PL247914B1

PL247914B1 - 8-Bromo-6-chloro-4’-O-β-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)- flawon i sposób wytwarzania 8-bromo-6-chloro-4’-O-β-D-(4”-Ometyloglukopiranozylo)- flawonu

Info

Publication number: PL247914B1
Application number: PL443539A
Authority: PL
Inventors: Martyna Perz; Edyta Kostrzewa-Susłow; Monika Dymarska; Tomasz Janeczko
Original assignee: Wrocław University Of Environmental And Life Sciences
Priority date: 2023-01-20
Filing date: 2023-01-20
Publication date: 2025-09-15
Also published as: PL443539A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest 8-bromo-6-chloro-4'-O-β-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-flawon o wzorze 2 oraz Sposób wytwarzania 8-bromo-6-chloro-4'-O-β-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-flawonu charakteryzujący się tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Isaria farinosa KCH J2.6, następnie po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 8-bromo-6-chloroflawon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 96 godzin, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest 8-bromo-6-chloro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawon o wzorze 2 przedstawiony na rysunku.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania 8-bromo-6-chloro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawonu.

8-bromo-6-chloro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawon może znaleźć zastosowanie jako związek przeciwdrobnoustrojowy, zwłaszcza w zwalczaniu bakterii gram-dodatnich, jako związek przeciwpierwotniaczy oraz jako związek zwiększający aktywność metaboliczną CYP3A4, zwłaszcza stosowany w preparatach farmaceutycznych.

Znany jest szczep Isaria farinosa KCH J2.6 ujawniony w literaturze Kozłowska E., Hoc N., Sycz J., Urbaniak M., Dymarska M., Grzeszczuk J., Kostrzewa-Susłow E., Stępień Ł., Pląskowska E., Janeczko T., (2018) Biotransformation of steroids by entomopathogenic strains of Isaria farinosa. Microbial Cell Factories 17, 1-11.

W ostatnich latach, w leczeniu różnych chorób i ich zapobieganiu, coraz większe znaczenie zyskują związki pochodzenia naturalnego oraz ich odpowiedniki uznawane za naturalne, które uzyskano na drodze przekształceń mikrobiologicznych. Dlatego istotne jest opracowywanie nowych metod wytwarzania związków aktywnych biologicznie na drodze biotransformacji, użytecznych dla przemysłu farmaceutycznego.

W dostępnej literaturze brak jest informacji na temat otrzymywania 8-bromo-6-chloro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawonu.

Istotą wynalazku jest 8-bromo-6-chloro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawon.

Istota sposobu polega na tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Isaria farinosa KCH J2.6. Po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 8-bromo-6-chloroflawon, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą. T ransformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, przez co najmniej 96 godzin. Następnie produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą oraz oczyszcza chromatograficznie. 8-bromo-6-chloro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawon znajduje się we frakcji o pośredniej polarności, w czwartym paśmie od linii startu.

Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,1 mg:1 cm³.

Korzystnie także jest, gdy proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Dodatkowo, korzystnie jest, gdy transformację prowadzi się przez 10 dni.

Korzystnie również jest, gdy oczyszczanie prowadzi się wykorzystując cienkowarstwową chromatografię preparatywną w układzie eluującym z chloroformem i metanolem w stosunku objętościowym 9:1.

Postępując zgodnie z wynalazkiem, w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Isaria farinosa KCH J2.6, następuje przyłączenie 4-metoksy-^-D-glukozy przy C-4’. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą (octan etylu).

Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie 8-bromo-6-chloro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawonu w temperaturze pokojowej i przy pH naturalnym dla szczepu oraz wykorzystując mikroorganizm niebędący patogenem ludzkim.

Wykorzystanie biotransformacji, zamiast syntezy chemicznej, umożliwia, w sposób przyjazny dla środowiska, uzyskanie związków o większej biodostępności i aktywności biologicznej, niż użyte substraty.

Wynalazek jest bliżej objaśniony na przykładzie wykonania.

Przykład. Do kolby stożkowej o pojemności 2000 cm³, w której znajduje się 500 cm³ sterylnej pożywki zawierającej 10 g aminobaku i 30 g sacharozy, wprowadza się szczep Isaria farinosa KCH J2.6. Po 72 godzinach jego wzrostu dodaje się 50 mg 8-bromo-6-chloroflawonu o wzorze 1, rozpuszczonego w 1 cm³ dimetylosulfotlenku. Transformację prowadzi się w 25 stopniach Celsjusza przy ciągłym wstrząsaniu przez 10 dni. Następnie mieszaninę poreakcyjną ekstrahuje się dwukrotnie octanem etylu, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Otrzymany ekstrakt oczyszcza się chromatograficznie z zastosowaniem jako eluentu mieszaniny chloroformu i metanolu w stosunku objętościowym 9:1. Produkt znajduje się we frakcji o pośredniej polarności, w czwartym paśmie od linii startu.

PL 247914 Β1

Na tej drodze otrzymuje się 15,4 mg 8-bromo-6-chloro-4’-0-/?-D-(4”-0-metyloglukopiranozylo)-flawon o wzorze 2 z wydajnością 19,59%. Stopień konwersji substratu według HPLC > 98%.

Uzyskany produkt charakteryzuje się danymi spektralnymi przedstawionymi w tabeli 1.

Tabela 1. Opis sygnałów pochodzących z widma ¹H NMR (601 MHz, Aceton-de)

Sygnały pochodzące od szkieletu flawonoidowego	Sygnały pochodzące od jednostki cukrowej
δ [ppm]	J[Hz]	H	δ [ppm]	J [Hz]	H
5,81 (dd)	12,6; 3,0	2	5,12 (d)	7,7	1”
6,9 (s)		3	3,52 (m)		2”
8,12 (m)		5	3,66 (t)	8	3”
8,01 (d)	2,5	7	3,24 (t)	9,3	4”
8,12 (m)		2’	3,56 (d)	1,7	5”
8,12 (m)		6’	3,87 (d) 3,71 (m)	11,5	6”
7,27 (d)	8,9	5'	4,75 (s)		C2”-OH
7,27 (d)	8,9	3’	4,47 (s)		C3”-OH
			3,83 (m)		C6”-OH
			3,58 (s)		C4”-OCHs

Wykonane badania modelowania aktywności 8-bromo-6-chloro-4’-0-/?-D-(4”-0-metyloglukopiranozylo)-flawonu przy użyciu platformy PASS online wykazały z prawdopodobieństwem 92,0%, że związek może być inhibitorem glicerofosfotransferazy CDP-glicerol. Glicerofosfotransferaza CDP-glicerol odpowiada za polimeryzację głównego łańcucha kwasu tejchojowego związanego ze ścianą komórkową bakterii gram-dodatnich. Kwas tejchojowy jest ważny w patogenezie i odgrywa kluczową rolę w oporności bakterii na antybiotyki. Kwasy tejchojowe (WTA) i przyłączone do nich podstawniki przyczyniają się do ładunku powierzchniowego i hydrofobowości komórki bakteryjnej, co z kolei wpływa na wiązanie cząsteczek pozakomórkowych. Wpływając na właściwości powierzchni komórek, WTA odgrywają zatem rolę w ochronie bakterii przed różnymi zagrożeniami i niekorzystnymi warunkami. W przypadku braku WTA bakterie są wrażliwe na wysokie temperatury i niezdolne do wzrostu w pożywkach o wysokiej zawartości soli, co wskazuje, że WTA są zaangażowane w tolerancję temperatury i stres osmotyczny. Dzięki temu 8-bromo-6-chloro-4’-0-/?-D-(4”-0-metyloglukopiranozylo)-flawonu może przyczynić się do zwalczania patogennych bakterii gram-dodatnich w organizmie człowieka (Brown, S., Santa Maria Jr, J. P., & Walker, S. (2013). Wall teichoic acids of gram-positive bacteria. Annual review of microbiology, 67, 313-336).

Kolejną cechą uzyskanego związku wykazaną przy użyciu platformy (PASS online) z prawdopodobieństwem 82,3% są właściwości przeciwpierwotniacze. Wywoływana przez pierwotniaki Leishmania choroba Leiszmanioza może występować w postaci trzewnej, skórnej czy skórno-śluzowej, a nieleczona powoduje śmierć. Dotyka ona miliony ludzi żyjących głównie na obszarach Ameryki Łacińskiej, Afryki i Azji Południowej. Obecnie w leczeniu tej choroby wykorzystuje się kurację antybiotykową lub leki cytostatyczne. Wykazane właściwości przeciwpierwotniacze 8-bromo-6-chloro-4’-0-/?-D-(4”-0-metyloglukopiranozylo)-flawonu a także cytostatyczne (39,3%) mogą przyczynić się do zwalczania Leiszmaniozy jak i innych chorób pierwotniaczych (Da Silva, L. A. L., De Moraes, Μ. H., Scotti, Μ. T., Scotti, L., de Jesus Souza, R., Ouete, J. L. N., Biavatti, M. W., Steindel, M. & Sandjo, L. P. (2019). Antiprotozoal investigation of 20 plant metabolites on Trypanosoma cruzi and Leishmania amazonensis amastigotes. Atalantoflavone altersthe mitochondrial membranę potential. Parasitology, 146(7), 849-856).

Badania in silico z wykorzystaniem platform Pass Online i SwissADME potwierdzają z prawdopodobieństwem 74,4%, że związek 8-bromo-6-chloro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawonu jest induktorem syntezy enzymów CYP3A4. Zwiększenie aktywności metabolicznej CYP3A4 przyczynia się do zwiększenia tempa metabolizmu wątrobowego, w którym pośredniczy zwiększona transkrypcja mRNA kodującego geny enzymów metabolizujących leki. Taki mechanizm może powodować klinicznie istotne zmniejszenie stężenia w osoczu wielu jednocześnie stosowanych leków, w tym np. inhibitorów proteazy (Volberding, P., Greene, W., Lange, J. M., Gallant, J. E., & Sewankambo, N. (2012) Sande's HIV/AIDS medicine: medical management of AIDS 2013. Elsevier Health Sciences); (Zhou, S. F. (2008) Drugs behave as substrates, inhibitors and inducers of human cytochrome P450 3A4. Current drug metabolism, 9(4), 310-322).

Symulacja SwissADME wykazuje wysokie wchłanianie żołądkowo-jelitowe związku, co jest korzystne, jeśli chodzi o przyszłościowe jego zastosowanie. Również wykazano, że związek jest substratem glikoproteiny P (PGP+) co oznacza, że jest aktywnie pompowany z mózgu lub do światła przewodu pokarmowego.

Obecność w związkach flawonoidowych atomów z grupy fluorowców (bromu, chloru) w pierścieniu A lub B nadają im dodatkowe właściwości biologiczne. W badaniach dowiedziono, że 8-chloro-5,7,3’,4’-tetrametoksyepikatechina wykazała działanie przeciwgrzybicze przeciwko ludzkim patogenom, takich jak: Trichophyton longifusus, Candida albicans, Aspergillus flavus, Microsporium canis, Fusarium solani, Candida glaberata nawet w niskich stężeniach (Bernini, R., Pasqualetti, M., Provenzano, G., & Tempesta, S., (2015) Ecofriendly synthesis of halogenated flavonoids and evaluation of their antifungal activity. New Journal of Chemistry, 39(4), 2980-2987). Z kolei w innych badaniach odnotowano, że dodanie grupy -Br w pozycji 6 (6-bromo-3’-nitroflawon) nadaje właściwości uspakajające, przeciwlękowe czy przeciwdrgawkowe. (Wolfman, C., Viola, H., Marder, M., Ardenghi, P., Wasowski, C., Schroder, N., Izquierdo, I., Rύveda, E., Paladini, A. & Medina, J. H. (1998). Pharmacological characterization of 6-bromo-3'-nitroflavone, a synthetic flavonoid with high affinity for the benzodiazepine receptors. Pharmacology Biochemistry and Behavior, 61(3), 239-246.

Claims

1. 8-bromo-6-chloro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawon o wzorze 2.

2. Sposób wytwarzania 8-bromo-6-chloro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawonu znamienny tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Isaria farinosa KCH J2.6, następnie po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 8-bromo-6-chloroflawon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 96 godzin, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,1 mg:1 cm³.

4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że transformację prowadzi się przez 10 dni.

6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że oczyszczanie prowadzi się wykorzystując cienkowarstwową chromatografię preparatywną w układzie rozwijającym chloroform : metanol w stosunku objętościowym 9:1.