosci pH 2 przez dodanie 82 ml kwasu solnego i ekstrahuje 3 porcjami po 800 ml n-buta¬ nolu. Polaczone ekstrakty butanolowe zageszcza sie pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac 29,0 g bezpostaciowego kwasnego produktu o barwie ciem¬ nobrazowej i aktywnosci 2 200 jednostek na mg.Dalsze oczyszczanie produktu mozna przeprowa¬ dzic przez rozdzial frakcji kwasnej w przeciwpra- dzie w ukladzie chloroform — metanol — woda (5:4: 2). Frakcje aktywna rozdziela sie nastepnie po¬ nownie ukladem rozpuszczalników n-butanol-octan etylu-woda (2:1:3). Frakcje zawierajace substancje czynna laczy sie, odparowuje do sucha pod zmniej¬ szonym cisnieniem, pozostalosc rozpuszcza w me¬ tanolu i przez dodanie octanu etylu wytraca bez¬ barwny produkt. Otrzymuje sie prazynomycyne o aktywnosci 2 655 jednostek na mg, o temperatu¬ rze topnienia 164—165°C (z rozkladem), posiadajaca widmo w podczerwieni przedstawione na fig. 1.Produkt ten wystawiony na dzialanie powietrza latwo sie uwadnia, pobierajac wode, w ilosci 7,2% wagowych. Wode te traci przy suszeniu w tempe¬ raturze 80°C pod cisnieniem 0,1 mm.Analiza uwodnionego produktu: C — 46,18%, H — 7,17%, N — 4,05%, P — 2,37%, O — 40,23% (z róz¬ nicy). Równowaznik zobojetniania przy miareczko¬ waniu wodorotlenkiem sodowym = 697. Produkt daje negatywne wyniki w próbach z ninhydryna lub azotanem srebra, lecz daje niebieskie zabarwie¬ nie po potraktowaniu 2% podchlorynem III-rzed. butylu, rozpuszczonym w cykloheksanie i nastepnie roztworem jodku potasowego i skrobi.W wyniku hydrolizy za pomoca silnego kwasu z proiuktu powstaje wolny kwas fosforowy i sub¬ stancje dajace reakcje z ninhydryna, a miedzy in¬ nymi D-glikozoamine i. 6-dezoksy-D-glikozoamine.66 009 9 10 10 g proszku nierozpuszczalnego w acetonie, otrzy¬ manego wyzej opisanym sposobem, rozciera sie do¬ kladnie w mozdzierzu i miesza z 100 ml wody (pil 3,4), a nastepnie mieszajac dodaje do zawiesiny 4,3 ml 2,5 n roztworu wodorotlenku sodowego, do¬ prowadzajac do wartosci pH 9. Pozostale slady sub¬ stancji nierozpuszczalnej pomija sie i zasadowy roztwór wodny ekstrahuje 3 porcjami po 75 ml n- -butanolu. Faze wodna o ciemnoczerwonym zabar¬ wieniu zakwasza sie do wartosci pH 5 za pomoca 6 n HC1 (0,35 ml) i przemywa 2 porcjami po 75 ml n-butanolu. Wodna faze zakwasza sie do wartosci pH 1,5—2,0 za pomoca 6 n HC1 (0,6 ml) i ekstrahuje 2 porcjami po 75 ml n-butanolu. Polaczone ekstrakty butanolowe z ostatniej ekstrakcji zobojetnia sie do wartosci pH 7 za pomoca NaOH i mieszanine za¬ geszcza pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac ' 2 gramy bezpostaciowej soli sodowej prazynomycy- ny o aktywnosci 3440 jednostek na mg.W celu wytworzenia wolnego kwasu, 1 gram soli sodowej rozpuszcza sie w 25 ml destylowanej wody i poddaje dzialaniu zywicy jonitowej o charakterze silnego anionitu, az do uzyskania wartosci pH roz¬ tworu okolo 2,5. Zywice odsacza sie, a wolny kwas wyosabnia z wodnego przesaczu przez liofilizacje, otrzymujac 0,7 g proszku o barwie jasnobrazowej.Aktywnosc produktu wynosi 3200 jednostek na mg.Przyklad III. W celu otrzymania soli baro¬ wej prazynomycyny wytwarza sie wodna zawiesine prazynomycyny o stezeniu 30 mg/ml, dodaje wodne¬ go roztworu wodorotlenku barowego az do otrzy¬ mania wartosci pH 8 i miesza do calkowitego roz¬ puszczenia antybiotyku. Nastepnie dodaje sie 5 objetosci etanolu, odsacza wytracona sól barowa i przemywa ja etanolem. Sól wystawiona na dzia¬ lanie powietrza uwadnia sie, przyjmujac wode w ilosci 9,7% wagowych. Wode te traci przy su¬ szeniu w temperaturze 80° pod cisnieniem 0,1 mm.Analiza uwodnionej soli: C — 40,93%, H — 6,25%, Ba — 9,22%, P — 1,79%. Równowaznik zobojetnie¬ nia przy miareczkowaniu kwasem nadchlorowym = = 647.Postepujac w analogiczny sposób lecz stosujac za¬ miast wodorotlenku barowego równowazne ilosci wodorotlenku sodowego lub potasowego, otrzymuje sie odpowiednio sól sodowa i potasowa.Przyklad IV. W kolbie o pojemnosci 500 ml 125 ml srodowiska o skladzie: maka sojowa 15 g odwodnione tluczone ziemniaki 15 g glikoza 50 g CoCl2 • 2H20 10 ml 5% roztworu CaC03 10 g agar 2,5 g destylowana woda 1 litr, zaszczepia sie kultura Streptomyces hirsutus ATCC 19091, zabezpieczona w liofilizowanym mleku i pod¬ daje hodowli w temperaturze 25°C w obrotowej wstrzasarce w ciagu 96 godzin. 125 ml otrzymanej hodowli dodaje sie do 1000 ml srodowiska o skla¬ dzie rózniacym sie od skladu wyzej podanego tylko tym, ze nie zawiera agaru i w kolbie o pojemnosci 4000 ml poddaje hodowli w temperaturze 25°C w ciagu 48 godzin we wstrzasarce o ruchu posuwisto- -zwrotnym. 1 000 ml otrzymanej mieszaniny dodaje sie do 227 litrów srodowiska o skladzie: makasojowa 15 g preparat skrobi pszenicznej, ryzowej, 5 ziemniaczanej i kukurydzianej 15 g glikoza 55 g CaC03 10 g C0CI2 • 2H20 0,005 g destylowana woda 1 litr 10 i poddaje hodowli w ciagu 72 godzin, doprowadza¬ jac powietrze w ilosci 472 ml/sekunde i mieszajac w ciagu 12 godzin, a nastepnie doprowadzajac po¬ wietrze w ilosci 1416 ml/sekunde i mieszajac. 34 litry otrzymanej mieszaniny dodaje sie do 568 li- 15 trów srodowiska zawierajacego w 1 litrze 60 g maki sojowej, 55 g glikozy, 10 g CaC03 i 0,5 g i srodka przeciw pienieniu i mieszajac i napowie¬ trzajac poddaje hodowli w ciagu 168 godzin. Do brzeczki pofermentacyjnej dodaje sie 6 g kwasu sol- 20 nego, w celu zakwaszenia do wartosci pH 1,5—3,0 i nastepnie filtruje z dodatkiem pomocniczego srod¬ ka filtracyjnego1. "10 kg otrzymanego osadu ekstrahuje sie dwukrot¬ nie metanolem i polaczone, przesaczone wyciagi 25 zobojetnia wodorotlenkiem sodowym do wartosci pH 6—7, a nastepnie odparowuje metanol pod zmniejszonym cisnieniem. Pozostala wodna zawie¬ sine zakwasza sie kwasem solnym do wartosci pH 1,5 i trzykrotnie ekstrahuje 0,25 objetosci chloro- 30 formu. Polaczone wyciagi steza sie pod zmniejszo¬ nym cisnieniem, otrzymany gesty syrop miesza z 4 litrami acetonu i wytrzasa w ciagu 1 godziny, po czym odsacza i osad suszy w temperaturze poko¬ jowej pod zmniejszonym cisnieniem. 35 60 g otrzymanego produktu nierozpuszczalnego w acetonie miele sie, miesza z 3,2 litrami wody (wartosc pH 3,4) i mieszajac alkalizuje za pomoca 25 ml 2,5 n wodorotlenku sodowego do wartosci pH 8,6. Otrzymany zasadowy roztwór ekstrahuje 40 sie 3 porcjami po 800 ml n-butanolu i faze wodna o barwie ciemnoczerwonej zakwasza do wartosci pH 2 za pomoca 82 ml 5% kwasu solnego, a na¬ stepnie ekstrahuje 3 porcjami po 800 ml n-buta¬ nolu. Polaczone wyciagi steza sie pod zmniejszo- 45 nym cisnieniem, otrzymujac bezpostaciowy, kwasny produkt o barwie ciemnobrazowej.Dalsze oczyszczanie produktu prowadzi sie ekstra¬ hujac w przeciwpradzie ukladem chloroform-meta- 50 nol-woda (5:4:2), po czym frakcje zawierajace sub¬ stancje czynna ekstrahuje sie ukladem n-butanol- -octan etylowy-woda (2:1:3). Frakcje zawierajace substancje czynna laczy sie, odparowuje do sucha pod zmniejszonym cisnieniem, pozostalosc rozpusz- 55 cza w metanolu i wytraca prazynomycyne przez dodanie octanu etylowego. Otrzymuje sie prazyno¬ mycyne w postaci bezbarwnego ciala stalego, iden¬ tycznego z produktem otrzymanym w sposób opi¬ sany w przykladzie II. 60 Przyklad V. Postepujac w sposób analogicz¬ ny do opisanego w przykladzie IV, lecz stosujac zamiast szczepu Streptomyces hirsutus ATCC 19091 liofilizowana w mleku kulture Streptomyces pra- sino-pilosus ATCC 19092, otrzymuje sie prazynomy- 65 cyne o wlasciwosciach identycznych z wlasciwos-11 ciami produktu otrzymanego w sposób opisany w przykladach II i IV.Przyklad VI. W celu rozdzielenia mieszaniny prazynomycyny na poszczególne prazynomycyny A, B, C, D i E, prazynomycyne otrzymana w sposób opisany w przykladzie V poddaje sie przeciwpra- dowej ekstrakcji, stosujac uklad rozpuszczalników n-propanol-n-butanol-0,25 n roztwór N-etylomorfo- liny (2:3:6). 4,4 g prazynomycyny rozpuszcza sie w 200 ml dolnej fazy i alkalizuje N-etylomorfolina do wartosci pH 9, po czym w atmosferze azotu przepuszcza 1 500 razy przez aparat do przeciwpra- v dowej ekstrakcji. Frakcje zawierajace poszczególne prazynomycyny laczy sie odpowiednio i odparo¬ wuje z nich rozpuszczalnik pod zmniejszonym ci¬ snieniem. Otrzymane sole N-etylenomorfoliny roz¬ puszcza sie w wodzie i traktuje zywicznym wymie¬ niaczem jonowym uwalniajac kwasy. Po odsaczeniu zywicy przesacz odparowuje sie do sucha pod zmniejszonym cisnieniem, pozostalosc rozpuszcza w metanolu i wytraca kwasy za pomoca octanu etylowego, otrzymujac 600 mg prazynomycyny A, 506 mg prazynomycyny B i 412 mg prazynomy¬ cyny C.Nie wyosobniona prazynomycyne D i prazyno¬ mycyne E rozdziela sie metoda chromatografii bi¬ bulowej i wykrywa metoda biochemiczna. W tym celu 0,1 /big produktu otrzymanego w sposób opisa¬ ny w przykladzie V umieszcza sie w postaci plamy na bibule filtracyjnej o dlugosci 50 cm, dwukrotnie przemytej kwasem i zanurza bibule w acetonowym roztworze dolnej fazy podanego wyzej ukladu roz¬ puszczalników (2:1). Bibule suszy sie w tempera¬ turze pokojowej w ciagu 2—3 minut w celu usu¬ niecia acetonu, po czym rozwija górna faza ukladu rozpuszczalników: n-butanol-pirydyna-woda (4:1:4) w ciagu 16 godzin w temperaturze pokojowej. Roz¬ puszczalniki usuwa sie w powietrzu i bibule bio- autografuje na agarze zaszczepionym za pomoca Staphylococcus aureus 209P.Prazynomycyna A ma wartosc Rf = 0,23, prazy¬ nomycyna B ma Rf = 0,28, prazynomycyna C ma Rf = 0,36, prazynomycyna D ma Rf = 0,38, a war¬ tosc Rf prazynomycyny E wynosi 0,45.Przyklad VII. W celu otrzymania soli poszcze¬ gólnych prazynomycyn, wolne kwasy otrzymane w sposób opisany w przykladzie VI miesza sie z wo¬ da i do zawiesiny dodaje 0,5 n wodny roztwór wo¬ dorotlenku sodowego az do otrzymania wartosci pH 8. Po wymieszaniu dodaje sie do roztworu soli etanol w stosunku objetosciowym 5:1, wytracajac sól sodowa. Sól te odsacza sie, przemywa etano¬ lem i suszy/ Przyklad VIII. W celu oznaczenia skutecz¬ nosci prazynomycyny przeciwko mikroorganizmom, przeprowadza sie próby metoda podwójnego roz¬ cienczania, stosujac do badan prazynomycyne w po¬ staci wolnego kwasu, otrzymanego w sposób opisa¬ ny w przykladzie II. 12 Wyniki podano w tablicy 5.Tablica 5 Badany mikroorganizm Staphylococcus aureus 209P Streptococcus pyogenes C203 Streptococcus agalactiae Salmonella schottmuelleri No. 3850 Salmonella typhimurium No. 3821 Pseudomonas aeruginosa No. 3843 Proteus vulgaris No. 3855 Proteus mirabilis No. 3873 Candida albicans No. 1539 Mycobacterium tuberculosis var B.C.G.I M.I.C. ^g/ml 0,09 0,24 0,25 50,0 50,0 50,0 25,0 18,7 1 50,0 1,0 Przyklad IX. Myszom wstrzykuje sie do 20 otrzewnej dawki 1 000 LD5o organizmu Strepto¬ coccus pyogenes C203 i w 5 godzin po zakazeniu podaje sie podskórnie mieszanine antybiotyków.Wyniki podano w tablicy 6. W rubryce 3 tej tabli¬ cy podano stosunek liczby myszy pozostalych przy 25 zyciu do liczby myszy poddanych badaniu.Tablica 6 Lek badany Penicylina C Prazynomycyna Bez antybiotyku Mg/Kg 2 1 0,5 10 5 2,5 1,25 — S/T 2/10 3/10 1/10 10/10 6/10 8/10 4/10 0/10 [ 40 PL PL

Claims (2)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania nowego antybiotyku prazy¬ nomycyny, bedacego mieszanina prazynomycyn A, B, C, D i E, znamienny tym, ze szczep Streptomy- ces prasinus ATCC 15825, Streptomyces hirsutus ATCC 19091 lub Streptomyces prasino-pilosus ATCC 19092 poddaje sie hodowli w wodnym srodowisku odzywczym w warunkach aerobowych, po czym utworzony antybiotyk wyosabnia sie w postaci mie¬ szaniny na drodze ekstrakcji brzeczki pofermenta¬ cyjnej i oczyszcza w znany sposób i ewentualnie rozdziela na prazynomycyne A, B, C, D i E, ko¬ rzystnie przez ekstrakcje w przeciwpradzie lub za 55 pomoca chromatografii bibulowej, albo mieszanine prazynomycyny lub poszczególne jej skladniki ewentualnie poddaje w znany sposób reakcji z za¬ sada, wytwarzajac sole prazynomycyny lub jej skladników z metalami alkalicznymi lub z meta- 60 lami ziem alkalicznych.KI. 30h,6 66 009 FIG. 1 MKP C12d 9/14 50 H U~ ty- p-l- p- 00 40oo ^ 300C 1 • 71 /« / f- /— ) 9.1! / - - 00 0 2000 1800 T [ 1 ~~)\ lA -B 1 ;- A / / ^ 400 \;A V 1200 1100 -:- •-• ¦Al-in /:0Ky i y r ~p I_^ ;:: U -V _i ....;._. ...j .. !¦: S~ 1000 950 ....;_:. I —f 3 ¦¦-[- .....;._ ----- i 7 ?00 — ._._.. 1 850 — - — ....._. o 800 -•- -r- --: ._.:.... ^™ ,_j .. .___ 750 — —-- _.:... 700 65 1 r ¦¦ i ; i i i — i- —^— . i i i —:—^— 1 10 11 12 13 14 15 FIG. 5000 4000 300C i i IH N ' 1 •i: . i i ;| k i ;i frrlii £¦}¦¦¦[ | -.; fcrt.7 B^ ) 2500 2000 1800 f H \\ M ," 1 —-- -4 - ! i tól^S:":^!;."!': I":."!- 1 ^SiSg^^k r^^rjfe*i-;i -^^1^^'^Li^fe'/ f^^^;::;i^^*p5F?! tH ¦-:fT"r<" i i £* \ , . ml , i i \- 4- ' i : 1 .! | 1600 - ¦ y '.{ J- -f . — 400 /\ l f • S i ;:-| ; • : i ¦ Ll^it^ZJlfeLlJ -j.'_j tr ^-^."T -I T •- 5 r J V i 1 i ! ! 1 ¦ ¦¦4-4-)-- ¦i" i i ¦ ! 1 ! y 1200 ¦¦:- - - -- j I I 1 ----- —- \ i *S \ j_L L_L l_L 1_. c 1tb T T i ^_ "i .. |.. . < I0C T 4 ! i I s . 10 ' / u i / / 1 00 950 , . i . r 1 ! 0 — W ! | i 850 1 ? 9 o!s -F^ T T 1 6( | . L. i ' 1 2 » " /" = . |.. . 1 750 — - ^T, 3 l 700 , ~t^ 4 50 ; ; j ¦ ;.- . 1* a Hk" T L_nm i 5 FIG. t3 &¦ Ef:;- IL] fffr^ BPf;i ffit: 00 40 7= !r:! :|j: rtt: jj:: :i N i im rH! 00 S; j *^?l|*H ' i 30W i 1 ! —1— ; \t\ i y / j 25 i i a , "i-1 , | 2000 ' !. r. *—i— —f— —1— -4- -^rn ! f 1 ^ ie i " ~T" i 1 —j— 4J 5 00 Y i 1 i 1600 -— b — ta . 4 _2l |i A V| 400 --— ii *" ./*! f i 7 ^ —i r ^ 0 g « 1200 r _ H + pp ^\ E i i1--1 <^ 1 i : "" I0C ^^ -^ i 10 +. i ^ 1 30 9 ; -{¦¦' r ^ iili 0 P^ ^ i 50 c i - J ^~ ^ KW , 9 1 «| ri h 850 -f- * '¦ 4-|- ,t f~ L_ 1 8C .. L — _.

2. K) -; - -T- i ¦^. ^ 1 750 . T | :- .. L... i ^-P- ± -H —i—i 3 -1-- —f- ._^ | 1 700 -r I - -H —j— ! 4 650 ,J _ : A ! - Gj _1 i • 1 1 -:- *..J— i l_ 5KI. 30h,6 66 009 MKP C12d 9/14 FIG. 30004000 K pjn El M^ E:h Ej ej; gjj: fci:. li 1 ti. Btii" i i . i Si \~ l 300C ! 'a ifl n i =y H L/ 1 1 25 , ! —i— i 00 20 ^- 1 ' —T~*f ¦ 00 If - [ ^~ \ JO0 \ V -- A- ^ t 1600 —- — —/ r ¦-¦¦ ft\ i\ / \ f \ 400 —r^ i..... I20C -: i " P Prt RF r v ¦ /-\o ^p 1 1 i ) 1 100 i - i i UU 3 < -•- ... I_ i i 1 __P ) 10 --- ""P 1 3 1 X) 9 - sy -i- 0 50 £ ) 850 1 L— aoo 75C 700 650 = 1 : T . 1 : 1 ; 1 : 1 1 1 j , i r- { (•¦ J\ * i i p 0 -P ¦¦¦+¦- % : 0i» _i_ ^P -:- ^ —|— 12 ¦- V s. i —i— -;- _..:. P^ 13 14 ! 2 i i i 1 1 1 ! X 1 "^f ' 1 ii . 1 15 2040 — LDA — 20.5.72 — 190 egz. Cena zl 10.— PL PL