JP6929949B2 - エリスロポエチン由来ペプチド、その製造方法及び用途 - Google Patents

Description

本発明は、生物学的遺伝子の分野に属し、エリスロポエチンに関し、具体的にエリスロポエチン由来ペプチド、その製造方法及び用途に関する。

人類の寿命の延伸に伴い、神経系疾患は患者、家族及び社会にとって、ますます大きな負担になってきている。２０１６年に、雑誌《Ｌａｎｃｅｔ》が発表した世界の疾病負担研究（ＧＢＤ）の新しい世界的な死因分析レポートによると、２０１５年に脳血管疾患による死因の順位は再び上昇し、人類の死因の第２位になった。中国では、脳血管疾患が人の死亡及び障害者になる第１位の原因になっており、その有病率は年々増加し、且つ若年化の傾向にある。アルツハイマー病、他の種類の認知症、てんかん、パーキンソン病などの他の神経系疾患の罹患率も年々増加しており、その死亡者数は１９９０年から２０１５年までに２０％以上増加している。脳血管疾患に代表される神経系疾患は、健康に影響を及ぼすだけでなく、国や社会にある程度の経済的負担をもたらしており、ＷＨＯの試算によれば、脳卒中及び心筋梗塞による死亡率を１０％低減させれば、介入措置のための経済的支出を毎年約２５０億ドル削減できるものと推定されている。ある意味で、神経系疾患は医学的な問題であるだけでなく、社会的な問題でもあると言える。

神経系疾患は、発病メカニズムが複雑であり、症状も非常に多いので、その多くはまだ有効な薬物治療が確立していない。例えば、低酸素性脳症では、高圧酸素治療装置により脳組織の酸素供給を改善できるが、コントロールが不十分な高血圧患者及び重症患者に対する使用は禁止され、且つ脳血管の二次収縮による有害作用を引き起こす可能性があり、その臨床適用は制限されている。また、例えば、虚血性脳卒中では、脳虚血後にエネルギー代謝障害、興奮性アミノ酸毒性などの一連の病態生理学的変化が発生し、血栓溶解が現在のところ唯一の有効な方法であるが、血栓溶解療法の時間枠は短く、少数の患者しか利益を享受できない。もう１つの方向は、神経保護治療であり、神経細胞の死滅を阻止することで、虚血性ペナンブラの神経細胞を保存することである。現在、保護効果を有する可能性のある主な神経保護剤には、グルタミン酸拮抗薬、抗炎症因子、カルシウムチャネル阻害薬、ナトリウムチャネル阻害薬、カリウムチャネル活性剤、フリーラジカル捕捉剤、ＧＡＢＡ受容体拮抗薬、セロトニン拮抗薬、ＮＭＤＡ受容体拮抗薬、低温フェノバルビタール薬物による誘発麻酔などがある。現在、動物実験に有効な１０００以上の神経保護薬があり、１００種類以上の薬物について臨床試験が行われたが、臨床的にほとんど効き目が現れていない。したがって、新たな有効な神経保護剤の研究及び開発は非常に重要な意義を有する。

エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、主に腎臓で生成される１６５個のアミノ酸からなる３４ｋＤａの糖タンパク質ホルモンであり、最も早く臨床に適用されたサイトカインである。エリスロポエチンは従来、臨床的に貧血の治療に広範に適用されていたが、近年の研究により、ＥＰＯ及びＥＰＯ受容体（ＥＰＯＲ）が神経、心臓、腎臓などを含む様々な非造血組織に広く分布し、広範な組織保護活性を有する多機能分子であることが発見された。特に、この２０年来の研究から、ＥＰＯがｉｎ ｖｉｖｏ実験でも、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験でも神経保護及び神経栄養の効果を果たせることが発見された。

神経系において、ＥＰＯ／ＥＰＯＲはニューロン、アストロサイト、血管内皮細胞などに発現され、ＥＰＯ／ＥＰＯＲは正常な成人の脳組織において低発現状態にあるが、損傷、又は虚血、低酸素などのストレスを受けると、その発現が著しく増加する。しかし、活性化されたＥＰＯ／ＥＰＯＲ系は、損傷を受けた神経細胞を保護するのに十分ではなく、組換えエリスロポエチン（ｒｈＥＰＯ）が外因的に大量に補給されると、細胞膜における受容体に媒介されるエンドサイトーシス又はピノサイトーシスを介して、血液脳関門を透過して神経系に入り、ＥＰＯは過剰発現したＥＰＯＲと結合されＪａｋ２リン酸化を誘導し、シグナル伝達兼転写活性化因子ＳＴＡＴ５、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（Ｐ１３Ｋ）／ＡＫＴ経路、核因子ＮＦーκＢなどの複数の経路を活性化させて、抗炎症、抗酸化ストレス、抗アポトーシス、興奮毒性の抑制、神経再生の促進、血液脳関門の保護などの複数のメカニズムの複合効果によって、神経細胞のアポトーシスを抑制し、ニューロンの損傷を軽減し、神経保護作用を果たす。しかも、ＥＰＯの神経保護作用は、脳虚血、低酸素性虚血性脳障害、脳虚血再灌流障害、脊髄損傷、実験的自己免疫性脳髄膜炎（ＥＡＥ）、くも膜下出血、てんかん、パーキンソン病、多系統萎縮症、坐骨神経圧迫、網膜神経節損傷などを含むさまざまな動物疾患モデルにおいて既に実証されている。

ＥＰＯがｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ実験で神経保護作用を有することが実証されてから、ここ十数年で、一連の臨床試験を行うことにより、脳虚血、神経損傷から炎症及び神経変性疾患の患者に対して、ＥＰＯが人体において神経保護及び再生の機能を発揮できるか否かについて研究が進められてきた。幸いなことに、これらの研究のほとんどから、ＥＰＯによる治療が効果的であることが実証された。しかし、ＥＰＯは、赤血球の産生を促進する作用を有するため、高用量に、又は長期的に使用すると、真性多血症、高血圧及び血栓症のような一連の深刻な医学的な問題を直接引き起こす。したがって、造血機能を有さないが、神経保護作用を有するＥＰＯ誘導体、アロステリックリガンドなどの製剤の研究・開発は現在、神経科学者から非常に注視されている。

研究者は近年来、神経保護作用を有するものの、赤血球の産生を促進する作用を有さないいくつかのＥＰＯ誘導体を相次いで開発した。一種類は、カルバミル化ＥＰＯ（ＣＥＰＯ）に代表され、アシアロＥＰＯ（ａｓｉａｌｏＥＰＯ）及び低シアル酸ＥＰＯ（Ｎｅｕｒｏ−ＥＰＯ）などを含むタンパク質が修飾されたエリスロポエチンの誘導体である。ＥＰＯ及びＣＥＰＯに対する研究の進展につれて、ＣＥＰＯはＥＰＯＲと組み合わされなくても、ＥＰＯの神経保護及びその他の組織保護作用を依然として保留できることが分かった。したがって、ＥＰＯと異なる赤血球の促進効果は、２分子のＥＰＯＲで形成された二量体によって媒介され、神経保護作用を含むＥＰＯが果たす組織保護作用は、ＥＰＯＲとＣＤ１３１、即ちβｃＲ（βコミュニティ）によって形成されたヘテロ多量体に媒介されていることがさらに示される。もう一種類の誘導体は、ＨＢＰ、ＨＢＳＰ（ＡＲＡ２９０）、ｐＨＢＳＰ、ＥｐｏｐｅｐｔｉｄｅＡＢ、ＭＫＸ−２、ＪＭ４、Ｅｐｏｔｒｉｓなどを含むＥＰＯ空間構造を模倣する小分子ポリペプチドである。この種類のポリペプチド誘導体は、分子量が小さく、血液脳関門を透過しやすいという利点を有し、有望な臨床適用用途を有するが、人体内におけるその作用を臨床的に検証するさらなる研究及び実験が必要である。

先行技術における前記課題に対し、本発明は、エリスロポエチン由来ペプチド、その製造方法及び用途を提供するものであり、前記エリスロポエチン由来ペプチドは赤血球の産生を促進する作用を有さないが、神経保護作用を有し、赤血球の産生を促進する作用によって引き起こされる真性多血症、高血圧症、血栓形成などの一連の深刻な医学的な問題を回避できる。

本発明は、まず、公開されたヒトＥＰＯのアミノ酸配列（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｄａｔａｂａｓｅｓ，Ｐ０１５８８）を参照し、１９９８年に雑誌Ｎａｔｕｒｅ（Ｎａｔｕｒｅ、１９９８，３９５（６７０１）：ｐ．５１１ー６）に発表された研究結果に基づいて、ＥＰＯとＥＰＯＲの結合部位及びＥＰＯのタンパク質ヘリックス構造を含むアミノ酸配列を選択し、且つ一部のアミノ酸が欠失し（例えば、ＥＰＯ分子のアミノ酸配列における８６位のグルタミン、８８位のトリプトファン、８９位のグルタミン酸、９０位のプロリン、９７位のリジンのうちの１つ又はいくつかが欠失し、好ましくは前記部位の全てが欠失している）、当初１０３位に位置したアルギニンをアラニンに置換し、該エリスロポエチン由来ペプチドは、赤血球の産生を促進する作用を有さないが、神経保護作用を有する。

本発明は、赤血球の産生を促進する作用を有さないが、神経保護作用を有する以下の（ａ）又は（ｂ）を含むエリスロポエチン由来ペプチドを提供するものである。
（ａ）配列番号１のようなアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列に基づいて、１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加されることにより、誘導されたポリペプチド。
具体的に、配列番号１は以下のとおりである。
ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ ＬＶＮＳＳＰ ＬＱＬＨＶＤＡＶＳＧＬＡＳＬＴＴＬＬＲＡＬ。

本発明の好ましい１つの実施形態において、前記エリスロポエチン由来ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１で示される配列である。

さらに、前記配列番号１で示されるアミノ酸配列の前記エリスロポエチン由来ペプチドの構造式は、以下のとおりである。

本発明のもう１つの態様は、前記エリスロポエチン由来ペプチドを含む医薬品を提供するか、又は前記エリスロポエチン由来ペプチドを含む組成物を提供するものである。

さらに、本発明は、前記エリスロポエチン由来ペプチド、及び賦形剤又は担体を含む医薬組成物を提供する。使用される場合、本発明の医薬組成物は薬学的に許容される製剤として使用される。このような製剤は、通常、濃度が薬学的に許容される塩、緩衝剤、防腐剤、適合性担体及び任意のその他の治療薬を含むことができる。

本発明のもう１つの態様は、前記のいずれかのエリスロポエチン由来ペプチドがコードされたヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供することである。

さらに、本発明は前記核酸分子の発現ベクターを提供する。

さらに、本発明は前記発現ベクターの宿主細胞又はウイルスを提供する。

さらに、本発明は、以下のいずれか１項を含むキットを提供する。
ａ）本発明に記載のエリスロポエチン由来ペプチド。
ｂ）本発明に記載の組成物。
ｃ）本発明に記載の核酸分子。
ｄ）本発明に記載の発現ベクター。
ｅ）本発明に記載の宿主細胞。
ｆ）本発明に記載の前記ウイルス。

本発明は、さらに、前記エリスロポエチン由来ペプチドの製造方法を提供するものであり、それは以下のステップを含む。
１）固相合成法を使用し、ロイシンが結合されている出発樹脂をＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）に２０〜５０分浸漬させ、次いで脱キャッピング剤に浸漬させることで、ＦＭＯＣ（フルオレニルメチルオキシカルボニル）を除去し、２０〜５０分したら、ジメチルホルムアミドで洗浄する。
２）次のアミノ酸、縮合剤及び塩基を添加して、２０〜５０分反応させ、さらにジメチルホルムアミドで洗浄する。
３）脱キャッピング剤を使用してフルオレニルメチルオキシカルボニルを除去し、２０〜５０分したら、さらにジメチルホルムアミドで洗浄する。
４）ステップ２）及びステップ３）を繰り返し、アミノ酸を順次結合させる。

さらに、本発明の製造方法において、アミノ酸の結合順序は、ロイシン→アラニン→アルギニン→ロイシン→ロイシン→トレオニン→トレオニン→ロイシン→セリン→アラニン→ロイシン→グリシン→セリン→バリン→アラニン→アスパラギン酸→バリン→ヒスチジン→ロイシン→グルタミン→ロイシン→プロリン→セリン→セリン→アスパラギン→バリン→ロイシン→ロイシン→アラニン→グルタミン→グリシン→アルギニン→ロイシン→バリン→アラニン→グルタミン酸→セリンである。

好ましくは、ステップ２）に記載の縮合剤は、ＴＢＴＵ、即ちＯ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム・テトラフルオロボラートである。

好ましくは、ステップ２）に記載の塩基はモルホリンである。

好ましくは、ステップ３）に記載の脱キャッピング剤は、ヘキサヒドロピリジンとＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドとからなる混合液であり、ここでヘキサヒドロピリジンとＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドとの体積比が１：３〜５であることが好ましく、１：４であることが最も好ましい。

本発明は、神経細胞損傷の治療における前記エリスロポエチン由来ペプチドの適用をさらに提供する。

本発明は、低酸素脳症の治療における前記エリスロポエチン由来ペプチドの適用をさらに提供する。

本発明は、てんかんの治療における前記エリスロポエチン由来ペプチドの適用をさらに提供する。

本発明は、本発明のエリスロポエチン由来ペプチドを含む神経細胞損傷の治療のための医薬品をさらに提供する。

本発明は、本発明のエリスロポエチン由来ペプチドを含む低酸素脳症の治療のための医薬品をさらに提供する。

本発明は、本発明のエリスロポエチン由来ペプチドを含むてんかんの治療のための医薬品をさらに提供する。

本発明は、新規なＥＰＯ由来ペプチドの製造及び合成に成功し、本発明の製造方法を適用すれば、その純度は９５％に達することができる。

発明人は、新規なＥＰＯ由来ペプチドの機能をさらに研究するために、てんかんの動物モデルを設計し、該動物モデルにおいてＥＰＯ由来ペプチドを使用することにより、てんかん発作の潜伏期間が延長され、神経細胞の損傷を軽減させる効果がある可能性があることが示唆され、さらに実験を設計し、神経損傷の動物に対して新規なＥＰＯ由来ペプチドを使用すると、前記新規なＥＰＯ由来ペプチドが急性損傷の際にニューロンを保護でき、血液脳関門を透過して神経保護作用を発揮できることにより、発作の潜伏期間が延長され、海馬におけるニューロンの喪失を減少できることを証明した。したがって、新規なＥＰＯ由来ペプチドは、神経損傷の治療に薬効があることを示している。

本発明の新規なＥＰＯ由来ペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験において、抗ニューロンのアポトーシス効果を有することが示唆されている。培養した初代ニューロンに無グルコース、無酸素による損傷及びＮＭＤＡ損傷を与えると、新規なＥＰＯ由来ペプチドの介入群のニューロン損傷が軽減され、細胞生存率が対照群より高くなる。ｉｎ ｖｉｖｏ実験において、新規なＥＰＯ由来ペプチドは、脳梗塞の体積を減少させ、脳虚血を改善し、神経行動学的スコアの重症度を減少させることができることが確認されている。また、新規なＥＰＯ由来ペプチドは、神経損傷を軽減させ、神経保護作用を有し、細胞アポトーシスを減少させることが示唆されている。マウスに長期間投与しても、赤血球の産生を促進する顕著な副作用がない。したがって、新規なＥＰＯ由来ペプチドは急性低酸素脳症に対して神経保護作用を有し、且つＥＰＯよりも優れている。

本発明は、先行技術と比べて技術的進歩が顕著である。本発明は、赤血球の産生活性を有さないが、神経保護作用を有する新規なＥＰＯ由来ペプチドを提供するものであり、該新薬品は、分子量が小さく、血液脳関門を透過でき、人体内の機能性タンパク質由来の低分子ポリペプチドであり、開発された他の合成医薬品と比較して、人体への副作用が極めて小さく、臨床適用の可能性が期待できる。該発明は臨床適用される場合、中枢神経系疾患を予防及び治療するための新規な神経保護医薬品になり、神経損傷の患者に新しい治療法を提供できる。

図１は、高速液体クロマトグラフィーによるＨＰＬＣ報告（Ａ）及び質量分析Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙによる報告（Ｂ）である。 図２は、赤血球数のヒストグラムの比較（３日、７日、１３日）であり、ここで、横軸は検出日数であり、縦軸は赤血球数（Ｍ／μＬ）である。 図３は、皮質ニューロンのＭＡＰ−２及びＤＡＰＩ蛍光二重染色図を示し、ここでニューロン細胞体は緑色に染色され、細胞核は青色に染色されている。 図４Ａは、異なる薬物の介入による酸素・グルコース欠乏によるニューロンの細胞生存率を示し、ここで、横軸は群分けであり、縦軸は細胞生存率である。図４Ｂは、異なる薬物の介入による酸素・グルコース欠乏によるニューロンの乳酸脱水素酵素の放出率を示し、ここで、横軸は群分けであり、縦軸は乳酸脱水素酵素の放出率である。 図５Ａは、異なる薬物の介入によるＮＭＤＡ損傷の細胞生存率を示し、ここで、横軸は群分けであり、縦軸は細胞生存率である。図５Ｂは、異なる薬物の介入によるＮＭＤＡ損傷のニューロンの乳酸脱水素酵素の放出率を示し、ここで、横軸は群分けであり、縦軸は乳酸脱水素酵素の放出率である。 図６は、異なる処置群のマウスの脳脊髄液のビオチンの濃度を示し、ここで、横軸は群分けであり、縦軸はビオチンの濃度である。 図７Ａは異なる処置群のマウスの神経行動学的スコアを示し、ここで、横軸は群分けであり、縦軸は神経行動学的スコアのスコアである。図７Ｂは異なる処置群のマウスの一過性の大脳における動脈閉塞による脳梗塞の写真を示している。図７Ｃは異なる処置群のマウスにおける一過性の大脳における動脈閉塞による脳梗塞の体積を示し、ここで、横軸は群分けであり、縦軸は脳梗塞の体積である。 図８は、異なる薬物介入によるマウスのピロカルピン誘発てんかんの発作の潜伏期間を示し、ここで、横軸は群分けであり、縦軸は発作の潜伏期間である。

実施例１ 本発明のＥＰＯ由来ペプチドの調製
本発明のＥＰＯ由来ペプチドの合成ステップ：出発樹脂をロイシンとし、樹脂をジメチルホルムアミドに３０分浸漬させ、次いで脱キャッピング剤でフルオレニルメチルオキシカルボニルを除去し、３０分したら、ジメチルホルムアミドで洗浄し、次いでアミノ酸（アラニン）、縮合剤及び塩基を添加して、３０分反応させ、さらにジメチルホルムアミドで洗浄し、検出して、検出に合格したら、脱キャッピング剤を使用してフルオレニルメチルオキシカルボニルを除去し、３０分したら、さらにジメチルホルムアミドで洗浄する。さらに、設計された配列に応じて、次のアミノ酸（アルギニン）を結合させ、最後の１つのアミノ酸まで結合させ、線状ペプチド対を保証することに基づいて、最終的に切断して、純度が９５％以上になるように精製する。

新規なＥＰＯ由来ペプチドの純度を同定する方法は、図１に示すとおりである。
粗ペプチドを体積でＡＣＮ（アセトニトリル）：Ｈ_２Ｏ＝１：２の溶液に溶解させ、ＨＰＬＣによって精製する。ＨＰＬＣ条件は、移動相Ａ相が０．１％のＴＦＡトリフルオロ酢酸／１００％のＡＣＮアセトニトリルである。移動相Ｂ相は０．１％のＴＦＡトリフルオロ酢酸／１００％の水である。カラムはＫｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８で、４．６×２５０ｍｍであり、５μｍである。
勾配： Ａ Ｂ
０．０ｍｉｎ ３８％ ６２％
２５．０ｍｉｎ ６３％ ３７％
２５．１ｍｉｎ １００％ ０％
３０．０ｍｉｎ 停止
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：２５℃。

機器の平衡を設定したら、機器を起動させて約１０分運転させ、粗ペプチドを機器に注入し、ベースラインを収集し、停止すると、最終的に純度９５．２５％のサンプルが得られる。

実施例２ 本発明のＥＰＯ由来ペプチドによる造血実験
１８−２２ｇの雄のＣ５７／ＢＬ６マウス（上海西普爾−必凱実験動物有限公司より購入、計５０匹、１群あたり１０匹）に対して、ＥＰＯ（５０ｕｇ／ｋｇ）、本発明のＥＰＯ由来ペプチド（５０ｕｇ／ｋｇ）、本発明のＥＰＯ由来ペプチド（２５０ｕｇ／ｋｇ）、生理食塩水（０．１ｍｌ／ｍｏｕｓｅ）及び溶剤（ＡＣＮ＋Ｍｉｌｌｉｑ，０．１ｍｌ／ｍｏｕｓｅ）を１日に１回、腹腔内注射する。３日、７日、１３日目に尾静脈からそれぞれ採血し、ＰｒｏＣｙｔｅ Ｄｘ自動血球分析装置によって赤血球数を測定する。実験結果は下表に示すとおりである。

上記データに基づいて図２のようなヒストグラムを作成すると、図２から分かるように、投与回数の増加に伴い、ＥＰＯ群は他の群よりも赤血球数が明らかに増加し、本発明のＥＰＯ由来ペプチド群（Ｔ３）は生理食塩水群（Ｓａｌｉｎｅ）及び溶剤群（ＡＣＮ＋Ｍｉｌｌｉｑ）と比較して、赤血球に明らかな増加はない。また、高用量のＥＰＯ由来ペプチド群と低用量群との赤血球数の差異も統計的に有意ではない。

実施例３ 本発明のＥＰＯ由来ペプチドによるニューロン保護実験
マウス胎児皮質ニューロンを文献方法によって培養し、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標）Ｍｅｄｉｕｍ（市販）無血清培地を使用し、５％のＣＯ_２インキュベーターで７〜１４日培養したら、ニューロンを特異的に標識し、即ち、微小管関連タンパク質−２（ＭＡＰ−２）を染色、同定すると共に、細胞核を４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）蛍光染料で標識する。蛍光顕微鏡で結果を観察すると、図３に示すとおりである。

具体的な操作プロセスは、以下のとおりである。
マウス胎児皮質ニューロンの初代培養
１． 妊娠１８日のＳＤマウス（上海西普爾−必凱実験動物有限公司）を、１０％の抱水クロラールで麻酔する。
２． ７５％のアルコールで腹部の皮膚を消毒し、腹腔を開き、子宮を分離して、胎児マウスを剥ぎ取る。
３． 組織分離：胎児マウスの頭部を切り、予冷したＰＢＳ緩衝液に直ちに入れ、氷上で操作し、脳組織を慎重に分離し、皮質を慎重に分離し、脳膜及び血管を慎重に剥がし、ＰＢＳ溶液で２回洗浄する。
４． 細断：眼科用ハサミで皮質を約１ｍｍ^３に細断すればよい。
５． 消化：細断した組織ブロックを５０ｍｌの清潔な遠心管に移し、３７℃の予熱した０．１２５％のトリプシンーＥＤＴＡを５ｍｌ添加し、３７℃の水浴箱に入れて約５〜１０分間消化させる。
６． 消化の終了：３７℃の予熱したＦＢＳーＤＭＥＭ培地を５ｍｌ添加することにより、消化を終了させる。フロック状の細胞塊を吸引し、１５ｍｌの清潔な遠心管に入れて、１０％のＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地を添加して、残った消化液を洗い流す。
７． スポイトで繰り返し吹き付けることにより、単細胞に分散させ、細胞を２００メッシュのフィルターでろ過して単細胞懸濁液を調製する。
８． ４℃、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨て、１０％のウシ胎児血清を含む植栽培地を添加して、細胞を再懸濁させる。
９． 顕微鏡下でカウントし、１×１０^６個／ｃｍ^２の密度で、ポリリジンに一晩被覆されたスライド又はプレート上に接種し、３７℃、５％ＣＯ_２、９５％の湿度のインキュベーターで培養する。
１０． ８〜１２時間培養したら、それらの全てをＮｅｕｒｏｂａｓａｌ Ａ＋Ｂ２７＋グルタミン無血清培地と交換して、培養を維持させ、３日毎に培地を交換する。
１１． ７〜１４日後にニューロンの同定を行う。

ニューロンＭＡＰ−２／ＤＡＰＩの同定
１． スライド上に接種し、７〜１４日間培養したニューロンを採取し、予熱したＰＢＳで５分間洗浄する。
２． ４％のパラホルムアルデヒドを添加して、室温で３０分間固定する。
３． ＰＢＳで５分間×３回洗浄する。
４． ０．２％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ＰＢＳを添加し、室温で細胞膜を２０分間透過させる。
５． ＰＢＳで５分間×３回洗浄する。
６． ブロッキング：ブロッキング溶液（５％のヒツジ血清）を滴下し、室温で３０〜６０分ブロッキングする。
７． 液体を吸引したら、１：１００の一次抗体（抗ウサギＭＡＰ−２ポリクローナル抗体、Ａｂｃａｍ）を滴下し、４℃で一晩静置し、陰性対照としてＰＢＳと交換する。
８． 液体を捨て、ＰＢＳで５分間×３回洗浄する。
９． 水分を吸収したら、１：２００の二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ロバ抗ウサギ蛍光二次抗体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を滴下して、室温、暗所で６０分間培養する。
１０． 液体を捨て、ＰＢＳで５分間×３回洗浄する。
１１． 液体を捨て、ＤＡＰ（ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）ＯＩ染色し、水を吸い取り、室温で１０分間培養する。
１２． 液体を捨て、ＰＢＳで５分間×３回洗浄する。
１３． 抗蛍光消光封入液（５０％のグリセロールで封入）を滴下する。
１４． 蛍光顕微鏡で観察し、写真を撮る。
結果は図３に示すとおりであり、緑色は、ＭＡＰ−２陽性ニューロンであり、青色は細胞核であり、結果から、マウス胎児皮質ニューロンの初代培養が９０％以上の純度を達成でき、培養が成功したことが分かる。

酸素グルコース欠乏（ｏｘｙｇｅｎ ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ／ＯＧＤ）によるニューロン損傷及び本発明のＥＰＯ由来ペプチドによる保護
初代培養のマウス胎児皮質ニューロンを無グルコースＤＭＥＤ培地に添加し、低酸素インキュベーター内でニューロンを３時間損傷させたら、無血清培地と交換して、ＥＰＯ、新規なＥＰＯ由来ペプチド組（Ｔ３）及び培地をそれぞれ添加し、５％のＣＯ_２正常酸素インキュベーターで４時間培養し、各群のＬＤＨ放出率及びＭＴＴ細胞の生存率を測定した。
上記結果に基づいて、初代の皮質ニューロンに２５０ｕｍｏｌ／ＬのＮＭＤＡを投与し、６０分すると、その結果は図５に示すとおりである。

具体的な操作プロセスは、以下のとおりである。
１． ７〜１４日間程度培養し、よく成長したニューロンを取って、ニューロンの元の培地を吸収させ除去し、ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、さらに低グルコースＤＭＥＭを添加する。
２． 培養プレートを３７℃の低酸素インキュベーターに入れ、その内部の酸素濃度を１％に設定する。
３． 低酸素で３時間維持したら、培養プレートを取り出し、低グルコース培地を吸収させ、元の無血清維持培地と交換して、ＥＰＯ（５ｕｇ／ｍｌ、１００ｕｇ／ｍｌ）、本発明のＥＰＯ由来ペプチド（５ｕｇ／ｍｌ、５０ｕｇ／ｍｌ、１００ｕｇ／ｍｌ）、培地をそれぞれ添加し、５％のＣＯ_２及び９５％の空気の３７℃のインキュベーターに入れて、４時間引き続き培養する。
４． ４時間したら、各群の細胞の細胞生存率（ＭＴＴキット、碧云天生物技術有限公司）、ＬＤＨ乳酸脱水素酵素の放出率（ＬＤＨキット、Ｐｒｏｍｅｇａ社のキット）をそれぞれ測定する。

その結果は図４に示すとおりである。本発明のＥＰＯ由来ペプチド群（Ｔ３）のニューロンの乳酸脱水素酵素の放出率は、対照群より少なくなり、細胞生存率は対照群より高くなり、本発明のＥＰＯ由来ペプチドが急性神経損傷を軽減させ、ニューロンのアポトーシスを低減できることが分かる。

ＮメチルＤアスパラギン酸（ＮＭＤＡ）によるニューロン損傷及び本発明のＥＰＯ由来ペプチドによる保護
１． ７〜１４日間程度培養し、よく成長したニューロンを取って、ＥＰＯ（５ｕｇ／ｍｌ）、本発明のＥＰＯ由来ペプチド（１００ｕｇ／ｍｌ）をそれぞれ添加する。
２． 最終濃度が２５０ｕｍｏｌ／ＬになるようにＮＭＤＡを添加し、３７℃のインキュベーターで６０分培養する。
３． 培地を捨て、各群の細胞の細胞生存率（ＭＴＴキット、碧云天生物技術有限公司）、ＬＤＨの乳酸脱水素酵素の放出率（ＬＤＨキット、Ｐｒｏｍｅｇａ社のキット）をそれぞれ測定する。

その結果は図５に示すとおりである。ＥＰＯを添加した群、本発明のＥＰＯ由来ペプチドを添加した群（Ｔ３）のニューロンの乳酸脱水素酵素の放出率は、対照群より少なくなり、細胞生存率は対照群より高くなり、本発明のＥＰＯ由来ペプチドが急性神経損傷を軽減させ、ニューロンのアポトーシスを低減できることが分かる。

実施例４ 本発明のＥＰＯ由来ペプチドの血液脳関門の透過試験
ビオチンで標記された新規なＥＰＯ由来ペプチドを腹腔内注射し、投与して１時間したら、５〜１５μｌのマウス脳脊髄液を全身麻酔下で採取し、ビオチン検出キットによってビオチンで標記された新規なＥＰＯ由来ペプチドが血液脳関門を透過して脳脊髄液に入ったか否かを検出し、その結果は図６に示すとおりである。

具体的な操作プロセスは、以下のとおりである。
１． ４％の抱水クロラールでマウスを麻酔する。
２． 頸背部を湿ったガーゼで拭き、背部の毛を切り落として皮膚を露出させる。後頭骨の下の皮膚に矢状の切開部を作り、皮膚を両側に分離して視野を広げる。
３． マウスを腹臥位にして、頭部を体に対して１３５°の角度に配置し、頭部を定位固定装置に固定し、立体顕微鏡下で皮下組織と筋肉を正中線に沿って鈍く切り離し、この角度で、硬脳膜と脊髄は後頭骨の下の切開部でよりはっきりと見ることができる（主な特徴は、白く明瞭な外観、脊髄血管の周期的な脈動、及び隣接する脳脊髄液の領域である）。
４． ニードルプラーは発熱量を３００とし、圧力値を３３０として、毛細管ガラス管を尖った先端に引っ張り、はさみで先端をトリミングして鈍い先端の直径を０．５ｍｍにする。
５． 毛細管ガラス管を負圧装置に接続し、収集システムを予め負圧状態に維持する。
６． 穿刺点の周囲の鮮明な視野を維持するために綿棒で血を拭く。
７． 血管の分布領域を回避し、小脳延髄槽に正対させ、立体顕微鏡下で操作し、先の細いガラス管で硬脳膜をゆっくりと穿刺し、突き破ったら、脳脊髄液がガラス管に流れ込んでくるのが見え、脳脊髄液が５〜２０ｕｌまでゆっくりと上昇したら、より多くの脳脊髄液を集めるために適切に負圧を増加できる。
８． 管内の脳脊髄液がもはや上昇しないか、又は十分になったら、ガラス管をゆっくりと取り出し、脳脊髄液を１．５ｍｌのｅｐ管に移し、遠心分離してから、−８０℃で凍結して保存するか、又は直ちに検出する。

対照群、ビオチン化された本発明のＥＰＯ由来ペプチド群、てんかん及びビオチン化された本発明のＥＰＯ由来ペプチド群のマウスの脳脊髄液をそれぞれ採取し、ビオチン検出キットによってビオチンの濃度を検出した。

結果は、図６に示すとおりであり、本発明のＥＰＯ由来ペプチドを投与した群のマウスの脳脊髄液からビオチンを検出でき、対照群ではビオチンがほとんど存在せず、それらの差異は統計学的に有意である。てんかん発作後の群のマウスの脳脊髄液のビオチンの濃度は単純投与群のそれよりも高いことから、てんかん発作すると、血液脳関門が破壊され、透過性が増加することを示している。つまり、本発明のＥＰＯ由来ペプチドは、血液脳関門を透過し、脳脊髄液に入ることにより、役割を果たすことができる。

実施例５ 一過性中大脳動脈閉塞のマウスモデルにおける本発明のＥＰＯ由来ペプチドによる神経保護作用試験
ＩＣＲマウス（雄、２５−３０ｇ、１８匹、上海斯莱克実験動物有限公司より購入）を使用し、対照群（ＡＣＮ＋Ｍｉｌｌｑ）、０．２ｍｌ／匹）、ＥＰＯ群（５０ｕｇ／ｋｇ）、新規なＥＰＯ由来ペプチド群（Ｔ３、５００ｕｇ／ｋｇ）に群分けし、６匹／群とした。マウスのモノフィラメント法による中大脳動脈閉塞のモデル手術をそれぞれ行い、塩酸ケタミン麻酔の腹腔内注射によりマウスを麻酔し、手術台に固定した。虚血して６０分したら、プラグを外して再灌流させ、溶剤（ＡＣＮ＋Ｍｉｌｌｑ）、ＥＰＯ、Ｔ３をそれぞれ投与した。手術後３日目に神経行動学的スコアを実施したら、マウスを殺処分して灌流し、脳切片を採取して、クレシルバイオレットで染色を行った。結果は図７に示すとおりである。
１． 頸部を消毒し、頸部の中央部で切開し、実体顕微鏡下で左総頸動脈をマイクロピンセットで露出させ、内頸動脈、外頸動脈及び口蓋動脈を分離させ、総頸動脈と内頸動脈を結紮し、２本のひもで外頸動脈に２つの結び目を作り、１本は遠位端にある小間結びであり、もう１本は近位端にある引き結びである。
２． Ｖｅｎｕｓはさみで、外頸動脈を血管の約半分の大きさの小さな開口に切る。
３． 外頸動脈を切り取り、モノフィラメントを外頸動脈から外頸動脈と内頸動脈の分岐部に慎重に逆向きに挿入し、次いで内頸動脈の結び目を緩め、さらにモノフィラメントをわずかな抵抗にぶつかるまで内頸動脈に挿入し、即ち、中大脳動脈の始まりに位置させ、ケージに戻す。
４． 脳虚血して６０分したら、再び麻酔して固定し、総頸動脈、内頸動脈及びモノフィラメント部位を実体顕微鏡下で再度露出させる。
５． モノフィラメントを固定するために外頸動脈の近位端で結紮されているひもをマイクロピンセットで緩め、モノフィラメントをゆっくりと引き抜き、且つ外頸動脈の断端を結紮し、総頸動脈に結紮されているひもを緩めることにより、再灌流を実現する。
６． 頸部の切開部を縫合し、消毒し、ケージに戻して観察する。

結果は図７に示すとおりであり、ＥＰＯ群、本発明のＥＰＯ由来ペプチド群は、神経行動学的スコア及び脳梗塞の体積が対照群より低減し、ＥＰＯ及び本発明のＥＰＯ由来ペプチドが体内で脳虚血を改善し、神経保護作用を有することが分かる。

実施例６ てんかん動物モデルにおける本発明のＥＰＯ由来ペプチドの神経保護作用試験
Ｃ５７／ＢＬ６マウス（雄、２０−２５ｇ、２４匹、上海傑思捷実験動物有限公司より購入）を、生理食塩水群（Ｓａｌｉｎｅ、０．２ｍｌ／匹）、溶剤群（ＡＣＮ＋Ｍｉｌｌｉｑ，０．２ｍｌ／匹）、ＥＰＯ群（５０ｕｇ／ｋｇ）、新規なＥＰＯ由来ペプチド群（Ｔ３，５００ｕｇ／ｋｇ）に群分けし、６匹／群とした。ピロカルピンでてんかんを誘発する１日前、４時間前、２時間前に投与し、てんかん発作の潜伏期間及び発作の重症度を記録した。結果は図８に示すとおりである。
１． ピロカルピンを注射する１日前、４時間前、２時間前に腹腔内注射で投与する。
２． ピロカルピンによって誘発されるコリン作動性反応を減少させるために、スコポラミン（１ｍｇ／ｋｇ）を３０分前に腹腔内注射する。
３． ピロカルピン（３５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、投与時間、発作時間及び発作の重症度を記録する。
４． グレード４以上の発作の後、自発的活動が起こり、てんかん重積状態が続き、モデル化に成功し、モデル化に成功して３０分したら、ジアゼパム（１０ｍｇ／ｋｇ）で発作を終了させる。

Ｒａｃｉｎｅてんかん重積状態の行動学的格付け基準
グレード１： 凝視、口顔部のひきつけ
グレード２： チック反応、単発の痙攣
グレード３： 片側又は両側の前肢クローヌス痙攣
グレード４： 立つ
グレード５： 姿勢の喪失、反復ジャンプ、地面に倒れ、強直・間代発作

結果は図８に示すとおりであり、ＥＰＯ群、本発明のＥＰＯ由来ペプチド群は、てんかんの発作の潜伏期間が生理食塩水群及び溶剤群よりも長くなり、それらの差異は統計学的に有意である。ＥＰＯ群、本発明のＥＰＯ由来ペプチド群が体内で神経保護作用を有することが明らかである。

実施例７
本発明のＥＰＯ由来ペプチドを医薬品に調製する場合、有効量のポリペプチド、及び少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を組み合わせて処方できる。これらの組成物を調製する場合通常、活性成分を賦形剤と混合するか、又は賦形剤で希釈するか、又はカプセルもしくはパッケージの形態で担体に封入される。賦形剤が希釈剤として作用する場合、それは賦形剤、担体又は活性成分の媒質としての固体、半固体又は液体材料であり得る。したがって、医薬物は錠剤、丸剤、散剤、液剤、シロップ剤、無菌注射用液剤などであり得る。適切な賦形剤としてラクトース、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水などが含まれる。製剤にはさらに湿潤剤、乳化剤、防腐剤（例えば、ヒドロキシ安息香酸メチル及びヒドロキシ安息香酸プロピル）、甘味料などを含むことができる。

つまり、本発明の新規なＥＰＯ由来ペプチドは、急性損傷の際にニューロン細胞を保護し、アポトーシスを減少させる。また、マウスに長期間投与しても、赤血球の産生を促進する顕著な副作用はない。さらに、血液脳関門を透過でき、体内で脳虚血損傷の後に脳梗塞の体積を低減させ、脳虚血を改善でき、予め投与すると、てんかんの発作の潜伏期間を延長でき、神経損傷医薬品を製造できることが実証された。本発明のＥＰＯ由来ペプチドについてｉｎ ｖｉｖｏ造血実験より、赤血球の産生を促進する作用がないことが確認された。さらに、本発明者は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗皮質神経細胞のアポトーシス実験により、新規なＥＰＯ由来ペプチドが神経細胞保護作用を有することが証明された。また、動物への投与後、脳脊髄液にビオチンで標識されたポリペプチドの存在を検出したことから、前記新規なＥＰＯ由来ペプチドが血液脳関門を透過して効果を発揮できることが証明された。

Claims (17)

1. アミノ酸配列が配列番号１で示されるエリスロポエチン由来ペプチド。
2. その構造式が以下のとおりであることを特徴とする請求項１に記載のエリスロポエチン由来ペプチド。
   

   
3. 請求項１又は２に記載のエリスロポエチン由来ペプチドを含む医薬品。
4. 請求項１又は２に記載のエリスロポエチン由来ペプチドを含む組成物。
5. 請求項１又は２に記載のエリスロポエチン由来ペプチド、及び賦形剤又は担体を含む医薬組成物。
6. 請求項１又は２に記載のエリスロポエチン由来ペプチドがコードされたヌクレオチド配列を含む核酸分子。
7. 請求項６に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
8. 請求項６に記載の核酸分子又は請求項７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
9. 請求項６に記載の核酸分子又は請求項７に記載の発現ベクターを含むウイルス。
10. ａ）請求項１又は２に記載のエリスロポエチン由来ペプチド
    ｂ）請求項４に記載の組成物、
    ｃ）請求項６に記載の核酸分子、
    ｄ）請求項７に記載の発現ベクター、
    ｅ）請求項８に記載の前記宿主細胞、
    ｆ）請求項９に記載の前記ウイルス
    から選択されるいずれか１項を含むキット。
11. 請求項１又は２に記載のエリスロポエチン由来ペプチドを製造する方法であって、
    １）固相合成法を使用し、ロイシンが結合されている出発樹脂をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに浸漬させ、次いで脱キャッピング剤に浸漬させることで、フルオレニルメチルオキシカルボニルを除去し、ジメチルホルムアミドで洗浄して、
    ２）次のアミノ酸、縮合剤及び塩基を添加し、反応させ、ジメチルホルムアミドで洗浄して、
    ３）脱キャッピング剤を使用してフルオレニルメチルオキシカルボニルを除去し、さらにジメチルホルムアミドで洗浄して、
    ４）ステップ２）及びステップ３）を繰り返し、アミノ酸を順次に結合させる、ステップを含む、
    エリスロポエチン由来ペプチドの製造方法。
12. ステップ２）に記載の前記縮合剤がＯ−ベンゾトリアゾール−Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’−テトラメチルウロニウム・テトラフルオロボラートであることを特徴とする請求項１１に記載のエリスロポエチン由来ペプチドの製造方法。
13. ステップ２）に記載の塩基がモルホリンであることを特徴とする請求項１１に記載のエリスロポエチン由来ペプチドの製造方法。
14. ステップ３）に記載の脱キャッピング剤がヘキサヒドロピリジンとＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドとからなる混合液であることを特徴とする請求項１１に記載のエリスロポエチン由来ペプチドの製造方法。
15. 請求項１又は２に記載のエリスロポエチン由来ペプチドを含有する神経細胞損傷の治療剤。
16. 請求項１又は２に記載のエリスロポエチン由来ペプチドを含有する低酸素脳症の治療剤。
17. 請求項１又は２に記載のエリスロポエチン由来ペプチドを含有するてんかんの治療剤。
    

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