PL236429B1

PL236429B1 - Zastosowanie totarolu do wytwarzania preparatu do leczenia bakteryjnego zakażenia pochwy i kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu stanów zapalnych pochwy o podłożu bakteryjnym

Info

Publication number: PL236429B1
Application number: PL422140A
Authority: PL
Inventors: Mariusz CIĘCIARA; Mariusz Cięciara; Artur Wrzosek
Original assignee: Emergopharm Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia Spolka Komandytowa
Priority date: 2017-07-06
Filing date: 2017-07-06
Publication date: 2021-01-11
Also published as: CA3066602A1; IL271875B2; CL2019003720A1; WO2019009739A4; UA126031C2; ES2929646T3; RU2020104832A3; KR20200024921A; MA50979A; RU2020104832A; BR112019027839A2; SI3648751T1; MA50980A; HUE060300T2; WO2019009739A1; LT3648751T; RS63728B1; PL422140A1; US11534412B2; MA50979B1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest zastosowanie totarolu do wytwarzania preparatu do leczenia stanów zapalnych błony śluzowej pochwy o podłożu bakteryjnym, do łagodzenia objawów w takim leczeniu oraz do profilaktyki i zapobiegania nawrotom takich stanów zapalnych. Zgłoszenie obejmuje także kompozycję farmaceutyczną do leczenia stanów zapalnych błony śluzowej pochwy o podłożu bakteryjnym, do łagodzenia objawów w takim leczeniu oraz do profilaktyki i zapobiegania nawrotom takich stanów zapalnych, zawierającą od 75 do 95 części masowych pochodnej celulozy, od 0,5 do 5 części masowych kwasu mlekowego, od 0,5 do 5 części masowych polimeru zasadowego, w której stosunek stechiometryczny kwasu mlekowego do polimeru zasadowego zawiera się w granicach od 1:1 do 8:1, i która zawiera totarol w ilości od 0,001 do 5 części masowych jako substancję aktywną.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie totarolu w celu przeciwdziałania zaburzeniom składu flory bakteryjnej pochwy oraz farmaceutyczna kompozycja zawierająca totarol jako składnik aktywny. Kompozycja przeznaczona jest do stosowania w ginekologii i położnictwie podczas terapii przeciwbakteryjnych, przeciwgrzybiczych, przeciwpierwotniakowych i mieszanych oraz jako środek regulujący kwasowość środowiska pochwy. Kompozycja może być stosowana jako preparat farmaceutyczny lub wyrób medyczny.

Najczęściej występującym stanem zapalnym w obrębie kobiecych dróg rodnych jest bakteryjna waginoza (bacterial vaginosis, BV) będąca zaburzeniem naturalnej mikroflory bakteryjnej. Szacuje się, że częstość występowania tej jednostki chorobowej u kobiet w okresie dojrzałości płciowej wynosi 10-40%. W przebiegu BV dochodzi do redukcji liczebności lub nawet całkowitego zaniku populacji laseczek z rodzaju Lactobacillus, w wyniku czego następuje niekontrolowane namnażanie się bakterii ściśle beztlenowych. Rodzaj laseczek z rodzaju Lactobacillus, ich liczebność oraz ilość zmagazynowanego w komórkach nabłonka pochwy glikogenu, który jest przetwarzany przez te bak terie w kwas mlekowy, regulują i odpowiadają za utrzymanie właściwego poziomu pH pochwy. Odczyn pochwy zależy od łącznej ilości wytwarzanych przez te bakterie kwasów organicznych, z których najistotniejszy to wspomniany kwas mlekowy. Kontrolowane wytwarzanie tych kwasów powoduje, że pH pochwy jest niższe niż 4,5, co warunkuje adhezję bakterii z rodzaju Lactobacillus do nabłonka pochwy i umożliwia utrzymanie jej prawidłowej mikroflory pod względem jakościowym i ilościowym. Prawidłowa mikroflora hamuje tym samym rozwój drobnoustrojów, które dla swojej obecności wymagają środowisk o pH > 4,5. Fizjologiczna mikroflora chroni w ten sposób przed zakażeniem drobnoustrojami patogennymi także przez współzawodnictwo o składniki odżywcze, miejsca receptorowe na powierzchni komórek oraz pobudza układ odpornościowy dróg płciowych do wytwarzania przeciwciał reagujących krzyżowo z innymi mikroorganizmami.

Najczęściej izolowanym patogenem będącym główną przyczyną BV jest Gardnerella vaginalis, która występuje niemal u wszystkich kobiet z tą przypadłością, podobnie jak inny beztlenowiec Atopobium vaginae oraz występujące w 50% przypadków BV pałeczki Mobiluncus spp.

Szczególnie istotna i utrudniająca terapię w przebiegu BV jest zdolność namnażających się bakterii patogennych do tworzenia wielobakteryjnego biofilmu, który przylega do nabłonka pochwy. Kolonie bakterii tworzących biofilm, których głównym składnikiem są Gardnerella vagianlis i Atopobium vaginae, wykazują zdolność do adhezji do wilgotnych powierzchni oraz do siebie nawzajem. Formowanie się matrycy biofilmu ma na celu ochronę tworzących go mikroorganizmów przed degradacyjnym działaniem naturalnych czynników środowiska pochwy i działaniem środków farmakologicznych, w tym antybiotyków. Zwarta struktura biofilmu jest niezwykle trudna do usunięcia z ścian pochwy. U kobiet z BV w biopsji wykazano obecność biofilmu przylegającego do komórek nabłonka, w którym 90% stanowiły bakterie Gardnerella vagianlis.

Zjawisko tworzenia przez patogeny biofilmu, brak cech stanu zapalnego w BV, przypadki błędnego rozpoznania BV sięgające 61% (rozpoznanie BV wg kryteriów Amsela jest tanie, łatwe i możliwe do wykonania praktycznie w każdym gabinecie ginekologicznym. Wadą jest subiektywna ocena i mniejszy wskaźnik powtarzalności, zależny od doświadczenia lekarza) oraz grupa pacjentek, u których BV ma charakter bezobjawowy sprawiają, że u większości z leczonych pacjentek po 12 miesiącach występują nawroty.

Opisane powyżej cechy oraz mechanizmy występujące w przebiegu BV są niezwykle istotne z medycznego punktu widzenia z uwagi na fakt, że bakteryjne zakażenie pochwy uważane jest za jeden z czynników etiologicznych poronień samoistnych, porodów przedwczesnych, zakażeń wewnątrzmacicznych, przedwczesnego odpływania płynu owodniowego, hipotrofii wewnątrzmacicznej (intra uterine growth restriction-IUGR), zapaleń błony śluzowej macicy i narządów miednicy mniejszej. BV może być również przyczyną innych zakażeń okołoporodowych, groźnych w równym stopniu dla zakażonej matki, jak i dla noworodka.

Innym stanem związanym z zaburzeniami jakościowo-ilościowego składu mikroflory pochwy jest zapalenie pochwy wywołane przez mikroorganizmy bytujące w warunkach tlenowych, nazywane tlenowym bakteryjnym zapaleniem pochwy AV (aerobic vaginitis). W AV również obserwuje się zmniejszenie liczby lub brak bakterii z rodzaju Lactobacillus i rozwój mieszanej flory pochwy, w składzie której dominują ziarnkowce Gram-dodatnich paciorkowców grupy B: Streptococcus agalactiae, Enterococcus fecalis, Staphylococcus aureus oraz pałeczki bakterii Gram-ujemnych:

PL 236 429 B1

Escherichia coli. Podobnie jak to ma miejsce w przypadku BV, również tutaj obserwuje się identyczne zmiany. W treści pochwy zmniejsza się stężenie mleczanów, wzrasta wartość odczynu pH pochwy >6,0, zwiększa się również stężenie cytokinin prozapalnych. Brak jednoznacznych kryteriów diagnostycznych oraz współwystępowanie innych zakażeń, takich jak grzybica i rzęsistkowica powodują, iż częstość występowania AV nie jest precyzyjnie określona.

Występowanie zaburzeń w składzie mikroflory pochwy jest przyczyną stanów zapalnych w obrębie dróg płciowych, które mogą być spowodowane przez dwa zupełnie różne rodzaje bakterii patogennych bytujących w skrajnie różnych warunkach tlenowych. Nieprawidłowa biocenoza i stany zapalne mogą być również przyczyną rozwoju zapalnych powikłań pooperacyjnych, szczególnie ginekologicznych, położniczych i urologicznych. Stanowią też ogromne zagrożenie dla płodu, którego organizm w okresie życia wewnątrzłonowego pozbawiony jest kontaktu z drobnoustrojami, jednak podczas przechodzenia przez kanał rodny organizm noworodka zostaje skolonizowany przez mikroflorę pochwy matki.

Większość obecnie stosowanych schematów terapeutycznych opiera się głównie na metronidazolu, tinidazolu oraz, w przypadku BV, na klindamycynie. Substancje te stosowane są powszechnie i rutynowo w postaci preparatów doustnych albo dopochwowych. Podstawową zaletą stosowania metronidazolu jest jego aktywność zarówno w stosunku do bakterii tlenowych, jak i beztlenowych oraz fakt, że beztlenowe laseczki kwasu mlekowego z rodzaju Lactobacillus są całkowicie na ten antybiotyk oporne. Ponadto lek ten jest tani, łatwo dostępny i zazwyczaj dobrze tolerowany przez pacjentki. Niestety w literaturze światowej coraz częściej pojawiają się doniesienia dotyczące oporności Gardnerella vaginalis na działanie tego chemoterapeutyku, które wskazują również na zwiększający się odsetek opornych szczepów tego gatunku. Badania przeprowadzone w 1993 r. przez Goldstein’a i współpracowników wykazywały odsetek szczepów opornych na metronidazol na poziomie 20%, podczas gdy już w 2002 r. ta sama grupa badaczy odnotowała wzrost szczepów opornych do poziomu 29%. Najnowsze doniesienia wskazują, że proces nabywania oporności na metronidazol narasta w znacznym tempie. W badaniach lekooporności przeprowadzonych i opublikowanych w 2007 r. zaobserwowano oporność szczepów Gardnerella vaginalis na metronidazol sięgającą aż 70%. Badanie przeprowadzone w Polsce na kolekcji 67 szczepów wyizolowanych z grupy 604 kobiet potwierdziło, że 68,7% (46 z 67 badanych) szczepów charakteryzowało się opornością na metronidazol. Niepokojący wzrost liczby szczepów beztlenowych związanych z BV, które wykazują opisany mechanizm oporności na metronidazol może za kilka lat doprowadzić do konieczności zmiany schematów dotyczących leczenia bakteryjnej waginozy.

Klindamycyna, w porównaniu do metronidazolu, charakteryzuje się większą skutecznością wobec beztlenowych pałeczek Gram-ujemnych, przy jednoczesnej ograniczonej aktywności w stosunku do bakterii bytujących w warunkach tlenowych. Dodatkowo negatywną stroną stosowania tego antybiotyku jest jego wysoka aktywność oraz zdolność do hamowania wzrostu bakterii z rodzaju Lactobacillus, co może zaburzać proces odtwarzania prawidłowego ekosystemu pochwy i w efekcie prowadzić do wtórnych zakażeń grzybiczych sromu i pochwy powodowanych przez drożdżaki z rodzaju Candida albicans i Candida glabrata.

Proponowanym lekiem drugiego rzutu w terapii BV jest amoksycylina z kwasem klawulonowym. Niestety, w literaturze brakuje danych dotyczących oceny skuteczności tego antybiotyku w leczeniu zakażeń pochwy wywołanych przez bakterie beztlenowe.

Pomimo dużej skuteczności opisanych antybiotyków dość często obserwowane są nawroty infekcji pochwy oraz dróg rodnych o podłożu bakteryjnym. Zjawisko to jest szczególnie zauważalne w przypadku pacjentek z BV. Szacuje się, że u około 30% kobiet ponowne objawy kliniczne BV pojawią się po 3 miesiącach, a u około 80% w ciągu pierwszego roku od momentu zakończenia leczenia. Za jedną z głównych przyczyn nawrotów podaje się oporność szczepów bakterii beztlenowych na stosowane antybiotyki przy jednoczesnej wysokiej aktywności przeciwbakteryjnej w stosunku do naturalnie występujących w mikroflorze pochwy niezbędnych do jej prawidłowego funkcjonowania laseczek kwasu mlekowego z rodzaju Lactobacillus.

Istotnym problemem są zmiany w budowie bakterii będących główną przyczyną infekcji błon śluzowych pochwy. Zakres zmian zachodzących w mikroorganizmach chorobotwórczych, mający na celu wykształcenie nowych mechanizmów oporności, jest wielokierunkowy oraz wielopoziomowy. Często pojedynczy patogen wykorzystuje kilka różnych mechanizmów w celu ochrony przed szerokim spektrum powszechnie stosowanych preparatów leczniczych.

PL 236 429 Β1

Trudno więc obecnie przewidzieć zakres aktywności przeciwbakteryjnej określonej substancji aktywnej w stosunku do tak zmieniających swoją budowę mikroorganizmów patogennych, mimo powszechnie znanej aktywności w stosunku do testowanych już patogenów. Zaobserwowano, że aktywność substancji leczniczej może zmieniać się w czasie, a w niektórych przypadkach nawet zanikać pod wpływem nowo wykształconych przez patogen mechanizmów obronnych.

Zmiana aktywności, łącznie z jej całkowitym zanikiem, oraz ograniczenie spektrum odziaływania na różnego rodzaju patogeny jest więc poważnym problemem obecnie stosowanych terapii, zarówno w przypadku infekcji typu BV, jak i AV. Narastająca częstość oporności bakterii Gardnerella vagianlis na metronidazol ogranicza możliwość skutecznego leczenia BV i prawdopodobnie przyczynia się do zwiększenia częstości nawrotów objawów klinicznych.

Istotne znaczenie w leczeniu stanów zapalnych błony śluzowej pochwy, zwłaszcza tych o charakterze mieszanym: BV+AV lub BV wraz z towarzysząca wtórną infekcją grzybiczą mogą mieć związki pochodzenia naturalnego. Szerokie spektrum aktywności przeciwbakteryjnej, zarówno w stosunku do bakterii tlenowych, jak i beztlenowych, jest warunkiem koniecznym stanowiącym o użyteczności terapeutycznej w leczeniu przypadków opornych lub zakażeń mieszanych. Należy również wziąć pod uwagę wpływ nowej substancji na fizjologiczny składnik prawidłowej mikroflory bakteryjnej pochwy, jakim są laseczki bakterii kwasu mlekowego z rodzaju Lactobacillus.

Znana jest aktywność przeciwbakteryjna tricyklicznego diterpenu o nazwie rodzajowej totarol którego struktura chemiczna pokazana jest za pomocą wzoru 1.

Jest to związek pochodzenia naturalnego, znaleziony w endemicznym gatunku drzewa Podocarpus totara (Zastrzalin totara) występującym na terenie Nowej Zelandii.

Aktywność przeciwbakteryjna totarolu jest ujawniona w szeregu prac naukowych oraz w publikacjach patentowych. „Antibacteral activity of totarol and its potentiation Journal of Natural Products Vol. 55, No. 10, pp. 1436-1440, October 1992 opisuje wysoką skuteczność ekstraktów zawierających totarol wobec bakterii Gram-dodatnich: Bacillus subtilis, Brevibacterium ammoniagenes, Streptococcus mutans, Propionibacterium acnes oraz Staphylococcus aureus. “Clinical report on the Efficacy of Totarol and Totarol in Combination with Tea Tree Oli as an Antimicrobial Against Gram-negative Bacteria” prepared for Mende-DEK Ltd. Nsiovember 2003 potwierdza skuteczność totarolu wobec czterech bakterii Gram-ujemnych: Salmonella menston, Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aeruginosa oraz bakterii Gram-dodatniej: Enterococcus fecalis. The synthesis and antibacterial activity of totarol derivatives. Part 1: modifications ofring-C and pro-drugs” Bioorganic & Medicinal Chemistry 1999, 7(9):1953-1964 opisuje aktywność wobec bakterii Gram-dodatniej, jaką jest Streptococcus pneumoniae. Cytowane wyżej publikacje zawierają informacje o bakteriach, przeciwko którym totarol jest aktywny, jak i wskazują również na dość dużą grupę bakterii patogennych, wobec których totarol nie wykazuje działania przeciwbakteryjnego. Bakterie te często są patogenami z tego samego rodzaju, dla którego odnotowano aktywność totarolu, co uwidacznia nieoczywistość oraz osobniczość oddziaływania na poszczególne szczepy drobnoustrojów.

Z opisu japońskiego zgłoszenia patentowego nr JP 01311019 znana jest aktywność totarolu przeciwko bakteriom Gram-dodatnim, w preparatach do stosowania zewnętrznego. Z kolei w opisie zgłoszenia patentowego nr WO2005073154 przedstawiono sposób ekstrakcji totarolu z materiału ro

PL 236 429 Β1 ślinnego oraz preparat wytwarzany z totarolu pozyskanego metodą według zgłoszenia. W opisie tym wykazano, że totarol działa także przeciwko bakteriom Gram-ujemnym. Skład preparatu, jego forma i zastosowanie zostały ujawnione w zgłoszeniu w sposób bardzo ogólny, bez wskazywania jego konkretnego przeznaczenia. W opisie zgłoszenia patentowego nr WO2014137231 ujawniono zastosowanie preparatów zawierających totarol do leczenia zapalenia gruczołu mlekowego, zapalenia macicy i leczenia ran. W opisie zgłoszenia patentowego CN104027260 ujawniono zastosowanie preparatów w formie pasty do zębów albo płynu do płukania ust i leczenia ran w jamie ustnej.

W opisie zgłoszenia patentowego CN104688810 ujawniono kompozycję antybakteryjną na bazie naturalnych surowców roślinnych składającą się z następujących składników: olej oregano albo karwakrol, sól dipotasowa kwasu glicyryzynowego, ekstrakt z rokitnika zwyczajnego, kompozycja nośnikowa oraz woda. Dodatkowo i opcjonalnie kompozycja może zawierać totarol. Kompozycja jest przeznaczona do stosowania w leczeniu licznych i zróżnicowanych stanów chorobowych, m.in. w zapaleniu pochwy.

Dotychczas nie wykazano aktywności przeciwbakteryjnej totarolu wobec bakterii patogennych będących głównymi przyczynami infekcji błony śluzowej pochwy. Jest to Gram-zmienna bakteria beztlenowa Gardnerella vagianlis odpowiedzialna za infekcje BV oraz Gram-dodatnia bakteria tlenowa Streptococcus agalactie powodująca infekcje typu AV.

W wyniku przeprowadzonych przez autorów wynalazku badań z wykorzystaniem szczepów klinicznych izolowanych z dróg rodnych kobiet okazało się, że totarol wykazuje niezwykle silną aktywność w stosunku do wymienionych patogenów przy bardzo niskim stężeniu MIC (minimalne stężenie hamujące, od ang. minimum inhibitory concentration). Aktywność zarówno w stosunku do klinicznego szczepu beztlenowej bakterii patogennej Gardnerella vagianlis, jak i klinicznego szczepu tlenowej bakterii Streptococcus agalactie sprawia, co niezwykle cenne, że spektrum działania totarolu pokrywa się z obszarem aktywności metronidazolu, wobec którego dramatycznie wzrasta oporność wyżej wymienionych mikroorganizmów, co ogranicza, a wręcz uniemożliwia jego efektywne użycie medyczne.

Dotychczas nieznany był również wpływ totarolu na laseczki bakterii kwasu mlekowego z rodzaju Lactobacillus. Badania takie po raz pierwszy zostały przeprowadzone przez autorów wynalazku. Zupełnie nieoczekiwanie okazało się, że pomimo, iż laseczki z rodzaju Lactobacillus są, tak jak Gardnerella vagianlis, przedstawicielami bakterii beztlenowych, istnieje znacząca, w przybliżeniu 10-ciokrotna różnica w wartościach stężeń MIC dla tych mikroorganizmów, co najlepiej obrazuje poniższa tabela.

Nazwa szczepu	E.faecalis	S.agalactiae	G. vaginalis	Lplantarum	L.gasseri
Wartość MIC	0,0025%	0,0013%	0,005%	0,08%	0,04%

To właśnie ta nieoczywista, a jednocześnie kluczowa dla przedmiotu wynalazku różnica w stężeniach skutecznych dla poszczególnych bakterii tego samego rodzaju stanowi o unikalności i wyjątkowości totarolu w opisanym zastosowaniu.

Nowe i unikalne właściwości totarolu po raz pierwszy odkryte przez autorów wynalazku stanowią o jego ogromnym potencjale medycznym w zastosowaniu będącym przedmiotem niniejszego zgłoszenia. Niskie stężenia MIC przy jednoczesnej wysokiej skuteczności przeciwbakteryjnej, zarówno w stosunku do bakterii będących główną przyczyną BV, jak i AV, nie wykazują aktywności, a co za tym idzie negatywnego wpływu na beztlenowe laseczki z rodzaju Lactobacillus będące głównym składnikiem prawidłowej fizjologiczne mikroflory bakteryjnej pochwy. Ten niepowtarzalny mechanizm działania totarolu stanowi o jego ogromnej użyteczności terapeutycznej w leczeniu infekcji pochwy o podłożu bakteryjnym. Brak aktywności w odpowiednim zakresie MIC w stosunku do laseczek kwasu mlekowego zapobiega dodatkowemu wyjałowieniu mikroflory pochwy stwarzając jednocześnie optymalne warunki do wzrostu tychże bakterii. Wzrost stężenia laseczek kwasu mlekowego warunkuje naturalną

PL 236 429 B1 odbudowę bariery ochronnej pochwy zapobiegając tym samym nawrotom objawów klinicznych oraz chroniąc środowisko pochwy przed wtórnymi zakażeniami grzybiczymi towarzyszącymi klasycznej terapii z wykorzystaniem klindamycyny.

Oprócz wyżej opisanych nowych i nieoczekiwanych właściwość totarolu o jego ogromnym potencjale terapeutycznym decyduje brak mechanizmu oporności występującego w przypadku metronidazolu.

Wysoką użyteczność terapeutyczną oraz bezpieczeństwo w zastosowaniach ginekologicznych autorzy wynalazku potwierdzili dodatkowo po raz pierwszy wykonanymi badaniami tkankowymi oceniającymi wpływ totarolu na komórki nabłonka pochwy ludzkiej z wykorzystaniem linii komórkowej A-431. Przeprowadzone badania nie wykazały działania apoptotycznego i nekrotycznego substancji badanej na ludzkie komórki nabłonka epitelium pochwy A-431 w szerokim czasie inkubacji (2-24 godziny).

Uzyskane po raz pierwszy przez autorów obecnego wynalazku wyniki badań potwierdzające szerokie spektrum aktywności przeciwbakteryjnej dla specyficznych ściśle określonych stężeń MIC totarolu, przy jednoczesnym braku aktywności w stosunku do laseczek kwasu mlekowego z rodzaju Lactobacillus oraz brak negatywnego wpływu na komórki nabłonka pochwy ludzkiej, stały się podstawą do zastosowania totarolu według wynalazku. Zastosowanie według wynalazku jest wynikiem badań autorów wynalazku, które wykazały, że totarol jest aktywny wobec klinicznych szczepów Gardnerella vagianlis i Streptococcus agalactie izolowanych z kobiecych dróg rodnych. Badania przeprowadzono w oparciu o metodykę opisaną w dokumencie „Determination of the Minimum Concentration of Totarol & Antibiotics Required to Inhibit and Kill Growth of Staphylococcus aureus in Broth Cultures” (Project NZC-MEND-1312). Wyniki oraz sposób przeprowadzenia opisanych badań szczegółowo przedstawiono w przykładach wynalazku.

Totarol ma jednak ograniczenia wynikające z właściwości fizyko-chemicznych tej substancji. Hydrofobowy charakter cząsteczki, skutkujący całkowitym brakiem rozpuszczalności w wodzie, jest podstawowym problemem technologicznym, który uniemożliwia efek tywne zastosowanie substancji w kompozycjach ginekologicznych. Z uwagi na miejsce docelowej aplikacji kompozycji farmaceutycznej, jakim jest błona śluzowa pochwy, niemożliwe okazało się zastosowanie większości rozpuszczalników organicznych, w których rozpuszcza się totarol. Rozpuszczalniki należące do grupy alkoholi, takie jak etanol bądź alkohole wielowodorotlenowe, jak glikol propylenowy wykazują działanie silnie drażniące, a dodanie do nich wody skutkuje wytrące niem rozpuszczonego totarolu. Z uwagi na toksyczny charakter niemożliwe jest również wykorzystanie rozpuszczalników chlorowcopochodnych, takich jak np. chlorek metylenu czy chloroform. Właściwości embriotoksyczne oraz teratogenne N,N-dimetyloformamidu dyskwalifikują jego zastosowanie jako składnika kompozycji farmaceutycznej. Użyty w badaniach „in-vitro” DMI stosowany jest w przemyśle farmaceutycznym, ale tylko do wyrobu produktów leczniczych stosowanych zewnętrznie, takich jak maści sterydowe.

Ponieważ skład mikroflory pochwy może zmieniać się pod wpływem stosowanych antybiotyków, środków o aktywności endokrynalnej lub immunologicznej w ciąży bądź podczas menopauzy wspomagająco zaleca się, szczególnie po zakończeniu leczenia farmakologicznego BV, stosowanie kwasu mlekowego w postaci żelu dopochwowego.

Z polskiego opisu patentowego PL 166898 znany jest sposób wytwarzania kompleksu metylocelulozy z kwasem mlekowym polegający na solwatacji metylocelulozy kwasem mlekowym w postaci roztworu złożonego z 5-25 części masowych kwasu mlekowego i 10-20 części masowych 95% alkoholu etylowego. Roztworem tym spryskuje się, przy ciągłym mieszaniu, 75-95 części masowych metylocelulozy, a następnie poddaje suszeniu, podczas którego usuwa się alkohol etylowy. Powstały proszek poddaje się tabletkowaniu. Kwas mlekowy wiąże się z metylocelulozą tworząc dwuskładnikowy kompleks. Solwatowana kwasem mlekowym metyloceluloza ma właściwości szybkiego wiązania wody z utworzeniem żelu o lepkości, właściwościach adhezyjnych i powlekających podobnych do właściwości śluzu wytwarzanego w pochwie w warunkach fizjologicznych. Kompozycje z użyciem jedynie kwasu mlekowego, których działanie opiera się na funkcji regulacji pH, są niewystarczające w przypadku leczenia stanów zapalnych pochwy i mogą być stosowane jedynie w celach profilaktycznych bądź w celu utrzymania higieny dróg rodnych u kobiet zdrowych.

Z opisów patentowych PL 194437, PL 201868 oraz PL 201869 znany jest sposób wytwarzania oraz kompozycje z użyciem kompleksu metylocelulozy z kwasem mlekowym, w których dodatkowo jako substancję aktywną wykorzystuje się pojedyncze szczepy bakterii kwasu mlekowego: Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jenseni, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus,

PL 236 429 B1 w postaci liofilizatu. Kompozycja zawiera od 75 do 95 części masowych metylocelulozy, od 0,5 do 5 części masowych kwasu mlekowego, od 0,5 do 5 części masowych polimeru zasadowego, korzystnie eudragitu lub chitozanu lub poliwinylopirolidonu lub ich mieszaniny oraz od 0,5 do 5 części masowych liofilizatu bakterii Lactobacillus, przy czym stosunek stechiometryczny kwasu mlekowego do polimeru zasadowego zawiera się w granicach od 1:1 do 8:1. Korzystne jest, gdy kompozycja zawiera pożywkę w ilości od 5 do 10 części masowych, w postaci cukrów prostych lub wielocukrów. Sposób wytwarzania tej znanej kompozycji polega na tym, że sporządza się dwuskładnikową komponentę przez rozpuszczenie w roztworze kwasu mlekowego polimeru zasadowego, w stosunku stechiometrycznym do wolnych grup aminowych w polimerze zasadowym w granicach od 1:1 do 8:1, mieszając do całkowitego rozpuszczenia polimeru zasadowego, po czym dodaje się alkohol etylowy w ilości nie mniejszej niż 5 części masowych, miesza do pełnej jednorodności i tak przygotowaną mieszaniną spryskuje się metylocelulozę i miesza, aż do uzyskania równomiernego jej zwilżenia. Otrzymany produkt poddaje się suszeniu, podczas którego odparowuje alkohol etylowy, zaś do tak otrzymanego suchego proszku dodaje się liofilizat bakterii Lactobacillus.

Celem dopochwowego podawania wyżej wymienionych pojedynczych szczepów jest zapewnienie optymalnych warunków do pełnego odtworzenia fizjologicznej flory bakteryjnej pochwy. Jednocześnie autorzy wymienionych opisów patentowych podkreślają iż narządy rodne, podobnie jak inne obszary anatomiczne człowieka, posiadają liczne „nisze ekologiczne”, w następstwie czego inna jest flora bakteryjna sklepienia pochwy, kanału szyjki macicy, ściany zewnętrznej szyjki macicy i dolnego odcinka pochwy. Opisane różnice w składzie flory bakteryjnej powodują obniżenie skuteczności o pisanych kompozycji zawierających pojedynczy szczep laseczek z rodziny Lactobacillus. Użycie większej ilości szczepów w pojedynczej kompozycji w świetle aktualnych badań nie jest korzystne, ponieważ może prowadzić do zbyt dużego stężenia tych bakterii, co w konsekwencji jest przyczyną cytolitycznego zapalenia pochwy, często błędnie diagnozowanego i leczonego jako kandydoza pochwy.

Surowiec w postaci liofilizatów bakteryjnych posiada wiele poważnych ograniczeń wynikających ze specyfiki materiału zawierającego żywe organizmy, a jego zastosowanie w warunkach technologicznych wiąże się z szeregiem trudności. Parametry surowca probiotycznego charakteryzują się wysoką zmiennością, ściśle zależną od wielu parametrów prowadzenia procesu fermentacji. Uzyskanie finalnego surowca o wysokiej czystości wymaga stosowania substancji zwiększających przeżywalność mikroorganizmów i stabilizujących proces fermentacji, skomplikowanych oraz kosztownych metod oczyszczania i liofilizacji. Liczba jednostek tworzących kolonie (colony forming units, CFU) w masie uzyskanego surowca jest ściśle zależna zarówno od rodzaju szczepu bakteryjnego, jak i sposobu oraz parametrów prowadzenia całego procesu produkcyjnego. Liczba ta ulega w czasie ciągłemu spadkowi, ponieważ stabilność i przeżywalność szczepów probiotycznych zależy od temperatury, warunków przechowywania i zawartej w nich wody. Wpływa to w sposób negatywny na żywotność i stabilność cech bakterii w czasie przechowywania i dystrybucji produktów probiotycznych.

Proces wytwarzania gotowych środków farmaceutycznych zawierających surowce probiotyczne musi być prowadzony na wydzielonych liniach produkcyjnych z użyciem dedykowanych urządzeń, ponieważ obowiązujące w przemyśle farmaceutycznym systemy jakości oraz wytyczne GMP (Good Manufacturing Practice) klasyfikują te surowce jako poważne źródło zanieczyszczenia mikrobiologicznego. Konieczność użycia dedykowanych urządzeń produkcyjnych wynika z wysokiego ryzyka kolonizacji oraz faktu, że standardowo stosowane procedury mycia nie gwarantują uzyskania odpowiedniej czystości. Można ją osiągnąć jedynie stosując zaawansowane i kosztowne metody czyszczenia i sterylizacji obejmujące demontaż poszczególnych elementów roboczych mających kontakt z wytwarzanym produktem. Procedury mycia i sterylizacji podlegają skomplikowanemu procesowi walidacji, który potwierdza ich skuteczność i powtarzalność oraz brak w czystym urządzeniu nawet niewielkich ilości stosowanych agresywnych substancji myjących.

Celem wynalazku było rozwiązanie wyżej zdefiniowanych problemów.

Istotą wynalazku jest zastosowanie totarolu do wytwarzania preparatu do leczenia stanów zapalnych błony śluzowej pochwy o podłożu bakteryjnym oraz do łagodzenia objawów w takim leczeniu. W szczególności zastosowanie według wynalazku dotyczy bakteryjnego zakażenia pochwy (BV) oraz tlenowego bakteryjnego zakażenia pochwy (AV).

Korzystnie totarol w zastosowaniu według wynalazku stosuje się w postaci kompozycji zawierającej od 75 do 95 części masowych pochodnej celulozy, korzystnie metylocelulozę, od 0,5 do 5 części masowych kwasu mlekowego, od 0,5 do 5 części masowych polimeru zasadowego, korzystnie polimeru akrylowego, najkorzystniej kopolimeru kwasu metakrylowego i akrylanu etylu, lub chitozanu lub

PL 236 429 B1 poliwinylopirolidonu lub ich mieszanin, w której stosunek stechiometryczny kwasu mlekowego do polimeru zasadowego zawiera się w granicach od 1:1 do 8:1. Zgodnie z wynalazkiem substancję aktywną w kompozycji stanowi totarol w ilości od 0,001 do 5 części masowych.

Kompozycja może również zawierać pożywkę dla bakterii probiotycznych w ilości od 5 do 10 części masowych w postaci cukrów prostych lub wielocukrów. Kompozycja może także zawierać dodatkowe składniki aktywne, w ilości od 0,001 do 10% masowych, w zależności od rodzaju składnika.

Kompozycję według wynalazku wytwarza się sposobem znanym ze stanu techniki (PL 194437, PL201868, PL201869), w którym totarol dodaje się do alkoholu. Szczegółowo, polimer zasadowy rozpuszcza się w roztworze kwasu mlekowego, w stosunku stechiometrycznym do wolnych grup aminowych w polimerze zasadowym w granicach od 1:1 do 8:1, miesza się do całkowitego rozpuszczenia polimeru zasadowego, po czym dodaje się alkohol pierwszorzędowy w ilości nie mniejszej niż 5 części masowych wraz z rozpuszczonym totarolem, miesza do pełnej jednorodności i tak przygotowaną mieszaninę nanosi się na powierzchnię cząstek pochodnej celulozy mieszając aż do uzyskania równomiernego jej zwilżenia. Otrzymany produkt poddaje się suszeniu, podczas którego usuwany jest alkohol pierwszorzędowy, następnie dozuje się do opakowań lub poddaje dalszej obróbce do żądanej postaci.

Na figurach rysunku przedstawiono:

Fig. 1 - od lewej: Komórki nekrotyczne (powiększenie 400x) po 8 h inkubacji z H2O2; od prawej: Komórki nekrotyczne (powiększenie 400x) po 24 h inkubacji z H2O2.

Fig. 2 - od lewej: Brak apoptozy i nekrozy w komórkach nabłonka (powiększenie 400x) po 8 h inkubacji - kontrola negatywna; od prawej: Brak apoptozy i nekrozy w komórkach nabłonka (powiększenie 400x) po 24 h inkubacji - kontrola negatywna.

Fig. 3 - od lewej: Brak apoptozy i nekrozy w komórkach nabłonka (powiększenie 400x) po 8 h inkubacji - kontrola rozpuszczalnika; od prawej: Brak apoptozy i nekrozy w komórkach nabłonka (powiększenie 400x) po 24 h inkubacji - kontrola rozpuszczalnika.

Fig. 4 - od lewej: Brak apoptozy i nekrozy w komórkach nabłonka (powiększenie 400x) po 8 h inkubacji - Totarol; od prawej: Brak apoptozy i nekrozy w komórkach nabłonka (powiększenie 400x) po 24 h inkubacji - Totarol.

Kompozycja zgodna z wynalazkiem przeznaczona jest do stosowania w profilaktyce i leczeniu stanów zapalnych błony śluzowej pochwy. Charakteryzuje się wysoką skutecznością i selektywnością działania przeciwbakteryjnego, dzięki zastosowaniu ściśle określonej ilości totarolu jako substancji aktywnej. Dodatkowo kompozycja może zawierać substancje o działaniu przeciwgrzybiczym i przeciwpierwotniakowym.

Najważniejszą, unikatową zaletą kompozycji według wynalazku w opisanej postaci jest to, iż wysoce selektywne działanie przeciwbakteryjne totarolu, ukierunkowane na bakterie patogenne, nie narusza prawidłowej biocenozy i nie niszczy laseczek kwasu mlekowego z rodziny Lactobacillus będących najistotniejszym składnikiem fizjologicznej flory. Dodatkowym czynnikiem stymulującym rozwój i odbudowę prawidłowej flory pochwy jest kwas mlekowy, który dzięki regulacyjnej funkcji obniżenia pH tworzy barierę dla drobnoustrojów wrażliwych na kwaśne środowisko oraz stwarza korzystne warunki dla rozwoju bakterii z rodziny Lactobacillus.

W obecnie stosowanych rozwiązaniach substancja lecznicza w postaci antybiotyku niszczy florę patogenną jednocześnie niszcząc również florę fizjologiczną i będące jej głównym składnikiem laseczki kwasu mlekowego. Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku, dzięki obecności eksperymentalnie określonego stężenia przeciwbakteryjnie aktywnego totarolu działa w sposób specyficzny i selektywny jedynie na bakterie patogenne będące przyczyną stanu zapalnego spowodowanego BV lub AV. Stężenie to zostało określone w wyniku procesu badawczego przeprowadzonego po raz pierwszy przez autorów wynalazku. Dodatkowa obecność kwasu mlekowego w kompozycji, zbuforowanego polimerem zasadowym, zakwasza środowisko i wspomaga rozwój i namnażanie istniejących bakterii Lactobacillus. Dzięki temu kompozycja wykazuje bardzo wysoką skuteczność przy jednoczesnym braku negatywnego wpływu na fizjologiczną biocenozę, co ogranicza występujące w przypadku stosowania klasycznych terapii nawroty choroby odnotowywane u większości pacjentek po przebytym BV lub AV. Jednocześnie w kompozycji można wykorzystać znaną możliwość precyzyjnej regulacji pH poprzez zmianę wzajemnego stosunku kwasu mlekowego do użytego polimeru zasadowego. Kompozycja dobrze przylega na całej powierzchni błony śluzowej, co wydłuża czas jej utrzymywania się wewnątrz pochwy i zapewnia równomierny kontakt z czynnikiem przeciwbakteryjnym w postaci totarolu.

Kompozycję do postępowania w przypadku infekcji mieszanych można uzyskać uzupełniając skład kompozycji podstawowej substancjami o profilowanym działaniu przeciwgrzybiczym bądź prze

PL 236 429 B1 ciwpasożytniczym, jednocześnie dobierając odpowiednie dla leczenia pH. Kompozycja może być również wykorzystana w celach profilaktycznych lub jako produkt do codziennej higieny intymnej. Kompozycja w postaci sypkiego proszku może być wykorzystana do bezpośrednich zabiegów ginekologicznych jako zasypka lub do sporządzania preparatów w innych formach, takich jak żel lub płyn do irygacji, po dodaniu odpowiednio dobranej ilości wody oczyszczonej lub do wytwarzania tabletek po zmieszaniu ze znanymi substancjami umożliwiającymi tabletkowanie lub globulek dopochwowych. Docelowy skład wszystkich wymienionych form preparatów końcowych może zostać uzupełniony substancjami o działaniu przeciwgrzybiczym bądź przeciwpierwotniakowym.

Sposobem według wynalazku uzyskuje się kompozycję o selektywnym działaniu przeciwbakteryjnym ukierunkowanym jedynie na bakterie patogenne. Dzięki równomiernemu naniesieniu totarolu na cząstki modyfikowanej chemicznie pochodnej celulozy uzyskano efekt rozwinięcia powierzchni kontaktu substancji aktywnej z błoną śluzową w całej objętości stosowanego preparatu. Rozwiązanie to pozwoliło również na znaczące ograniczenie a w niektórych przypadkach na wyeliminowanie konieczności stosowania w produktach gotowych dużych ilości rozpuszczalników organicznych mieszających się z wodą w celu rozpuszczenia hydrofobowego totarolu. Jednocześnie wskutek buforującego działania użytego polimeru zasadowego uzyskuje się efekt stopniowego i wydłużonego w czasie uwalniania substancji czynnej wraz z regulującym pH pochwy kwasem mlekowym. Opisane działanie nie było możliwe do uzyskania przy zastosowaniu kompleksu znanego z opisów patentowych: PL 166898, 194437, 201868 oraz 201869. Wytworzona sposobem według wynalazku kompozycja zapewnia dobre jej przyleganie na całej powierzchni błony śluzowej co wydłuża czas jej utrzymywania się wewnątrz pochwy i zapewnia równomierny kontakt z czynnikiem przeciwbakteryjnym w postaci totarolu.

Wynalazek obejmuje także zastosowanie wyżej zdefiniowanej kompozycji do wytwarzania preparatu do wspomagającego leczenia oraz łagodzenia objawów w leczeniu stanów zapalnych błon śluzowych pochwy o podłożu bakteryjnym. Kompozycja jest szczególnie użyteczna w przypadku nawracających infekcji błony śluzowej pochwy.

Wynalazek został bliżej przedstawiony w przykładach.

P r z y k ł a d 1

Badanie aktywności przeciwbakteryjnej totarolu z użyciem DMI (dimetylo izosorbid) jako rozpuszczalnika.

Z 24-godzinnej hodowli szczepu wzorcowego przygotowano zawiesinę 0,5 jednostek McFarlanda (McF) w soli fizjologicznej [gęstość zawiesiny 108 cfu/ml (cfu - colony-forming-unit - jednostka tworząca kolonie)]). Pobrano 1 ml do 9 ml bulionu tryptonowo sojowego (TSB) (rozcieńczenie 10^-1). Postępując w opisany sposób przygotowano zawiesiny o rozcieńczeniu 10^-6. Do dalszych badań przeznaczono zawiesinę o gęstości komórek 105 cfu/ml. Dla każdego szczepu przygotowano 2 płytki 96-dołkowe: pierwsza przeznaczona do pomiaru średniej z 3 pomiarów (OD), druga w celu wykonania posiewu ilościowego na podłoża stałe.

A/ do dołków B1-D1, B2-D2 oraz B-D od 4-11 dodano 100 pl bulionu

B/ do dołków B3-D3 dodano 200 pl bulionu

C/ do dołków B1-D1 dodano 1 pl roztwór wyjściowyI

D/ do dołków B2-D2 dodano 1 pl roztwór wyjściowyII

E/ do dołków B3-D3 dodano 2 pl roztwór wyjściowyIII

Używając pipety wielokanałowej z dołków B3-D3 pobrano po 100 pl próbki i umieszczono w dołkach B4-D4 (mieszając przez 5-krotne wciąganie i wypuszczanie zawartości). Po wymianie końcówek pipety pobrano po 100 pl zawartości dołków B4-D4 i umieszczono w dołkach B5-D5 mieszając jak poprzednio. Czynności te powtarzano aż do dołków B11-D11 włącznie. Po wymieszaniu zawartości w dołkach B11-D11 pobrano 100 pl płynu i odrzucono. W ten sposób otrzymano kolejne rozcieńczenia próbek totarolu w DMI w zakresie od 0,32% do 0,0004%.

Następnie do dołków B, C, D od 1-11 dodano 100 pl odpowiedniej hodowli bakterii. W konsekwencji nastąpiła zmiana w zakresie końcowego stężenia od 0,16% do 0,0002%.

Przygotowanie kontroli:

Kontrola ujemna: do dołka A1 dodano 100 pl bulionu + 1 pl DMI

Kontrola dodatnia (I): do dołka E1-G1 dodano 100 pl bulionu z hodowlą bakterii

Kontrola dodatnia rozcieńczalnika (II): do dołka E2-G2 dodano 100 pl bulionu z hodowlą bakterii + 1 pl DMI.

PL 236 429 B1

Odczytano wartość OD w poszczególnych dołkach przy długości fali 620 nm (czas 0 odczytu), z drugiej 96-dołkowej płytki wysiano hodowlę metodą ilościową z każdego rozcieńczenia na płytkę z odpowiednim podłożem stałym i inkubowano 24 h w temp. 37°C w zależności od szczepu w warunkach tlenowych lub beztlenowych. Płytki inkubowano w warunkach tlenowych lub atmosferze podwyższonego stężenia CO2 (dla szczepów wymagających) w cieplarce w temp. 37°C. Po upływie odpowiednio 8 h, 16 h i 24 h dokonywano odczytu OD. Zawartość płytek delikatnie mieszano przed każdym pomiarem OD. Równolegle z odczytem OD, z drugiej 96-dołkowej płytki posiano hodowle z każdego rozcieńczenia na płytki z odpowiednim podłożem stałym i inkubowano 24 h w temp. 37°C, w warunkach tlenowych lub beztlenowych.

Do analizy wyników eksperymentów brano pod uwagę średnią wartość pomiaru OD uzyskaną z trzech powtórzeń w poszczególnych czasach (0, 8, 16 i 24h) dla poszczególnych drobnoustrojów (Gardnerella vaginalis, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecalis, Lactobacillus gasseri/plantarum). Dodatkowo brano pod uwagę liczbę bakterii wyrosłych na podłożach stałych. Wyniki przedstawiono w Tabelach 1, 2, 3, 4 i 5. Wyniki badań potwierdzają specyficzną, zależną od użytego stężenia selektywność oraz wysoką skuteczność przeciwbakteryjną tot arolu w stosunku do mikroorganizmów patogennych: Gardnerella vaginalis, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecalis przy niskich bezpiecznych dla bakterii z rodzaju Lactobacillus wartościach MIC.

P r z y k ł a d 2

Badanie wpływu totarolu na komórki nabłonka pochwy ludzkiej linii komórkowej A-431 (ATCC® CRL-1555™).

Badanie wykonano z wykorzystaniem testu: Annexin-V-Fluos (Roche, Mannheim, Germany), w trakcie inkubacji przez 2, 8 oraz 24 godziny, w warunkach in vitro, zgodnie z instrukcją producenta testu. Próbkę totarolu przygotowano przez rozpuszczenie w 3 ml 100% DMI 3 mg totarolu.

Czas hodowli dla linii tkankowej A-431 wynosił 20 dni. Hodowlę prowadzono w temperaturze 37°C w atmosferze zawierającej 10% CO2 na podłożu hodowlanym DMEM (Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej-PAN, Wrocław) z dodatkiem 10% surowicy wołowej FBS (Fetal Bovine Serum) Sigma-Aldrich. Płyny hodowlane wymieniano regularnie co 48 godzin. Po osiągnięciu zlewnego wzrostu czyli tzw. „monolayer” komórki pasażowano stosując (przez około 10 min) 0.25% Trypsynę (Sigma-Aldrich). Następnie uzyskaną linię tkankową przesiewano na płytki 24-dołkowe (TPP) doprowadzając ich gęstości do wartości 5 x 105 na dołek. Hodowlę tkankową badanych linii prowadzono przez kolejne 3 dni na powierzchni jałowych szkiełek podstawowych umieszczonych na dnie 24-dołkowej płytki do osiągnięcia na powierzchni szkiełek podstawowych zlewnego wzrostu. Po uzyskaniu tzw. „monolayer” komórki przepłukiwano zbuforowanym roztworem soli fizjologicznej (PBS) bez jonów Ca+2 i Mg+2 (IITD PAN Wrocław) i zalewano 700 gl świeżego podłoża DMEM z 10% surowicą FBS wraz z 300 gl odpowiednio przygotowanego totarolu.

Kontrola ujemna: 1000 gl świeżego podłoża DMEM z 10% surowicą FBS

Kontrola rozpuszczalnika: 700 gl świeżego podłoża DMEM z 10% surowicą FBS + 300 gl rozpuszczalnika DMI

Kontrola dodatnia nekrozy: 900 gl świeżego podłoża DMEM z 10% surowicą FBS + 100 gl H2O2 (30%)

Badanie właściwe z użyciem testu Annexin-V-Fluos powoduje, iż komórki apoptotyczne ulegają wybarwieniu na kolor zielony. W celu wybarwiania komórek nekrotycznych stosuje się jodek propidyny (JP). Barwnik ten posiada zdolność swobodnego przemieszczania się do wnętrza komórki tylko przez uszkodzoną błonę komórkową, barwiąc to wnętrze na kolor czerwony. W przypadku braku uszkodzenia błony komórkowej jodek propidyny zatrzymuje się na jej powierzchni tworząc charakterystyczne czerwone „halo” wokół komórki. Po upływie odpowiedniego czasu badania, tj. 2, 8 i 24 godz., płyn hodowlany usuwano, całość przepłukiwano dwukrotnie PBS podgrzanym uprzednio do temperatury 37°C. Następnie na powierzchnię każdego szkiełka podstawowego (umieszczonego w dołku hodowlanym) nanoszono po 100 gl mieszaniny barwników fluorescencyjnych wchodzących w skład zestawu Annexin-V-Fluos (Roche) oraz dodatkowo stosowano barwnik Hoechst (barwienie DNA komórek). Procedurę barwienia przeprowadzono zgodnie z zaleceniami producenta. Hodowlę wraz z naniesionymi na nią barwnikami inkubowano 20 min w temp. pokojowej. Intensywność świecenia komórek zabarwionych poszczególnymi barwnikami obserwowano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnnego przy długości fali 494-520 nm, stosując powiększenie 400x. Komórki zliczano w pięciu polach widzenia, a wyniki uśredniono. Wiarygodność przeprowadzonych badań potwierdza zastosowany jako kontrola dodatnia nadtlenek wodoru, który spowodował wystąpienie silnego procesu nekrozy już

PL 236 429 B1 po 2 godzinach inkubacji. Analizy danych wykonano na podstawie średniej liczby komórek z pięciu pól widzenia w poszczególnych czasach (2, 8 i 24 h). Wyniki przedstawiono w Tabelach 6 oraz w postaci dokumentacji zdjęciowej Rycina 1, 2, 3, 4. Wyniki badań potwierdzają brak działania apoptotycznego i nekrotycznego totarolu na ludzkie komórki nabłonka epitelium pochwy A-431 w szerokim czasie inkubacji (2-24 godziny).

P r z y k ł a d 3

Otrzymywanie kompozycji w postaci proszku.

Skład kompozycji:

1. Totarol

2. Kwas mlekowy

3. Eudragit E-100

4. Metyloceluloza

0,1 części masowych

1,0 części masowych (2 mole)

1,5 części masowych (1 mol)

97,4 części masowych

Kompozycję wytwarza się rozpuszczając Eudragit w kwasie mlekowym w wymienionym w składzie kompozycji stosunku stechiometrycznym, w mieszalniku wyposażonym w mieszadło mechaniczne, mieszając przez czas 20 minut, po czym pozostawia całość na 24 godziny. Po tym czasie rozpuszcza się otrzymaną komponentę w 95% alkoholu etylowym, stosując 10 części masowych alkoholu oraz 0,1 części masowych totarolu licząc w stosunku do sumy składników. Całość miesza się aż do rozpuszczenia komponenty, a następnie otrzymanym roztworem spryskuje się przez dyszę metylocelulozę umieszczoną w mieszalniku rozpylacza dyszowego i miesza do czasu, aż metyloceluloza ulegnie równomiernemu zwilżeniu, lecz nie krócej niż 10 minut. Wilgotny produkt poddaje się suszeniu w temperaturze 25°C podczas którego usuwa się alkohol etylowy, w suszarce z wymuszonym przepływem powietrza i skraplaczem rozpuszczalników. Otrzymuje się sypki proszek, który miesza się do pełnego ujednolicenia i dozuje do pojemników z tworzywa sztucznego lub do pojemników szklanych.

P r z y k ł a d 4

Otrzymywanie kompozycji w postaci żelu.

Skład kompozycji:

1.	Totarol	0, 5 części masowych
2.	Kwas mlekowy	0,5 części masowych (1 mole)
3.	Chitozan	0, 83 części masowych (1 mol)
4.	Metyloceluloza	98,2 części masowych
5.	Woda oczyszczona	25 części masowych w stosunku do sumy składników

Kompozycję wytwarza się podobnie jak w przykładzie 3, z tym że do otrzymanego suchego produktu w postaci proszku dodaje się, mieszając, wodę, a następnie, po uzyskaniu jednorodnej mieszaniny, pozostawia bez mieszania na czas 30 min. Otrzymany żel dozuje się do pojemników plastikowych z aplikatorem.

P r z y k ł a d 5

Otrzymywanie kompozycji w postaci tabletek.

Skład kompozycji:

1. Totarol 2. Kwas mlekowy 3. Poliwinylopirolidon-90 4. Metyloceluloza

0,08 części masowych 0,5 części masowych (1 mole) 5,0 części masowych (1 mol) 94,4 części masowych

Kompozycję wytwarza się podobnie jak w przykładzie 3, z tym że do otrzymanego suchego produktu w postaci proszku dodaje się, jeżeli to konieczne, znanych substancji stosowanych przy tabletkowaniu, a następnie znanym sposobem tabletkuje się w odpowiednich dozach leczniczych.

P r z y k ł a d 6

Otrzymywanie kompozycji w postaci globulek.

Skład kompozycji:

1. Totarol 2. Kwas mlekowy 3. Chitozan 4. Metyloceluloza

0,5 części masowych 4,0 części masowych (8 moli) 0,83 części masowych (1 mol) 94,4 części masowych

Dodatki licząc w stosunku do sumy składników kompozycji:

1 Żelatyna 2. Woda oczyszczona

16,5 części masowych 83,5 części masowych

PL 236 429 B1

Kompozycję wytwarza się podobnie jak w przykładzie 3, z tym że otrzymany suchy produkt w postaci proszku rozpuszcza się w części wody uzyskując żel, do którego dodaje się wodny roztwór żelatyny, sporządzony z resztą wody, podgrzany do temperatury 90°C, miesza i wyle wa do form otrzymując globulki.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie totarolu do wytwarzania preparatu do leczenia beztlenowego bakteryjnego zakażenia pochwy (BV) oraz tlenowego bakteryjnego zakażenia pochwy (AV), do łagodzenia objawów w takim leczeniu oraz do profilaktyki i zapobiegania nawrotom takich stanów zapalnych.
2. Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu stanów zapalnych błony śluzowej pochwy o podłożu bakteryjnym, do łagodzenia objawów w takim leczeniu oraz do profilaktyki i zapobiegania nawrotom takich stanów zapalnych, zawierająca od 75 do 95 części masowych pochodnej celulozy, korzystnie metylocelulozę, od 0,5 do 5 części masowych kwasu mlekowego, od 0,5 do 5 części masowych polimeru zasadowego, korzystnie polimeru akrylowego, najkorzystniej kopolimeru kwasu metakrylowego i akrylanu etylu, lub chitozanu lub poliwinylopirolidonu lub ich mieszanin, w której stosunek stechiometryczny kwasu mlekowego do polimeru zasadowego zawiera się w granicach od 1:1 do 8:1, znamienna tym, że zawiera totarol w ilości od 0,001 do 5 części masowych jako substancję aktywną.