PL247913B1

PL247913B1 - 8-Bromo-6-chloro-4’-O-β-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)- flawan-4-ol i sposób wytwarzania 8-bromo-6-chloro-4’-O-β-D-(4”- O-metyloglukopiranozylo)-flawan-4-olu

Info

Publication number: PL247913B1
Application number: PL443538A
Authority: PL
Inventors: Martyna Perz; Edyta Kostrzewa-Susłow; Monika Dymarska; Tomasz Janeczko
Original assignee: Wrocław University Of Environmental And Life Sciences
Priority date: 2023-01-20
Filing date: 2023-01-20
Publication date: 2025-09-15
Also published as: PL443538A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest 8-bromo-6-chloro-4'-O-β-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-flawan-4-ol o wzorze 2 oraz sposób wytwarzania 8-bromo-6-chloro-4'-O-β-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-flawan-4-olu, charakteryzujący się tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCH J2, następnie po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 8-bromo-6-chloroflawanon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 96 godzin, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest 8-bromo-6-chloro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawan-4-ol o wzorze 2 przedstawiony na rysunku.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania 8-bromo-6-chloro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawan-4-olu.

8-Bromo-6-chloro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawan-4-ol może znaleźć zastosowanie jako związek przeciwdrobnoustrojowy, zwłaszcza w zwalczaniu bakterii gram-dodatnich i grzybów, jako związek o działaniu antagonistycznym na receptory anafilatoksyn, a także związek wspomagający usuwanie toksycznych substancji bądź leków z organizmu, zwłaszcza stosowany w preparatach farmaceutycznych.

Znany jest szczep Isaria fumosorosea KCH J2 ujawniony w zgłoszeniu patentowym o numerze PL416996A1.

W ostatnich latach, w leczeniu różnych chorób i ich zapobieganiu, coraz większe znaczenie zyskują związki pochodzenia naturalnego oraz ich odpowiedniki uznawane za naturalne, które uzyskano na drodze przekształceń mikrobiologicznych. Dlatego istotne jest opracowywanie nowych metod wytwarzania związków aktywnych biologicznie na drodze biotransformacji, użytecznych dla przemysłu farmaceutycznego.

W dostępnej literaturze brak jest informacji na temat otrzymywania 8-bromo-6-chloro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawan-4-olu.

Istotą wynalazku jest 8-bromo-6-chloro-4’-O-^- D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawan-4-ol.

Istota sposobu polega na tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCH J2. Po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 8-bromo-6-chloroflawanon, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą. Transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, przez co najmniej 96 godzin. Następnie produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą oraz oczyszcza chromatograficznie. 8-bromo-6-chloro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawan-4-ol znajduje się we frakcji o wysokiej polarności, w pierwszym paśmie od linii startu.

Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,1 mg:1 cm³.

Korzystnie także jest, gdy proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Dodatkowo, korzystnie jest, gdy transformację prowadzi się przez 10 dni.

Korzystnie również jest, gdy oczyszczanie prowadzi się wykorzystując cienkowarstwową chromatografię preparatywną w układzie rozwijającym z chloroformem i metanolem w stosunku objętościowym 9:1.

Postępując zgodnie z wynalazkiem, w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Isaria fumosorosea KCH J2, następuje redukcja grupy karbonylowej w pozycji C-4 do grupy hydroksylowej oraz przyłączenie 4-metoksy-^-D-glukozy przy C-4’. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą (octan etylu).

Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie 8-bromo-6-chloro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawan-4-olu w temperaturze pokojowej i przy pH naturalnym dla szczepu oraz wykorzystując mikroorganizm niebędący patogenem ludzkim.

Wykorzystanie biotransformacji, zamiast syntezy chemicznej, umożliwia, w sposób przyjazny dla środowiska, uzyskanie związków o większej biodostępności i aktywności biologicznej, niż użyte substraty.

Wynalazek jest bliżej objaśniony na przykładzie wykonania.

Przykład. Do kolby stożkowej o pojemności 2000 cm³, w której znajduje się 500 cm³ sterylnej pożywki zawierającej 10 g aminobaku i 30 g glukozy, wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCH J2. Po 72 godzinach jego wzrostu dodaje się 50 mg 8-bromo-6-chloroflawanonu o wzorze 1, rozpuszczonego w 1 cm³ dimetylosulfotlenku. Transformację prowadzi się w 25 stopniach Celsjusza przy ciągłym wstrząsaniu przez 10 dni. Następnie mieszaninę poreakcyjną ekstrahuje się dwukrotnie octanem etylu, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Otrzymany ekstrakt oczyszcza się chromatograficznie z zastosowaniem jako eluentu mieszaniny chloroformu i metanolu w stosunku objętościowym 9:1. Produkt znajduje się we frakcji o wysokiej polarności, w pierwszym paśmie od linii startu.

PL 247913 Β1

Na tej drodze otrzymuje się 2,1 mg 8-bromo-6-chloro-4’-O-/?-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawan-4-olu o wzorze 2 (wydajność 2,67%). Stopień konwersji substratu według HPLC > 98%.

Uzyskany produkt charakteryzuje się danymi spektralnymi przedstawionymi w tabeli 1.

Tabela 1. Opis sygnałów pochodzących z widma ¹H NMR (601 MHz, Aceton-de)

Sygnały pochodzące od szkieletu flawonoidowego	Sygnały pochodzące od jednostki cukrowej
δ [ppm]	J[Hz]	H	δ [ppm]	J[Hz]	H
5,37 (dd)	11,7; 2,2	2	4,98 (d)	7,8	1”
2,27 (m)		3eq	3,48 (m)		2”
2,15 (m)		3ax	3,63 (m)		3”
4,83 (m)		4	3,24 (m)		4”
7,54 (d)	2,5	5	3,48 (m)		5”
7,40 (d)	2,5	7	3,85 (ddd) 3,69 (ddd)	11,7; 5,4; 2,2 7,1; 6,0; 4,3	6”
7,45 (d)	8,6	2’	4,63 (d)	4,2	C2”-OH
7,11 (d)	8,7	3’	4,38 (d)	4,1	C3”-OH
7,11 (d)	8,7	5’	3,76 (dd)	7,1; 5,4	C6”-OH
7,45 (d)	8,6	6’	3,57 (s)		C4”- OCH3

Wykonane badania analizy chemii medycznej związku 8-bromo-6-chloro-4’-O-/?-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawan-4-olu przy użyciu platformy SwissADME wykazały, że może on być bezpiecznie stosowany w medycynie jako lek. Analiza opiera się na liście sklasyfikowanych fragmentów substancji opracowanej przez Brenk i wsp., która wyklucza potencjalną toksyczność, niestabilność metaboliczną lub właściwości odpowiedzialne za słabą farmakokinetykę w odniesieniu dla badanego związku (Daina, A., Michielin, O. & Zoete, V. SwissADME: a free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness and medicinal chemistry friendliness of smali molecules. Sci Rep 7, 42717 (2017).

Stwierdzono również, że 8-bromo-6-chloro-4’-O-/?-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawan-4-ol jest substratem glikoproteiny P (PGP+), co świadczy o jego aktywnym pompowaniu z mózgu lub do światła przewodu pokarmowego.

Dzięki modelowaniu aktywności przy użyciu programu PASS online wykazano, z prawdopodobieństwem 91,0%, że 8-bromo-6-chloro-4’-O-/?-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawan-4-ol jest inhibitorem glicerofosfotransferazy CDP-glicerol. Glicerofosfotransferaza CDP-glicerol odpowiada za polimeryzację głównego łańcucha kwasu tejchojowego związanego ze ścianą komórkową bakterii gram-dodatnich. Kwasy tejchojowe (WTA) i przyłączone do nich podstawniki przyczyniają się do ładunku powierzchniowego i hydrofobowości komórki bakteryjnej, co z kolei wpływa na wiązanie cząsteczek pozakomórkowych. Wpływając na właściwości powierzchni komórek, WTA odgrywają zatem rolę w ochronie bakterii przed różnymi zagrożeniami i niekorzystnymi warunkami. W przypadku braku WTA bakterie są wrażliwe na wysokie temperatury i niezdolne do wzrostu w pożywkach o wysokiej zawartości soli, co wskazuje, że WTA są zaangażowane w tolerancję temperatury i stres osmotyczny. W Badaniach Brown i wsp. wykazano, że zablokowanie syntezy WTA powoduje, że Staphylococcus aureus (MRSA) staje się wrażliwy na antybiotyki β-laktamowe. Wnioskując, 8-bromo-6-chloro-4’-O-/?-D-(4”-O-metyloglukopi ranozylo)-flawan-4-ol) może przyczynić się do zwalczania patogennych bakterii gram-dodatnich w organizmie człowieka (Brown, S., Santa Maria Jr, J. P., & Walker, S., (2013) Wall teichoic acids of gram-positive bacteria. Annual review of microbiology, 67, 313-336).

Kolejną cechą 8-bromo-6-chloro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawan-4-olu (prawdopodobieństwo 83,5% PASS online) jest antagonistyczne działanie na receptory anafilatoksyn uniemożliwiając ich działanie. Anafilatoksyny w dużych ilościach w organizmie mogą wywołać wstrząs anafilaktyczny. Odgrywają także ważną rolę w zakażeniach i stanach zapalnych, odpowiadając między innymi za choroby takie jak posocznica (sepsa), uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne, choroby układu immunologicznego i choroby nadwrażliwości, takie jak astma (Haas, P. J., & van Strijp, J., (2007) Anaphylatoxins. Immunologie research, 37(3), 161-175).

Również badania in silico z prawdopodobieństwem 74,2% wykazały, że 8-bromo-6-chloro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawan-4-ol może być substratem UDP-glukuronylotransferazy (UGT). Reakcja katalizowana przez enzym UGT polega na dodaniu cząsteczki kwasu glukuronowego do ksenobiotyków i jest najważniejszą drogą eliminacji leków z organizmu. Jest to również główna droga usuwania obcych substancji chemicznych (środowiskowych, farmaceutycznych) toksyn i substancji endogennych. Uzyskany związek w wyniku biotransformacji posiadając takie właściwości mógłby być cennym składnikiem suplementów diety wspomagając usuwanie toksycznych substancji z organizmu (Greenblatt, D. J., (2000) Molecular genetic basis for deficient acetaminophen glucuronidation by cats: UGT1A6 is a pseudogene, and evidence for reduced diversity of expressed hepatic UGT1A isoforms. Pharmacogenetics and Genomics, 10(4), 355-369).

Obecność w związkach flawonoidowych atomów z grupy fluorowców (bromu, chloru) w pierścieniu A lub B nadaje im dodatkowe właściwości biologiczne. W badaniach dowiedziono, że 8-chloro-5,7,3’,4’-tetrametoksyepikatechina wykazała działanie przeciwgrzybicze przeciwko ludzkim patogenom, takim jak: Trichophyton longifusus, Candida albicans, Aspergillus flavus, Microsporium canis, Fusarium solani oraz Candida glaberata nawet w niskich stężeniach (Bernini, R., Pasqualetti, M., Provenzano, G., & Tempesta, S., (2015) Ecofriendly synthesis of halogenated flavonoids and evaluation of their antifungal activity. New Journal of Chemistry, 39(4), 2980-2987), co również wykazują badania in silico z prawdopodobieństwem 71,7% dla 8-bromo-6-chloro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawan-4-olu. Z kolei w innych badaniach odnotowano, że dodanie atomu bromu w pozycji 6 (6-bromo-3‘-nitroflawon) nadaje właściwości uspakajające, przeciwlękowe czy przeciwdrgawkowe (Wolfman, C., Viola, H., Marder, M., Ardenghi, P., Wasowski, C., Schroder, N., Izquierdo, I., Rύveda, E., Paladini, A. & Medina, J. H., (1998) Pharmacological characterization of 6-bromo-3'-nitroflavone, a synthetic flavonoid with high affinity for the benzodiazepine receptors. Pharmacology Biochemistry and Behavior, 61 (3), 239-246).

Claims

1. 8-bromo-6-chloro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawan-4-ol o wzorze 2.

2. Sposób wytwarzania 8-bromo-6-chloro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawan-4-olu znamienny tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCH J2, następnie po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 8-bromo-6-chloroflawanon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 96 godzin, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,1 mg:1 cm³.

4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że transformację prowadzi się przez 10 dni.

6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że oczyszczanie prowadzi się wykorzystując cienkowarstwową chromatografię preparatywną w układzie rozwijającym chloroform : metanol w stosunku objętościowym 9:1.