CN106581687A - 以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶及其制备方法,属于抑菌凝胶生物的技术领域。制备原料有乳清蛋白凝胶、桃柁酚、无水乙醇。制备方法采用溶胶‑凝胶技术,步骤有乳清蛋白凝胶制备、桃柁酚嵌入、超声处理和静置与杀菌。本发明抑菌纳米水凝胶配方,实现了一种新型的食源性抑菌剂。同时具有乳清蛋白和桃柁酚的特点和优势。乳清蛋白聚合物在抑菌纳米水凝胶体系中起着分散稳定剂、凝胶基质等多重作用,不添加任何交联剂和引发剂,不会产生对人体的毒性作用,使用更安全有效;本发明生产抑菌纳米水凝胶的设备和工艺过程简单,条件温和,成本低,易推广,适合工业化生产。
Description
技术领域:
本发明属于抑菌凝胶生物的技术领域,特别是涉及以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶及其制备方法。
背景技术:
乳清蛋白作为原辅料已经有40多年的历史,是重要的优质蛋白质资源之一。乳清蛋白生物价(BV)高,属于全价蛋白,含有组成蛋白质的全部20种氨基酸,且含量高于普通的食用蛋白质,与FAO规定的氨基酸标准模式相比,其氨基酸模式与人体相似,均能满足人体AA平衡的需要。随着乳清蛋白生物学功能的研究及其衍生产品开发的兴起,已证实乳清蛋白中含有具有免疫调节、降血压、降血糖、降胆固醇、抗氧化、抗菌和抗病毒等生物活性的潜在肽段,这对进一步提升乳清蛋白产品的营养保健功能,提高乳清蛋白产品的附加值及开发利用具有重大意义。成胶特性是乳清蛋白一个重要的特性,其原理在于乳清蛋白分子结构的展开,改变结构的蛋白质之间通过聚合形成乳清蛋白分子之间的聚合体。当加热温度高于70℃时,乳清蛋白中的β-乳球蛋白发生不可逆的变性作用,空间构象发生改变,暴露出疏水集团和游离巯基,形成乳清蛋白聚集体溶液,进而在不同因素诱导下形成凝胶。
桃柁酚(Totarol)是天然植物提取物,是一种高效抗菌剂,对革兰氏阳性,包括链球菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌等具有较好的抗菌作用。桃柁酚的活性成分对人体皮肤、身体和口腔有非常好的抗菌、清洁作用,且对人体皮肤无刺激性和过敏反应。因此,桃柁酚已被广泛证实具有高效的生物活性、人体安全性和产品配方兼容性,应用于临床医疗及药妆产品。
细菌感染,是指致病菌或条件致病菌等侵入人体所引起的局部組织和全身性炎症反应,是生物医学领域面临的一个严重问题。水凝胶作为一种广泛应用的生物材料,在实际医学应用中不可避免地要面临细菌感染问题,比如手术后伤口处的感染等;而且,其自身具有较高的含水量,保持着一种湿润环境,该环境既会促进正常细胞组织的生长,同时也有利于微生物的繁殖。所以,研究开发抗菌水凝胶材料既可以治疗人体组织损伤处的细菌感染问题,也可以防止水凝胶自身引起的相关感染,具有重要的现实意义。
目前抗菌水凝胶的研究报道并不多,根据水凝胶中抗菌成分分类,主要有四种:银系抗菌水凝胶、季铵盐类抗菌水凝胶、多肽类抗菌水凝胶及天然大分子抗菌水凝胶。中国专利CNI05878280.A公开了具有抑菌功效医用温敏水凝胶的制备方法,该发明以壳聚糖纳米银复合物、甘油磷酸钠为原料,在室温条件下制得为可流动胶体溶液,而在加热条件下可转变为不流动的凝胶。中国专利CN104523452.A公开了一种抑菌型羧化壳聚糖复合凝胶的制备方法,改产品采用闪式提取器破碎和水浴杀菌法制得符合凝胶,对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等具有良好抑菌效果。中国专利CN104606680.A公开了一种壳聚糖-γ-聚谷氨酸的聚电解质复合抗菌水凝胶。壳聚糖中氨基与γ-聚谷氨酸中羧基通过离子相互作用形成复合体,得到水凝胶PEC。但该类水凝胶的抗菌活性不是很好,且其抗菌性受壳聚糖分子量影响。中国专利CN103004757.A公开了一种多孔温敏水凝胶缓释剂及其制备方法。该发明以聚N-异丙基丙烯酞胺多孔温敏水凝胶为载体,在凝胶内负载上药物,利用聚N-异丙基丙烯酞胺的温度敏感特性来实现对药物的控制释放。中国专利CN102579322.A公开了一种外用水凝胶剂及其制备方法与它的用途。该发明以卡波姆、3,5-二轻基-4-异丙基二苯乙烯等制得而成,用于制备治疗牛皮癣或湿疹的药物。中国专利CN 200910039822.X公开了一种抗菌性超分子水凝胶及其制备方法和应用。该发明以硝酸银晶体和聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇三嵌段共聚物溶液为原料制备得到可注射水凝胶。
理想的抗菌水凝胶材料在具有良好抗菌活性的同时,也应具有良好的生物相容性、良好的生物可降解性及简易温和的制备方法。但从上述已经公开的专利中制备得到的水凝胶或抑菌凝胶产品可以看出,抗菌水凝胶材料很少能够兼顾以上的性能。因此,制备一种具有高效抗菌活性、生物相容性和生物可降解性,实现一种新型的食源性抑菌剂等技术难题对本领域技术人员是一种新的挑战。
发明内容:
本发明所要解决的技术问题是提供一种以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶。该抗菌纳米水凝胶是利用超声技术物理改性代替化学改性,避免引入有害化学试剂而导致的细胞毒性上升的问题,并以乳清蛋白为凝胶基质引入桃柁酚抑菌剂制备抗菌纳米水凝胶,对以金黄色葡萄球菌为代表的革兰氏阳性菌具有较好的抑菌作用,无细胞毒性,制备条件温和,产品质量稳定,具备良好的生物相容性和生物可降解性等优势,是一种新型的食源性抑菌剂。
本发明解决问题的技术方案是:
一种以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶,制备原料有乳清蛋白凝胶、桃柁酚、无水乙醇;各成分按质量份数计,乳清蛋白凝胶70~90、桃柁酚0.0001~0.001、无水乙醇10~30;所述的乳清蛋白凝胶,成分及按质量份数计有去离子水100、乳清蛋白粉5~30、氢氧化钠(NaOH)调节pH值为7.0~10.0。
优选的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶,制备原料按质量份数的用量是:乳清蛋白凝胶90、桃柁酚0.0001~0.0005、无水乙醇10;所述的乳清蛋白凝胶,成分及按质量份数计有去离子水100、乳清蛋白粉15~20。
本发明的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶,所述的乳清蛋白粉,蛋白含量90%以上;所述的桃柁酚,提取纯度98%以上;所述的无水乙醇,分析纯AR,纯度95%以上;所述的去离子水,是经Milli-Q超纯水系统制得;所述的氢氧化钠(NaOH),分析纯AR,纯度96%以上。
本发明的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶制备方法有如下步骤:
(1)乳清蛋白凝胶制备:
a.水合:将乳清蛋白粉(5%~30%)加入去离子水中,并于磁力搅拌器下以2000~4000rpm转速搅拌1h-2h,4℃条件下放置8~15h,使其充分水合。
b.平衡:水合后的乳清蛋白溶液(5%~30%)置于室温条件下平衡1~4h。
c.调节pH:用2~10M的NaOH溶液调节平衡后的乳清蛋白溶液体系pH值,得到pH值为7.0~10.0的乳清蛋白溶液。
d.加热:将调节pH值后的乳清蛋白溶液置于70~100℃恒温水浴中加热5~20min,形成乳清蛋白凝胶。
在乳清蛋白凝胶制备中,各原料括号内的百分数是以去离子水为基数的质量含量。
(2)桃柁酚嵌入:
a.溶解:用无水乙醇(10~30%)溶解桃柁酚
b.嵌入:根据桃柁酚对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC值)1~10μg/mL加入到乳清蛋白凝胶(70~90%),得到乳清蛋白凝胶与桃柁酚混合液。
在桃柁酚嵌入过程中,各原料括号内的百分数是以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶为基数的质量含量。
(3)超声处理:取步骤(2)得到的乳清蛋白凝胶与桃柁酚混合液15~30mL置于烧杯中,在冰浴条件下进行超声处理。超声探头置于乳清蛋白凝胶与桃柁酚混合液液面下3~6mm,且所有超声样品保持相同距离。
超声条件为超声振幅20~40%、超声温度0℃、超声时间10~30min。使桃柁酚与乳清蛋白凝胶充分融合,形成乳清蛋白-桃柁酚抑菌纳米溶液。
(4)静置:将步骤(3)得到乳清蛋白-桃柁酚抑菌纳米水溶液在室温条件下静置1~4h,使其充分凝胶化,得到以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶。最后紫外杀菌:将静置后的乳清蛋白-桃柁酚抑菌纳米水凝胶置于无菌操作台中,紫外光照射6~18h。
本发明的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶制备方法的技术方案可归纳如下。
一种以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶的制备方法,有如下步骤:
(1)乳清蛋白凝胶制备:将乳清蛋白粉加入去离子水中,以2000~4000rpm转速磁力搅拌1~2h,4℃条件下放置8~15h,使其充分水合;再室温条件下平衡1~4h;NaOH溶液调节乳清蛋白溶液体系pH值为7.0~10.0,再于70~100℃恒温水浴中加热5~20min,形成乳清蛋白凝胶;其中,乳清蛋白粉与去离子水的质量比为5~30:100;
(2)桃柁酚嵌入:用无水乙醇溶解的桃柁酚加入到乳清蛋白凝胶中,得到乳清蛋白凝胶与桃柁酚混合液,其中按质量计桃柁酚:无水乙醇:乳清蛋白凝胶为0.0001~0.001:10~30:70~90;
(3)超声处理:将乳清蛋白凝胶与桃柁酚混合液在冰浴条件下进行超声处理,超声探头置于乳清蛋白凝胶与桃柁酚混合液液面下3~6mm,超声振幅20~40%,超声时间10~30min,使桃柁酚与乳清蛋白凝胶充分融合,形成乳清蛋白-桃柁酚抑菌纳米溶液;
(4)静置与杀菌:将乳清蛋白-桃柁酚抑菌纳米水溶液静置1~4h,得到以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶;最后紫外光杀菌。
在乳清蛋白凝胶制备步骤中,所述的NaOH溶液,可以是2~10M的NaOH溶液。
在超声处理步骤中,超声温度将影响以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶的抑菌效果,0℃下超声制备的凝胶抑菌效果较好。
在静置与杀菌步骤中,所述的紫外光照射杀菌,是在无菌操作台中紫外光照射6~18h。
与现有技术相比,本发明的有益效果如下:
(1)采用本发明抑菌纳米水凝胶配方,实现了一种新型的食源性抑菌剂。同时具有乳清蛋白和桃柁酚的特点和优势。本发明添加的乳清蛋白,具有免疫调节、降血压、降血糖、降胆固醇、抗氧化、抗菌和抗病毒等生物活性;添加的桃柁酚是一种高效抗菌剂,对革兰氏阳性,包括链球菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌等具有较好的抗菌作用。还可以修护细胞间脂质,促进细胞生长,具有高效的生物活性、人体安全性和产品配方兼容性。
(2)本发明抑菌纳米水凝胶制备过程中,桃柁酚首先借助于乳清蛋白聚合物在水溶液中形成分散稳定的溶胶,进而利用溶胶-凝胶技术,通过乳清蛋白与桃柁酚的主客体作用于凝胶机制中。这种凝胶制备方法保证了桃柁酚颗粒在凝胶基质中的均匀分散,在桃柁酚含量较低的条件下仍能实现抑菌纳米水凝胶的抗菌性能。
(3)本发明制备的抑菌纳米水凝胶的强度和凝胶化时间可通过乳清蛋白聚合物浓度调控,随着乳清蛋白聚合物浓度的增加,凝胶的弹性模量增加,凝胶化时间缩短。
(4)本发明所用的乳清蛋白聚合物在抑菌纳米水凝胶体系中起着分散稳定剂、凝胶基质等多重作用,不添加任何交联剂和引发剂,不会产生对人体的毒性作用,使用更安全有效,还可实现良好的生物相容性和高效的抑菌性能,可被广泛应用在生物医药、组织工程学领域。
(5)采用本发明抑菌纳米水凝胶制备方法,提高了抑菌纳米水凝胶各种性能。一是经超声处理后制得以乳清蛋白为基质的桃拓酚抑菌纳米水凝胶平均粒径为27.44nm,粒径均匀,实现了低纳米级,超声处理对控制凝胶粒径大小和防止分子聚合起到了主要作用;二是超声处理可以延缓凝胶转化过程,得到的抑菌纳米水凝胶可能是含较小包裹水和结合水的三维疏松网络状空间结构的水凝胶,有利于抑菌成分分散均匀;三是超声处理能促使植物细胞(桃拓酚)的破壁,提高抑菌功效。
(6)本发明生产抑菌纳米水凝胶的设备、工艺过程简单,条件温和,成本低,易推广,适合工业化生产。
附图说明
图1为实施例1的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶动态模量扫描曲线。
图2为实施例1的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶时间-杀菌曲线图。
图3为实施例1的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶抑菌环实验结果图。
图4为实施例1的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶扫描电镜图。
图5为实施例2的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶动态模量扫描曲线。
图6为实施例2的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶时间-杀菌曲线图。
图7为实施例2的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶抑菌环实验结果图。
图8为实施例2的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶扫描电镜图。
图9为实施例3的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶动态模量扫描曲线。
图10为实施例3的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶时间-杀菌曲线图。
图11为实施例3的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶抑菌环实验结果图。
图12为实施例3的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶扫描电镜图。
图13为实施例4的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶动态模量扫描曲线。
图14为实施例4的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶时间-杀菌曲线图。
图15为实施例4的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶抑菌环实验结果图。
图16为实施例4的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶扫描电镜图。
图17为实施例5的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶动态模量扫描曲线。
图18为实施例5的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶时间-杀菌曲线图。
图19为实施例5的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶抑菌环实验结果图。
图20为实施例5的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶扫描电镜图。
图21为未超声处理的水凝胶动态模量扫描曲线。
图22为未超声处理的水凝胶时间-杀菌曲线图。
图23为未超声处理的水凝胶抑菌环实验结果图。
图24为未超声处理的水凝胶扫描电镜图。
具体实施方式:
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
以下各实施例中的产品分析,分析项目及方法如下:
a.以乳清蛋白为基质的桃柁酚抑菌纳米水凝胶特性分析:
粒度分析:用Zetasizer Nano激光粒度仪(英国马尔文公司)直接测量。
电位分析:用Zetasizer Nano激光粒度仪(英国马尔文公司)直接测量。
粘度分析:用CT-3质构仪(CT-3质构仪)直接测量。
流变学分析:用CT-3质构仪(CT-3质构仪)直接测量。
b.以乳清蛋白为基质的桃柁酚抑菌纳米水凝胶抑菌机制分析:
本分析项目考察抑菌纳米水凝胶对金黄色葡萄球菌的抑制作用,所选的金黄色葡萄球菌株为S.aureus strains ATCC 29213,如表1所示。
表1最小抑菌浓度MIC
最小抑菌浓度MIC(活性研究)分析:考察桃柁酚在纳米水凝胶中发挥抑菌作用的最小浓度(μg/mL)。
时间-杀菌曲线(活性研究)分析:考察纳米凝胶的杀菌作用随时间变化的效果
琼脂扩散实验(活性研究)分析:基本原理将含有定量抗菌成分的纸片贴在已接种待检菌的琼脂平板上,纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后会不断地向纸片周围区域扩散,在纸片周围抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制,从而产生透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映检测菌对纳米凝胶中抑菌成分的敏感程度,并与该成分对待检菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关,即抑菌圈愈大,MIC愈小。
细菌膜损伤实验(机制研究)分析:考察细菌细胞壁在纳米凝胶抑菌作用下的受损程度。
扫描电镜(机制研究)分析:考察超声技术对纳米凝胶结构及抑菌特性的影响。在纳米凝胶抑菌成分的作用下,细菌细胞壁会受到损伤,加药量越大,细菌细胞壁的损伤程度越大,具体变现为细菌细胞壁破裂,凹陷,甚至菌体解散。
实施例1
(1)乳清蛋白凝胶制备:
a.水合:将乳清蛋白粉(15%)加入去离子水中,并于磁力搅拌器下以2000rpm转速搅拌2h,4℃条件下放置12h,使其充分水合。
b.平衡:水合后的乳清蛋白溶液(15%)置于室温条件下平衡1h。
c.调节pH:用2M的NaOH溶液调节平衡后的乳清蛋白溶液体系pH值,得到pH值为7.0的乳清蛋白溶液。
d.加热:将调节pH值后的乳清蛋白溶液置于70℃恒温水浴中加热10min,形成乳清蛋白凝胶。
在乳清蛋白凝胶制备中,各原料括号内的百分数是以去离子水为基数的质量含量。
(2)桃柁酚嵌入:
a.溶解:用无水乙醇(10%)溶解桃柁酚
b.嵌入:根据桃柁酚对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC值)4μg/mL加入到乳清蛋白凝胶(90%),得到乳清蛋白凝胶与桃柁酚混合液。
在桃柁酚嵌入过程中,各原料括号内的百分数是以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶为基数的质量含量。
(3)超声处理:取步骤(2)得到的乳清蛋白凝胶与桃柁酚混合液15mL置于烧杯中,在冰浴条件下进行超声处理。超声探头置于乳清蛋白凝胶与桃柁酚混合液液面下3mm,且所有超声样品保持相同距离。
超声条件为超声振幅30%、超声温度0℃、超声时间10min。使桃柁酚与乳清蛋白凝胶充分融合,形成乳清蛋白-桃柁酚抑菌纳米溶液。
(4)静置:将步骤(3)得到乳清蛋白-桃柁酚抑菌纳米水溶液在室温条件下静置2h,使其充分凝胶化,得到乳清蛋白-桃柁酚抑菌纳米水凝胶。
(5)紫外杀菌:将步骤(4)得到的乳清蛋白-桃柁酚抑菌纳米水凝胶至于无菌操作台中,紫外光照射6h。
(6)产品分析,见表2。
表2乳清蛋白-桃柁酚抑菌纳米水凝胶各项指标
图1给出实施例1的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶动态模量扫描曲线。图2给出实施例1的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶时间-杀菌曲线图。图3给出实施例1的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶抑菌环实验结果图。图4给出实施例1的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶扫描电镜图。
实施例2
(1)乳清蛋白凝胶制备:
a.水合:将乳清蛋白粉(15%)加入去离子水中,并于磁力搅拌器下以2000rpm转速搅拌2h,4℃条件下放置12h,使其充分水合。
b.平衡:水合后的乳清蛋白溶液(15%)置于室温条件下平衡1h。
c.调节pH:用2M的NaOH溶液调节平衡后的乳清蛋白溶液体系pH值,得到pH值为7.0的乳清蛋白溶液。
d.加热:将调节pH值后的乳清蛋白溶液置于70℃恒温水浴中加热10min,形成乳清蛋白凝胶。
在乳清蛋白凝胶制备中,各原料括号内的百分数是以去离子水为基数的质量含量。
(2)桃柁酚嵌入:
a.溶解:用无水乙醇(10%)溶解桃柁酚
b.嵌入:根据桃柁酚对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC值)2μg/mL加入到乳清蛋白凝胶(90%),得到乳清蛋白凝胶与桃柁酚混合液。
在桃柁酚嵌入过程中,各原料括号内的百分数是以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶为基数的质量含量。
(3)超声处理:取步骤(2)得到的乳清蛋白凝胶与桃柁酚混合液15mL置于烧杯中,在冰浴条件下进行超声处理。超声探头置于乳清蛋白凝胶与桃柁酚混合液液面下3mm,且所有超声样品保持相同距离。
超声条件为超声振幅30%、超声温度0℃、超声时间20min。使桃柁酚与乳清蛋白凝胶充分融合,形成乳清蛋白-桃柁酚抑菌纳米溶液。
(4)静置:将步骤(3)得到乳清蛋白-桃柁酚抑菌纳米水溶液在室温条件下静置2h,使其充分凝胶化,得到乳清蛋白-桃柁酚抑菌纳米水凝胶。
(5)紫外杀菌:将步骤(4)得到的乳清蛋白-桃柁酚抑菌纳米水凝胶至于无菌操作台中,紫外光照射6h。
(6)产品分析,见表3。
表3乳清蛋白-桃柁酚抑菌纳米水凝胶各项指标
图5给出实施例2的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶动态模量扫描曲线。图6给出实施例2的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶时间-杀菌曲线图。图7给出实施例2的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶抑菌环实验结果图。图8给出实施例2的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶扫描电镜图。
实施例3
(1)乳清蛋白凝胶制备:
a.水合:将乳清蛋白粉(15%)加入去离子水中,并于磁力搅拌器下以2000rpm转速搅拌2h,4℃条件下放置12h,使其充分水合。
b.平衡:水合后的乳清蛋白溶液(15%)置于室温条件下平衡1h。
c.调节pH:用2M的NaOH溶液调节平衡后的乳清蛋白溶液体系pH值,得到pH值为7.0的乳清蛋白溶液。
d.加热:将调节pH值后的乳清蛋白溶液置于70℃恒温水浴中加热10min,形成乳清蛋白凝胶。
在乳清蛋白凝胶制备中,各原料括号内的百分数是以去离子水为基数的质量含量。
(2)桃柁酚嵌入:
a.溶解:用无水乙醇(10%)溶解桃柁酚
b.嵌入:根据桃柁酚对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC值)2μg/mL加入到乳清蛋白凝胶(90%),得到乳清蛋白凝胶与桃柁酚混合液。
在桃柁酚嵌入过程中,各原料括号内的百分数是以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶为基数的质量含量。
(3)超声处理:取步骤(2)得到的乳清蛋白凝胶与桃柁酚混合液15mL置于烧杯中,在冰浴条件下进行超声处理。超声探头置于乳清蛋白凝胶与桃柁酚混合液液面下3mm,且所有超声样品保持相同距离。
超声条件为超声振幅30%、超声温度0℃、超声时间30min。使桃柁酚与乳清蛋白凝胶充分融合,形成乳清蛋白-桃柁酚抑菌纳米溶液。
(4)静置:将步骤(3)得到乳清蛋白-桃柁酚抑菌纳米水溶液在室温条件下静置2h,使其充分凝胶化,得到乳清蛋白-桃柁酚抑菌纳米水凝胶。
(5)紫外杀菌:将步骤(4)得到的乳清蛋白-桃柁酚抑菌纳米水凝胶至于无菌操作台中,紫外光照射6h。
(6)产品分析,见表4。
表4乳清蛋白-桃柁酚抑菌纳米水凝胶各项指标
图9给出实施例3的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶动态模量扫描曲线。图10给出实施例3的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶时间-杀菌曲线图。图11给出实施例3的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶抑菌环实验结果图。图12给出实施例3的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶扫描电镜图。
实施例4
(1)乳清蛋白凝胶制备:
a.水合:将乳清蛋白粉(30%)加入去离子水中,并于磁力搅拌器下以4000rpm转速搅拌2h,4℃条件下放置12h,使其充分水合。
b.平衡:水合后的乳清蛋白溶液(30%)置于室温条件下平衡1h。
c.调节pH:用10M的NaOH溶液调节平衡后的乳清蛋白溶液体系pH值,得到pH值为9.0的乳清蛋白溶液。
d.加热:将调节pH值后的乳清蛋白溶液置于70℃恒温水浴中加热5min,形成乳清蛋白凝胶。
在乳清蛋白凝胶制备中,各原料括号内的百分数是以去离子水为基数的质量含量。
(2)桃柁酚嵌入:
a.溶解:用无水乙醇(30%)溶解桃柁酚
b.嵌入:根据桃柁酚对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC值)4μg/mL加入到乳清蛋白凝胶(70%),得到乳清蛋白凝胶与桃柁酚混合液。
在桃柁酚嵌入过程中,各原料括号内的百分数是以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶为基数的质量含量。
(3)超声处理:取步骤(2)得到的乳清蛋白凝胶与桃柁酚混合液15mL置于烧杯中,在冰浴条件下进行超声处理。超声探头置于乳清蛋白凝胶与桃柁酚混合液液面下3mm,且所有超声样品保持相同距离。
超声条件为超声振幅20%、超声温度0℃、超声时间30min。使桃柁酚与乳清蛋白凝胶充分融合,形成乳清蛋白-桃柁酚抑菌纳米溶液。
(4)静置:将步骤(3)得到乳清蛋白-桃柁酚抑菌纳米水溶液在室温条件下静置2h,使其充分凝胶化,得到乳清蛋白-桃柁酚抑菌纳米水凝胶。
(5)紫外杀菌:将步骤(4)得到的乳清蛋白-桃柁酚抑菌纳米水凝胶至于无菌操作台中,紫外光照射6h。
(6)产品分析,见表5。
表5乳清蛋白-桃柁酚抑菌纳米水凝胶各项指标
图13给出实施例4的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶动态模量扫描曲线。图14给出实施例4的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶时间-杀菌曲线图。图15给出实施例4的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶抑菌环实验结果图。图16给出实施例4的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶扫描电镜图。
实施例5
(1)乳清蛋白凝胶制备:
a.水合:将乳清蛋白粉(10%)加入去离子水中,并于磁力搅拌器下以3000rpm转速搅拌2h,4℃条件下放置12h,使其充分水合。
b.平衡:水合后的乳清蛋白溶液(10%)置于室温条件下平衡1h。
c.调节pH:用10M的NaOH溶液调节平衡后的乳清蛋白溶液体系pH值,得到pH值为9.0的乳清蛋白溶液。
d.加热:将调节pH值后的乳清蛋白溶液置于80℃恒温水浴中加热5min,形成乳清蛋白凝胶。
在乳清蛋白凝胶制备中,各原料括号内的百分数是以去离子水为基数的质量含量。
(2)桃柁酚嵌入:
a.溶解:用无水乙醇(20%)溶解桃柁酚
b.嵌入:根据桃柁酚对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC值)4μg/mL加入到乳清蛋白凝胶(80%),得到乳清蛋白凝胶与桃柁酚混合液。
在桃柁酚嵌入过程中,各原料括号内的百分数是以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶为基数的质量含量。
(3)超声处理:取步骤(2)得到的乳清蛋白凝胶与桃柁酚混合液15mL置于烧杯中,在冰浴条件下进行超声处理。超声探头置于乳清蛋白凝胶与桃柁酚混合液液面下3mm,且所有超声样品保持相同距离。
超声条件为超声振幅40%、超声温度0℃、超声时间10min。使桃柁酚与乳清蛋白凝胶充分融合,形成乳清蛋白-桃柁酚抑菌纳米溶液。
(4)静置:将步骤(3)得到乳清蛋白-桃柁酚抑菌纳米水溶液在室温条件下静置2h,使其充分凝胶化,得到乳清蛋白-桃柁酚抑菌纳米水凝胶。
(5)紫外杀菌:将步骤(4)得到的乳清蛋白-桃柁酚抑菌纳米水凝胶至于无菌操作台中,紫外光照射6h。
(6)产品分析,见表6。
表6乳清蛋白-桃柁酚抑菌纳米水凝胶各项指标
图17给出实施例5的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶动态模量扫描曲线。图18给出实施例5的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶时间-杀菌曲线图。图19给出实施例5的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶抑菌环实验结果图。图20给出实施例5的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶扫描电镜图。
实施例6
本实施例给出上述实施例1~5与未经超声处理的样品的比较。
1)产品分析结果表明:超声处理降低了抑菌纳米水凝胶的粒径并缩小了粒径分布范围,实现了以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米级水凝胶。从电位数据可见,以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶中带负电荷的氨基酸含量要高于带正电荷的氨基酸含量,且水凝胶表面电荷特性和分子相互作用在超声处理前后发生了改变,超声处理后电位绝对值增大。流变学特性数据表明,以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶粘度和凝胶化时间受乳清蛋白聚合物浓度及超声处理条件的影响,浓度越大,超声处理时间越短,粘度越大,凝胶的弹性模量增加,凝胶化时间缩短。抑菌机制各项测定指标表明经超声处理后的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米级水凝胶具有更强的抑菌作用。
2)图21给出未超声处理的水凝胶动态模量扫描曲线。图22给出未超声处理的水凝胶时间-杀菌曲线图。图23给出未超声处理的水凝胶抑菌环实验结果图。图24给出未超声处理的水凝胶扫描电镜图。
由图1、5、9、13、17与图21的动态模量扫描曲线相比较,表明经超声处理后的水凝胶储能模量和损耗模量均有所增加,在乳清蛋白浓度为15%时,呈现出典型的粘弹性流体,且储能模量的上升幅度高于损耗模量上升的幅度,说明样品最终状态趋于半固体状态。
由图2、6、10、14、18与图22的时间-杀菌曲线相比较,表明在菌种起始浓度为107CFU/mL时,实施例2产品和实施例3产品抑菌效果显著,说明超声处理10min以上的水凝胶抑菌效果要高于未经超声处理的水凝胶。
由图3、7、11、15、19与图23的抑菌环实验结果相比较,结果显示了不同产品在不同浓度下的抑菌活性,图23(未超声)中抑菌圈直径为7、11、12和12mm,图7(实施例2超声20min)抑菌圈直径为13、15、20和36mm;图11(实施例3超声30min)抑菌圈直径为12、15、15和35mm,说明水凝胶经超声处理20min后抑菌效果显著提高。
由图4、8、12、16、20与图24的扫描电镜图相比较,表明经超声处理后的水凝胶抑菌效果显著,细菌细胞膜出现褶皱、破裂,变形、胞内菌丝外漏等现象,随着超声处理时间的增加细胞形态的变化程度增大。如图可见大多数细菌细胞最外层消失了,说明超声处理使得以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶抑菌效果增强。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (6)
1.一种以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶,其特征是,制备原料有乳清蛋白凝胶、桃柁酚、无水乙醇;各成分按质量份数计,乳清蛋白凝胶70~90、桃柁酚0.0001~0.001、无水乙醇10~30;所述的乳清蛋白凝胶,成分及按质量份数计有去离子水100、乳清蛋白粉5~30、氢氧化钠(NaOH)调节pH值为7.0~10.0。
2.根据权利要求1所述的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶,其特征是,制备原料按质量份数的用量是:乳清蛋白凝胶为90、桃柁酚为0.0001~0.0005、无水乙醇为10;所述的乳清蛋白凝胶,成分及按质量份数计有去离子水100、乳清蛋白粉15~20。
3.根据权利要求1或2所述的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶,其特征是,所述的桃柁酚,提取纯度98%以上。
4.一种权利要求1的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶的制备方法,有如下步骤:
(1)乳清蛋白凝胶制备:将乳清蛋白粉加入去离子水中,以2000~4000rpm转速磁力搅拌1~2h,4℃条件下放置8~15h,使其充分水合;再室温条件下平衡1~4h;NaOH溶液调节乳清蛋白溶液体系pH值为7.0~10.0,再于70~100℃恒温水浴中加热5~20min,形成乳清蛋白凝胶;其中,乳清蛋白粉与去离子水的质量比为5~30:100;
(2)桃柁酚嵌入:用无水乙醇溶解的桃柁酚加入到乳清蛋白凝胶中,得到乳清蛋白凝胶与桃柁酚混合液,其中按质量计桃柁酚:无水乙醇:乳清蛋白凝胶为0.0001~0.001:10~30:70~90;
(3)超声处理:将乳清蛋白凝胶与桃柁酚混合液在冰浴条件下进行超声处理,超声探头置于乳清蛋白凝胶与桃柁酚混合液液面下3~6mm,超声振幅20~40%,超声时间10~30min,使桃柁酚与乳清蛋白凝胶充分融合,形成乳清蛋白-桃柁酚抑菌纳米溶液;
(4)静置与杀菌:将乳清蛋白-桃柁酚抑菌纳米水溶液静置1~4h,得到以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶;最后紫外光杀菌。
5.根据权利要求4所述的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶的制备方法,其特征是,在乳清蛋白凝胶制备步骤中,所述的NaOH溶液,是2~10M的NaOH溶液。
6.根据权利要求4或5所述的以乳清蛋白为基质的桃柁酚抗菌纳米水凝胶的制备方法,其特征是,在静置与杀菌步骤中,所述的紫外光照射杀菌,是在无菌操作台中紫外光照射6~18h。
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