PL224443B1 - Test diagnostyczny do detekcji białka Efb(105-124) - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest test diagnostyczny do detekcji białka Efb(105-124) znajdujący zastosowanie w wykrywaniu białka Efb wydzielanego przez bakterie Staphylococcus aureus. Test diagnostyczny do detekcji białka Efb(105-124) zawiera jako czynnik detekcyjny przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec epitopu białka Efb(105-124) izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci koniugatu fragmentu epitopowego białka Efb(105-124) o sekwencji CIKKEQKLIQAQNLVREFEKT z białkiem nośnikowym - hemocyjnaniną.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest test diagnostyczny do detekcji fragmentu białka Efb(105-124) znajdujący zastosowanie w wykrywaniu białka Efb wydzielanego przez bakterie Staphylococcus aureus.

Białko Efb (ang. extracellular fibrinogen-binding protein) jest zewnątrzkomórkowym białkiem należącym do grupy czynników wirulencji wydzielanych przez bakterie Staphylococcus aureus. Białko to wykazuje zdolność wiązania do składników ludzkiego systemu dopełniacza (białka C3b) oraz do fibrynogenu [Lee L.Y.L., Liang X., Hook, Brown E.L, Journal of Biological Chemistry, 2004, 279, 50710]. Duża zjadliwość szczepu S. aureus wynika z faktu, iż bakterie mają zdolność do deregulacji mechanizmów odpornościowych organizmu gospodarza. Wiele spośród wydzielanych przez S. aureus zewnątrzkomórkowych czynników wirulencji wykazuje właściwości superantygenów, które na drodze nieklasycznej stymulują limfocyty T. Białko Efb wykazuje zdolność wiązania z fibrynogenem, co ułatwia kolonizację bakterii w tkankach. Dodatkowo Efb zdolne jest do blokowania funkcji ludzkiego systemu dopełniacza, wiążąc się z białkiem C3, które odpowiada zarówno za prawidłowe funkcjonowanie całego systemu dopełniacza, jak i stanowi miejsce współdziałania mechanizmów wrodzonej i nabytej odporności immunologicznej [Haviland D.L., Wetsel R.A., Encyclopedia of Molecular Biology, Wiley, 1999; Lambris J.D., Immunol Taday, 1988, 9, 387]. Dane literaturowe wskazują, iż gen Efb obecny jest we wszystkich wyizolowanych szczepach Staphylococcus aureus, natomiast nie stwierdzono jego obecności u przedstawicieli innych gatunków bakterii z rodzaju Staphylococcus [Boden M.K., Flock J.I., J. Clin. Microbiol, 1995, 33, 2347]. Ma to istotne znaczenie z punktu widzenia diagnostyki infekcji bakterii S. aureus, w której kluczowym elementem może być detekcja konstytutywnego, gatunkowo specyficznego białka Efb w płynach ustrojowych organizmu, co jest przedmiotem niniejszego wynalazku.

Epitop białka Efb(105-124) został wybrany ze względu na swą potencjalnie wysoką immunogenność. Epitop Efb(105-124) charakteryzuje się α-helikalną strukturą drugorzędową. Obejmuje aminokwasy od reszty 105 do 124 (zgodnie z numeracją sekwencji gi: 21282769 zdeponowanej w bazie GenBank) o sekwencji CIKKEQKLIQAQNLVREFEKT.

Immunoglobuliny Y są podstawową klasą przeciwciał występujących u ptaków. Pełnią analogiczną funkcję jak ssacze immunoglobuliny G. Przeciwciała IgY nie wykazują interakcji z czynnikiem reumatoidalnym, białkiem A oraz białkiem G, które prowadzą często do otrzymania fałszywie pozytywnych wyników w testach diagnostycznych. Dodatkowo ze względu na dużą odległość filogenetyc zną immunizacja ptaków z wykorzystaniem antygenów pochodzących od ssaków daje wysoką odpowiedź immunologiczną w postaci produkcji specyficznych przeciwciał IgY. Dzięki obecności dużej ilości (około 100-150 mg) przeciwciał IgY w żółtku jaj możliwe jest wykorzystanie ich jako źródła specyficznych przeciwciał bez konieczności skrwawiania zwierząt, stanowi zaletę przy ich produkcji. Ptasie przeciwciała klasy IgY stanowią cenne narzędzie diagnostyczne, ze względu na zalety wynikające z nieinwazyjnej technologii ich produkcji oraz reaktywności odróżniających je od stosowanych w di agnostyce ssaczych przeciwciał IgG.

Test diagnostyczny na bazie immunoglobulin Y specyficznych wobec epitopu białka Efb(105-124) umożliwiających detekcję antygenu specyficznego dla bakterii Staphylococcus aureus nie został dotychczas opisany w literaturze naukowej i patentowej, a także nie jest dostępny handlowo. Doniesienia literaturowe opisują wykorzystanie ssaczych przeciwciał IgG anty-Efb, najczęściej w postaci antysurowicy, pochodzących z organizmów takich jak mysz, królik czy owca [Shannon O, Uekotter A, Flock Jl., Scand J Immunol., 2006, 63, 184; Scarpa M, Piccinini R, Brun P, Grillo A, Palu G, Mengoli C, Dapra V, Castagliuolo I, Zecconi A., J Dairy Res., 2010, 77, 159; Palma M, Wade D, Flock M, Flock JL, J BiolChem., 1998, 273, 13177].

Istotą wynalazku jest test diagnostyczny do detekcji białka Efb(105-124), który zawiera jako czynnik detekcyjny przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec epitopu białka Efb(105-124) izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci koniugatu fragmentu epitopowego białka Efb(105-124) o sekwencji CIKKEQKLIQAQNLVREFEKT z białkiem nośnikowym-hemocyjnaniną.

Korzystnie przeciwciała mają masę cząsteczkową od 175000 do 200000 daltonów.

Po etapie izolacji, przeciwciała poddaje się analizie biochemicznej, której celem jest określenie czystości przeciwciał, stężenia, awidności, mianowanie przeciwciał oraz określenie limitu detekcji epitopu białka Efb(105-124). W trakcie procesu immunizacji analizę biochemiczną przeciwciał przeprowadzono

PL 224 443 B1 dla każdego zebranego jaja w trakcie 15 tygodni. Odpowiedź organizmu kurcząt w postaci produkcji specyficznych przeciwciał pojawiła się w 4 tygodniu od momentu pierwszej iniekcji.

Test diagnostyczny do detekcji białka Efb(105-124), według wynalazku, znajduje zastosowanie w diagnostyce chorób związanych z infekcjami wywołanymi przez bakterie Staphylococcus aureus do których należą zakażenia skóry i tkanek podskórnych (np. czyraki, zakażenia ran pooperacyjnych), zakażenia układowe (np. zapalenia tchawicy, mięśnia sercowego, żył), jak również zakażenia związane z produkowanymi przez bakterię toksynami np. zespół wstrząsu toksycznego.

Zastosowanie przeciwciał specyficznych wobec epitopu białka Efb(105-124) w teście diagnostycznym polega na ich zdolności do specyficznego wiązania z antygenem, którym może być pełne białko Efb lub epitop białka Efb(105-124). Po związaniu specyficznych przeciwciał IgY z białkiem Efb możliwa jest jego pośrednia detekcja stosując dowolne handlowo dostępne przeciwciała anty-IgY (np. królicze przeciwciała IgG anty-IgY) zawierające dowolny znacznik (peroksydaza chrzanowa, fosfataza alkaliczna, biotyna, fluoresceina).

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładach oraz na rysunku na którym:

Fig. 1 przedstawia analizę elektroforetyczną (SDS-PAGE, 4-12%) w warunkach nieredukujących otrzymanych przeciwciał IgY specyficznych wobec epitopu białka Efb(105-124). Barwienie wykonano przy użyciu barwnika Coomassie R 250.

Fig. 2 przedstawia wykres przedstawiający odpowiedź w postaci produkcji specyficznych przeciwciał anty-Efb(105-124) IgY. Strzałkami oznaczono czas immunizacji.

Fig. 3 przedstawia detekcję epitopu białka Efb(105-124) przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY (western blotting).

Fig. 4 przedstawia wykres przedstawiający zdolność przeciwciał IgY do wykrywania epitopu białka Efb(105-124).

Fig. 5 przedstawia wykres mianowania przeciwciał IgY do detekcji epitopu białka Efb(105-124).

Fig. 6 przedstawia zdolność detekcji epitopu białka Efb(105-124) przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY.

Fig. 7 przedstawia miano przeciwciał IgY specyficznych wobec epitopu białka Efb(105-124).

Fig. 8 przedstawia zdolność krzyżowej detekcji białka Efb przez otrzymane przeciwciała IgY specyficzne wobec epitopu białka Efb(105-124).

Fig. 9 przedstawia detekcję białka Efb przez przeciwciała specyficzne wobec epitopu białka Efb(105-124).

P r z y k ł a d 1

1.1 Synteza peptydu.

Peptyd o sekwencji CIKKEQKLIQAQNLVREFEKT otrzymano wykorzystując technikę syntezy na podłożu stałym z użyciem żywicy H-L-Thr(O-tBu)-2-Cl-Trt (0,92 mmol/g). Etapy sprzęgania kolejnych aminokwasów prowadzono z wykorzystaniem strategii Fmoc/Boc przy użyciu HBTU jako czynnika sprzęgającego w obecności DIPEA. Do usunięcia grupy ochronnej Fmoc zastosowano 20% roztwór piperydyny w DMF. W celu odłączenia peptydu od żywicy zastosowano mieszaninę TFA/TIPS/EDT/fenol w stosunku 92,5:2,5:2,5:2,5 (v/v). Otrzymany peptyd oczyszczono z za pomocą techniki HPLC, a masę cząsteczkową oczekiwanego produktu potwierdzono metoda wysokorozdzielczej spektrometrii mas (HRMS).

1.2 Otrzymywanie koniugatu Efb(105-124)-KLH

Do roztworu białka KLH w 10 mM buforze fosforanowym (pH 7,0) dodaje się roztwór GMBS w DMSO. Reakcję prowadzi się 2 h w temperaturze pokojowej, po czym zaktywowane białko KLH-MB oczyszcza z wykorzystaniem chromatografii żelowej. Frakcje zawierające białko łączy się, a następnie rozcieńcza acetonitrylem do końcowego stężenia 25%. Do roztworu KLH-MB dodaje się roztwór peptydu w 50% acetonitrylu delikatnie mieszając. Wartość pH mieszaniny utrzymuje się w granicach 7,2-7,4 przy pomocy 1M wodnego roztworu NaOH. Postęp reakcji monitoruje się przy użyciu chromatografii HPLC.

1.3 Synteza koniugatu Efb(105-124)-BSA

Do roztworu białka BSA w buforze fosforanowym powoli dodaje się roztwór GMBS w DMSO. Reakcję prowadzi się 30 min w temperaturze pokojowej po czym zaktywowane białko BSA-MB oczyszcza się z wykorzystaniem chromatografii żelowej. Frakcje zawierające białko łączy się a następnie rozcieńcza acetonitrylem do końcowego stężenia 25%. Do roztworu BSA-MB dodaje się roztwór peptydu w 50% acetonitrylu. Wartość pH mieszaniny utrzymuje się w granicach 7,0-7,4 przy pomocy 1 M wodnego roztworu NaOH. Postęp reakcji monitoruje się przy użyciu chromatografii HPLC.

PL 224 443 B1

P r z y k ł a d 2

2.1 Przygotowanie antygenu do immunizacji

Koniugat Efb(105-124)-KLH (o sekwencji peptydu przedstawionej wzorem 1) rozpuszcza się tuż przed wykonaniem iniekcji w mieszaninie sterylnego roztworu soli fizjologicznej i pełnego adiuwantu Freund'a przy pierwszej immunizacji oraz niepełnego adiuwantu Freund'a przy dawkach przypominających w stosunku 1:1 (v/v).

2.2 Immunizacja kurcząt

Kury hodowlane rasy White Leghorn immunizuje się, poprzez podanie domięśniowe antygenu w ilości 80 pg/zwierzę (300 μΙ). Immunizację powtarza się po 4 i 8 tygodniach stosując antygen w dawce 40 μg/zwierzę. Grupę kontrolną stanowią kurczęta otrzymujące iniekcję roztworu pełnego adiuwantu Freund'a w soli fizjologicznej w stosunku 1:1 (v/v).

2.3 Pobieranie i przechowywanie materiału biologicznego

Jaja kolekcjonuje się codziennie od następnego dnia po immunizacji przez 15 tygodni. Jaja przechowywane są w temperaturze 4°C do momentu izolacji przeciwciał.

2.4 Izolacja przeciwciał IgY

Jaja przemywa się 50% roztworem izopropanolu. Rozdziela się żółtko od białka, a następnie usuwa się błonę białkową otaczającą worek żółtkowy. Płynną zawartość żółtka rozcieńcza się czterokrotnie buforem fosforanowym (PBS, 10 mM, pH 7,4) z 4,75% dodatkiem glikolu polietylenowego 6000 (PEG 6000). Po dokładnym wymieszaniu całość wiruje się przez 15 min przy 11 000 rpm w 4°C. Otrzymany supernatant filtruje się przez sączek bibułowy, a następnie do przesączu dodaje się PEG 6000 do końcowego stężenia 12%. Po dokładnym wymieszaniu wytrącony osad odwirowuje się przy 11 000 rpm przez 15 min w 4°C. Supernatant odrzuca się, pozostały osad rozpuszcza się w 10 ml buforu fosforanowego (pH 7,4). Do mieszaniny dodaje się glikol polietylenowy do końcowego stężenia 12%. Po dokładnym wymieszaniu, całość wiruje się przy 11 000 rpm przez 15 min w 4°C. Supernatant odrzuca się, a osad zawierający przeciwciała klasy IgY rozpuszcza się w 5 ml buforu fosforanowego. Po wykonaniu analiz biochemicznych przeciwciała przechowuje się w temperaturze -20°C.

2.5 Analiza czystości i stężenia przeciwciał

Stężenie otrzymanych białek oznacza się spektrofotometrycznie (A₂₈₀). Czystość otrzymanych przeciwciał sprawdza się poprzez wykonanie analizy elektroforetycznej SDS-PAGE (4-12%) w warunkach nieredukujących (fig. 1). Czystość otrzymanych przeciwciał zawiera się w zakresie 86-95%.

P r z y k ł a d 3. Analiza odpowiedzi immunologicznej na podany antygen oraz awidność przeciwciał anty-Efb(105-124), w teście ELISA w czasie procesu immunizacji

W celu wykonania analizy odpowiedzi immunologicznej immunizowanych zwierząt na podany antygen zastosowano test ELISA. 96-cio dołkowe płytki mikrotitracyjne pokryto antygenem w postaci koniugatu Efb(105-124)-BSA (50 ng peptydu/100 μθ rozpuszczonym w buforze węglanowym (50 mM, pH 9,6) i inkubowano przez 12 godzin w temperaturze 4°C. Wolne miejsca zablokowano przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym (pH 7,4) zawierającym 0,05% Tween-20 (PBS-T, v/v) w temperaturze 37°C przez 60 min. Po odmyciu czynnika blokującego na płytkę mikrotitracyjną naniesiono przeciwciała specyficzne oraz kontrolne w stukrotnym rozcieńczeniu w 0,5% ro ztworze odtłuszczonego mleka w buforze fosforanowym (pH 7,4) z dodatkiem 0,05% Tween-20 i inkubowano przez 60 min w temperaturze 37°C. W celu oznaczenia awidności przeciwciał część próbek inkubowano z 6 M roztworem mocznika w PBS-T. Detekcję kompleksów epitopu białka Efb(105-124) ze specyficznymi przeciwciałami IgY prowadzono z wykorzystaniem króliczych przeciwciał detekcyjnych anty-IgY sprzężonych z peroksydazą chrzanową. Jako substratu użyto O-fenyIenodiaminy. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (fig. 2).

P r z y k ł a d 4. Analiza specyficzności przeciwciał IgY anty-Efb(105-124) w czasie immunizacji (western blotting)

W celu potwierdzenia specyficzności otrzymanych przeciwciał specyficznych wobec epitopu białka Efb(105-124) wykorzystano technikę western blotting. Po rozdziale elektroforetycznym koniugatu Efb(105-124)-BSA (50 ng peptydu/studzienkę żelu) w warunkach redukujących (SDS-PAGE, 4%-12%) przeprowadzono elektro transfer na membranę nitrocelulozową. Blokowanie wolnych miejsc na membranie nitrocelulozowej wykonano przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym (pH 7,4) z 0,05% (v/v) dodatkiem Tween-20 przez 12 h w temperaturze 4°C. Następnie membranę inkubowano z roztworem otrzymanych przeciwciał IgY specyficznych wobec fragmentu Efb(105-124) lub roztworem kontrolnych przeciwciał IgY rozcieńczonych w stosunku 1:100 (w 0,5%

PL 224 443 B1 roztworze mleka odtłuszczonego w PBS-T) przez 1 h w temperaturze 37°C. Po wypłukaniu membrany buforem PBS-T detekcję związanych z antygenem specyficznych przeciwciał przeprowadza się przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY sprzężonego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonuje się przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (fig. 3).

P r z y k ł a d 5. Limit detekcji epitopu białka Efb(105—124) w teście ELISA

W celu określenia limitu detekcji epitopu białka Efb(105-124) przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY wykorzystano enzymatyczny test immunosorpcyjny fazy stałej (ELISA) w sposób opisany powyżej. W tym celu 96-cio dołkową płytkę mikrotitracyjną opłaszczono koniugatem Efb(105-124)-BSA w różnych stężeniach peptydu mieszczących się w przedziale od 1 pg/ml do 0,03125 pg/ml (100 pl//studzienkę). Po zablokowaniu miejsc wiążących inkubowano z roztworem specyficznych wobec epitopu białka Efb(105-124) przeciwciał IgY (1:100; 0,5% roztworem mleka odtłuszczonego w PBS-T). Detekcję kompleksów Efb(105-124)-specyficzne IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Jako kontroli użyto przeciwciała z grupy kontrolnej w analogicznych rozcieńczeniach. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (fig. 4).

P r z y k ł a d 6. Miano przeciwciał - test ELISA

Miano przeciwciał specyficznych wobec epitopu białka Efb(105-124) określono przy użyciu testu ELISA. Płytkę mikrotitracyjną opłaszczono koniugatem BSA-Efb(105-124) w ilości 100 ng peptydu na studzienkę (12 h, 4°C). Po zablokowaniu wolnych miejsc (5% mleko w PBS-T) płytkę inkubowano z roztworem specyficznych lub kontrolnych przeciwciał IgY w zakresie od 1:100 do 1:100000. Detekcję kompleksów Efb(105-124)-IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylenodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (fig. 5).

P r z y k ł a d 7. Określenie limitu detekcji epitopu białka Efb(105-124) techniką western blotting

W celu określenia limitu detekcji fragmentu białka Efb(105-124) w technice western blotting w pierwszym etapie wykonano rozdział elektroforetyczny (SDS PAGE, 4%-12%) koniugatów Efb(105-124)-BSA w warunkach redukujących w zakresie od 200 ng do 62,5 pg peptydu na studzienkę. Następnie wykonano transfer białek na membranę nitrocelulozową. Po zablokowaniu wolnych miejsc wiążących przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze PBS-T, membranę inkubowano z roztworem otrzymanego specyficznego wobec epitopu Efb(105-124) przeciwciała IgY w rozcieńczeniu 1:100 (0,5% mleko w PBS-T). Detekcję kompleksów epitopu białka Efb(105-124) z przeciwciałami IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (fig. 6).

P r z y k ł a d 8. Miano przeciwciał specyficznych wobec epitopu białka Efb(105-124)

W celu określenia zakresu stężeń otrzymanych przeciwciał klasy IgY w technice western blotting niezbędnego do detekcji epitopu białka Efb(105-124) przeprowadzono rozdział elektroforetyczny koniugatu Efb(105-124)-BSA (50 ng peptydu na studzienkę). Po transferze białek na membranę nitrocelulozową i blokowaniu wolnych miejsc paski membrany inkubowano z roztworami specyficznych wobec epitopu białka Efb(105-124) przeciwciał IgY rozcieńczonych w zakresie od 1:100 do 1:25000 (0,5% odtłuszczone mleko w PBS-T). Po wypłukaniu pasków membrany buforem PBS-T detekcję związanych z antygenem specyficznych przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (fig. 7).

P r z y k ł a d 9. Zdolność przeciwciał specyficznych wobec epitopu białka Efb(105-124) do rozpoznawania natywnego białka Efb

Zdolność przeciwciał specyficznych wobec epitopu białka Efb(105-124) do rozpoznawania pełnego białka Efb potwierdzono testem western blotting. W tym celu przeprowadzono rozdział elektroforetyczny (SDS-PAGE, 4%-12%) białka Efb w warunkach redukujących. Następnie wykonano elektrotransfer białek na nitrocelulozową membranę. Zablokowano wolne miejsca wiążące przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze PBS-T (pH 7,4) i inkubowano z roztworami przeciwciał specyficznych wobec epitopu białka Efb(105-124) w rozcieńczeniu 1:100 (0,5% mleko odtłuszczone

PL 224 443 B1 w PBS-T, pH 7,4). Jako kontrolę negatywną zastosowano roztwór przeciwciał IgY wyizolowanych z nieimmunizowanych kur, natomiast jako kontrolę pozytywną użyto roztworu przeciwciał IgY specyficznych wobec natywnego białka Efb. Oba kontrolne przeciwciała przygotowano w rozcieńczeniu 1:100 (0,5% mleko odtłuszczone w PBS-T, pH 7,4). Detekcję kompleksów białka Efb z przeciwciałami IgY specyficznymi wobec fragmentu epitopowego prowadzono z wykorzystaniem przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (fig. 8).

P r z y k ł a d 10. Detekcja białka Efb z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych wobec epitopu białka Efb(105—124) w teście ELISA

W celu określenia limitu detekcji natywnego białka Efb przez otrzymane przeciwciała IgY spec yficzne wobec epitopu białka Efb(105—124), płytkę mikrotitracyjną opłaszczono białkiem Efb w ilości 100 ng na studzienkę. Następnie inkubowano z roztworem przeciwciał specyficznych wobec epitopu białka Efb(105—124) lub przeciwciał kontrolnych, rozcieńczonych 500-krotnie (0,5% roztwór mleka odtłuszczonego w PBS-T). W celu oznaczenia awidności przeciwciał, część próbek inkubowano z 6 M roztworem mocznika w PBS-T. Detekcję kompleksów Efb-IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Jako kontroli użyto przeciwciała z grupy kontrolnej w analogicznych rozcieńczeniach (fig. 9).

P r z y k ł a d 11. Test diagnostyczny do wykrywania białka Efb w teście ELISA.

Surowicę pacjenta rozcieńcza się 100-krotnie buforem PBS i nanosi na płytkę mikrotitracyjną w dwóch powtórzeniach. Równocześnie przygotowuje się roztwór białka Efb(105-124)-BSA w zakresie stężeń peptydu od 1 pg/ml do 0,03125 pg/ml i nanosi na płytkę w dwóch powtórzeniach. Płytkę inkubuje się następnie w temperaturze 37°C przez 1 h po czym płucze, blokuje wolne miejsca wiążące przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze PBS-T. Po 2 godzinnej inkubacji w 37°C płytkę płucze się i inkubuje z roztworem specyficznych przeciwciał IgY otrzymanych po immunizacji koniugatem Efb(105-124)-KLH. Płytkę inkubuje się w 37°C przez 1 h, płucze a następnie inkubuje z dowolnym przeciwciałem specyficznym wobec IgY zawierającym dowolny enzym znacznikowy (peroksydazą chrzanowa, fosfataza alkaliczna) lub znacznik fluorescencyjny (fluoresceina). Po 1 h inkubacji w temperaturze 37°C płytkę płucze się i dodaje dowolny substrat enzymatyczny lub, w przypadku zastosowania znacznika fluorescencyjnego, analizę wykonuje się spektrofluorymetrycznie. Wynik uzyskany dla badanej próbki porównuje się z wynikami krzywej standardowej i na tej podstawie potwierdza się obecność białka Efb oraz określa jego ilość.

P r z y k ł a d 12. Test diagnostyczny do wykrywania białka Efb w teście western blotting.

Próbkę badanej surowicy rozcieńcza się 100-krotnie, a następnie poddaje się rozdziałowi elektroforetycznemu (SDS PAGE) w warunkach redukujących. Równolegle rozdziałowi poddaje się białko Efb (50 ng/studzienkę) oraz białko Efb(105-124)-BSA (50 ng peptydu/studzienkę). Po wykonaniu elektroforezy białka przenosi się na membranę nitrocelulozową, blokuje wolne miejsca wiążące 5% roztworem mleka odtłuszczonego w buforze PBS-T (2 h, 37°C) a następnie membranę płucze się buforem PBS-T. Wypłukaną membranę inkubuje się następnie z roztworem przeciwciał IgY otrzym anych po immunizacji koniugatem Efb(105-124)-KLH (1 h, 37°C). Detekcję kompleksów białka Efb lub jego fragmentu z przeciwciałami IgY prowadza się z wykorzystaniem dowolnych przeciwciał zawierających dowolny enzym znacznikowy (peroksydazą chrzanowa, fosfataza alkaliczna) lub znacznik fluorescencyjny (fluoresceina) przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego lub chromogennego substratu, lub światła o odpowiedniej długości fali wzbudzenia dla znaczników fluorescencyjnych. Na podstawie uzyskanych wyników określa się, czy analizowana próbka zawiera białko Elb lub fragmenty jego degradacji.

Claims (2)

1. Test diagnostyczny do detekcji białka Efb(105-124), znamienny tym, że zawiera jako czynnik detekcyjny przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec epitopu białka Efb(105-124) izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci koniugatu fragmentu

PL 224 443 B1 epitopowego białka Efb(105-124) o sekwencji CIKKEQKLIQAQNLVREFEKT z białkiem nośnikowym-hemocyjnaniną.

2. Test według zastrz. 1, znamienny tym, że przeciwciała mają masę cząsteczkową od 175000 do 200000 daltonów.

Rysunki

Fig. 3 kDa <- IgY anty-Efbf105-124)

150 lig. t

Fig .2

Odpowiedź w postaci produkcji specyficznych przeciwciał IgY anty-Efb epitop I

Efb(105~124)-B$A

1.0· *- PBS-T - 6M mocznik

7 8 9

Tygodnie immunizacji

PL 224 443 B1

Limit detekcji epitopu biała Efb {105-124) przez specyficzne przeciwciała IgY