KR20190109192A - 푸니칼라진을 포함하는 par2 활성 억제용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 푸니칼라진을 포함하는 PAR2 활성 억제용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 푸니칼라진, 이의 입체이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 PAR2 활성 억제용 조성물, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 건강기능식품 조성물 또는 화장료 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 조성물은 PAR2 수용체를 특이적으로 억제함으로써 PAR2 수용체 활성으로 인해 유발되는 사이토카인의 분비를 억제할 수 있으며, 이를 통해 PAR2 수용체 활성으로 인해 유발되는 다양한 염증성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 식물 유래 천연 화합물로서 부작용과 독성이 적은 새로운 항염증 약학적 조성물, 건강기능식품 조성물 및 화장료 조성물로 개발될 수 있다.

Description

푸니칼라진을 포함하는 PAR2 활성 억제용 조성물{Composition for inhibition of protease-activated receptor 2 activity including punicalagin}
본 발명은 푸니칼라진을 포함하는 PAR2 활성 억제용 조성물 에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 푸니칼라진, 이의 입체이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 PAR2 활성 억제용 조성물, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 건강기능식품 조성물 또는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
PAR2(protease-activated receptor 2)은 G단백결합수용체(G protein-coupled receptor, GPCR)의 하나로 근육세포, 골세포, 신경세포, 면역세포, 상피세포, 혈관 내피세포, 섬유아세포 등 다양한 세포에서 발현한다. PAR2 수용체는 여러 염증 질환의 조직 손상 및 감염에서 트립신(trypsin), 트립타제(tryptase), 팩터 IIVa/Xa(factor IIVa/Xa), 매트립타아제(matriptase), 칼리크레인(kallikreins), 그랜자임 A(granzyme A), 히스톤아세틸기전달효소(histone acetyltransferases, HAT), 콜라겐 분해효소(Matrix metalloproteinase-1, MMP-1), 세균성 세린 프로테아제(bacterial serine protease) 등 다양한 체내 또는 외부의 세린 단백질분해효소에 노출되어 활성화된다. 최근 연구결과 결막염, 대장염, 관절염, 피부염, 위염 모델 등에서 PAR2 수용체를 억제할 경우 염증 억제 효과가 있음이 입증되었다(Br J Pharmacol. 2014 Mar;171(5):1180-94, Expert Opin Ther Pat. 2016;26(4):471-83).
푸니칼라진(Punicalagin)은 페놀계 화합물의 일종인 엘라지타닌(ellagitannin)으로서, 석류(Punica granatum), 뱅골아몬드(Terminalia catappa), 동부 인도 아몬드(Terminalia myriocarpa) 및 남아프리카의 벨벳 부시윌로우(Combretum molle)에 함유되어 있는 천연물이다. 푸니칼라진은 수용성 화합물로 엘라그산(ellagic acid)과 같은 더 작은 페놀계 화합물로 가수분해된다. 현재까지 푸니칼라진의 작용기전에 대해서 잘 알려지지 않았다. 래트에 6% 푸니칼라진 식이를 37일 간 섭취시켰을 때 독성이 없었다는 연구가 보고되었으며, 탄산탈수효소조해제(carbonic anhydrase inhibitor)에 대한 억제 활성이 있다는 것이 알려져 있으나, PAR2 수용체 억제 기전에 대해서는 알려진 바가 없다.
전신홍반루푸스(이하 루푸스)는 주로 가임기 여성을 포함한 젊은 나이에 발병하는 만성 자가 면역 질환이다. 루푸스의 유병률은 대략 인구 10만 명당 14.6 ~ 50.8명으로 추산되며, 호발연령은 15세에서 45세까지로 알려져 있으며, 여성에서의 유병률이 현저히 높아 남녀비가 약 1:12 정도이다. 루푸스는 면역체계의 이상으로 인하여 정상 조직을 외부 항원으로 인지하여 면역반응을 유발 시키는 질환으로 이론적으로는 모든 장기에 침범이 가능하다.
루푸스에 의한 신장질환에는 미만성 증식성 사구체 신염(diffuse proliferative glomerulonephritis)이 가장 흔하고 이것은 면역복합체의 침착에 의한 것으로 생각된다. 지속적으로 면역복합체가 침착하게 되면 만성적인 염증이 발생하여 사구체가 괴사되고 신기능이 감소한다. 또 다른 형태로는 막성신병증(membranous nephropathy)이 있는데, 이는 염증반응과 관련되어 있지 않다. 이러한 병변에서는 보체가 활성화되는 장소가 혈액 내 염증세포들과 기저막에 의해서 분리되어 있고 주로 사구체 상피세포에 손상이 발생하고 단백뇨가 주로 나타나지만 염증과 사구체 신염은 보이지 않는다.
루푸스신염에 의한 신장 기능 손실은 일상생활의 장애뿐 아니라 사회적, 경제적으로 지대한 손실을 끼친다. 루푸스신염의 치료에 소요되는 비용이 연간 수 십 억 원에 달하고 있으며, 루푸스신염에 의한 수명의 단축 및 만성 합병증 역시 심각한 문제가 되고 있다. 현재 루푸스신염 치료를 위해 다양한 약제들이 사용되고 있고, 새로운 생물학적 약제 개발 연구가 꾸준히 이루러지고 있으나 이러한 약제의 사용에도 불구하고 루푸스신염의 완치는 아직도 어려운 실정이다. 현재까지 사용된 루푸스신염 치료제로는 글루코코르티코이드(prednisolone, PL)를 기본으로 하여 싸이클로포스파마이드(cyclophosphamide)와 마이코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil, MMF)이 가장 많이 사용되고 있으며, 임상적으로 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 하지만 이러한 결과들은 비교적 짧은 임상연구 기간의 결과이기 때문에 실제로 장기적인 측면으로 접근하게 되었을 때에는 치료제의 효과는 반감되게 되고, 오히려 치료제에 의한 많은 부작용에 의한 이차적인 문제점들이 발생하게 된다. 글루코코르티코이드의 부작용으로는 쿠싱증후군과 장기적인 복용에 따르는 부신 기능저하, 심부전, 골소실, 췌장염, 신경 및 근육의 염증, 신경정신과적 증상, 피부의 경화 혹은 박피 등이 있고, 싸이클로포스파마이드는 골수억제, 신장기능 저하, 불임, 출혈성 방광염, 방광암 등의 부작용이 있으며, 마이코페놀레이트 모페틸의 경우에도 소화기능 저하를 포함한 다양한 부작용을 내포한다. 또한, 치료제를 중단할 경우에는 재발이 빈번하게 일어난다는 어려움이 있다. 또한 최근에 개발된 생물학적 치료제인 항-CD20 단일클론항체인 리툭시맙(Rituximab)이 B 세포의 증식을 억제하는 항-B 임파구세포 자극제(lymphocyte stimulator)(BAFF or BLyS)가 치료 저항성 루푸스신염의 치료에 적용되고 있지만, 아직은 뚜렷한 효과를 입증하지 못하고 있다. 특히 제 4형 루푸스신염의 경우에는 신장의 5년 기능적 생존율이 치료에도 불구하고 11 ~ 33%에 육박하는 결과를 보이기 때문에 새로운 치료제의 도입의 필요성이 절실히 요구된다.
본 발명자들은 천연물 유래 물질로부터 PAR2 수용체를 억제하여 염증성 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과 푸니칼라진이 특이적으로 PAR2 수용체를 억제함을 확인하였으며, 세포 실험 및 동물실험에서 푸니칼라진이 PAR2 수용체 억제 기전을 통해 항염증 효과를 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 푸니칼라진(Punicalagin), 이의 입체이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 PAR2(protease-activated receptor 2) 활성 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 푸니칼라진(Punicalagin), 이의 입체이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 PAR2(protease-activated receptor 2) 활성 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 양상에 따르면, 상기 조성물은 PAR2활성에 의한 칼슘(Ca2+)의 증가, 염소(Cl-) 분비 증가 또는 사이토카인 분비를 억제할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 양상에 따르면, 상기 사이토카인은 IL-6(interleukin-6), IL-8(interleukin-8), GMCSF(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), TNF-α(Tumor necrosis factor alpha) 또는IL-1β(interleukin-1β) 중에서 선택될 수 있으나, PAR2 활성에 의해 발현이 증가하거나 분비되는 염증성 사이토카인이라면 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 푸니칼라진, 이의 입체이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 양상에 따르면, 상기 염증성 질환은 대장염, 췌장염, 결막염, 관절염, 피부염, 위염 및 신장염으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, PAR2 활성에 의해 발병하는 염증성 질환이라면 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 일 양상에 따르면, 상기 약학적 조성물은 PAR2의 활성을 억제함으로써 염증성 질환을 예방하거나, 염증성 질환의 증상을 개선하고, 치료할 수 있다.
또한, 본 발명은 푸니칼라진, 이의 입체이성질체, 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염을 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 푸니칼라진, 이의 입체이성질체, 또는 이의 화장품학적으로 허용되는 염을 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 PAR2 수용체를 특이적으로 억제함으로써 PAR2 수용체 활성으로 인해 유발되는 사이토카인의 분비를 억제할 수 있으며, 이를 통해 PAR2 수용체 활성으로 인해 유발되는 다양한 염증성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 식물 유래 천연 화합물로서 부작용과 독성이 적은 새로운 항염증 약학적 조성물, 건강기능식품 조성물 및 화장료 조성물로 개발될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 푸니칼린(A) 또는 푸니칼라진(B)이 HT-29 세포에서 PAR2-AP에 의한 세포 내 칼슘 농도 증가를 억제하는 효과를 확인한 결과이다.
도 2는 HT-29 세포에서 PAR2의 활성을 억제하는 푸니칼라진의 특이성을 확인한 결과이다. 도 2A ~ 도 2D는 각각 농도별로 푸니칼라진을 처리한 후 트립신(A), PAR1-AP(B), 트롬빈(trombin)(C), ATP(D)를 처리하였을 때 칼슘 변화를 측정한 결과; 도 2E는 푸니칼라진 농도에 따라 트립신, PAR1-AP, PAR2-AP, 트롬빈 및 ATP에 의한 세포내 칼슘 증가 억제효과를 비교한 그래프이다.
도 3은 일차배양한 사람 결막 상피 세포에서 PAR2 활성에 의한 Cl- 분비를 억제하는 푸니칼라진의 효과를 확인한 결과이다: 도 3A는 사람 결막상피 세포에서 ENaC 채널, PAR1 수용체, PAR2 수용체, CFTR 채널의 활성이 어느 정도인지 확인하기 위해 각각의 억제제 또는 활성화제를 처리하였을 때 Cl- 분비 변화를 측정한 결과이고, 도 3B는 푸니칼라진의 PAR2-AP에 의한 Cl- 분비 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 4는 일차배양한 사람 결막 상피세포에서 푸니칼라진이 PAR2-AP에 의한 사이토카인 분비를 억제하는지 확인한 결과이다.
도 5A는 일차배양한 사람 결막 상피세포에서 푸니칼라진이 집먼지진드기(HDM) 및 PAR2-AP에 의한 세포내 칼슘 증가를 억제하는지 확인한 결과이고, 도 5B는 푸니칼라진이 HDM 처리에 의한 사이토카인 분비를 억제하는 효과를 확인한 결과이다.
도 6은 DSS(Dextran Sodium Sulfate)으로 대장염이 유도된 C57BL6N 마우스에서 푸니칼라진이 체중감소(A) 및 대장 염증으로 인한 대장 길이 축소(B)를 억제하는지 여부를 확인한 결과이다.
도 7는 DSS로 대장염이 유도된 C57BL6N 마우스에서 푸니칼라진이 사이토카인 분비를 억제하는지 여부를 확인한 결과이다.
도 8는 SD-Rat에서 푸니칼라진이 세룰레인(caerulein)에 의해 유발된 급성 췌장염 증상을 완화시킬 수 있는지 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 루푸스 신장염이 유도된 마우스에서 푸니칼라진을 주입하였을 때 효과를 확인하기 위한 실험 설계 모식도(A), 실험 동물 생존률(B)과 단백뇨 양(C) 및 혈청 크레아티닌 농도(D)의 측정결과이다.
도 10은 루푸스 신장염 마우스 모델에서 푸니칼라진의 신장 조직의 보호 효과를 현미경으로 확인한 결과(A), 사구체, 세뇨관 및 혈관이 손상된 정도를 조직학적으로 수치화한 결과(B), 신장 조직의 자가 항체 발현을 형광현미경으로 관찰한 결과(C) 및 형광량을 정량적으로 나타낸 결과(D)이다.
도 11은 루푸스 신장염 마우스 모델에서 적출한 비장 무게 및 비장세포 수(A), T 세포 수 변화(B)를 측정한 결과이다.
도 12는 루푸스 신장염 마우스 모델의 혈청의 염증성 사이토카인 농도(A-C), 및 항염증성 사이토카인 IL_10 농도(D)를 확인한 결과이다.
도 13은 루푸스 신장염 마우스 모델의 혈중 B 세포 항체 변화(A-E), 및 신장 무게(F) 측정 결과이다.
본 발명자들은 염증 치료용 천연물 신약을 개발하기 위해 한국 화합물 은행에서 제공한 화합물 라이브러리를 검색하고, 분자생리 실험을 수행하여 푸니칼린(Punicalin)이 PAR2 수용체를 억제함을 발견하였으나, 푸니칼린의 세포내 칼슘 증가 억제 효력이 비교적 약하다는 것을 알고 보다 우수한 천연물 화합물을 발굴하기 위해 예의 노력한 결과, 푸니칼린의 유사체 화합물인 푸니칼라진이 PAR2 수용체의 활성을 특이적으로 강력하게 억제하며, 일차 배양한 사람의 결막상피의 염증에서 분비되는 사이토카인을 억제할 뿐만 아니라, 동물 모델 실험에서 유도된 대장염, 급성 췌장염 및 루프스 신장염으로 인한 증상을 완화한다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명은 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식으로 표시되는 푸니칼라진(Punicalagin), 이의 입체이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 PAR2(protease-activated receptor 2) 활성 억제용 조성물을 제공한다.
[화학식]
Figure pat00001
구체적으로, 상기 푸니칼라진은 주로 석류에 함유되어 있는 성분으로, 구조식은 C48H28O30, 분자량은 1084.71 g/mol이고, CAS 번호는 65995-63-3, IUPAC 이름은 1,2,3,11,12,13-Hexahydroxy-5,10-dioxo-8-[3,4,5,11,17,18,19,22,23,34,35-undecahydroxy-8,14,26,31-tetraoxo-9,13,25,32-tetraoxaheptacyclo[25.8.0.02,7.015,20.021,30.024,29.028,33]pentatriaconta- 1(35),2,4,6,15,17,19,21,23,27,29,33-dodecaen-10-yl]-5,7,8,10-tetrahydrodibenzo[f,h][1,4]dioxecin-7-carbaldehyd이다.
본 발명의 푸니칼라진은 상기 푸니칼라진과 동일한 효능을 갖는 범위 내에서 푸니칼라진 수화물, 푸니칼라진 유도체 등을 포함할 수 있고, 이의 용매 화합물이나 입체 이성질체 또한 포함할 수 있다.
상기 푸니칼라진의 수득방법은 특별히 한정되지 않으며, 상기 푸니칼라진을 함유하고 있는 식물로부터 분리하거나, 공지된 제법을 사용하여 화학적으로 합성하거나, 시판되는 것을 사용할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "약학적으로 허용 가능한 염", "식품학적으로 허용 가능한 염", "화장품학적으로 허용 가능한 염" 또는 "이의 염"은 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염일 수 있다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 상기 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 동량의 상기 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고, 이어서 이 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
또한, 본 발명의 상기 화합물은 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물 및 용매화물을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 상기 화합물을 수혼화성 유기용매, 예를 들면 아세톤, 메탄올, 에탄올, 또는 아세토니트릴 등에 녹이고 과량의 유기산을 가하거나 무기산의 산 수용액을 가한 후 침전시키거나 결정화시켜서 제조할 수 있다. 이어서 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조시켜서 부가염을 얻거나 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.
본 발명의 용어 "PAR2 활성 억제제" 또는 "PAR2 억제제"란, 트립신, PAR2-AP 등에 의해 PAR2 수용체가 활성화될 때 그 활성 작용을 억제시킴으로써 PAR2에 의한 생체 대사 작용을 억제하거나 감소시킬 수 있는 물질을 의미한다.
본 발명의 PAR2 활성 억제제 조성물은 PAR2 활성을 통해 나타나는 염증 작용을 차단하거나 완화시킬 수 있다. 구체적으로 본 발명의 조성물은 PAR2 활성에 의한 칼슘(Ca2+)의 증가를 특이적으로 감소시킬 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 PAR2 활성에 의한 칼슘 의존적 염소 이온통로(calcium-activated chloride channel, CaCC)의 활성을 억제함으로써 염소(Cl-)의 분비 증가를 감소시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 PAR2 활성에 의한 사이토카인의 분비를 억제할 수 있다. 상기 사이토카인은 IL-6(interleukin-6), IL-8(interleukin-8), GMCSF(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), TNF-α(Tumor necrosis factor alpha) 및 IL-1β(interleukin-1β)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, PAR2 활성에 의해 분비되는 사이토카인이라면 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 또한 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 "염증성 질환"이란 PAR2의 활성으로 인해 염증성 사이토카인이 분비되어 발생하는 다양한 증상 및 질환을 의미하며, 구체적으로 대장염, 췌장염, 결막염, 관절염, 피부염, 위염 및 신장염으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, PAR2에 의해 유발되는 염증성 질환이라면 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 상기 조성물은 PAR2의 활성을 억제함으로써 상기 염증성 질환을 예방하거나, 증상을 완화시키거나 치료할 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은, 상기 화합물을 유효 성분으로 함유하는 것에 더하여, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 "약학적으로 허용 가능"하다는 것은, 이를 투여 시 생물체를 자극하지 않으면서, 투여되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는, 약학 분야에서 통상적으로 사용되는 것을 의미한다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은, 상기 담체와 함께 제제화되어, 식품, 의약품, 사료 첨가제, 음용수 첨가제 등으로 활용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 말토 덱스트린, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 약학적 조성물은 필요한 경우, 부형제, 희석제, 항산화제, 완충액 또는 정균제 등 기타 약학적으로 허용 가능한 첨가제 들을 첨가하여 사용할 수 있으며, 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 분산제, 계면 활성제, 결합제 또는 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여를 위한 적합한 다양한 제형으로 제제화되어 사용될 수 있다. 상기 경구 투여용 제제의 비제한적인 예로는, 트로키제(troches), 로젠지(lozenge), 정제, 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등을 들 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물을 경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴(Amylopectin), 셀룰로오스(Cellulose) 또는 젤라틴(Gelatin) 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트(Dicalcium phosphate) 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕괴제; 스테아르산 마그네슘(Magnesium stearate), 스테아르산 칼슘(Calcium stearate), 스테아릴 푸마르산 나트륨(Sodium stearyl fumarate) 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스(Polyethylene glycol wax) 등과 같은 윤활유 등을 사용할 수 있으며, 감미제, 방향제, 시럽제 등도 사용할 수 있다.
나아가 캡슐제의 경우에는 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체 등을 추가로 사용할 수 있다.
상기 비경구용 제제의 비제한적인 예로는, 주사액, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 연고, 도포용 파우더, 오일, 크림 등을 들 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물을 비경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조 제제, 외용제 등을 사용할 수 있으며, 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
또한, 보다 구체적으로 본 발명의 상기 약학적 조성물을 주사액으로 제제화하는 경우, 본 발명의 상기 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플(ampoule) 또는 바이알(vial)의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 약학적 조성물을 에어로졸제로 제제화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 약학적 조성물을 연고, 크림 등으로 제제화하는 경우에는, 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등을 담체로 사용하여 제제화할 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물의 약학적 유효량, 유효 투여량은 상기 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 상기 약학적 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물의 보다 바람직한 효과를 위한 투여량은, 바람직하게는 1일 0.1 mg/kg 내지 1,000 mg/kg, 보다 바람직하게는 10 mg/kg 내지 500 mg/kg일 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물의 투여는 하루에 1 회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 상기 약학적 조성물의 투여 경로 및 투여 방식은 각각 독립적일 수 있으며, 그 방식에 있어 특별히 제한되지 아니하며, 목적하는 해당 부위에 상기 약학적 조성물이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 상기 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다.
상기 비경구 투여하는 방법으로는, 예를 들어 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 경피 투여 또는 피하 투여 등을 이용할 수 있으며, 상기 조성물을 질환 부위에 도포하거나 분무, 흡입하는 방법 또한 이용할 수 있으나 이들에 제한되지 아니한다.
본 발명은 또한 상기 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염을 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "건강기능식품"은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품 조성물은 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 항염증 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
본 발명에 따른 항염증용 건강기능식품에 있어서, 상기 푸니칼라진을 건강기능식품의 첨가물로 사용하는 경우 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 예방, 건강 또는 치료 등의 각 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.
건강기능식품의 제형은 산제, 과립제, 환, 정제, 캡슐제의 형태뿐만 아니라 일반 식품 또는 음료의 형태 어느 것이나 가능하다.
상기 식품의 종류에는 특별히 제한은 없고, 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있다.
일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 상기 푸니칼라진은 원료 100 중량부에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 또한 본 발명은 천연물로부터의 분획물을 이용하는 점에서 안전성 면에서 문제가 없으므로 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 기능성식품 중 음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명에 따른 음료 100 mL당 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g일 수 있다.
상기 외에 본 발명에 따른 항염증용 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제를 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 항염증용 건강기능식품 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 제한되지 않으나 본 발명의 기능성식품 100 중량부 대비 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명은 또한 상기 화합물 또는 이의 화장품학적으로 허용되는 염을 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 상기 화합물 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로 플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. HT-29 세포에서 PAR2-AP에 의한 세포 내 칼슘증가 억제
본 발명의 천연물 푸니칼라진(punicalagin)은 시그마-알드리치(SIGMA-ALDRICH) 에서 구매하여 사용하였다.
대장암 세포(HT-29)를 RPMI1640 배양액으로 96-웰 마이크로 플레이트(96-well micro plate)에서 48시간 동안 배양한 후 배양액을 제거한 다음, Flou4-NW dye mixture 100 μl를 넣고 빛을 차단한 상태에서 칼슘 이온 염색약(Ca2+ dye)이 세포에 로딩(loading) 되도록 1시간 동안 안정화 시켰다. 그 다음으로 농도별 푸니칼린(0, 3, 10, 30 μM) 또는 농도별 푸니칼라진(0, 0.3, 1, 2, 3, 10 μM) 을 10분간 처리한 후, 각 웰에 30 μM PAR2-AP(PAR2-Activating Peptide, SLIGRL-NH2)를 처리하여 세포 내 칼슘 농도 변화를 측정하였다.
그 결과 도 1에 나타난 바와 같이, 푸니칼라진은 푸니칼린에 비해 약 10배 이상 PAR2 수용체를 강력하게 억제하며 IC50는 1.45 μM인 것을 확인하였다.
실시예 2. HT-29 세포에서 PAR2의 활성을 특이적으로 억제
대장암 세포(HT-29)를 RPMI1640 배양액으로 96-웰 마이크로 플레이트에서 48시간 동안 배양한 후 배양액을 제거한 다음, Flou4-NW dye mixture 100 μl를 넣은 후 빛을 차단한 상태에서 칼슘 이온 염색약(Ca2+ dye)이 세포에 로딩되도록 1시간 동안 안정화 시켰다. 그 다음으로 푸니칼라진을 농도별(0, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100 μM)로 10분간 전처리 하고, 100 nM트립신(trypsin)을 처리하여 PAR2 활성화에 의한 세포 내 칼슘의 변화가 푸니칼라진에 의한 억제 효과인지 1초 간격으로 약 70초간 측정하였다(도 2A). 상기와 같은 방법으로 푸니칼라진을 농도별(0, 1, 3, 10, 30, 100, 300 μM) 전처리한 후 100 μM PAR1-AP(도2B), 10 Unit/ml 트롬빈(thrombin)(도2C), 100 μM ATP(도2D) 처리하여 각각의 경우 세포 내 칼슘 변화를 1초 간격으로 70초간 측정하였다. 그 결과 푸니칼라진의 농도가 증가할수록 칼슘 증가를 억제하는 효과 역시 향상되는 것을 알 수 있었다.
또한, 트립신, PAR1-AP, PAR2-AP, 트롬빈 및 ATP에 의한 칼슘 증가를 푸니칼라진 농도에 따라 얼마나 억제하는지 비교하였다. 그 결과 도 2E에 나타낸 바와 같이, 푸니칼라진은 ATP, 트롬빈, PAR1-AP 보다 약 10배 이상 더 PAR2의 활성을 선택적으로 억제한 것을 알 수 있었다.
실시예 3. 사람 결막 상피세포에서 PAR2 활성에 CaCC 의존적인 Cl - 분비를 억제
PAR2을 발현하는 사람의 결막 상피세포(Human Conjunctival Epithelial cells)를 트랜스웰(transwell)에서 배양한 뒤 apical membrane쪽 배양액을 제거한 후 basolateral membrane 쪽에 레티노산(retinoic acid)을 추가하여 약 2주간 분화 시킨 뒤(Invest Ophthalmol Vis Sci. 2013 Oct 29;54(10):7143-52) 유싱 챔버(Ussing chamber)를 이용하여 단락 전류(short-circuit currents)를 측정하였다. 유싱 챔버의 luminal bath와 basolateral bath에 Regular HCO3- 용액(120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2.5 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 10 mM Glucose, 25 mM NaHCO3)을 넣고 20분간 안정화 시킨 다음, 100 μM 아밀로라이드(amiloride)를 처리하여 상피 나트륨채널(Epithelial Na channel, ENaC) 활성을 억제하였다. 그 다음으로 100 μM PAR1-AP 또는 100 μM PAR2-AP를 처리하여 PAR1, PAR2 수용체 활성화를 통한 CaCC(Calcium activated Chloride channel) 의존적인 Cl- 분비 촉진 효과를 측정하였다. 다음으로 CFTR(Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) 활성화제인 10 μM 포스콜린(forskolin) 을 처리하여 CFTR(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) 채널에 의한 Cl- 분비 촉진 효과를 측정하고, CFTR 억제제인 10 μM CFTRihn-172(5-[(4-Carboxyphenyl)methylene]-2-thioxo-3-[(3-trifluoromethyl)phenyl-4-thiazolidinone]) (J Clin Invest.　2002 Dec;110(11):1651-8)를 처리하여 CFTR 채널에 의한 Cl- 분비가 억제됨을 확인하였다(도3 A).
한편, 상기 실험 결과 PAR1-AP에 의한 Cl- 분비는 측정되지 않았으며, 푸니칼라진 처리 시 Cl- 분비 억제 효과를 확인하기 위해 상기와 동일한 방법으로 ENaC를 안정화시킨 후 100 μM 아밀로라이드를 처리하여 ENaC 활성을 억제하였다. 다음으로 10 μM 푸니칼라진을 10분간 처리하고, 100 μM PAR2-AP를 처리하였다. 그 결과 푸니칼라진을 처리한 경우 PAR2-AP 처리로 PAR2 수용체가 활성화되었을 때 CaCC 의존적인 Cl- 분비 증가를 억제한 것을 확인할 수 있었다(도 3B).
실시예 4. 사람 일차배양 세포에서 PAR2-AP에 의한 사이토카인 억제효과
푸니칼라진이 PAR2 수용체 활성에 의한 사이토카인 분비를 억제하는지 확인하기 위해, 트랜스웰(transwell)에서 일차 배양하여 분화 시킨 사람의 결막 상피세포에 100 μM PAR2-AP 또는 10 μM 푸니칼라진을 24시간 동안 처리하고 Apical membrane에서 배양액을 채취하여 효소면역정량법(Enzyme Linked Immunosorbent assay)으로 사이토카인의 농도를 측정하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 PAR2-AP처리에 의해 유발되는 IL-6(interleukin-6), IL-8(interleukin-8) 및 GMCSF(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)가 푸니칼라진에 의해 각각 59.5%(도 4A), 61.6%(도 4B) 및 66.8%(도 4C) 만큼 억제되는 것을 확인하였다. 한편, TNF-α(Tumor necrosis factor alpha)는 PAR2-AP에 의해 증가되지 않았다(도 4D).
실시예 5. 사람 일차배양 세포에서 집먼지진드기에 의한 사이토카인 분비 억제 효과
푸니칼라진이 집먼지진드기(House Dust Mite, HDM)에 의한 사이토카인 분비를 억제하는 효과가 있는지 확인하기 위해, 트랜스웰(transwell)에 일차 배양하여 분화시킨 결막 상피세포의 배양액을 제거한 다음, Flou4-NW dye mixture 300 μl를 넣은 후 빛을 차단한 상태에서 Ca2+ dye가 세포에 로딩되도록 1시간 동안 안정화 시켰다. 그 다음으로 푸니칼라진을 농도별(0, 10, 30 μM)로 10분간 전처리한 후 10 μg/ml 집먼지진드기 추출물(HDM extract)을 처리하였다. 그 후 3분간 1초 간격으로 칼슘(Ca2+)을 측정하고, 100 μM PAR2-AP를 처리하여 PAR2 활성화에 의한 세포 내 칼슘의 변화를 푸니칼라진이 억제하는지 1초 간격으로 약 3분간 측정하였다.
그 결과, 푸니칼라진을 처리하지 않은(0 μM) 경우 집먼지진드기와 PAR2-AP를 처리했을 때 일차배양한 사람 상피 세포에서 PAR2 활성을 통해 세포 내 칼슘이 증가되었지만, 10 μM 또는 30 μM의 푸니칼라진을 처리한 경우 칼슘의 증가가 푸니칼라진에 의해 모두 억제된 것을 확인할 수 있었다(도 5A).
그 다음 HDM과 PAR2-AP에 의한 세포 내 칼슘증가 반응을 잘 보이는 사람의 결막 상피세포에 1, 3, 10 μM 푸니칼라진을 처리하고 10 μg/ml HDM을 24시간 동안 처리한 후 분비되는 IL-6 사이토카인을 효소면역측정법으로 측정하였다. 그 결과 1, 3, 10 μM 의 푸니칼라진이 HDM에 의해 증가한 IL-6 사이토카인을 각각 50, 91, 93% 억제하는 것을 알 수 있었다(도 5B).
실시예 6. 동물실험에서 대장염 완화 효과
오리엔트바이오에서 구매한 7주령 C57BL6N 마우스 19마리를 대상으로 푸니칼라진이 DSS(Dextran Sodium Sulfate)에 의해 유도된 대장염 증상을 완화하는 효과가 있는지 확인하였다.
구체적으로 마우스가 먹는 물에 대장염 유발물질인DSS(Dextran Sodium Sulfate) 2.5%를 희석하여 9일 동안 먹이면서 3 mg/kg (n = 4) 또는 10 mg/kg (n = 5) 푸니칼라진을 생리식염수에 녹여48시간에 한번씩 복강 주사하고 1일 1회 체중측정을 하였다. 대조군으로 DSS 2.5%만 먹인 그룹(n = 4), DSS를 먹이지 않고 푸니칼라진도 주사하지 않은 그룹(n = 3)과 DSS를 먹이지 않고 푸니칼라진 10 mg/kg를 주사한 그룹(n = 3)을 설정하고 체중 변화를 측정하였다.
그 결과, 대장염을 유발시키지 않은 마우스들은 체중 감소가 일어나지 않았지만, DSS로 대장염이 유발된 마우스는 급격한 체중 감소가 일어났다. 한편, 3 mg/kg 또는 10 mg/kg 푸니칼라진을 투여한 경우 푸니칼라진이 DSS에 의한 체중감소를 각각 약 25%, 50% 억제한다는 것을 확인하였다(도6A).
또한 대장 염증으로 인해 대장의 길이가 감소하는 것을 푸니칼라진이 억제할 수 있는지 확인하기 위해 상기 실험에 사용된 마우스의 대장조직을 적출하여 길이를 측정한 결과, DSS에 의해 줄어든 대장의 길이보다 푸니칼라진을 주사한 대장의 길이가 약 2 cm더 길었다(도 6B).
실시예 7. 동물실험에서 DSS에 유발되는 사이토카인 억제 효과
C57BL6N 마우스로부터 대장조직을 적출하여 단백질을 분리한 뒤 DSS에 유발되는 사이토카인을 푸니칼라진이 억제할 수 있는지 효소면역측정법으로 확인하였다.
구체적으로 마우스가 먹는 물에 대장염 유발물질인DSS(Dextran Sodium Sulfate) 2.5%를 희석하여 9일 동안 먹이면서 3 mg/kg (n = 4) 또는 10 mg/kg (n = 5) 푸니칼라진을 생리식염수에 녹여48시간에 한번씩 복강 주사하고 1일 1회 체중측정을 하였다. 대조군으로 DSS 2.5%만 먹인 그룹(n = 3), DSS를 먹이지 않고 푸니칼라진도 주사하지 않은 그룹(n = 3)과 DSS를 먹이지 않고 푸니칼라진 10 mg/kg(n = 3) 또는 100 mg/kg(n = 1) 주사한 그룹을 설정하고 체중 변화를 측정하였다. 각 그룹의 마우스를 희생시킨 다음, 대장을 적출하여 순수한 단백질을 분리하여 R&D system에서 구매한 마우스 ELISA Kit을 이용하여 DSS에 의해 유발된 사이토카인을 푸니칼라진이 억제하는지 측정하였다.
그 결과, 10 mg/kg 푸니칼라진은 DSS에 의해 유발된 사이토카인TNF-α(79.1%, 도 7A), IL-6(73%, 도 7B) 및 IL-1β(68.8%, 도 7C)를 유의미한 수준으로 억제하였다. 또한 마우스의 혈청을 채혈하여 IL-1β의 농도를 분석한 결과 푸니칼라진은 DSS에 의한 IL-1β의 혈중 농도를 약 99% 이상 억제한 것을 확인하였다(도 7D).
실시예 8. 세룰레인에 의해 유발되는 급성 췌장염 완화 효과
나라바이오테크에서 구매한 6주령 SD-Rat 24마리를 대상으로 푸니칼라진이 세룰레인(caerulein)에 의해 유도된 급성 췌장염 증상을 완화하는 효과가 있는지 확인하였다.
구체적으로, 상기 래트에 10 mg/kg 푸니칼라진을 처리하고 30분 후 급성 췌장염 유발 물질인 세룰레인(caerulein) 40 μg/kg을 복강 주사한 다음, 2시간 후에 실험동물의 췌장을 적출하여 분석하였다.
먼저, 푸니칼라진이 급성 췌장염의 증상인 부종을 억제하는지 확인하기 위해 적출한 췌장의 무게를 측정하였다. 그 결과, 세룰레인으로 급성 췌장염을 유도시킨 마우스에 10 mg/kg 푸니칼라진을 투여한 경우 췌장의 부종을 95% 이상 억제하는 것을 확인할 수 있었다(도 8A).
다음으로, 세룰레인에 의한 췌장 세포의 손상을 확인하기 위해 H&E 염색을 통해 적출한 췌장 조직의 핵과 세포질을 현미경으로 관찰한 결과, 세룰레인을 투여한 래트는 급성 췌장염 증상으로 췌장 세포 간의 거리가 멀어지고 세포가 손상을 입은 것을 확인할 수 있었으나, 푸니칼라진을 전처리 한 후 세룰레인을 처리한 경우 췌장 세포가 대조군과 비슷한 모양을 나타내었다(도 8B).
실시예 9. 동물실험에서 신장염 완화 효과
중앙실험동물에서 구매한 NZB/WF1 마우스로 루푸스 신장염 증상에 대한 푸니칼리진의 효과를 확인하였다.
루푸스 신장염에 의해 단백뇨가 증가하기 시작하는 23주령 마우스에 1 mg/kg 및 10 mg/kg 푸니칼라진을 생리식염수에 녹여 1 주일에 3회 복강 주사하고 1주일 2회 단백뇨를 측정하였다. 대조군으로는 생리식염수만 주입한 신장염 유도 그룹과 루푸스 신장염의 표준치료제인 7 mg/kg 메틸프레드니솔론(methylprednisolone) 을 주사한 2개 그룹이며, 1주일에 2회 단백뇨를 측정하였다(도 9A).
그 결과, 23주부터 30주까지 사망률은 신장염 유도 그룹에서만 관찰되었으며, 푸니칼라진을 처리한 군에서 사망한 개체는 없었다(도 9B). 또한, 신장염 유도 그룹에서 높은 단백뇨가 관찰된 반면, 10 mg/kg 푸리칼라진을 처리한 그룹은 신장염 유도 그룹에 비해 단백뇨가 50% 낮았으며, 1 mg/kg 푸니칼라진을 처리한 그룹은 7 mg/kg 메틸프레드니솔론(methylprednisolone)을 처리한 수준으로 단백뇨가 낮았다(도 9C). 혈청 내 크레아티닌의 농도 또한, 1 mg/kg 및 10 mg/kg 푸니칼라진을 처리한 그룹에서 신장염 유도 그룹에 비해 낮았으며, 1 mg/kg 푸니칼라진을 처리한 그룹에서 가장 낮은 혈청 크레아티닌 농도를 보였다(도 9D).
실시예 10. 동물실험에서 신장 구조 보호 효과
다음으로 루푸스 신장염에 대한 푸니칼라진의 신장 구조손상에 대한 보호효과를 조직학적으로 평가하였다. 이를 위해 30주령 마우스에서 신장을 적출하고 PAS 염색을 실시하였으며, 사구체 및 관, 혈관이 손상된 정도를 조직학적으로 수치화하였다. 또한 루푸스 신장염이 유발될 경우, 신장 조직에서 많이 발현하는 자가항체인 IgG, C3의 발현을 형광염색하여 형광현미경에서 관찰하였다.
그 결과, 1 mg/kg 및 10 mg/kg 푸니칼라진을 처리한 마우스에서 생리식염수만 처리한 신장염 유도 마우스에 비해 사구체 및 관, 혈관 손상 정도가 모두 완화되었으며, 표준치료제인 메틸프레드니솔론을 처리한 수준과 유사하였다(도 10A 및 B). 또한, 형광형미경 관찰 결과 생리식염수만 처리한 신장염 유도 마우스에서 IgG와 C3 침착이 많이 일어난 것에 비해 1 mg/kg 및 10 mg/kg 푸니칼라진을 처리한 마우스에서는 IgG와 C3 침착이 크게 감소하였으며, 특히 1 mg/kg 푸니칼라진을 처리한 그룹은 메틸프레드니솔론을 처리한 수준과 유사하였다(도 10C 및 D).
실시예 11. 푸니칼라진에 의한 T 세포 변화
루푸스 신장염에 대한 푸니칼라진의 완화 효과 기전을 알아내기 위해 30주령 마우스에서 비장을 적출한 후, 비장의 무게와 비장세포 수를 측정하고, 비장 내 T 세포의 변화를 FACS 분석하였다.
그 결과, 생리식염수만 처리한 신장염 유도 마우스에 비해 1 mg/kg 푸니칼라진을 처리한 마우스에서 메틸프레드니솔론을 처리한 그룹과 유사하게 비장의 무게가 면역반응에 의해 증가하지 않았으며, 전체 비장세포 수도 증가하지 않았다(도 11A).
또한, 비장 내 CD4 T 세포 수, TH1, TH2, TH17 T 세포의 발현을 측정한 결과, 1 mg/kg 및 10 mg/kg 푸니칼라진을 처리한 마우스에서 생리식염수만 처리한 신장염 유도 마우스에 비해 모두 유의하게 감소하였으며, 조절 T 세포(Treg)의 발현은 10 mg/kg 푸니칼라진을 처리한 마우스에서 현저하게 증가하였다(도 11B).
실시예 12. 푸니칼라진에 의한 혈청 사이토카인 변화
30 주령 마우스에서 혈청을 분리한 뒤, 루푸스 신장염에 의해 발현된 사이토카인을 푸니칼라진이 억제 또는 증가시키는지 효소면역측정법으로 분석하였다.
그 결과, 생리식염수만 처리한 신장염 유도 마우스 그룹에서 염증성 사이토카인인 IFN-γ, IL-17A, IL-6의 발현이 증가한 반면, 1 mg/kg 및 10 mg/kg 푸니칼라진을 처리한 마우스에서는 모두 발현이 감소하였으며, 표준치료제인 메틸프레드니솔론을 처리한 그룹과 발현 수준이 유사하게 낮았다(도 12A 내지 C).
또한, 항염증성 사이토카인인 IL-10의 발현의 경우 1 mg/kg 푸니칼라진을 처리한 그룹은 생리식염수만 처리한 신장염 유도 마우스 그룹과 유사하였고, 10 mg/kg 푸니칼라진을 처리한 그룹에서는 신장염 유도 마우스 그룹에 비해 낮았다 (도 4D).
실시예 13. 푸리칼라진에 의한 B 세포 항체 감소 효과
루푸스 신장염에 대한 푸니칼라진의 완화 효과를 알아내기 위해 30주령 마우스에서 혈청을 분리하여 B 세포 자가항체의 발현을 효소면역측정법으로 분석하였다.
그 결과, 생리식염수만 처리한 신장염 유도 마우스 그룹에 비해 1 mg/kg 및 10 mg/kg 푸니칼라진을 처리한 마우스 혈청에서 anti-dsDNA, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3의 발현이 모두 감소하였으며, 특히 1 mg/kg 푸니칼라진을 처리한 그룹에서 유의하게 감소하였다(도 13A 내지 E).
또한, 염증반응에 의해 생리식염수만 처리한 신장염 유도 마우스에서는 신장의 무게가 증가한 반면, 1 mg/kg 푸니칼라진을 처리한 마우스에서는 신장 무게가 감소하였다(도 13F).

Claims (10)

  1. 푸니칼라진(Punicalagin), 이의 입체이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 PAR2(protease-activated receptor 2) 활성 억제용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 PAR2활성에 의한 칼슘(Ca2+)의 증가를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 PAR2활성에 의한 염소(Cl-)의 분비 증가를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 사이토카인 분비를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 사이토카인은 IL-6(interleukin-6), IL-8(interleukin-8), GMCSF(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), TNF-α(Tumor necrosis factor alpha) 및 IL-1β(interleukin-1β)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 푸니칼라진(Punicalagin), 이의 입체이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 염증성 질환은 PAR2 활성에 의해 발병하는 대장염, 췌장염, 결막염, 관절염, 피부염, 위염 및 신장염으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 PAR2의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  9. 푸니칼라진(Punicalagin), 이의 입체이성질체, 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염을 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  10. 푸니칼라진(Punicalagin), 이의 입체이성질체, 또는 이의 화장품학적으로 허용되는 염을 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
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