PL232743B1 - Lipopeptyd antyangiogenny, zawierająca go kompozycja i ich zastosowanie - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest lipopeptyd antyangiogenny, zawierająca go kompozycja oraz ich zastosowanie, zwłaszcza w dziedzinie kosmetyki i dermatologii.

Skóra naczyniowa jest częstym problemem kosmetycznym i medycznym. Cechuje się ona nadwrażliwością, występowaniem rumienia o różnym nasileniu, któremu często towarzyszy ściąganie kłucie i pieczenie skóry. Występowanie takich objawów oraz teleangiektazji, zwanych pajączkami i odczynów zapalnych może być skutkiem bodźców wewnętrznych albo środowiskowych. Objawy te występują najczęściej wskutek kontaktu z czynnikami drażniącymi lub uczulającymi. Objawy te, bez względu na rodzaj rozszerzenia drobnych naczyń skóry, są widoczne w okolicach twarzy, szyi, dekoltu i górnej połowy klatki piersiowej, na których rumień występuje najczęściej. Szczególnie podatna na wystąpienie rumienia jest twarz. Skórę, na której występuje rumień, teleangiektazje, albo inne zmiany skórne o podobnym charakterze, określa się jako naczyniową.

Skóra naczyniowa nie toleruje wielu, a w przypadku zdecydowanej większości osób, praktycznie wszystkich dostępnych komercyjnie kosmetyków i leków. Ponadto jest ona narażona na skutki uboczne niemal ciągłego stosowania (także jednocześnie) wielu środków kosmetycznych, które pozostają na skórze często przez długi okres czasu.

Przy skórze naczyniowej często dodatkowo stwierdza się dermatozę skóry twarzy w postaci trądziku różowatego, który objawia się przemijającym, a w stadium zaawansowanym utrwalonym, rumieniem i różnego rodzaju wypryskami i krostami, zwłaszcza w środkowej części twarzy. Statystycznie kobiety cierpią na trądzik różowaty znacznie częściej niż mężczyźni, ale prawdopodobne jest, że statystyki zaburza fakt zdecydowanie mniejszej dbałości mężczyzn o wygląd twarzy i związanego z tym braku leczenia dolegliwości. Najwięcej zachorowań stwierdza się u pacjentów pomiędzy 30 a 60 rokiem życia.

Wyróżnia się kilka postaci i odmian trądziku różowatego. Postać teleangiektatyczno-rumienio-wata, przy której występuje przelotny lub rumień twarzy z teleangiektazjami, obrzękiem i pieczeniem zmienionej skóry. Postać grudkowo-krostkowa z rumieniem przetrwałym w środkowej części twarzy i czasowo pojawiającymi się grudkowymi krostami. W przypadku zaś postaci z dominacją zmian przerostowych skóra jest pogrubiona z widocznymi zmianami guzowatymi i zapaleniem mieszków włosowych, najczęściej w obrębie nosa, brody i czoła. Opisywana jest także postać oczna z zapaleniem brzegów powiek, spojówek i rogówek i przekrwieniem oczu. Do objawów trądziku różowatego można zaliczyć również upośledzenie funkcji lub zapalenie gruczołów Meiboma. Wyróżnia się także ziarniniakowy trądzik różowaty, w której to postaci występują twarde, przebarwione grudki lub guzki, które mogą prowadzić do bliznowacenia.

Rodzaj łagodzenia lub leczenia trądziku różowatego zależy od nasilenia jego objawów. Ocena nasilenia objawów, choć jest subiektywna, jest dobrze znana fachowcom w dziedzinie i opiera się na ilości wykwitów i zaczerwienień skóry.

Znanych jest kilka sposobów leczenia trądziku różowatego. W leczeniu miejscowym stosuje się 0,75% i 1% metronidazol w postaci żelu lub kremu, kwas azelainowy (redukuje głównie zmiany zapalne), 10% sulfacetamid sodowy z 5% siarką oraz nadtlenek benzoilu (zalecza zmiany grudkowo-krostkowe, stosowany w postaci guzowatej i odmianie ziarniniako-wej). Winian briminidyny 0,33% (MIRVASO®) stosuje się miejscowo w objawowym leczeniu rumienia skóry twarzy i w trądziku różowatym u dorosłych pacjentów. Miejscowo stosuje się także antybiotyki takie, jak erytromycyna, klindamycyna i tetracyklina. W razie stwierdzenia jednoczesnego występowania nużeńców stosuje się krotamiton. Natomiast przy występowaniu zaburzeń ze strony przewodu pokarmowego leczenie obejmuje zwalczanie zakażenia Helicobacter pylori. Leczenie doustne trądziku różowatego opiera się terapii antybiotykowej. Stosuje się głównie tetracykliny, takie jak tetracyklina, doksy-cyklina, czy limecyklina. W przypadku przeciwwskazań do stosowania tetracyklin stosuje się makrolidy takie jak erytromycynę, azytromycynę, klarytromycynę. W przypadku rozwinięcia się po trądziku różowatym rhinophyma dodatkowo (wspomagająco) stosuje się zabiegi chirurgiczne.

Przy lżejszych postaciach trądziku różowatego pomocne jest stosowanie kosmetyków dedykowanych temu schorzeniu. W kosmetologii proponuje się stosowanie substancji o działaniu antyangio-gennym. Jak przykładowo w kremie przeznaczonych do zwalczania trądziku różowatego firmy Clarena, zawierającym ekstrakt z ambory, który reguluje angiogenezę przyczyniając się do minimalizowania teleangiektazji. W pracy Vincent C. Eris. I. pt. „Inhibitory metaloproteinaz w trądziku różowatym”, Dermatologia Estetyczna, tom 6 , nr 1, 2004, opisano korzyści ze stosowania inhibitorów MMP w kremach przeznaczonych do pielęgnacji cery z trądzikiem różowatym. Do pielęgnacji i łagodzenia zmian w trądziku różowatym proponuje się także stosowanie połączenia oktopiroksu i inhibitorów proteaz matrycowych (Dermatologia Estetyczna, tom 14, nr 5-6, 2012).

Wymienione powyżej sposoby zwalczania i pielęgnacji trądziku różowatego cechują się jednak niską skutecznością. W przypadku stosowania naturalnych ekstraktów nawet długotrwałe stosowanie skutkuje jedynie złagodzeniem objawów, a w przypadku konieczności stosowania środków leczniczych o silnym działaniu, jak przykładowo antybiotyków, rzadko obserwuje się pożądaną, zadawalającą skuteczność przy licznych działaniach niepożądanych. Ponadto, już same te składniki aktywne mogą prowadzić do dodatkowego podrażnienia skóry, co w konsekwencji jeszcze bardziej nasila objawy trądziku różowatego. W literaturze opisuje się także wiele biocząsteczek, których celem jest specyficzne blokowanie receptorów zaangażowanych w proces angiogenezy. Przykładowo, heptapeptyd R-K-R-K-K-S-R został zidentyfikowany przez Bainbridge i wsp. (A peptide encoded by exon 6 of VEGF (EG3306) inhibits VEGF-induced angiogenesis in vitro and ischaemic retinal neovascularisation in vivo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 302: 793-799, 2003.) Ten siedmioaminokwasowy fragment jest kodowany przez ekson 6 czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF, z ang. Vascular Endothelial Growth Factor). W badaniach na liniach komórkowych stwierdzono, że ten minimalny fragment VEGF hamuje wiązanie naturalnego ligandu z receptorem VEGF, a w konsekwencji hamuje angiogenezę. Stosowanie heptapeptydu było także skuteczne w hamowaniu angiogenezy w niedokrwieniu na mysim modelu niedokrwiennej neowaskularyzacji siatkówki. Jednakże peptyd ten jako taki nie nadaje się do formułowania w kompozycjach leczniczych lub kosmetycznych do zastosowań na skórę ze względu na niekorzystne właściwości stabilności. Ponadto heptapeptyd R-K-R-K-K-S-R jest zbyt silnie zjonizowany i z tego powodu praktycznie nie przenika przez warstwę skóry. Dlatego, mimo obiecującej aktywności antyangio-gennej, nie jest możliwa penetracja i aktywność peptydu w miejscu docelowym, w przypadku stosowania kompozycji kosmetycznej czy leczniczej przeznaczonej do stosowania miejscowego na skórę. W świetle powyższego, pożądane jest zatem zapewnienie środka, który z jednej strony hamowałby powstawanie naczyń krwionośnych w płytkich warstwach skóry, a przez to zapobiegał rozwojowi trądziku różowatego, a z drugiej cechował się wysokim stopniem bezpieczeństwa, prostotą wytwarzania, dobrym wchłanianiem oraz dobrymi własnościami technologicznymi.

Cel ten rozwiązuje lipopeptyd antyangiogenny według wynalazku.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że biodostępność heptapeptydu może zostać istotnie poprawiona wskutek zwiększenia jego penetracji przy zastosowaniu miejscowym na skórę. Acylowanie heptapeptydu resztą kwasu tłuszczowego prowadzi do uzyskania pochodnej w postaci lipopeptydu. Nieoczekiwanie stwierdzono, że tłuszczowa pochodna heptapeptydu R-K-R-K-K-S-R, a szczególnie jego pochodna palmitoilowa, która może tworzyć struktury micelarne, wykazuje bardzo korzystne właściwości przenikania przy miejscowym zastosowaniu na skórę.

Przedmiotem wynalazku jest zatem lipopeptyd antyangiogenny przedstawiony Wzorem ogólnym 1:

Palm-R-K-R-K-K-S-R (Wzór 1), przy czym we wzorze tym

Palm - oznacza resztę palmitoilową, R - oznacza resztę argininową, K - oznacza resztę lizynową, i S - oznacza resztę serynową, i przy czym wszystkie aminokwasy są L-aminokwasami.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja zawierająca lipopeptyd określony Wzorem 1 oraz co najmniej jedną odpowiednią substancję pomocniczą. Rodzaj, ilość i charakter stosowanych substancji pomocniczych jest zależny od docelowej postaci kompozycji zawierającej lipopeptyd według wynalazku. W szczególności, kompozycja zawierająca lipopeptyd według wynalazku może być w postaci kremu, maści, żelu, kremożelu, roztworu, lotionu, płynu do nacierania, lepkiej emulsji, proszku czy opatrunków impregnowanych w roztworze lipopeptydu według wynalazku.

Zarówno postacie wyżej wymienionych kompozycji, jak i ogólne sposoby ich wytwarzania są znane w dziedzinie i przedstawione przykładowo w Remington:

The Science and Practice of Pharmacy 1995, edycja E. W. Martin, Mack Publishing Company, wydanie 19, Easton, Pa.

Korzystnie, kompozycja według wynalazku jest w postaci emulsji. W korzystnym przykładzie wykonania, kompozycja według wynalazku w postaci emulsji zawiera wodę, emolient, humekant, emulgator oraz substancję konsystencjotwórczą.

Jako przykładowe emolienty należy wymienić oleje roślinne, estry kwasów tłuszczowych i wyższych alkoholi tłuszczowych, estry kwasów tłuszczowych i krótkołańcuchowych alkoholi. Korzystnie i w szczególności stosowanymi w kompozycji według wynalazku emolientami są: syntetyczny triglideryd kaprylowo/kaprynowy (nazwa handlowa Myritol 318), izoheksadekan (nazwa handlowa Arlamol HD), stearynian etylo-heksylowy (nazwa handlowa Cetiol 868), izostearynian izostearylu (nazwa handlowa Crodamol ISIS) oraz mieszanina benzoesanów alkoholi C13-C15 (nazwa handlowa Crodamol AB).

Jako przykładowe humektanty, które można wykorzystać w kompozycji według wynalazku, należy wymienić glikol pentylenowy (nazwa handlowa Neofect PEN), gliceryna, 1,3-propanodiol (nazwa handlowa Zemea). Z kolei, jako przykładowe emulgatory, które można wykorzystać w kompozycji według wynalazku, należy wymienić stearynian glicerolu (nazwa handlowa Cutina GSM SE) lub distearynian metyloglukozy i poligliceryny-3 (nazwa handlowa Tego Care 450). A jako przykładowe substancje konsystencjotwórcze, które można wykorzystać w kompozycji według wynalazku, należy wymienić alkohol stearylowy (nazwa handlowa Tego Alcanol 18) lub alkohol cetearylowy.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie antyangiogennego lipopeptydu albo zawierającej go kompozycji jako leku. Lipopeptyd według wynalazku znajduje zastosowanie jako lek w przypadku, gdy wymienione powyżej schorzenia skóry występują w umiarkowanym i dużym nasileniu, przy czym nasilenie objawów oceniane jest przez fachowca w dziedzinie.

Korzystnie, antyangiogenny lipopeptyd według wynalazku albo zawierającą go kompozycję stosuje się do leczenia zaczerwienienia skóry, przy czym takie zaczerwienienie jest związane z powstawaniem i obecnością nadmiernej ilości nowych naczyń krwionośnych oraz rozszerzaniem się istniejących naczyń w płytkich warstwach skóry. Szczególnie korzystnie, antyangiogenny lipopeptyd według wynalazku albo zawierającą go kompozycję stosuje się do leczenia trądziku różowatego. W przypadku, gdy antyangiogenny lipopeptyd według wynalazku albo zawierającą go kompozycję stosuje się jako lek przewiduje się, że lipopeptyd będzie stosowany w stężeniu 0,001% do 0,1% wag. w odniesieniu do całkowitej masy kompozycji. Przykład takiej kompozycji przedstawiono poniżej w Przykładzie 3. Szczególnie korzystnie, kompozycja według wynalazku stosowana jako lek, zawiera lipopeptyd według wynalazku w ilości 0,01% wag. w odniesieniu do całkowitej masy kompozycji. Przykładowo lipopeptyd według wynalazku jest dodawany do takiej kompozycji w ilości 1% wagowego, przykładowo w stężeniu 1% wag. w wodzie tak, aby ostatecznie uzyskać stężenie 0,01% wag. Oczywistym jest, że stosowanie lipopeptydu według wynalazku jako leku powinno odbywać się pod kontrolą lekarza.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie antyangiogennego lipopeptydu albo zawierającej go kompozycji w kosmetyce. Lipopeptyd według wynalazku znajduje zastosowanie jako kosmetyk w przypadku, gdy wymienione powyżej schorzenia skóry występują w niskim nasileniu, przy czym nasilenie objawów oceniane jest przez fachowca w dziedzinie.

Korzystnie, lipopeptyd antyangiogenny jest stosowany do łagodzenia zaczerwienienia skóry. A szczególnie korzystnie, lipopeptyd antyangiogenny jest stosowany do łagodzenia objawów trądziku różowatego. W przypadku, gdy antyangiogenny lipopeptyd według wynalazku albo zawierającą go kompozycję stosuje się jako kosmetyk przewiduje się, że lipopeptyd będzie stosowany w stężeniu 0,00001% do 0,001% wag. w odniesieniu do całkowitej masy kompozycji. Przykład takiej kompozycji przedstawiono poniżej w Przykładzie 3. Szczególnie korzystnie, kompozycja według wynalazku stosowana jako kosmetyk, zawiera lipopeptyd według wynalazku w ilości 0,0001% wag. w odniesieniu do całkowitej masy kompozycji. Przykładowo jest dodawany do takiej kompozycji w ilości 1 % wag. w stężeniu 0,01% wag. w wodzie tak, aby ostatecznie uzyskać stężenie 0,0001% wag.

Lipopeptyd antyangiogenny według wynalazku zarówno w zastosowaniu jako lek jak i w zastosowaniu jako kosmetyk stosuje się miejscowo na zmienioną skórę, przykładowo, dwa razy dziennie, przykładowo rano i wieczorem.

Działanie lipopeptydu i zawierającej go kompozycji będących przedmiotem wynalazku bardziej szczegółowo przedstawiono na rysunku, na którym:

Fig. 1 przedstawia działanie antyangiogenne lipopeptydu Palm-R-K-R-K-K-S-R wobec sferoidów sformowanych z ludzkich komórek endotelialnych HUVEC. Na osi rzędnej przedstawiono średnią liczbę kiełków. Zebrane dane zaprezentowano w postaci średniej ± SEM (#p<0,05 vs kontrola pozytywna; $$ Hp<0,01 vs F25 (bufor rekonstytucyjny na bazie Tris).

Fig. 2 przedstawia działanie antyangiogenne lipopeptydu Palm-R-K-R-K-K-S-R wobec sferoidów sformowanych z ludzkich komórek endotelialnych HUVEC. Na osi rzędnej przedstawiono średnią długość kiełków. Zebrane dane zaprezentowano w postaci średniej ± SEM. ** p<0,01 vs kontrola negatywna; # p<0,05 vs kontrola pozytywna; ## p<0,01 vs kontrola pozytywna; $$ p<0,01 vs F25 - F25 (bufor rekonstytucyjny na bazie Tris).

Fig. 3 przedstawia działanie antyangiogenne lipopeptydu Palm-R-K-R-K-K-S-R wobec sferoidów sformowanych z ludzkich komórek endotelialnych HUVEC. Na osi rzędnej przedstawiono całkowitą długość kiełków. Zebrane dane zaprezentowane w postaci średniej ± SEM. ** p<0,01 vs kontrola negatywna; ## p<0,01 vs kontrola pozytywna; $$$ p<0,01 vs F25 (bufor rekonstytucyjny na bazie Tris).

Fig. 4 przedstawia reprezentatywne zdjęcia dokumentujące działanie antyangiogenne lipopeptydu Palm-R-K-R-K-K-S-R wobec sferoidów sformowanych z ludzkich komórek endotelialnych HUVEC w teście sferoidowym.

Fig. 5 przedstawia działanie antyangiogenne różnych stężeń lipopeptydu Palm-R-K-R-K-K-S-R na mysie krążki aortalne.

Fig. 6 przedstawia działanie cytotoksyczne lipopeptydu Palm-R-K-R-K-K-S-R wobec ludzkich prawidłowych fibroblastów płuc CCD-11 Lu w teście MTT.

Fig. 7 przedstawia działanie cytotoksyczne lipopeptydu Palm-R-K-R-K-K-S-R wobec komórek ludzkiego nowotworu płuc - linia A549 w teście MTT.

Fig. 8 przedstawia działanie cytotoksyczne lipopeptydu Palm-R-K-R-K-K-S-R wobec komórek ludzkiego nowotworu okrężnicy - linia HCT116 w teście MTT.

Fig. 9 przedstawia działanie cytotoksyczne lipopeptydu Palm-R-K-R-K-K-S-R wobec komórek ludzkiego nowotworu płuc - linia NCI-H460 w teście MTT. P r z y k ł a d 1

Synteza lipopeptydu Palm-R-K-R-K-K-S-R

Do naczynia reakcyjnego odważono 2 g żywicy 2-chlorotritylowej, żywicę spęczniano w dichlorometanie przez 60 min. Po odsączeniu rozpuszczalnika dodano 0,7 mmola Fmoc-Ser oraz 1,5 mmola diizopropyloetyloaminy. Mieszaninę wytrząsano na wytrząsarce przez 10 h, po czym odsączono rozpuszczalniki.

Następnie prowadzono syntezę liniowego lipopeptydu Palm-R-K-R-K-K-S-R zgodnie ze standardowa procedurą, która obejmuje etapy: a) odbezpieczanie aminowej grupy funkcyjnej zabezpieczonej Fmoc przy użyciu 20% pipe-rydyny/dimetyloformamidu, b) przemywanie żywicy (kolejno dimetyloformamidem i dichlorometanem), c) reakcję acylowania przy użyciu równomolowej mieszaniny pochodnej aminokwasowej, N,W-diizopropylokarbodiimidu (DIC) i Tritonu X-100, w trakcie której kolejne pochodne aminokwasowe przyłącza się stosując 2-krotny molowy nadmiar w stosunku do osadzenia na nośniku, całość mieszano przez 60 min, d) powtarzanie etapów a) do c) aż do otrzymania pełnej sekwencji aminokwasowej, stosując za każdym razem Fmoc-zabezpieczony aminokwas, przy czym w przypadku Fmoc--lizyny oraz Fmoc-argininy, zasadowe łańcuchy boczne każdorazowo zabezpieczono grupą BOC, e) przyłączanie kwasu palmitynowego do N-końca liniowego lipopeptydu przy użyciu rów-nomolowej ilości kwasu palmitynowego oraz heksafluorofosforanu N,N,N’,W-tetrametylo--O-(1H-benzotriazol-1-ilo)uronium i 2-krotnego nadmiaru molowego diizopropyloetyloaminy w obecności Tritonu Χ-100. W celu odszczepienia lipopeptydu z żywicy stosuje się 5 ml roztworu zawierającego 95% kwasu trifluorooctowego, 2,5% triizopropylosilanu i 2,5% wody. Koniugat lipopeptydu z polimerem żywicy zalano wymienionym roztworem i mieszano na mieszadle magnetycznym przez 60 min w temperaturze pokojowej. Po tym czasie roztwór odsączono do probówek i zalano 10 ml schłodzonego eteru dietylo-wego. Wytrącony lipopeptyd odwirowano w probówkach wirówkowych. Po zlaniu supernatantu, osad rozpuszczono w wodzie destylowanej i po przeniesieniu do kolbki okrągłodennej liofilizowano. Otrzymany związek analizowano metodą HPLC, warunki analizy: liniowy gradient acetonitrylu (z dodatkiem 0,1% TFA) w wodzie (z dodatkiem 0,1% TFA) 30-100% w 15 minut, stosując przepływ 2 ml/min, detekcję eluatu prowadzono przy długości fali I = 214 nm, RT = 8 min). Otrzymany lipopeptyd oczyszczono metodą HPLC, warunki oczyszczania: liniowy gradient acetonitrylu (z dodatkiem 0,1% kwasu trifluorooctowego) w wodzie (z dodatkiem 0,1% kwasu trifluorooctowego) 30-100% w 60 min, stosując przepływ 10 ml/min. Detekcję eluatu prowadzono przy długości fali I = 214 nm). Wykonano również analizę masową MALDI-TOF (wykryto sygnał m/z 1040,4). Eluat liofilizowano i uzyskano 200 mg lipo-peptydu Palm-R-K-R-K-K-S-R. P r z y k ł a d 2

Wpływ lipopeptydu Palm-R-K-R-K-K-S-R na angiogenezę stymulowaną obecnością ludzkiego ligandu VEGF

Hodowla komórkowa HUVEC (ludzkie komórki endotelialne, komórki śródbłonka naczyniowego) świeżo pozyskane poprzez izolację z żyły pępkowej zdrowego, anonimowego noworodka ludzkiego, hodowano w pożywce M199 suplementowanej 10% FBS, EGF, hydrokortyzonem, glutaminą, penicyliną i streptomycyną. Hodowlę prowadzono w standardowych warunkach: 5% CO2, 37°C, przy odpowiedniej wilgotności powietrza.

Test sferoidowy - dla potwierdzenia działania antyangiogennego W celu uzyskania sferoidów (struktur przestrzennych, 3D) zbudowanych z komórek endotelial-nych HUVEC, ok. 750 komórek HUVEC zawieszono w medium hodowlanym zawierającym 0,25% (w/v) karboksymetylocelulozy, i przeniesiono do 96-studzienkowej okrągłodennej, nieadhezyjnej płytki. Podczas trwającej 24 godziny inkubacji w opisanych powyżej warunkach, dostrzeżono, iż wszystkie komórki uczestniczyły w procesie tworzenia pojedynczych sferoidów w każdym z dołków. Utworzone w ten sposób sferoidy, osadziły się na wyściółce z żelu kolagenowego. Następnie do każdego z dołków dodano podstawowe medium do hodowli komórek endotelialnych suplementowane 10% FBS z (w przypadku próbek z białkiem według wynalazku) oraz niesuplementowane bez FBS (w przypadku kontroli negatywnej). Kontrole pozytywną stanowił rekombinowany ludzki VEGF (Sigma). W trakcie inkubacji zauważono formowanie przez sferoidy przypominających kapilary „kiełków”, będących efektem działania angiogennego ludzkiego ligandu receptora VEGF. W przypadku sferoidów, które wytworzyły „kiełki”, po 24 godzinach prowadzenia testu poddano je badaniu i pomiarom z wykorzystaniem cyfrowego systemu pomiarowego połączonego z mikroskopem odwróconym. Mniejsza ilość i długość „kiełków” świadczy bezpośrednio o silnym działaniu antyangiogennym testowanego lipopeptydu. Wyniki doświadczenia przedstawiono na Figurach 1-4. Wyniki te potwierdzają dawkozależne działanie antyangiogenne lipopeptydu według wynalazku wobec sferoidów sformowanych z ludzkich komórek endotelialnych HUVEC. Dla wszystkich zastosowanych stężeń lipopeptydu według wynalazku zaobserwowano zmniejszoną średnią liczbę kapilaro-podobnych kiełków, natomiast dla najwyższego zastosowanego stężenia także obniżoną całkowitą długość kiełków.

Test krążków aortalnych - potwierdzenie działania antyangiogennego

Segmenty aortalne zostały pozyskane w wyniku izolacji od dzikich myszy. Uzyskane fragmenty aortalne pocięto poprzecznie na drobne krążki, które delikatnie umieszczono w zagłębieniu o kształcie krążka w Matrigelu, wypełnionym 100 μl medium hodowlanego dla komórek endotelialnych suplemen-towanym 10% FBS w 96 studzienkowych płytkach ze szklanym dnem. Krążki aortalne stymulowano mysim VEGF (Sigma) w obecności i bez (kontrola), testowanego lipopeptydu. Pomiaru obecności i ilości kiełków o kształcie kapilar, powstałych w wyniku stymulacji mysim VEGF (w przypadku grup badanych w obecności testowanego lipopeptydu) dokonano po 6-8 dniach inkubacji. Medium hodowlane bez su-plementacji FBS służyło za kontrolę negatywną dla testu. Wyniki tego doświadczenia zebrano na Figurze 5. Uzyskane wyniki potwierdzają dawkozależne działanie antyangiogenne lipopeptydu Palm-R-K-R-K-K-S-R względem mysich krążków aortalnych.

Testy cytotoksyczności wobec linii transformowanych i prawidłowych - Test MTT

Do testów zastosowano następujące linie komórkowe z kolekcji ATCC: komórki niedrobnokomór-kowego raka płuc A549 (ATCC# CCL-185) oraz komórki niedrobnokomórkowego raka płuc NCI-H460 (ATCC# HTB177) utrzymywano w pożywce RPMI 1640 (Hyclone, Logan, UT, USA) suplementowanej 10% FCS; komórki ludzkiego raka jelita grubego HCT-116 (ATCC# CCL-247) utrzymywano w pożywce McCoy's (Hyclone, Logan, UT, USA) suplementowanej 10% FCS; komórki HUVEC z żyły pępowinowej (ATCC# CRL-1730) utrzymywano w pożywce M199 (HyClone, Logan, UT, USA) suplementowanej 10% FCS, czynnikami wzrostu 0,02 mg/ml ECGS (Sigma), 0,1 mg/ml heparyną (Sigma), komórki te rosły na podłożu pokrytym z żelatyną; komórki ludzkich prawidłowych fibroblastów z płuc CCD-11LU (ATCC#CCL-202™) utrzymywano w pożywce MEM (Hyclone, Logan, UT, USA) suplementowanej 10% FCS. Wszystkie pożywki suplementowane były dodatkowo 2mM L-glutaminy i antybiotykami (100 jedn./ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny (HyClone, Logan, UT, USA)). Komórki utrzymywano w temperaturze 37°C w atmosferze powietrza z odpowiednią dla danej linii zawartością CO2. Komórki poddawano rutynowemu sprawdzeniu w kierunku obecności Mycoplasma stosując PCR z użyciem gotowego zestawu Venor®GeM Mycoplasma PCR Detection Kit (Minerva Biolabs, Berlin, Germany).

Test cytotoksyczności MTT jest testem kolorymetrycznym stosowanym do pomiaru proliferacji, żywotności oraz cytotoksyczności komórek. Polega on na rozkładzie żółtej soli tetrazolowej MTT (bromek 3-(4,5-dimetylotiazo-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolu) do nierozpuszczalnego w wodzie purpurowego barwnika formazanu przez obecną w mitochondriach reduktazę bursztynylo-tetrazolową. Redukcja MTT zachodzi jedynie w żywych komórkach. Analiza danych polega na wyznaczeniu stężenia badanego białka IC50 (w ng/ml), przy którym następuje 50% obniżenie ilości komórek w populacji traktowanej związkiem w odniesieniu do komórek kontrolnych. Wyniki analizowano za pomocą programu GraphPad Prism 5.0. Test wykonano zgodnie z opisami literaturowymi (Celis, J.E., (1998). Cell biology, a laboratory handbook, second edition, Academic Press, San Diego; Yang, Y., Koh, L.W., Tsai, J-H., (2004), Involvment of viral and chemical factors with oral cancer in Taiwan, Jpn J Clin Oncol, 34(4)176-183).

Hodowlę komórkową rozcieńczono pożywką do gęstości (104-105 komórek na 100 μβ. Następnie 100 μl odpowiednio rozcieńczonej zawiesiny komórkowej naniesiono na płytkę 96-studzienkową w trzech powtórzeniach. Tak przygotowane komórki inkubowano przez 24 h w 37°C w 5% lub 10% CO2 w zależności od użytej pożywki, po czym do komórek (w 100 μl pożywki) dodano kolejne 100 μl pożywki zawierającej różne stężenia testowanego lipopeptydu. Komórki inkubowano z testowanymi lipopepty-dami przez kolejne 72 h co odpowiada 3-4 czasom podziału komórkowego, po czym do pożywki z testowymi lipopeptydami dodano 20 μl roztworu roboczego MTT [5 mg/ml] i inkubowano przez 3 h w 37°C w 5% lub 10% CO2, (odpowiednio). Następnie pożywkę z roztworem roboczym MTT usunięto, a kryształy formazanu rozpuszczono, dodając 100 μl DMSO. Po wymieszaniu mierzono absorbancję przy długości fali 570 nm (filtr referencyjny 690 nm). Wyniki tego doświadczenia przedstawiono na Figurach 6 do 9. Wyniki te wskazują, że stężenia lipopeptydu według wynalazku stosowane w kompozycjach według wynalazku nie wykazują działania cytotoksycznego na komórkach prawidłowych, a tym sam ich stosowanie jest bezpieczne. Wykazano także, że lipopeptyd według wynalazku wykazuje działanie cy-totoksyczne jedynie na komórkach transformowanych nowotworowo.

Omówienie wyników badań

Przeprowadzone badania biologiczne w kierunku aktywności antyangiogennej testowanego lipo-peptydu według wynalazku w przypadku obu metod badawczych ujawniły jego wysoką aktywność an-tyangiogenną. W przypadku testu sferoidowego, pomimo stosowania wysokich stężeń ludzkiego czynnika VEGF, lipopeptyd był w stanie hamować pojawianie się nowych kapilaropodobnych „kiełków”. W przypadku najwyższego testowanego stężenia badany lipopeptyd całkowicie hamował proces tworzenia nowych „kiełków”, a w przypadku niższych stężeń znacząco ograniczał długość wytworzonych kiełków. Efekty te przedstawiono na Figurach 1-3 oraz Figurze 4, odpowiednio. W przypadku badania na modelu mysich aort, wykorzystano fakt bliskiego podobieństwa na poziomie struktury i sekwencji aminokwasowych pomiędzy elementami mysiego i ludzkiego układu ligand--receptory VEGF. W tym teście wszystkie zastosowane stężenia lipopeptydu skutkowały dawko-zależ-nymi efektami biologicznymi. W przypadku stężenia lipopeptydu 1 μg/ml zaobserwowano znaczącą redukcję długości i ilości wytworzonych „kiełków”, natomiast w przypadku najwyższego stężenia niemal całkowite zahamowanie wytwarzania „kiełków” (Figura 5). W sposób pośredni w powyższych testach badano aktywność cytotoksyczną testowanego lipopeptydu wobec komórek linii HUVEC. HUVEC to linia nietransformowanych komórek prawidłowych. Uzyskane wyniki pokazują, że nawet dosyć wysokie stężenia lipopeptydu stosowane w teście nie wywoływały efektu toksycznego (śmierci komórkowej) na linii komórek HUVEC. Ten fakt świadczy o wysokim poziomie bezpieczeństwa lipopeptydu według wynalazku.

Działanie cytotoksyczne lipopeptydu oceniono także w testach cytotoksyczności MTT na intensywnie proliferujących komórkach transformowanych nowotworowo oraz na linii prawidłowych komórek ludzkich fibroblastów płuc (Figury 6 do 9). Wykazano brak toksyczności lipopeptydu według wynalazku wobec prawidłowej linii komórkowej CCD-11 Lu (Figura 6), co jest zgodne z wynikami uzyskanymi na linii HUVEC. Brak efektu cytotoksycznego potwierdza bezpieczeństwo lipopeptydu według wynalazku wobec komórek prawidłowych. W przypadku zastosowanych w teście komórek transformowanych zaobserwowano działanie antyproliferacyjne lipopeptydu według wynalazku. Zgodnie z doniesieniami literaturowymi należy oczekiwać synergii aktywności antyproliferacyjnej i antyangiogennej lipopeptydu według wynalazku. Działanie antyangiogenne lipopeptydu według wynalazku, brak jego toksyczności wobec komórek prawidłowych oraz jego działanie toksyczne wobec komórek transformowanych, sprawia, że lipopeptyd według wynalazku znajduje zastosowanie jako składnik kosmetyków przeznaczonych do stosowania na powierzchnię skóry, ponieważ poza działaniem hamującym powstawanie przeciekających naczyń krwionośnych i pajączków może także odpowiadać za eliminację uszkodzonych komórek skóry, wzmacniając tym samym procesy jej regeneracji i odbudowy.

Przykład 3

Kompozycie zawierające lipopeptyd według wynalazku

Krem pielęgnacyjny

Tabela 1

Kompozycja kremu pielęgnacyjnego

Przygotowanie:

Fazę A i B podgrzano w osobnych zbiornikach do 75°C. Fazę A dodano do zbiornika zawierającego Fazę B i homogenizowano w ciągu 1 minuty. Uzyskaną emulsję ochłodzono mieszając do temperatury 30°C i dodano roztwór lipopeptydu intensywnie mieszając.

Krem leczniczy

Tabela 2

Kompozycja kremu leczniczego

Przygotowanie:

Fazę A i B podgrzano w osobnych zbiornikach do 75°C. Fazę A dodano do zbiornika zawierającego Fazę B i homogenizowano w ciągu 1 minuty. Uzyskaną emulsję ochłodzono mieszając do temperatury 30°C i dodano roztwór lipopeptydu intensywnie mieszając. Otrzymaną kompozycję zapakowano do pojemników.

Przykład 4

Zastosowanie kompozycji według wynalazku na skórze trądzikowej

Przeprowadzono badanie skuteczności kremu leczniczego, kremu kosmetycznego oraz kremu kontrolnego (niezawierającego lipopeptydu według wynalazku) przygotowanych zgodnie z powyższym Przykładem 3. W kremie kontrolnym lipopeptyd zastąpiono wodą oczyszczoną.

Do badania włączono 13 kobiet w wieku 42-55 lat ze zdiagnozowanym trądzikiem różowatym o różnych stopniach nasilenia. Przydzielono je do grup badanych według następującego schematu. Kobiety z ciężkimi postaciami trądziku różowatego przypisano do grupy stosującej krem leczniczy (4 osoby, grupa I), pozostałe kobiety z objawami trądziku różowatego o niskim nasileniu przydzielono do 2 grup: liczącej 5 osób grupy stosującej krem kosmetyczny (grupa II) oraz liczącej 4 osoby grupy stosującej krem kontrolny (grupa III).

Kobiety stosowały odpowiedni dla swojej grupy krem przez okres 8 tygodni, dwa razy dziennie rano i wieczorem, nakładając go na oczyszczoną skórę twarzy.

Po tym czasie dokonano oceny dermatologicznej wyglądu skóry. Wynik oceny podano w skali od 0 do 2, przy czym 0 oznacza brak poprawy, 1 oznacza poprawę częściową, a 2 oznacza całkowite ustąpienie objawów (wyleczenie). Wyniki uśredniono dla każdej z grup i przedstawiono w Tabeli 3 poniżej.

Tabela 3

Efekty stosowania kompozycji według wynalazku

Wyniki przedstawione w Tabeli 3 wskazują na bardzo wysoką skuteczność kremu kosmetycznego w łagodzeniu objawów trądziku różowatego o niskim nasileniu - w przypadku stosowania kremu kosmetycznego. Podobnie wysoką skuteczność uzyskano w grupie z objawami trądziku o dużym nasileniu.

Claims (11)

Zastrzeżenia patentowe

1. Lipopeptyd antyangiogenny o Wzorze 1 Palm-R-K-R-K-K-S-R (Wzórl) przy czym we wzorze tym Palm - oznacza resztę palmitoilową, R - oznacza resztę argininową K - oznacza resztę lizynową, a S - oznacza resztę serynową, i przy czym wszystkie aminokwasy są L-aminokwasami.

2. Lipopeptyd antyangiogenny określony zastrzeżeniem 1 do zastosowania jako lek.

3. Lipopeptyd antyangiogenny określony zastrzeżeniem 1 do zastosowania według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się go do leczenia zaczerwienienia skóry.

4. Lipopeptyd antyangiogenny określony zastrzeżeniem 1 do zastosowania według zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, że stosuje się go do leczenia trądziku różowatego.

5. Kompozycja zawierająca lipopeptyd określony zastrz. 1 do zastosowania według zastrz. 2 do 4, znamienna tym, że lipopeptyd stosuje się w ilości 0,001% do 0,1% wagowo w przeliczeniu na całkowitą masę kompozycji.

6. Kompozycja zawierająca lipopeptyd określony zastrz. 1 do zastosowania według zastrz. 2 do 4, znamienna tym, że lipopeptyd stosuje się w ilości 0,01% wagowo w przeliczeniu na całkowitą masę kompozycji.

7. Lipopeptyd antyangiogenny określony zastrz. 1 do zastosowania w kosmetyce.

8. Lipopeptyd antyangiogenny określony zastrz. 1 do zastosowania według zastrz. 7, znamienny tym, że stosuje się go do łagodzenia zaczerwienienia skóry.

9. Lipopeptyd antyangiogenny określony zastrz. 1 do zastosowania według zastrz. 7, znamienny tym, że stosuje się go do łagodzenia objawów trądziku różowatego.

10. Kompozycja zawierająca lipopeptyd określony zastrzeżeniem 1 do zastosowania według zastrz. 7 do 9, znamienna tym, że lipopeptyd stosuje się w ilości 0,00001% do 0,001% wagowo w przeliczeniu na całkowitą masę kompozycji.

11. Kompozycja określona zastrz. 1 do zastosowania według zastrz. 7 do 9, znamienny tym, że lipopeptyd stosuje się w ilości 0,0001% wagowo w przeliczeniu na całkowitą masę kompozycji.