PL247265B1

PL247265B1 - Sposób wytwarzania 4’,5-dihydroksy-7-O-β-D-(4’’-O-metyloglukopiranozylo)- izoflawonu

Info

Publication number: PL247265B1
Application number: PL439738A
Authority: PL
Inventors: Monika Dymarska; Edyta Kostrzewa-Susłow; Tomasz Janeczko
Original assignee: Wrocław University Of Environmental And Life Sciences
Priority date: 2021-12-03
Filing date: 2021-12-03
Publication date: 2025-06-02
Also published as: PL439738A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób wytwarzania 4',5-dihydroksy-7-O-β-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-izoflawonu o wzorze 2, charakteryzujący się tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCH J2, następnie po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 4',5,7-trihydroksyizoflawon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 96 godzin, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie, przy czym 4',5-dihydroksy-7-O-β-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-izoflawon o wzorze 2 znajduje się we frakcji o najwyższej polarności.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania 4’,5-dihydroksy-7-O-β-ϋ-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-izoflawonu o wzorze 2 przedstawionym na rysunku.

4’,5-dihydroksy-7-O-β-ϋ-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-izoflawon może znaleźć zastosowanie w preparatach stosowanych do leczenia zakażeń przewodu pokarmowego jak również jako związek przeciwutleniający i przeciwdrobnoustrojowy w preparatach farmaceutycznych i kosmetycznych oraz produktach spożywczych; może również znaleźć zastosowanie w środkach ochrony roślin.

Flawonoidy stanowią ważną grupę polifenoli zawartych w owocach i warzywach. Współodpowiadają za kolor i aromat wielu pokarmów pochodzenia roślinnego i stanowią istotny składnik diety ludzi. Związki te coraz częściej stanowią substancje aktywne suplementów diety, ze względu na ich działanie prozdrowotne i zapobiegające rozwojowi różnorodnych schorzeń, w tym chorób cywilizacyjnych.

Flawonoidy w roślinach występują wyłącznie w połączeniu z jednostkami cukrowymi. Glikozylacja skutkuje wzrostem rozpuszczalności cząsteczki flawonoidu w wodzie i wzrostem jego stabilności. Dzięki temu zwiększa się przyswajalność przyjmowanych z pokarmem związków flawonoidowych (J. Xiao, T.S. Muzashvili, M.l. Georgiev, BiotechnologyAdvances, 2014, 32, 1145-1156, Plaza, M.; Pozzo, T.; Liu, J.; Gulshan Ara, K. Z.; Turner, C.; Nordberg Karlsson, E. Substituent effects on in vitro antioxidizing properties, stability, and solubility in flavonoids. J. Agric. Food Chem. 2014, 62, 3321-3333).

Cząsteczka glukozy przyłączona w pozycji 3 kwercetyny (3,3’,4’,5,7-pentahydroksyflawon) zwiększała absorpcję tego związku w jelicie cienkim do 52%, w porównaniu z 24% absorpcją aglikonu kwercetyny i 17% rutynozydu kwercetyny (Heim, K. E.; Tagliaferro, A. R.; Bobilya, D. J. Flavonoid antioxidants: Chemistry, metabolism and structure-activity relationships. J. Nutr. Biochem. 2002, 13, 572-584, Hollman, P. C.; Bijsman, M. N.; van Gameren, Y.; Cnossen, E. P.; de Vries, J. H.; Katan, M. B. The sugar moiety is a major determinant of the absorption of dietary flavonoid glycosides in man. Free Radic. Res. 1999, 31, 569-573).

Znany jest szczep Isaria fumosorosea KCH J2 ujawniony w zgłoszeniu patentowym o numerze PL416996A1.

W ostatnich latach, w leczeniu różnych chorób i ich zapobieganiu, coraz większe znaczenie zyskują związki pochodzenia naturalnego oraz ich odpowiedniki uzyskane metodami biotechnologicznymi. Dlatego istotne jest opracowywanie nowych metod wytwarzania związków aktywnych biologicznie na drodze biotransformacji, użytecznych dla przemysłu farmaceutycznego, kosmetycznego i spożywczego.

Znana jest metoda otrzymywania 4’,5-dihydroksy-7-O-e-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-izoflawonu. Związek ten uzyskano w kulturach: Beauveria bassiana z wydajnością 6,6%, Metarhizium robertsii z wydajnością 4,1 i Cordyceps militaris z wydajnością 15,2%. Przy zastosowaniu drodży S. cerevisiae z wklonowanymi genami odpowiedzialnymi za przyłączanie cząsteczki 4-O-metyloglukopiranozy wydajność przekroczyła 50% (10.1021/acs.jafc.9b02819). W kulturze Isaria fumosorosea ArSeF2679 4’,5-dihydroksy-7-O-e-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-izoflawon otrzymywany był z wydajnością 12,8%. Wydajność biotransformacji określona została bazując na analizie HPLC, w całym ekstrakcie bez wcześniejszego wyizolowania i oczyszczenia produktu, zatem izolowana wydajność mogłaby być znacząco niższa. Mikroorganizmy hodowane były w podłożu PDB (bulion glukozowo-ziemniaczany). Biotransformacje prowadzone były w 100 mL kolbach stożkowych zawierających 50 mL podłoża. Stężenie substratu wynosiło 0,05 mg/mL. (Methylglucosylation of Phenolic Compounds by Fungal Glycosyltransferase-Methyltransferase Functional Modules, Linan Xie, Liwen Zhang, Jing Bai, Qun Yue, Min Zhang, Jiancheng Li, Chen Wang, Yuquan Xu, J. Agric. Food Chem. 2019, 67, 31, 8573-8580).

Istotą wynalazku jest sposób wytwarzania 4’,5-dihydroksy-7-O-e-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-izoflawonu.

Istota sposobu polega na tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCH J2. Po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 4’,5,7-trihydroksyizoflawon (genisteina), rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą. Transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, przez co najmniej 96 godzin. Następnie produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą oraz oczyszcza chromatograficznie. 4’,5-dihydroksy-7-O -p-D-(4”- O-metyloglukopiranozylo)-izoflawon znajduje się we frakcji o najwyższej polarności.

Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,2 mg:1 cm³.

Korzystnie także jest, gdy proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Dodatkowo, korzystnie jest, gdy transformację prowadzi się przez 14 dni.

PL 247265 Β1

Korzystnie również jest, gdy oczyszczanie prowadzi się wykorzystując cienkowarstwową chromatografię preparatywną w układzie eluującym złożonym z chloroformu i metanolu w stosunku objętościowym 9:1.

Postępując zgodnie z wynalazkiem, w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Isaria fumosorosea KCH J2, następuje przyłączenie 4-metoksy-/Fglukozy do grupy hydroksylowej przy C-7. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą (octan etylu).

Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie 4’,5-dihydroksy-7-O-p-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-izoflawonu jako jedynego produktu w temperaturze pokojowej i przy pH naturalnym dla szczepu oraz wykorzystując mikroorganizm niebędący patogenem ludzkim.

Wykorzystanie biotransformacji, zamiast syntezy chemicznej, umożliwia, w sposób przyjazny dla środowiska, uzyskanie związków o większej biodostępności i aktywności biologicznej, niż użyte substraty. Wynalazek jest bliżej objaśniony na przykładzie wykonania.

Przykład. Do kolby stożkowej o pojemności 2000 cm³, w której znajduje się 500 cm³ sterylnej pożywki zawierającej 10 g aminobaku i 30 g sacharozy, wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCH J2. Po 72 godzinach jego wzrostu dodaje się 100 mg 4’,5,7-trihydroksyizoflawonu o wzorze 1, rozpuszczonego w 1 cm³ dimetylosulfotlenku. Transformację prowadzi się w 25 stopniach Celsjusza przy ciągłym wstrząsaniu przez 14 dni. Następnie mieszaninę poreakcyjną ekstrahuje się dwukrotnie octanem etylu, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Otrzymany ekstrakt oczyszcza się chromatograficznie z zastosowaniem jako eluentu mieszaniny chloroformu i metanolu w stosunku objętościowym 9:1. Produkt znajduje się we frakcji o najwyższej polarności.

Na tej drodze otrzymuje się 61,2 mg 4’,5-dihydroksy-7-O-p-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-izoflawonu (wydajność 37%). Stopień konwersji substratu według HPLC >99%.

Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektralnymi.

Opis sygnałów pochodzących z widma ¹H NMR (601 MHz, Aceton-ds)

Sygnały pochodzące od szkieletu flawonoidowego	Sygnały pochodzące od jednostki cukrowej
δ [ppm]	J[Hz]	Η	δ [ppm]	J[Hz]	H
8,24 (s)		Η-2	5,13 (d)	.7=7,7	1C
-	-	Η-3	3,50 (m)		2C
-	-	Η-5	3,66 (m)		3C
6.44 (d)	Je# =2,1	Η-6	3,24 (t)	.7 9,3	4C
-	-	Η-7	3,61 (m)		5C
6,66 (d)	Λ,β=2,2	Η-8	3,87 (m) 3,71 (m)		6C
7,46 (d)	Λ’,3’=8,5	Η-2’	3,57 (s)		C4-OCH₃
6,91 (d)	J3’2’=8,6	Η-3’
-	-	Η-4’
6,91 (d)	Λ\6’=8,6	Η-5’
7,46 (d)	Λ’.5’=8,5	Η-6’

W ramach wewnętrznego grantu badawczego finansowanego przez Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu oceniono wpływ 4’,5-dihydroksy-7-O-β-ϋ-(4”- O-metyloglukopiranozylo)-izoflawonu na mikrobiom jelitowy osób po przebytej antybiotykoterapii. W tym celu zastosowano symulowany układ pokarmowy in vitro. 4’,5-dihydroksy-7-O-β-ϋ-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-izoflawon hamował rozwój niepożądanych drobnoustrojów (E. coli, Clostridium, bakterie proteolityczne i grzyby drożdżopodobne) i nie miał negatywnego wpływu na bakterie kwasu mlekowego.

Claims

1. Sposób wytwarzania 4’,5-dihydroksy-7-O-β-ϋ-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-izoflawonu o wzorze 2, znamienny tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCH J2, następnie po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 4’,5,7-trihydroksyizoflawon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 96 godzin, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie, przy czym 4’,5-dihydroksy-7-O-β-ϋ-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-izoflawon o wzorze 2 znajduje się we frakcji o najwyższej polarności.

2. Sposób według zastrz. 1., znamienny tym, że stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,2 mg:1 cm³.

3. Sposób według zastrz. 1., znamienny tym, że proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

4. Sposób według zastrz. 1., znamienny tym, że transformację prowadzi się przez 14 dni.

5. Sposób według zastrz. 1., znamienny tym, że oczyszczanie prowadzi się wykorzystując cienkowarstwową chromatografię preparatywną w układzie eluującym chloroform : metanol w stosunku objętościowym 9:1.