PL247886B1

PL247886B1 - 4-Chloro-2’-O-β-D-(4’’-O-metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkon i sposób wytwarzania 4-chloro-2’-O-β-D-(4’’-O-metyloglukopiranozylo)- dihydrochalkonu

Info

Publication number: PL247886B1
Application number: PL443856A
Authority: PL
Inventors: Agnieszka Krawczyk-Łebek; Edyta Kostrzewa-Susłow
Original assignee: Univ Przyrodniczy We Wroclawiu; Wrocław University Of Environmental And Life Sciences
Priority date: 2023-02-22
Filing date: 2023-02-22
Publication date: 2025-09-15
Also published as: PL443856A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest 4-Chloro-2'-O-β-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkon o wzorze 2 oraz sposób wytwarzania 4-chloro-2'-O-β-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkonu, który polega na tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCH J2, następnie po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 4-chloro-2'-hydroksychalkon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 96 godzin, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie, przy czym 4-chloro-2'-O-β-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkon o wzorze 2 znajduje się we frakcji o pośredniej polarności, w drugim paśmie od linii startu.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest 4-chloro-2'-O-^D-(4-O-metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkon o wzorze 2 przedstawionym na rysunku.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania 4-chloro-2'-O-^-D-(4-O -metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkonu.

4-Chloro-O-^-D-(4-O-metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkon może znaleźć zastosowanie jako związek przeciwdrobnoustrojowy, obniżający cholesterol, przeciwzapalny i chroniący przed promieniowaniem ultrafioletowym w preparatach kosmetycznych i farmaceutycznych.

Neutrofile w trakcie procesu zapalnego produkują kwas chlorowy(l) w odpowiedzi immunologicznej na czynniki uznane za patogenne. Jego nadprodukcja może wywoływać oksydację/chlorowanie tkanek w miejscu zapalenia i je uszkadzać. Badania in vitro wykazały, że flawonoidy unieszkodliwiają kwas chlorowy(l) same ulegając mono- i dichlorowaniu. Niektóre powstające w ten sposób chlorowane flawonoidy zachowują, a nawet wzmacniają swój potencjał przeciwutleniający. Zsyntezowane chlorowane flawonoidy takie jak: 8-chloro-3',4’,5,7-tetrahydroksyflawon, 6,8-dichloro-3’,4’,5,7-tetrahydroksyflawon, 3-chloro-3',4’,5,7-tetrahydroksyflawon, 3,8-dichloro-3',4’,5,7-tetrahydroksyflawon, a także chlorowane naturalne flawonoidy: luteolina, rutyna i kwercetyna (po chlorowaniu kwasem chlorowym(l)) są bardziej efektywne w regulacji żywotności neutrofili i uwalniania przez nie reaktywnych form tlenu, niż ich niechlorowane odpowiedniki (Krych-Madej, J.; Stawowska, K.; Gebicka, L. Oxidation of flavonoids by hypochlorous acid: reaction kinetics and antioxidant studies. Free Radical Research, 2016, 50(8), 898908; Freitas, M.; Ribeiro, D.; Tome, S.M.; Silva, A.M.S.; Fernandes, E. Synthesis of chlorinated flavonoids with anti-inflammatory and proapoptotic acitivities in human neutrophils. European Journal of Medicinal Chemistry, 2014, 86, 153-164).

Chloroflawonina to naturalny chlorowany związek flawonoidowy izolowany z endofitycznych grzybów strzępkowych z gatunku Mucor irregularis wykazuje silną aktywność bakteriostatyczną in vitro przeciwko prątkom gruźlicy. Nie powoduje przy tym efektu cytotoksycznego w stężeniu do 100 μM na ludzkich liniach komórkowych: MRC-5 (linia komórek fibroblastów pochodząca z tkanki płuc męskiego zarodka ludzkiego) i THP-1 (linia komórek monocytarno-makrofagowych pochodzących od człowieka chorego na ostrą białaczkę monocytową) (Rehberg, N.; Akone, H.S.; loerger, T.R.; Erlenkamp, G.; Daletos, G.; Gohlke, H.; Proksch, P.; Kalscheuer, R. Chloroflavonin targets acetohydroxyacid synthase catalytic subunit IIvB1 for synergistic killing of Mycobacterium tuberculosis. ACS Infectious Diseases. 2017, 4(2), 123-134).

Jedną z funkcji flawonoidów zawartych w roślinach jest ochrona przed szkodliwym działaniem promieniowania ultrafioletowego. Jest ona możliwa dzięki występowaniu w ich cząsteczkach układów chromoforowych - pierścieni aromatycznych z układem sprzężonych wiązań podwójnych. Flawonoidy są gromadzone w komórkach epidermalnych gdzie działają jak filtr ochronny, zmniejszając ilość promieniowania UV-A i UV-B docierającego do komórek mezofilu i chroniąc je przed oksydatywnym uszkodzeniem (Jasiński M., Mazurkiewicz M., Rodziewicz P., Figlerowicz M. Flawonoidy - budowa, właściwości i funkcja ze szczególnym uwzględnieniem roślin motylkowatych. Biotechnologia, 2009, 2(85), 81-94). Flawonoidy mają potencjał do zastosowania w zapobieganiu szkodliwemu wpływowi promieniowania UV na skórę człowieka, mogą odgrywać rolę w zastosowaniach klinicznych i estetycznych w zapobieganiu i leczeniu oparzeń słonecznych oraz fotostarzenia, a także mogą być potencjalnie stosowane przeciwko nowotworom skóry związanym z promieniowaniem UV (Anbualakan K., Tajul Urus N.Q., Makpol S., Jamil A., Mohd Ramli E.S., Md Pauzi S.H., Muhammad N. A scoping review on the effects of carotenoids and flavonoids on skin damage due to ultraviolet radiation, nutrients, 2022, 15(1), 92).

Większość flawonoidów, poza katechinami, jest obecna w roślinach w połączeniu z cukrami, jako ^-glikozydy. Glikozylacja skutkuje wzrostem rozpuszczalności w wodzie i stabilności cząsteczki flawonoidu oraz przyswajalności przyjmowanych z pokarmem związków flawonoidowych. Zasadniczo glukozydy są jedynymi glikozydami, które mogą być absorbowane w jelicie cienkim. Natomiast flawonoidy niezaabsorbowane w jelicie cienkim oraz zaabsorbowane flawonoidy wydzielone z żółcią ulegają degradacji wraz z rozerwaniem struktury pierścieniowej przez mikroorganizmy (Hollman, P. C. Absorption, bioavailability, and metabolism of flavonoids. Pharmaceutical Biology, 2004, 42, 74-83, Plaza, M.; Pozzo, T.; Liu, J.; Gulshan Ara, K. Z.; Turner, C.; Nordberg Karlsson, E. Substituent effects on in vitro antioxidizing properties, stability, and solubility in flavonoids. Journal of Agricultural Food Chemistry, 2014, 62, 3321-3333).

Znany jest szczep Isaria fumosorosea KCH J2 ujawniony w zgłoszeniu patentowym o numerze PL416996A1.

W ostatnich latach, w leczeniu różnych chorób i ich zapobieganiu, coraz większe znaczenie zyskują związki pochodzenia naturalnego oraz ich odpowiedniki uznawane za naturalne, które uzyskano na drodze przekształceń mikrobiologicznych. Dlatego istotne jest opracowywanie nowych metod wytwarzania związków aktywnych biologicznie na drodze biotransformacji, użytecznych dla przemysłu kosmetycznego i farmaceutycznego.

W dostępnej literaturze brak jest informacji na temat otrzymywania 4-chloro-2'-O-^-D-(4-O -metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkonu.

Istotą wynalazku jest 4-chloro-2'-O-/W-(4- O-metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkon.

Istotą wynalazku jest również sposób, który polega na tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCH J2. Po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 4-chloro-2’-hydroksychalkon, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą. Transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, przez co najmniej 96 godzin. Następnie produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą oraz oczyszcza chromatograficznie. 4-Chloro-2'-O-^-D-(4-O-metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkon znajduje się we frakcji o pośredniej polarności, w drugim paśmie od linii startu.

Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,1 mg:1 cm³.

Korzystnie także jest, gdy proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Dodatkowo, korzystnie jest, gdy transformację prowadzi się przez 8 dni.

Korzystnie również jest, gdy oczyszczanie prowadzi się wykorzystując cienkowarstwową chromatografię preparatywną w układzie eluującym z chloroformem i metanolem w stosunku objętościowym 9:1.

Postępując zgodnie z wynalazkiem, w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Isaria fumosorosea KCH J2, następuje przyłączenie 4-metoksy-^-D-glukozy przy C- 2’-OH oraz redukcja wiązania podwójnego. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą (octan etylu).

Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie 4-chloro-2'-O-^-D-(4-O-metyloglukopiranozylo)dihydrochalkonu w temperaturze pokojowej i przy pH naturalnym dla szczepu oraz wykorzystując mikroorganizm niebędący patogenem ludzkim.

Wykorzystanie biotransformacji, zamiast syntezy chemicznej, umożliwia, w sposób przyjazny dla środowiska, uzyskanie związków o większej biodostępności i aktywności biologicznej, niż użyte substraty.

Wynalazek jest bliżej objaśniony na przykładzie wykonania.

Przykład. Do kolby stożkowej o pojemności 2000 cm³, w której znajduje się 500 cm³ sterylnej pożywki zawierającej 10 g aminobaku i 30 g sacharozy, wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCH J2. Po 72 godzinach jego wzrostu dodaje się 50 mg 4-chloro-2’-hydroksychalkonu o wzorze 1, rozpuszczonego w 1 cm³ dimetylosulfotlenku. Transformację prowadzi się w 25 stopniach Celsjusza przy ciągłym wstrząsaniu przez 8 dni. Następnie mieszaninę poreakcyjną ekstrahuje się dwukrotnie octanem etylu, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Otrzymany ekstrakt oczyszcza się chromatograficznie z zastosowaniem jako eluentu mieszaniny chloroformu i metanolu w stosunku objętościowym 9:1. Produkt znajduje się we frakcji o pośredniej polarności, w drugim paśmie od linii startu.

Na tej drodze otrzymuje się 50,7 mg 2-chloro-2'-O-^-D-(4-O-metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkonu (wydajność 60,1%). Stopień konwersji substratu według HPLC >99%.

Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektralnymi.

PL 247886 Β1

Opis sygnałów pochodzących z widma ¹H NMR (601 MHz, Aceton-de)

Sygnały pochodzące od protonów szkieletu flawonoidowego	Sygnały pochodzące od protonów jednostki cukrowej
δ [ppm]	J[Hz]	H	δ [ppm]	J[Hz]	H
3,45 (m)		a	5,08 (d)	7,7	1”
2,97 (m)		β	3,51 (ddd)	9,9; 4,8; 2,1	2”
7,30 (m)		2	3,63 (dd)	8,9; 3,7	3”
7,30 (m)		3	3,22 (m)		4”
7,30 (m)		5	3,51 (ddd)	9,9, 4,8, 2,1	5”
7,30 (m)		6	3,84 (m) 3,69 (ddd)	11,3; 6,2; 4,9	6”
7,10 (td)	7,7; 0,9	3’	3,56 (s)		4”-OCH3
7,48 (ddd)	9,0; 7,3; 1,8	4’	4,68 (d)	3,4	2-OH
7,30 (m)		5’	4,52 (d)	4,0	3-OH
7,58 (dd)	7,7; 1,6	6’	3,78 (m)		6-OH

Symulacje komputerowe przy użyciu platformy SwissADME, służącej do oceny farmakokinetyki i przydatności małych cząsteczek jako leków, wykazały większą rozpuszczalność w wodzie 4-chloro- 2'- O-/?-D-(4-O-metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkonu w stosunku do substratu biotransformacji 4-chloro-2’-hydroksychalkonu. Ponadto związek ten może być aktywnie transportowany w organizmie przez glikoproteinę P w przeciwieństwie do swojego aglikonu i w wysokim stopniu absorbowany w układzie pokarmowym człowieka.

Symulacje przeprowadzone z użyciem programu Way2Drug PASS online służącego do przewidywania m.in. biologicznej aktywności, efektów farmakologicznych i mechanizmu działania związków chemicznych na podstawie ich struktury wykazały, że 4-chloro-2'-O-/?-D-(4-O-metyloglukopiranozylo)dihydrochalkon z 94% prawdopodobieństwem będzie wykazywał działanie przeciwdrobnoustrojowe, na przykład jako inhibitor glicerofosfotransferazy CDP-glicerolu odpowiedzialnej za polimeryzację łańcuchów kwasów tejchojowych. Enzym ten odgrywa kluczową rolę w nadawaniu kształtu komórce bakteryjnej, integracji jej otoczki, tworzeniu biofilmu bakteryjnego, a w konsekwencji patogenezie bakterii gram-dodatnich (Brown S., Meredith T., Swoboda J., Walker S. Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis W23 make polyribitol wali teichoic acids using different enzymatic pathways. Chemistry & biology 2010, 17(70), 1101-1110).

Symulacje wskazują również, że związek ten może pozytywnie wpływać na integralność błon (prawdopodobieństwo 89%) oraz działać jako antagonista cholesterolu (prawdopodobieństwo 83%).

Przeprowadzone symulacje wykazały również, że 4-chloro-2'-O-/?-D-(4-O-metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkon z 87% prawdopodobieństwem może być antagonistą receptorów anafilatoksyn, ograniczając ich nadaktywność. Anafilatoksyny odgrywają istotną rolę w trakcie odpowiedzi na infekcje bakteryjne i procesach zapalnych, ale także w sepsie, uszkodzeniach niedokrwienno-reperfuzyjnych, złożonych chorobach immunologicznych i astmie (Haas P.J., van Strijp J. Anaphylatoxins. Immunologie Research 2007, 37, 161-175).

Claims

1. 4-Chloro-2'-O-^-D-(4-O-metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkon o wzorze 2.

2. Sposób wytwarzania 4-chloro-2'-O-/>-D-(4-O-metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkonu, znamienny tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCH J2, następnie po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 4-chloro-2’-hydroksychalkon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 96 godzin, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie, przy czym 4-chloro-2'-O-^-D-(4-O-metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkon o wzorze 2 znajduje się we frakcji o pośredniej polarności, w drugim paśmie od linii startu.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,1 mg:1 cm³.

4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że transformację prowadzi się przez 8 dni.

6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że oczyszczanie prowadzi się wykorzystując cienkowarstwową chromatografię preparatywną w układzie eluującym chloroform : metanol w stosunku objętościowym 9:1.