PL46863B1 - - Google Patents

Description

Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania oddzielnie spiramycyny I, II lub III i ich soli przy zastosowaniu, jako materialów wyjscio¬ wych, mieszanin utworzonych badz ze spira¬ mycyn I, II i III, badz ze spiramycyny II i III.Spiramycyna jest antybiotykiem, wytworzo¬ nym przez fermentacje szczepu streptomyces S-3486 (NRRL nr 2420) sposobem opisanym w patencie francuskim nr 1.159.160 i stanowi w rzeczywistosci mieszanine trzech- róznych zwiazków o bardzo zblizonym skladzie chemicz¬ nym. Istnienie tych trzech zwiazków zostalo analitycznie wykazane przez rozdzielenie ich w przeciwpradzie za pomoca urzadzenia Craig'a, przy zastosowaniu cykloheksanu i wodnego roztworu spiramycyny, zawierajacego lVo fos¬ foranu dwusodowego. Zwiazki te oznaczone da¬ lej jako spiramycyna I, II i III zostaly roz¬ dzielone w stanie czystym i to rozdzielanie wlasnie stanowi przedmiot niniejszego wyna¬ lazku. Glówne charakterystyczne cechy fizycz¬ ne spiramycyny I, II i III podane sa w tabeli na str. 2.Tabela I Wzór sumaryczny C°/o Sklad H«/o elemen- 0°/o tarny N°/o Ciezar czasteczkowy (ebuliometrycznie) Równowaznik zobojetnienia pk b.Temperatura topnienia (na bloku Maauenna) 20' (a) D (c = l°/o w metanolu) „ „ (c = l°/o w metanolu) „ „ (c = l°/o w chloroformie)' Widmo nadfiolkowe (roztwór etanolowy): dlugosc fali maksimum absorpcji: 1% E a 232mpi 1 cm Widmo podczerwone Chromatografia papierowa Rf (1) Spiramycyna I C H O N 46-48 79-83 16-17 2 60,3 8,7 28,5 ¦ 3'2 okolo 800 463 7,7 134 — 137° — 96° — 91° — 57° 232 mu 322 Spiramycyna II C H O N 46-48 79-83 15-16 2 61,6 8,5 26,8 3,1 okolo 800 464 7,6 130 — 133° — 86° — 80° — 55° 232 mu 307 (porównac z tabelka II) 0,04 0,01£ Spiramycyna III C H O N 46-48 79-83 15-16 2 61,0 8,5 26,7 3,0 okolo 800 473 7,6 128 — 131° — 83° — 79° — 50° 232 m[i 327 0,22 (1) Chromatografia przeprowadzona na pa¬ pierze Whatmana nr 1, impregnowanym roz¬ tworem buforowym o pH = 9 (Na^H PO^ • • 12H20 23,8 g/litr), przy zastosowaniu, jako rozpuszczalnika rozwijajacego faze lekka ukla¬ du cykloheksanu metyloizobutyloketonu i wody (w stosunku objetosciowym 85:15:25). Technika splywowa. Przesuniecie frontu rozpuszczalnika 40 cm w 4 godzinach: w temperaturze 25°C.Stwierdzenie biologiczne na plycie z zelatyny z posiewem.Widma absorpcyjne podczerwone tych zwiaz¬ ków zostaly oznaczone i sa przedstawione na fig. 1 (dla spiramycyny I), na fig. 2 (dla spi- ramycyny II) i na fig. 3 (dla spiramycyny III).Na odcietych naniesiono dlugosci fal z jednej strony w mikronach (skala nizsza) i w cm-1 ((skala wyzsza), a na rzednych naniesiono % transmisji. W tabeli II oznaczono glówne pasma absorpcyjne dla trzech produktów.Tabela II Widmo absorpcyjne podczerriyone zasad spira- mycynowych I, II i III.Widmo zmierzono na produkcie stalym spa- stylkowanym z bromkiem potasu. Polozenie pasm absorpcyjnych jest wyrazone w cm-1.Podstawa I Podstawa II Podstawa III 3470 F 2970 F 2940 F 1735 F 1455 m 1378 m 1317 m 1275 m 3460 F 2970 F 2940 F 1740 F 1457 m 1372 m 1300 m 1275 m 3470 F 2970 F 2940 F . 1740 F 1460 m 1380 m 1370 m 1300 m 1280 m1237 m 1240 m 1232 F 1160 F 1122 F 1090 F 1052 tF 1015 F 993 F 905 m 865 f 840 m 810 m 782 m 1160 F 1122 F 1085 F 1052 tF 1015 F 993 F 940 m 905 m 860 m 840 m 810 f 782 m 685 m 1185 m 1162 F 1122 F 1085 F 1052 tF 1015 F 995 F 906 m 865 f 842 m 810 m 782 m 695 f 685 f tF — absorpcja bardzo silna F — absorpcja silna m — absorpcja srednia f — absorpcja slaba.Róznice widmowe miedzy tymi trzema pro¬ duktami polegaja glównie na róznicach wzgled¬ nej intensywnosci pasm absorpcyjnych. Róz¬ nice widmowe wystepuja w przypadku zwiaz¬ ków rozpuszczonych w czterochlorku wegla, co wskazuje, ze nie sa one spowodowane roz¬ maitymi stanami krystalizacji.Sposób wedlug wynalazku polega na roz¬ dzieleniu spiramycyny I, II lub III w przeciw- pradzie, metoda która zostala zastosowana do wykazania istnienia trzech spiramycyn, przy czym rozdzial ten mozna przeprowadzic na przyklad za pomoca urzadzenia Craig'a (A.Weissberger — Techniaue of organie chemistry — Interscience Publishers — New York, tom III, strona 286), w temperaturze 0 — 50°C, naj¬ korzystniej jednak w temperaturze 20—25°C.Ze wzgledu na slaba rozpuszczalnosc spiramy¬ cyny w cykloheksanie, który byl stosowany jako rozpuszczalnik przy wstepnych pracach badawczych spiramycyn, lepiej jest zastapic go rozpuszczalnikiem grupy weglowodorów aro¬ matycznych (na przyklad benzenem) lub tez weglowodorem alifatycznym lub aromatycznym chlorowanym (na przyklad dwuchloroetanem) lub mieszanina tych rozpuszczalników. Jako druga faze stosuje sie roztwór buforowy o pH = 6 — 7. Do rozdzialu stosuje sie oby¬ dwie fazy (wodna i organiczna), uprzednio wza¬ jemnie nasycone, to znaczy, ze roztwór bu¬ forowy o pH = 6 — 7 nasyca sie uprzednio stosowanym rozpuszczalnikiem organicznym (benzenem, dwuchloroetanem). Z drugiej strony rozpuszczalnik organiczny nasyca sie zastoso¬ wanym roztworem buforowym. Aby uzyskac to wystarczy na przyklad zmieszac jedna obje¬ tosc rozpuszczalnika organicznego z jedna obje¬ toscia roztworu buforowego, wstrzasnac i zde- .kantowac mieszanine. Otrzymane po dekantacji dwie fazy sa wzajemnie nasycone.Mieszanine spiramycyn poddawana rozdzia¬ lowi rozpuszcza sie w frakcji organicznej, przy czym objetosc tej frakcji odpowiada objetosci fazy organicznej, wprowadzanej do jednej lub kilku pierwszych komór aparatu rozdzielczego, pracujacego w przeciwpradzie. Najlepiej byloby wprowadzic cala ilosc spiramycyny do komory pierwszej, poniewaz w tym przypadku nasta¬ pilby najlepszy rozdzial, lecz ze wzgledu na ograniczona rozpuszczalnosc spiramycyny, pod¬ dawanej obróbce najczesciej w znacznych ilos¬ ciach, jest to utrudnione. Rozprowadzajac spi- ramycyne do dwóch, trzech lub czterech pierw¬ szych komór, nastepuje rozdzial w granicach, które jeszcze mozna przyjac.Frakcjonowanie przeprowadza sie w sposób zwykly w aparaturze Craig'a. Poszczególne spiramycyny przechodza stopniowo do fazy wod¬ nej, przy czym kazda z nich posuwa sie z inna szybkoscia od jednej komory do drugiej. Gdy frakcjonowanie jest zakonczone, kazda ze spi¬ ramycyn jest umiejscowiona w pewnej ilosci komór. Wówczas laczy sie zawartosc komór odpowiadajacych tej samej spiramycynie i al- kalizuje ja. Kazde ze spiramycyn wydzielo¬ nych w ten sposób w postaci zasady przechodzi do fazy organicznej, z której nastepnie wyo- sabnia sie ja przez odparowanie rozpuszczalnika.Pozostalosc po odparowaniu w przypadku spi¬ ramycyny II i III przekrystalizowuje sie z roz¬ puszczalnika grupy weglowodorów aromatycz¬ nych, na przyklad z benzenu.Jako mieszanine spiramycyn mozna stoso¬ wac badz surowa mieszanine trzech spiramy¬ cyn, jaka otrzymuje sie wychodzac z bulionów fermentacyjnych, badz mieszanine spiramycyny II i III pochodzaca z frakcjonowanej krysta¬ lizacji mieszaniny trzech spiramycyn, badz lugi macierzyste z tej frakcjonowanej krystalizacji, które sa silnie wzbogacone w spiramycyne I.Spiramycyny I, II i III posiadaja prawie, ze to samo widmo antybakteryjne i ta sama aktywnosc, co spiramycyna wyjsciowa. Przez okreslenie „widmo antybakteryjne" rozumiana jest aktywnosc hamujaca produktu w stosunku do okreslonej liczby zarodków zespolu gatun¬ ków drobnoustrojów.Poafcfez* przyklady, które nie ograniczaja wynaltricu, ilustruja hliiej sposób jego prze¬ prowadzenia.Przyklad I. 20 gramów spiramycyny w po- staci surowej zasady rozdziela sie w aparatu¬ rze Cralg'a posiadajacej 60 komórek, kazda o pojemnosci 200 ml. Jako rozpuszczalniki stosuje sie: benzen (1 objetosc) oraz 1 objetosc roztworu buforowego o pH = 0,47, <6r36 granów KH2POA, 7,14 gramów NA2H PO^ . 12H2Of wo¬ dy do 1 litra). 100 ml fazy wodnej doprowadza sie do kazdej z komór aparatury Craig^ ustawionej w po¬ mieszczeniu o temperaturze 24°C i rozpuszcza sie spiramycyne w 200 ml fazy benzenowej, po czym przeprowadza sie rozdzielanie spira¬ mycyny wedlug normalnie przyjetej techniki.Do pierwszej komory wprowadza sie 100 ml roztworu spiramycyny w fazie benzenowej, miesza sie i pozostawia do zdekantowania, nastepnie odprowadza sie faze benzenowa do drugiej komórki, po czym do pierwszej ko¬ mory wprowadza sie znowu 100 ml swiezego roztworu spiramycyny w fazie benzenowej.Zawartosc komory drugiej wytrzasa sie, de- kantuje, a faze benzenowa przenosi z drugiej komory do trzeciej. Frakcjonowanie przepro¬ wadza sie analogicznie dalej, wprowadzajac zawsze po kazdej dekantaeji 100 ml swiezej fazy benzenowej do pierwszej komory. Po 50 seryjnych przenoszeniach rozdzial zostaje za¬ konczany.Faze wodna zebranej zawartosci kazdej ko¬ mory alkalizuje sie za pomoca rozcienczonego roztworu sody do pif = 9 — 10. Calosc mie¬ sza sie, dekantuje, a nastepnie oddziela sie faze benzenowa. Z kolei przeprowadza sie dru¬ ga ekstrakcje fazy wodnej za pomoca 40 ml benzenu. Calkowita objetosc ekstraktu benze¬ nowego doprowadza sie do objetosci 150 ml.Ilosc suchego ekstraktu oznacza sie w stosunku do kazdorazowo wprowadzonej równej ilosci roztworu benzenowego i wykresla sie krzywa przedrtawUijara stezenie suchego ekstraktu w kazdej komorze. Otrzymuje sie trzy maksima stezen, które odpowiadaja wspólczynnikom roz¬ dzialu nastepujacych trzech skladników: Komora Wspólczynnik rozdzialu z maksimum = Stezenie fazy benzenowej stezenia Stezenie fazy wodnej: ProduktA 11 Ki = 0,22 Produkt B 25. Ku = 0,71 ProduktC 37 KIII = 1,6 Porównanie krzywej eksperymentalnej roz¬ dzialu z krzywa wyliczona wedlug znalezionych wspólczynników rozdzialu wskazuje, ze roztwo¬ ry znajdujace sie w nastepujacych komorach ^zawieraja skladniki w stanie czystym: produkt A — w komorach 5—* 15 B- „ 21—28 „ C — „ 35 — 45 Roztwory benzenowe, zawierajace ten sam skladnik w stanie czystym laczy sie razem.Rozpuszczalnik odpedza sie przez destylacje pod zmniejszonym cisnieniem, a pozostalosc po des¬ tylacji suszy w prózni (w ciagu 6 godzin w tem¬ peraturze 40°C pod cisnieniem 1 mm).Otrzymuje sie w ten sposób: produktu A — 7,8 gramów B — 2,9 „ C - 3,4 Produkt A suszy sie az do stalej wagi w su¬ szarce prózniowej (temperatura 40°C — cis¬ nienie 1 mm — czas 12 godzin).Charakteryzuje sie on nastepujacymi danymi: sklad: •/• C = 00,3; •/• H = 8,7; •/• O =28,5; */• N = 3,2; temperatura topnienia (na bloku Maauenna) = 134 — 137 °C skrecalnosc (a) ** (c = l%v w metanolu) 96°, 20 widmo nadfiolkowe (w etanolu, jako rozpusz¬ czalniku) — maksimum absorpcji 232 mft [E 1V* = 322 I 1cm J Wyzej wymienione stale sa identyczne ze sta¬ lymi spiramycyny I (tabela I).Chromatografia na papierze Whatmanna nr 1, przepojonym roztworem buforowym o pH = 9 (Na2HP04 • 12H20 — 23,8 g/1), przy zastosowaniu, jako rozpuszczalnika rozwijajacego faze lekka ukladu cykLahefcsaa-metyloizobutyloketon-woda zastosowaniu techniki splywowej z rozwinie¬ ciem w czterech godzinach w temperaturze 25°C, wykazuje, po wywolaniu na plycie zela¬ tynowej posianej bakteria B. subtilis obecnosc tylko jednego produktu charakteryzujacego sie Rf = 0,04. 2 g zasady spiramycyny I przeprowadza sie w siarczan przez rozpuszczenie jej w 5 ml metanolu* i nastepne wprowadzenie do otrzy¬ manego roztworu kwasu siarkowego rozpusz¬ czonego w metanolu przy pH roztworu = 5,5.Nastepnie w celu wytracenia siarczanu spira¬ mycyny, roztwór wprowadza sie do 250 ml bezwodnego eteru stosujac przy tym mieszanie.Strat suszy sie. — 4 —Ciezar otrzymanego siarczanu — 1,05 g so4v» . = io,« g (a) *• (c = 2»/o, w wodzie) = —75° ±1° D Mozliwe jest równiez otrzymanie metoda wy¬ zej opisana- innych s&li spiramycyny na przy¬ klad chloranu, azotanu, nadchloranu, ftalanu. 3 g produktu B rozpuszcza sie w 4 ml wrza¬ cego benzenu, po czyim roztwór oziebia sie do temperatury 1Q°C, a po 15 godzinach otrzymane krysztaly odsacza sie, przemywa za pomoca 0,2 ml benzenu i suszy. Otrzymuje sie w ten sposób 1,57 g krystalicznego produktu, o tem¬ peraturze topnienia 129—132°C.Przeprowadzajac druga krystalizacje w tych samych warunkach, uzyskuje sie produkt o tem¬ peraturze topnienia 130—133°C, posiadajacy nastepujaca charakterystyke: sklad: C% = 61fi; HVo = 8,5; OV* = 26,8; NVt = 3,1 (a) *° (c = l°/o w metanolu) = — 86° D widmo nadfioMcowe (w roztworze etanolu) : maksimum absorpcji przy 232 mu- Fe 1V* 307 1 [ 1 cm J Stale te odpowiadaja stalym spiramycyny II (tabela I). w Chromatografia przeprowadzona na papierze w tych samych warunkach, jak dla spiramycy¬ ny I wykazuje obecnosc jednego produktu cha¬ rakteryzujacego sie Rf = 0,15. 2 g spiramycyny II przeprowadza sie w siar¬ czan waga uzyskanego siarczanu: 1,9 g S04°/o 9,8 (a) 20 (c = 2Vo w wodzie): —72° ±1° D 3 g produktu C rozpuszcza sie w 6 ml ben¬ zenu w etanie wrzenia, roztwór oziebia sie do temperatury 10°C. Po 15 godzinach uzyskane krysztaly odsacza sie, przemywa 0,3 ml ben¬ zenu i suszy. Otrzymuje sie w ten sposób 1,9 g krystalicznego produktu, o temperaturze top¬ nienia 127 — 130°C.Druga krystalizacje przeprowadzono analo¬ gicznie, jak pierwsza. Otrzymano produkt o tem¬ peraturze topnienia 128 — 131 °C o nastepu¬ jacych cechach charakterystycznych: sklad: C°/o = 61; H"/o = 8,5; Ó«/t = 26,7; N°/o = 3,0 (a)20 (c = l°/o w-metanolu) = —83° D * widmo nadfiolkowe (w roztworze etanolu): maksimum absorpcji przy 232 m* TE ™ = 327 1 [ lem J Te stale odpowiadaja spiramycynie III (tabe¬ la I).Chromatografia papierowa przeprowadzona w tych samych warunkach, jak w przypadku spiramycyny I, wskazuje na obecnosc jednego produktu charakteryzujacego sie Rf = 0,22. 2 g spiramycyny III przeksztalca sie na siar¬ czan waga uzyskanego siarczanu: 1,85 S040/o 9,5 (a) 20 (c = 2*/# w wodzie): —72° ±1° D Przyklad II. 20 g mieszaniny spiramycyny II i III, otrzymanych przez przekrystalizowanie z benzenu surowej mieszaniny spiramycyn I, II i III, posiadajacej nastepujacy sklad: Spiramycyna II: 56°/© wagowych „ III: 4&I* wagowych rozdziela sie w aparaturze Crai^a stosowanej podczas rozdzialu opisanego w przykladzie I.Rozdzial przeprowadza sie, jak opisano w tym przykladzie, przy zastosowaniu nastepujacych rozpuszczalników: benzenu (1 objetosc) i roztworu buforowego o pH = 6,24 (NatHPO* • 12HtO : 4,8 g, wody dopelniono do 1 litra) (1 objetosc).Po przeprowadzeniu rozdzialu, fazy wodne ekstrahuje sie benzenem i oznacza suchy eks¬ trakt kazdego roztworu benzenowego. Krzywa rozdzialu posiada dwa maksima, odpowiadajace spiramycynom II i III wyrózniajacym sie na¬ stepujacymi wspólczynnikami rozdzialu: Komórki Wspólczynnik rozdzialu z maksimum=Stezenie w fazie benzenowej stezenia Stezenie w fazie wodnej spiramycyna II 11 Kii 0,22 spiramycyna III 26 Kin 0,76 Porównanie krzywej doswiadczalnej rozdzialu z krzywa wyliczona wedlug znalezionych wspól¬ czynników rozdzialu wykazuje, ze obydwa skladniki znajduja sie w stanie czystym w roz¬ tworach pochodzacych z nastepujacych komó¬ rek: spiramycyna II : komórki 6 — 15 - III : „ 21 — 31 Roztwory benzenowe z tych dwóch grup ko¬ mórek suszy sie, a uzyskane zasady krystali¬ zuje z benzenu, jak w przykladzie I. — 5 —Otrzymuje sie w ten sposób 7,2 g spiramy- cyny II i 5,1 g spiramycyny III w stanie kry¬ stalicznym, których charakterystyki sa naste¬ pujace: Spiramycyna II Spiramycyna III Temperatura topnienia (w bloku Maauenna) 130—132° 20 (a) — 86c 128 — 130° — 82° (c = !•/• D w metanolu) widmo nadfiolkowe (w roztworze etanolowym) E 10/l 1 cm chromatografia na papierze 1 produkt 1 produkt „ „ „ Rf 0,15 0,22 przy 232 m\i 305 325 PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób rozdzielania spiramycyn I, II lub III, w aparacie rozdzielczym Craig'a w przeciw- pradzie za pomoca rozpuszczalnika organicz¬ nego, znamienny tym, ze mieszanine spira¬ mycyny I, II i III luib mieszanine spiramy¬ cyny II i III poddaje sie frakcjonowaniu w aparacie rozdzielczym w przeciwpradzie posiadajacym pewna ilosc komórek, przy zastosowaniu fazy organicznej skladajacej sie z rozpuszczalnika grupy weglowodorów aromatycznych lub chlorowanych weglowo¬ dorów alifatycznych albo aromatycznych i fazy wodnej, skladajacej sie z roztworu buforowego o pH = 6 — 7, przy czym oby- • dwie fazy uprzednio wzajemnie sie nasyca, a mieszanine spiramycyn wprowadza do apa¬ ratu w postaci roztworu w czesci fazy orga¬ nicznej, nastepnie zbiera sie zawartosc ko¬ mórek odpowiadajaca poszczególnym spira- mycynom, alkalizuje w kazdej w ten spo¬ sób utworzonej frakcji faze wodna, zawie¬ rajaca poszczególna spiramycyne, nastepnie miesza obydwie fazy aby przeprowadzic po¬ szczególna, uwolniona w ten sposób spira¬ mycyne w faze' organiczna, oddziela kazda faze organiczna i wydziela kazda ze spira¬ mycyn przez odparowanie odpowiedniego roztworu, przy czym pozostalosc odpowia¬ dajaca spiramycynie II wzglednie III prze- krystalizowuje sie nastepnie z rozpuszczal¬ nika grupy weglowodorów aromatycznych.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako mieszanine spiramycyn stosuje sie surowa mieszanine trzech spiramycyn, taka jaka otrzymuje sie z bulionów fermentacyj¬ nych. Rhóne — Poulenc Zastepca: inz. J. Felkner rzecznik patentowy WIDrtO DODCZ€RWON£ SPIftA/nYCYNV DLUGOSC fAll W cm*1 *o— ioo« i%o» lloo **** iwo psa n l <| 10 l\f 1 V ~}< V •n l ^ \ V V \ r V /- f 1 r\ j /A/ * -^ ' * * 6 DLU60SC fALI W MIKRONACH ZASADA IDo opisu patentowego nr 46863 WID/no PODCZERWONE SPIRAAWCYNY ZASADA U *11SJI 1/1 z < cc DLU&OSC FALI W cm-1 100 " V 60 < 20 2 (\( 1 S i — — ' • ! ^1 1 1«00 r\ 6 1 1100 1)00 \[* 1 1100 l/U u\Ai . 1100 1000 fSO \ Jl \ V A f i !• 10 1 900 |So /V/ •00 ^v no IDO 650 « t»' h 13 DLUGOSC fALI W MIKRONACH Flq. 2 WIDMO PODCZERWONE SPIRAAWCYNY ZASADA HI Oi-UGOSC FALI W Cm"' *000 Jooo iZoo 2ooo iw \hoo moo 1209 lico looo «so 900 |So 600 r^ i P \ 60 ko 20 II ^»_»— ¦ ~^l V PC 1 VVV \n ir V A / / pj / V \/ * ,3/ H 5 6 DLUGOSC fALI W MIKRONACH io u u n FI&.-3 PL