PL227201B1 - Przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec peptydowego składnika sciany komórkowej bakterii oraz ich zastosowanie - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec peptydowego elementu ściany komórkowej bakterii oraz ich zastosowanie.

Immunoglobuliny Y są głównymi przeciwciałami wytwarzanymi u zwierząt jajorodnych i uznawane są za ewolucyjnych przodków ssaczych przeciwciał IgG, jak i IgE. Funkcjonalnie przeciwciała IgY przypominają ssacze IgG, jednak strukturalnie są bardziej podobne do IgE. Znaczące ilości specyficznych przeciwciał transportowane są do żółtek kurzych jaj co pozwala na ich nieinwazyjną izolację i stanowi istotną zaletę technologii IgY w porównaniu do klasycznych metod izolacji przeciwciał z surowicy ssaków. Dodatkowo wydajność produkcji specyficznych immunoglobulin klasy IgY u kur jest dużo wyższa w porównaniu do ssaków. Powyższe cechy technologii IgY wraz z niskimi kosztami produkcji decydują o ekonomice produkcji przeciwciał klasy Y [Schade R, Calzado EG, Sarmiento R, Chacana PA, Porankiewicz-Asplund J, Terzolo HR. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine. Altern Lab Anim., 2005, 33, 129-54], Dotychczas w literaturze naukowej opisanych zostało wiele protokołów immunizacji oraz metod izolacji przeciwciał IgY z żółtek jaj ptaków [Tan S. Mohamedali HA, Kapur A, Lukjanenko L, Baker MS. A novel, cost-effective and efficient chicken egg IgY purification procedure. J Immunol Methods, 2012, 380, 73-6], znanych jest też wiele przykładów ich wykorzystania w badaniach naukowych, diagnostyce, ale także jako środków profilaktycznych i terapeutycznych. [Schade R, Calzado EG, Sarmiento R, Chacana PA, Porankiewicz-Asplund J, Terzolo HR. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine. Altern Lab Anim, 2005, 33, 129-54],

Istnieją liczne doniesienia literaturowe dotyczące otrzymywania specyficznych przeciwciał IgY skierowanych przeciwko antygenom bakteryjnym, wśród których wymienić można przeciwciała specyficzne wobec H. pylori, E coli, S. mutans, S. aureus, L. monocytogenes czy bakterii z rodzaju Salmonella. Badania z wykorzystaniem tych przeciwciał potwierdziły ich aktywność przeciwbakteryjną oraz użyteczność np. w procesie pasywnej immunizacji zwierząt dającej ochronę przed infekcjami bakteryjnymi [Spillner E, Braren I, Greunke K, Seismann H, Blank S, du Plessis D. Avian IgY antibodies and their recombinant equivalents in research, diagnostics and therapy. Biologicals, 2012, 40, 313-22],

Mechanizm hamowania podziałów komórek bakteryjnych in vitro przez specyficzne immunoglobuliny Y nie został w pełni poznany. Jednym z proponowanych mechanizmów inhibicji wzrostu bakterii w podłożach płynnych jest aglutynacja komórek bakteryjnych sieciowanych przeciwciałami, skutkująca zmniejszeniem ich ruchliwości, zdolności do pobierania składników odżywczych oraz rozmnażania. Efekt antybakteryjny IgY obserwowany w hodowlach na podłożach stałych wynika z oddziaływania immunoglobulin ze składnikami powierzchni komórek bakteryjnych, będącymi czynnikami kluczowymi dla wzrostu i podziału bakterii m.in. fragmentami lipopolisacharydu czy peptydoglikanu [ Sunwoo HH, Lee EN, Menninen K, Suresh MR, Sim JS. Growth Inhibitory Effect of Chicken Egg Yolk Antibody (IgY) on Escherichia coli O157:11, JFood Sci, 2002, 67, 1486-1494], Jedynym z immunodominujących fragmentów peptydoglikanu jest C-końcowy dipeptyd D-alanylo-D-alanina, który ma kluczowe znaczenie w procesie sieciowania peptydoglikanu, a tym samym w procesie syntezy ściany komórkowej bakterii [Bokisch VA, Chiao JW, Bernstein D, Krause RM, Homogeneous Rabbit 7s Anti-IgG With Antibody Specificity For Peptidoglycan, J Exp Med, 1973, 138, 1184-1193]. Co istotne, w przeciwieństwie do innych antygenów bakteryjnych charakterystycznych tylko dla określonych szczepów bakterii, dipeptyd D-alanylo-D-alanina występuje tak u bakterii Gram-dodatnich, jak i Gram-ujemnych.

Nieliczne doniesienia literaturowe opisują ssacze przeciwciała klasy IgG skierowane względem peptydowych składników bakteryjnego peptydoglikanu, pochodzące z organizmów owcy [Sandhu S, Schouten JA, Thompson J, Davis M, Bugg TD. Detection of Staphylococcus aureus cell walls by enzyme-linked immunoassay using antibodies prepared from a semi-synthetic peptidoglycan precursor. Analyst, 2012, 137, 1130-6] czy królików [Wergeland HI, Endresen C. Antibodies to various bacterial cell wall peptidoglycans in human and rabbit sera. J Clin Microbiol, 1987, 25, 540-5],

Dotychczas nie opisano, ani w literaturze naukowej, ani patentowej przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec peptydowego elementu ściany komórkowej bakterii.

PL 227 201 B1

Istotą wynalazku są przeciwciała poliklonalne klasy Y specyficzne wobec peptydu L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci koniugatów peptydów z białkiem nośnikowym hemocyjaniną.

Istotą wynalazku jest również zastosowanie przeciwciał poliklonalnych klasy Y specyficznych wobec peptydu L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala jako środka przeciwbakteryjnego. Wynalazek dotyczy również zastosowania przeciwciał poliklonalnych klasy Y specyficznych wobec peptydu L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala jako środka terapeutycznego w szczególności do pasywnej immunizacji.

Wyizolowane przeciwciała według wynalazku poddaje się ewaluacji biochemicznej w celu określenia ich czystości, stężenia, miana przeciwciał, specyficzności wobec antygenu oraz awidności. W trakcie procesu immunizacji analizę przeciwciał przeprowadzi się dla każdego pobranego jaja w okresie 19 tygodni. Odpowiedź organizmu w postaci produkcji specyficznych przeciwciał IgY pojawia się po 4 tygodniach od momentu pierwszej immunizacji.

Wykorzystanie otrzymanych przeciwciał IgY anty-L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala polega na ich zdolności do specyficznego wiązania z peptydowym składnikiem ściany komórek bakteryjnych. Dzięki związaniu przeciwciał IgY do antygenu dochodzi do zahamowania podziałów komórkowych, co prowadzi do obserwowanego efektu przeciwbakteryjnego.

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładach jego wykonania.

P r z y k ł a d 1

1.1 Przygotowanie antygenu do immunizacji

Koniugaty peptydu z hemocyjaniną rozpuszcza się tuż przed wykonaniem iniekcji w mieszaninie sterylnego roztworu soli fizjologicznej i pełnego Adjuwantu Freund'a (przy pierwszej immunizacji) lub niepełnego Adjuwantu Freund'a (przy dawkach przypominających) w stosunku 1:1 (v/v).

1.2 Immunizacja kurcząt

Kury hodowlane rasy White Leghorn immunizuje się, poprzez podanie domięśniowe antygenu w ilości 100 pg/zwierzę (300 pl). Immunizację powtarza się po 3 i 7 tygodniach, podając 50 pg/zwierzę antygenu. Grupę kontrolną stanowią kury otrzymujące iniekcję roztworu pełnego adjuwantu Freund'a w soli fizjologicznej (1:1, v/v, 300 pl/zwierzę).

Jaja kolekcjonuje się codziennie od następnego dnia po immunizacji przez 19 tygodni. Jaja przechowywane są w temperaturze 4°C do momentu izolacji przeciwciał.

P r z y k ł a d 2

Izolacja przeciwciał IgY

Jaja przemywa się 50% roztworem izopropanolu. Rozdziela się żółtko od białka, a następnie usuwa się błonę białkową otaczającą worek żółtkowy. Płynną zawartość żółtka rozcieńcza się pięciokrotnie buforem fosforanowym (PBS, 10 mM, pH 7.4). Do mieszaniny dodaje się glikol polietylenowy 6000 (PEG 6000) tak, aby końcowe stężenie wynosiło 3.5%. Po dokładnym wymieszaniu, całość wiruje się przez 15 min przy 4700 rpm w 4°C. Otrzymany supernatant filtruje się przez sączek bibułowy, a następnie do przesączu dodaje się PEG 6000 do końcowego stężenia wynoszącego 12%. Po dokładnym wymieszaniu wytrącony osad odwirowuje się przy 4700 rpm przez 15 min w 4°C. Supernatant odrzuca się a pozostały osad rozpuszcza się w 10 ml buforu PBS. Do mieszaniny dodaje się PEG 6000 do końcowego stężenia 12%. Po dokładnym wymieszaniu, całość wiruje się przy 4700 rpm przez 15 min w 4°C. Supernatant odrzuca się, a osad zawierający przeciwciała klasy Y rozpuszcza się w 5 ml buforu PBS. Po wykonaniu analiz biochemicznych przeciwciała przechowuje się w temperaturze - 20°C.

P r z y k ł a d 3

Oczyszczanie przeciwciał IgY

3.1 Oczyszczanie przeciwciał metodą chromatografii kolumnowej

Kolumnę chromatograficzną wypełnia się zawiesiną złoża Sephadex G-200 w buforze fosforanowym PBS (pH 7.4). Na czoło kolumny nanosi się 0.5 mg izolatu przeciwciał w PBS i zbiera frakcje o objętości około 5 ml. Frakcje białkowe identyfikuje się za pomocą odczynnika Coomassie. Frakcje białkowe analizuje się przy zastosowaniu elektroforezy (SDS-PAGE, warunki nieredukujące) oraz barwienia srebrem, a następnie wybrane frakcje łączy się. Do wizualizacji wyników wykorzystano system do obrazowania molekularnego zaopatrzony w kamerę CCD (Rys. 1).

PL 227 201 B1

Rys. 1. Analiza elektroforetyczna (SDS-PAGE, 4-12%) w warunkach nieredukujących przeciwciał IgY specyficznych wobec peplydu L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala, oczyszczonych metodą chromatografii kolumnowej. Barwienie wykonano metodą barwienia srebrem.

3.2 Przygotowanie kolumny powinowactwa do oczyszczania przeciwciał anty-L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala IgY

Kolumnę powinowactwa przygotowuje się, przyłączając peptyd L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala do złoża które stanowi sefaroza aktywowana CNBr. Nośnik aktywuje się roztworem HCl (1 mM, pH 3.0) a następnie nanosi peptyd L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala (1.81 mg na 100 mg złoża) w buforze do sprzęgania (0.1 M NaHCO3, 0.5 M NaCl, pH 8.3) i inkubuje przez noc w temperaturze 4°C. Złoże przepłukuje się buforem do sprzęgania a następnie inkubuje z buforem Tris-HCl (0.1 M Tris-HCl, 0.5 M NaCl, pH 8.0) przez 2h w temperaturze pokojowej. Następnie złoże naprzemiennie przemywa się buforem o niskim pH (0.1 M CH3COOH, 0.1 M CH3COONa, pH 4) oraz buforem o wysokim pH (0.1 M Tris-HCl, 0.5 M NaCl, pH 8.0). Kolumnę ze złożem przechowuje się w buforze fosforanowym (10 mM PBS, pH 7.4).

3.3 Izolacja specyficznych przeciwciał anty-L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala metodą chromatografii powinowactwa.

Na przygotowane złoże nanosi się około 3 mg izolatu specyficznych przeciwciał anty-L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala IgY w buforze PBS (pH 7.4). Po godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej, niezwiązane ze złożem przeciwciała usuwa się grawitacyjnie, a złoże przepłukuje dziesięciokrotnie buforem PBST (10 mM PBS, 0.1% Tween 20) i dwukrotnie buforem PBS. Specyficzne przeciwciała IgY wymywa się ze złoża przy użyciu buforu cytrynianowego (20 mM, pH 2.5) w ilości 500 μΙ i neutralizuje każdą frakcję przy użyciu 1 M Tris-base (pH 8.5). Obecność przeciwciał w zebranych frakcjach potwierdza się przy zastosowaniu elektroforezy (SDS PAGE, warunki nieredukujące) oraz metody barwienia srebrem. Wizualizację wyników przeprowadzono w świetle białym dzięki systemowi do obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (Rys. 2).

PL 227 201 B1

Rys. 2. Analiza elektroforetyczna (SDS-PAGE, 4-12%) w warunkach nieredukujących przeciwciał IgY specyficznych wobec peptydu L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala, oczyszczonych metodą chromatografii powinowactwa. (FT) frakcja IgY niezwiązana ze złożem, (W1 i W10) frakcje 1 i 10 po płukaniu złoża buforem PBST, (PBS1) frakcja po płukaniu buforem PBS, (A1-A10) frakcje monospecyficznych IgY anty-L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala.

3.4 Analiza immunoreaktywności przeciwciał anty-L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala IgY oczyszczonych metodą chromatografii powinowactwa.

Dla potwierdzenia immunoreaktywności przeciwciał IgY oczyszczonych na przygotowanej kolumnie powinowactwa wykonuje się doświadczenie z wykorzystaniem techniki dot blot. Na membranę nitrocelulozową nanosi się peptyd L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala (200 ng peptydu/100 μΙ) w postaci koniugatu z BSA w buforze PBS. W następnym etapie wolne miejsca wiążące blokuje się 5% roztworem odtłuszczonego mleka w buforze PBST (12 h, 4°C). Po trzykrotnym wypłukaniu membrany buforem PBST detekcję peptydu prowadzi się z wykorzystaniem otrzymanych po kolumnie powinowactwa frakcji zawierających specyficzne przeciwciała anty-L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala IgY oraz nieoczyszczonych przeciwciał IgY. W tym celu paski membrany inkubuje się 1h w temperaturze 37°C z roztworami przeciwciał pierwszorzędowych (frakcji FT, W1, W10, A1, A2 oraz przeciwciał nieoczyszczonych i kontrolnych) w stężeniu 2 μg/ml, przygotowanych w 0.5% roztworze odtłuszczonego mleka w buforze PBST. Następnie membranę płucze się trzykrotnie buforem PBST. Detekcję kompleksów koniugatu białkowego z przeciwciałami IgY prowadzi się przy użyciu przeciwciała króliczego IgG specyficznego wobec immunoglobulin kurzych skoniugowanego z peroksydazą chrzanową (HRP) przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analiza obrazów wykonana została przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (Rys. 3).

Rys. 3. Analiza specyficzności przeciwciał IgY uzyskanych podczas oczyszczania na kolumnie powinowactwa. (FT) frakcja IgY niezwiązana ze złożem, (W1 i W10) frakcja 1 i 10 po płukaniu złoża buforem PBST, (A1 i A2) frakcja monospecyficznych przeciwciał IgY, (klgY) przeciwciała kontrolne.

P r z y k ł a d 4

Analiza odpowiedzi immunologicznej na podany antygen w teście ELISA w czasie procesu immunizacji.

W celu wykonania analizy odpowiedzi immunologicznej immunizowanych zwierząt na podany antygen zastosowano test immunoenzymatyczny fazy stałej ELISA. 96-cio dołkową płytkę mikrotitracyjną pokryto antygenem w postaci koniugatu albuminy wołowej (BSA) z peptydem L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala (50 ng peptydu/100 μθ rozpuszczonym w buforze węglanowym (50 mM, pH 9.6) i inkubowano przez 5 godzin w temperaturze 37°C. Po wypłukaniu płytki buforem fosforanowym (10 mM, pH 7.4) z 0.05% (v/v) dodatkiem detergentu Tween-20 (PBST) wolne miejsca wiążące zablokowano przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze PBST inkubując płytkę w temperaturze 4°C przez 12 godzin. Po odmyciu czynnika blokującego na płytkę mikrotitracyjną naniesiono przeciwciała specyficzne wobec peptydu L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala oraz kontrolne IgY w stukrotnym rozcieńczeniu w 0.5% roztworze odtłuszczonego mleka w buforze PBST i inkubowano przez 1h w temperaturze 37°C. Detekcję kompleksów koniugatu BSA-L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala ze specyficznymi przeciwciałami IgY prowadzono z wykorzystaniem króliczych przeciwciał detekcyjnych anty-IgY sprzężonych z peroksydazą chrzanową. Jako chromogenicznego substratu użyto O-fenylenodiaminy. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Dla każdego tygodnia immunizacji pomiar przeprowadzono dla trzech izolatów przeciwciał anty-L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala IgY (Rys. 4).

PL 227 201 B1

Rys. 4. Wykres przedstawiający odpowiedź w postaci produkcji specyficznych wobec peptydu L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala przeciwciał IgY. Strzałkami oznaczono czas immunizacji. Abs* - przedstawione wartości absorbancji po odjęciu wartości absorbancji otrzymanych dla kontrolnych przeciwciał IgY.

P r z y k ł a d 5

Analiza awidności przeciwciał anty-L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala IgY w trakcie procesu immunizacji w teście ELISA.

W celu określenia awidności otrzymanych przeciwciał specyficznych wobec peptydu L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala wykonano immunoenzymatyczny test ELISA w sposób opisany powyżej. Studzienki płytki mikrotitracyjnej opłaszczono koniugatem BSA-L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala w ilości ng peptydu/100 μ! w buforze węglanowym (50 mM, pH 9.6). Po inkubacji (5h, 37°C) i wypłukaniu płytki buforem PBST wolne miejsca wiążące zablokowano 5% roztworem odtłuszczonego mleka w PBST (12 h, 4°C). Po odpłukaniu czynnika blokującego, płytkę inkubowano (1h, 37°C) z roztworami specyficznych wobec peptydu L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala przeciwciał IgY lub przeciwciał kontrolnych rozcieńczonych 100-krotnie 0.5% roztworem odtłuszczonego mleka w PBST. Następnie dla każdego z badanych przeciwciał przeprowadzono inkubację z 6 M roztworem mocznika w PBST przez 10 min w temperaturze pokojowej. Detekcję kompleksów antygen-przeciwciało IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (Rys. 5).

Rys. 5. Wykres przedstawiający awidność przeciwciał IgY specyficznych wobec peptydu L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala w czasie trwania immunizacji. Abs* - przedstawione wartości absorbancji po odjęciu wartości absorbancji otrzymanych dla kontrolnych przeciwciał IgY.

PL 227 201 B1

P r z y k ł a d 6

Limit detekcji peptydu L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala

6.1 Limit detekcji peptydu L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala przez przeciwciała IgY w teście ELISA

W celu określenia limitu detekcji peptydu L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY wykorzystano enzymatyczny test immunosorpcyjny fazy stałej (ELISA) w sposób opisany powyżej. W tym celu 96-cio dołkową płytkę mikrotitracyjną opłaszczono koniugatem BSA-L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala w buforze węglanowym o stężeniach peptydu w przedziale od 2500 ng/ml do 1 ng/ml (100 μΐ/studzienkę). Płytkę wypłukano, wolne miejsca wiążące zablokowano 0.5% roztworem hydrolizatu kazeiny w PBST, a następnie inkubowano z roztworem specyficznego wobec peptydu L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala lub kontrolnego przeciwciała IgY oczyszczonego metodą chromatografii kolumnowej (Sephadex G-200) o stężeniu 50 μg/ml w 0.5% roztworze odtłuszczonego mleka w buforze PBST. Detekcję kompleksów koniugat BSA-L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala przeciwciało IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (Rys. 6).

Rys. 6. Limit detekcji peptydu L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala przez specyficzne przeciwciała IgY. Wykres przedstawia wartości Indeksu ELISA (stosunek średniej absorbancji specyficznych IgY do średniej absorbancji kontrolnych IgY) od stężenia antygenu.

6.2 Limit detekcji peptydu L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala przez przeciwciała IgY w technice dot błot W celu określenia limitu detekcji peptydu L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala w technice dot blot w pierwszym etapie membranę nitrocelulozową opłaszczono koniugatem BSA-L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala, w ilości od 0.05 ng do 200 ng peptydu na studzienkę (100 μl/studzienkę) w buforze PBS. Po zablokowaniu wolnych miejsc wiążących przy użyciu 5% roztworu odtłuszczonego mleka w buforze PBST (12 h, 4°C) membranę inkubowano z roztworem otrzymanego specyficznego wobec peptydu L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala przeciwciała IgY oczyszczonego metodą chromatografii powinowactwa w stężeniu 2 μg/ml w 0.5% odtłuszczonym mleku w PBST (37°C, 1h). Jako kontroli użyto przeciwciała IgY izolowanego od zwierząt z grupy kontrolnej w analogicznym stężeniu. Detekcję kompleksów koniugatu białkowego z przeciwciałami IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (Rys. 7).

PL 227 201 B1

Rys. 7. Limit detekcji peptydu L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY. slgY - specyficzne IgY, klgY - kontrolne IgY.

P r z y k ł a d 7

Miano przeciwciał anty-L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala IgY 7.1 Miano przeciwciał anty-L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala IgY w teście ELISA

Miano przeciwciał specyficznych wobec peptydu L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala określono przy użyciu testu ELISA w sposób opisany powyżej. Płytkę mikrotitracyjną opłaszczono koniugatem BSA-L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala w ilości 50 ng peptydu na studzienkę (100 μΙ/studzienkę) w buforze węglanowym. Następnie wolne miejsca wiążące zablokowano 0.5% roztworem hydrolizatu kazeiny w buforze PBST. W kolejnym etapie płytkę inkubowano z roztworami specyficznego wobec peptydu L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala przeciwciała, oczyszczonego metodą chromatografii kolumnowej (Sephadex G-200), w stężeniach 50 μο/ml - 0.1 μg/ml sporządzonych w 0.5% roztworze odtłuszczonego mleka w buforze PBST. Detekcję kompleksów koniugatów białkowych z przeciwciałami IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Jako kontroli użyto przeciwciała otrzymanego od zwierząt z grupy kontrolnej w analogicznych stężeniach. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (Rys. 8).

Rys. 8. Wykres mianowania przeciwciał IgY w detekcji peptydu L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala. Wykres przedstawia wartości Indeksu ELISA (stosunek średniej absorbancji specyficznych przeciwciał IgY do średniej absorbancji kontrolnych IgY) od stężenia przeciwciał.

PL 227 201 B1

7.2 Miano przeciwciał specyficznych wobec peptydu L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala w teście dot blot. W celu określenia miana otrzymanych przeciwciał anty-L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala IgY wykonano analizę techniką dot blot w sposób opisany powyżej. Po opłaszczeniu membrany nitro celulozowej koniugatem BSA-L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala w ilości 200 ng peptydu na studzienkę (100 μΐ/studzienkę) w buforze PBS i zablokowaniu wolnych miejsc 5% roztworem odtłuszczonego mleka w buforze PBST (12 h, 4°C), paski membrany inkubowano (1h, 37°C) z roztworami specyficznego wobec peptydu L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala przeciwciała IgY (oczyszczonego metodą chromatografii powinowactwa), użytymi w stężeniach w zakresie od 0.01 do 5 μg/ml przygotowanymi w 0.5% mleku w PBST. Jako kontroli użyto przeciwciała pochodzącego od zwierząt z grupy kontrolnej w analogicznych stężeniach. Po wypłukaniu pasków membrany buforem PBST detekcję związanych z antygenem specyficznych przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (Rys. 9).

Rys. 9. Miano przeciwciał IgY specyficznych wobec peptydu L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala. slgY - specyficzne IgY, klgY - kontrolne IgY.

P r z y k ł a d 8

Określenie zdolności przeciwciał IgY do detekcji komórek Staphylococcus aureus W celu określenia zdolności otrzymanych przeciwciał IgY do detekcji komórek S. aureus wykorzystano test immunoenzymatyczny fazy stałej ELISA. W tym celu 96 dołkową płytkę mikrotitracyjną opłaszczono szeregiem rozcieńczeń (w zakresie od 100x do 50000x), zawiesiny komórek S.aureus w buforze węglanowym (50 mM, pH 9.6) i inkubowano 12 h w temperaturze 4°C. Po wypłukaniu płytki w buforze PBST wolne miejsca wiążące zablokowano 5% roztworem PEG6000 w PBST (12 h, 4°C). Następnie płytkę inkubowano z roztworem specyficznego wobec peptydu L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala przeciwciała IgY, oczyszczonego na złożu Sephadex G-200, w stężeniu równym 20 μg/ml sporządzonym w 0.5% odtłuszczonym mleku w PBST (1h, 37°C). Detekcję kompleksów komórek bakteryjnych z IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Jako kontroli użyto przeciwciała izolowanego od zwierząt z grupy kontrolnej w analogicznym stężeniu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (Rys. 10).

PL 227 201 B1

Rys. 10. Wykres przedstawiający detekcję komórek Staphylococcus aureus przez specyficzne przeciwciała anty-L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala IgY.

P r z y k ł a d 9

Określenie miana przeciwciał IgY w detekcji komórek bakteryjnych Staphylococcus aureus W celu określenia miana otrzymanych przeciwciał IgY w detekcji komórek S. aureus wykonano test ELISA w sposób opisany powyżej. W tym celu płytkę mikrotitracyjną opłaszczono roztworem zawiesiny komórek S. aureus w rozcieńczeniu 100x w buforze węglanowym (12 h, 4°C). Po zablokowaniu wolnych miejsc wiążących (5% PEG6000 w buforze PBST) płytkę inkubowano z roztworami specyficznego wobec peptydu L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala przeciwciała IgY, oczyszczonego na złożu Sephadex G-200, użytymi w stężeniach w zakresie od 20 do 0.1 μg/ml w 0.5% odtłuszczonym mleku w PBST (1h, 37°C). Detekcję kompleksów komórek bakteryjnych z IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Jako kontroli użyto przeciwciała izolowanego od zwierząt z grupy kontrolnej w analogicznym stężeniu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (Rys. 11).

Rys. 11. Mianowanie specyficznych przeciwciał anty-L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala IgY w detekcji komórek Staphylococcus aureus.

PL 227 201 B1

P r z y k ł a d 10

Właściwości przeciwbakteryjne przeciwciał anty-L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala IgY Właściwości przeciwbakteryjne przeciwciał IgY specyficznych względem peptydu L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala badano, przez pomiar gęstości optycznej (OD595) w czasie dla hodowli komórkowej Staphylococcus aureus. W płynnym podłożu LB założono hodowlę bakteryjną i po osiągnięciu gęstości optycznej równej 0.1 przeniesiono ją do studzienek mikropłytki (100 μl/studzienkę). Następnie, dodano po 100 μl roztworów specyficznych albo kontrolnych przeciwciał IgY (oczyszczonych metodą chromatografii kolumnowej) lub wankomycyny w stężeniu 400 μg/ml w buforze PBS lub samego buforu PBS. Płytkę inkubowano w 37°C, prowadząc odczyt OD przy λ=595 nm za pomocą czytnika mikropłytek w regularnych odstępach czasu. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (Rys. 10).

Rys. 10. Wykres inhibicji wzrostu komórek S. aureus przez anty-L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala lgY. OD* wartości OD pomniejszone o gęstość optyczną w czasie 0.

Claims (3)

1. Przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec peptydu L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci koniugatu peptydu z białkiem nośnikowym hemocyjaniną.

2. Przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec peptydu L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala do zastosowania jako środek przeciwbakteryjny.

3. Przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec peptydu L-Cys-L-Ala-L-Ala-D-Ala-D-Ala do zastosowania jako środek terapeutyczny w szczególności do pasywnej immunizacji.