PL248909B1

PL248909B1 - 6-Metylo-8-nitro-4’-O-β-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)- flawon i sposób wytwarzania 6-metylo-8-nitro-4’-O-β-D-(4”-Ometyloglukopiranozylo)- flawonu

Info

Publication number: PL248909B1
Application number: PL443870A
Authority: PL
Inventors: Martyna Perz; Edyta Kostrzewa-Susłow; Monika Dymarska; Tomasz Janeczko
Original assignee: Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Priority date: 2023-02-23
Filing date: 2023-02-23
Publication date: 2026-02-09
Also published as: PL443870A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest 6-Metylo-8-nitro-4'-O-β-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-flawon o wzorze 2 oraz sposób wytwarzania 6-metylo-8-nitro-4'-O-β-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-flawonu, charakteryzujący się tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Beauveria bassiana KCH J1.5, następnie po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 6-metylo-8-nitroflawon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 96 godzin, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie, przy czym 6-metylo-8-nitro-4'-O-β-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-flawon o wzorze 2 znajduje się we frakcji o pośredniej polarności, w czwartym paśmie od linii startu.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest 6-metylo-8-nitro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawon o wzorze 2 przedstawionym na rysunku.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania 6-metylo-8-nitro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawonu.

6-Metylo-8-nitro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawon może znaleźć zastosowanie jako związek przeciwdrobnoustrojowy, zwłaszcza w zwalczaniu bakterii gram-dodatnich, jako związek hepatoprotekcyjny oraz jako związek przeciwdziałający brązowieniu owoców, grzybów i warzyw oraz zapobiegający przebarwieniom skóry człowieka, zwłaszcza stosowany w preparatach farmaceutycznych, przemyśle kosmetycznym i przemyśle spożywczym.

Znany jest szczep Beauveria bassiana KCH J1.5 ujawniony w literaturze (Kozłowska E., Urbaniak M., Hoc N., Grzeszczuk J., Dymarska M., Stępień Ł., Pląskowska E., Kostrzewa-Susłow E., Janeczko T. Cascade biotransformation of dehydroepiandrosterone (DHEA) by Beauveria species. Scientific Reports, 2018, 8:13449).

W ostatnich latach, w leczeniu różnych chorób i ich zapobieganiu, coraz większe znaczenie zyskują związki pochodzenia naturalnego oraz ich odpowiedniki uznawane za naturalne, które uzyskano na drodze przekształceń mikrobiologicznych. Dlatego istotne jest opracowywanie nowych metod wytwarzania związków aktywnych biologicznie na drodze biotransformacji, użytecznych dla przemysłu farmaceutycznego.

W dostępnej literaturze brak jest informacji na temat otrzymywania 6-metylo-8-nitro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawonu.

Istotą wynalazku jest 6-metylo-8-nitro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawon.

Istota sposobu polega na tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Beauveria bassiana KCH J1.5. Po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 6-metylo-8-nitroflawon, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą. Transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, przez co najmniej 96 godzin. Następnie produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą oraz oczyszcza chromatograficznie. 6-Metylo-8-nitro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawon znajduje się we frakcji o pośredniej polarności, w czwartym paśmie od linii startu.

Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,1 mg : 1 cm³.

Korzystnie także jest, gdy proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Dodatkowo, korzystnie jest, gdy transformację prowadzi się przez 7 dni.

Korzystnie również jest, gdy oczyszczanie prowadzi się wykorzystując cienkowarstwową chromatografię preparatywną w układzie eluującym z chloroformem i metanolem w stosunku objętościowym 9 : 1.

Postępując zgodnie z wynalazkiem, w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Beauveria bassiana KCH J1.5, następuje przyłączenie 4-metoksy-^-D-glukozy przy C-4’. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą (octan etylu).

Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie 6-metylo-8-nitro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawonu w temperaturze pokojowej i przy pH naturalnym dla szczepu oraz z wykorzystaniem mikroorganizmu niebędącego patogenem ludzkim.

Wykorzystanie biotransformacji, zamiast syntezy chemicznej, umożliwia, w sposób przyjazny dla środowiska, uzyskanie związków o większej biodostępności i aktywności biologicznej.

Wynalazek jest bliżej objaśniony na przykładzie wykonania.

Przykład. Do kolby stożkowej o pojemności 2000 cm³, w której znajduje się 500 cm³ sterylnej pożywki zawierającej 10 g aminobaku i 30 g sacharozy, wprowadza się szczep Beauveria bassiana KCH J1.5. Po 72 godzinach jego wzrostu dodaje się 50 mg 6-metylo-8-nitroflawonu o wzorze 1, rozpuszczonego w 1 cm³ dimetylosulfotlenku. Transformację prowadzi się w 25 stopniach Celsjusza przy ciągłym wstrząsaniu przez 7 dni. Następnie mieszaninę poreakcyjną ekstrahuje się dwukrotnie octanem etylu, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Otrzymany ekstrakt oczyszcza się chromatograficznie z zastosowaniem jako eluentu mieszaniny chloroformu i metanolu w stosunku objętościowym 9 : 1. Produkt znajduje się we frakcji o pośredniej polarności, w czwartym paśmie od linii startu.

PL 248909 Β1

Na tej drodze otrzymuje się 4,2 mg 6-metylo-8-nitro-4’-0-/?-D-(4”-0-metyloglukopiranozylo)-flawonu o wzorze 2 (wydajność 5%). Stopień konwersji substratu według HPLC > 98%.

Uzyskany produkt charakteryzuje się danymi spektralnymi przedstawionymi w tabeli.

Tabela

Opis sygnałów pochodzących z widma ¹H NMR (601 MHz, Aceton-de)

Sygnały pochodzące od szkieletu flawonoidowego	Sygnały pochodzące od jednostki cukrowej
δ [ppm]	J [Hz]	H	δ [ppm]	J [Hz]	H
6,93 (s)		3	5,12 (d)	7,8	1
8,24 (dd)	2,2; 0,8	5	3,52 (m)		2
8,34 (dd)	2,3;0,6	7	3.67 (m)		3”
8,10 (m)		2’	3,25 (m)		4”
8,10 (m)		6’	3,57 (m)		5”
7,28 (m)		5’	3,87 (ddd) 3,71 (m)	11,8; 5,1; 2.3	6
7,28 (m)		3’	4,75 (d)	4.2	C2”-OH
2.59 (s)		6-CH3	4,46 (d)	3.9	C3”-OH
			4.14 (m)		C6”-OH
			3,57 (m)		C4”-OCH3

Wykonane badania modelowania aktywności 6-metylo-8-nitro-4’-0-/?-D-(4”-0-metyloglukopiranozylo)-flawonu przy użyciu platformy PASS online wykazały z prawdopodobieństwem 92,0%, że związek może być inhibitorem glicerofosfotransferazy CDP-glicerol. Glicerofosfotransferaza CDP-glicerol odpowiada za polimeryzację głównego łańcucha kwasu tejchojowego związanego ze ścianą komórkową bakterii gram-dodatnich. Kwas tej ch oj owy jest ważny w patogenezie i odgrywa kluczową rolę w oporności bakterii na antybiotyki. Kwasy tejchojowe (WTA) i przyłączone do nich podstawniki przyczyniają się do zmiany ładunku powierzchniowego i hydrofobowości komórki bakteryjnej, co z kolei wpływa na wiązanie cząsteczek poza kom orkowych. Wpływając na właściwości powierzchni komórek, WTA odgrywają zatem rolę w ochronie bakterii przed różnymi zagrożeniami i niekorzystnymi warunkami. W przypadku braku WTA bakterie są wrażliwe na wysokie temperatury i niezdolne do wzrostu w pożywkach o wysokiej zawartości soli, co wskazuje, że WTA są zaangażowane w tolerancję temperatury i stres osmotyczny. 6-Metylo-8-nitro-4’-0-/?-D-(4”-0-metyloglukopiranozylo)-flawon wpływając na inhibicję glicerofosfotransferazy CDP-glicerol może przyczynić się do zwalczania patogennych bakterii gram-dodatnich w organizmie człowieka (Brown, S., Santa Maria Jr, J. P., & Walker, S. (2013). Wall teichoic acids of gram-positive bacteria. Annual review of microbiology, 67, 313-336).

Badania przy użyciu platformy PASS online wykazały z prawdopodobieństwem 82,8%, że kolejną cechą uzyskanego związku może być inhibicja monooksygenazy monofenolowej. Brązowienie owoców, grzybów i warzyw oraz przebarwienia skóry człowieka to dwa powszechnie występujące zjawiska niepożądane. Tyrozynaza jest głównym enzymem odpowiedzialnym za brązowienie enzymatyczne i melanogenezę u ssaków. Zwiększona synteza melaniny i gromadzenie się tych barwników występuje w wielu typach chorób skóry, co może prowadzić m.in. do raka skóry. Warto również podkreślić, że tyrozynaza jest główną przyczyną niepożądanego brązowienia owoców i warzyw oraz chorób wynikających z nadprodukcji melaniny (Zolghadri, S., Bahrami, A., Hassan Khan, M. T., Munoz-Munoz, J., Garcia-Molina, F., Garcia-Canovas, F., & Saboury, A. A. (2019), A comprehensive review on tyrosinase inhibitors. Journal of enzyme inhibition and medicinal chemistry, 34(1), 279-309). 6-Metylo-8-nitro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawon może być nowym inhibitorem tyrozynazy hamując proces melanogenezy w różnych zastosowaniach w przemyśle spożywczym, kosmetycznym oraz medycznym.

Badania in situ przy zastosowaniu platformy PASS online wykazały, że związek może mieć właściwości hepatoprotekcyjne z prawdopodobieństwem 78,1%. Kim i współpracownicy wykazali, że zawarte w ekstrakcie z Lactuca indica L. m.in. glikozydy flawonoidowe posiadają aktywność hepatoprotekcyjną w teście in vitro HBV (wirusowego zapalenia wątroby typu B). W ludzkiej linii kom órkowej wątroby HepG2.2.15 transfekowanej HBV, nastąpiło zmniejszenie poziomu DNA HBV w uwalnianiu dojrzałych cząstek HBV z hodowli HepG2.2.15 dzięki 7-O-^-D-glukuronidowi luteoliny, 5,2’-dihydroksy-7-O-^-D-glukuronyloflawonie oraz 3-O-^-D-glukopiranozydowi kwercetyny (Kim, K. H., Kim, Y. H., & Lee, K. R. (2007). Isolation of quinic acid derivatives and flavonoids from the aerial parts of Lactuca indica L. and their hepatoprotective activity in vitro. Bioorganic & medicinal chemistry letters, 17(24), 6739-6743). Otrzymany 6-metylo-8-nitro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawon, również może być zastosowany jako substancja obniżająca poziom pozakomórkowego DNA HBV, co sugeruje, że może działać przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu B.

Analiza związku przy użyciu SwissADME wykazała, że jest on substratem glikoproteiny P (PGP+), co oznacza, że jest aktywnie pompowany z mózgu lub do światła przewodu pokarmowego a także, potwierdziła, że jest cząsteczką polarną rozpuszczalną w wodzie.

Odnośnie do grupy nitrowej przedmiotowego 6-metylo-8-nitro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawonu, badania Mughal i współpracowników potwierdziły, że grupa nitrowa albo siarkowa zwiększa właściwości przeciwbakteryjne, co za tym idzie, działa negatywnie na wzrost E. coli, S. flexneri, P. aeruginosa and S. typhi. (Mughal, E. U., Ayaz, M., Hussain, Z., Hasan, A., Sadiq, A., Riaz, M.,... & Choudhary, M. I. (2006). Synthesis and antibacterial activity of substituted flavones, 4-thioflavones and 4-iminoflavones. Bioorganic & medicinal chemistry, 14(14), 4704-4711).

Claims

1. 6-Metylo-8-nitro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawon o wzorze 2.

2. Sposób wytwarzania 6-metylo-8-nitro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawonu znamienny tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Beauveria bassiana KCH J1.5, następnie po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 6-metylo-8-nitroflawon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 96 godzin, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie, przy czym 6-metylo-8-nitro-4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawon o wzorze 2 znajduje się we frakcji o pośredniej polarności, w czwartym paśmie od linii startu.

3. Sposób według zastrz. 2., znamienny tym, że stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,1 mg : 1 cm³.

4. Sposób według zastrz. 2., znamienny tym, że proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

5. Sposób według zastrz. 2., znamienny tym, że transformację prowadzi się przez 7 dni.

6. Sposób według zastrz. 2., znamienny tym, że oczyszczanie prowadzi się wykorzystując cienkowarstwową chromatografię preparatywną w układzie rozwijającym chloroform : metanol w stosunku objętościowym 9 : 1.