PL222576B1 - Przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec białka Efb, sposób ich wytwarzania oraz ich zastosowanie - Google Patents

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 222576 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 398829 (22) Data zgłoszenia: 16.04.2012 (51) Int.Cl.

C07K 16/02 (2006.01) C07K 16/12 (2006.01)

Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy

Przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec białka Efb, sposób ich wytwarzania oraz ich zastosowanie (73) Uprawniony z patentu:

POLITECHNIKA WROCŁAWSKA, Wrocław, PL UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCŁAWIU, Wrocław, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono:

08.10.2012 BUP 21/12 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:

31.08.2016 WUP 08/16 (72) Twórca(y) wynalazku:

MARCIN SIEŃCZYK, Wrocław, PL AGNIESZKA ŁUPICKA, Milicz, PL KAMILA BOBREK, Łaziska Górne, PL RENATA GRZYWA, Wrocław, PL MACIEJ WALCZAK, Wrocław, PL ERIC L. BROWN, Houston, US DARIA NOWAK, Oława, PL JOANNA ONIŚKIEWICZ, Nysa, PL JÓZEF OLEKSYSZYN, Siechnice, PL ANDRZEJ GAWEŁ, Wrocław, PL TADEUSZ STEFANIAK, Wrocław, PL (74) Pełnomocnik:

rzecz. pat. Katarzyna Paprzycka

PL 222 576 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec białka Efb, sposób ich wytwarzania oraz zastosowanie przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec białka Efb w immunoterapii ludzi i zwierząt przeciw infekcjom Staphylococcus aureus, zarówno pasywnej immunizacji jak i zastosowań w infekcjach zewnętrznych.

Białko Efb należy do grupy czynników wirulencji wydzielanych przez bakterie Staphylococcus aureus. To zewnątrzkomórkowe białko wykazuje zdolność wiązania do składników ludzkiego systemu dopełniacza (białka C3b) oraz do fibrynogenu. Ostatnie doniesienia literaturowe udowadniają także, iż białko Efb wykazuje cechy superantygenu [Brown E., Nishiyama Y., Dunkle J.W., Aggarwal S., Planque S., Watanabe K., Csencsits-Smith K., Bowden G.M., Kaplan S.L., Paul S., Journal of Biological Chemistry, 2012]. Zdolność S. aureus do kolonizowania tkanek i rozwoju infekcji wynika ze zdolności bakterii do manipulacji bądź ucieczki przed mechanizmami immunologicznymi organizmu gospodarza. Wiele spośród wydzielanych przez S. aureus zewnątrzkomórkowych czynników wirulencji wykazuje właściwości superantygenów, które stymulują limfocyty T. Białko Efb wykazuje z jednej strony zdolność wiązania z fibrynogenem, co ułatwia kolonizację bakterii w tkankach. Z drugiej strony zdolne jest do blokowania funkcji ludzkiego systemu dopełniacza, a dokładnie wiąże się z białkiem C3, które nie tylko odpowiada za prawidłowe funkcjonowanie całego systemu, ale także stanowi miejsce współdziałania mechanizmów wrodzonej i nabytej odporności immunologicznej. Udowodniono, że pacjenci z brakiem składnika C3 wykazują silne zaburzenie funkcjonowania systemu dopełniacza oraz są skrajnie podatni na wszelkie infekcje. Wykazano, iż gen efb obecny jest u wszystkich wyizolowanych szczepów Staphylococcus aureus, natomiast nie stwierdzono jego obecności u przedstawicieli innych gatunków bakterii z rodzaju Staphylococcus [Boden M.K., Flock J.I., J. Clin. Microbiol., 1995, 33, 2347], Zaleta ta ma istotne znaczenie z punktu widzenia diagnostyki infekcji bakterii S. aureus, w której kluczowym elementem może być detekcja konstytutywnego, gatunkowo specyficznego białka Efb w płynach ustrojowych organizmu.

Stosowana obecnie diagnostyka infekcji bakterią Staphylococcus aureus w większości opiera się na technikach posiewów mikrobiologicznych na selektywnych podłożach różnicujących czy też testach koagulacyjnych wykorzystujących obecność produkowanej przez szczepy Staphylococcus aureus koagulazy. Niestety, często pobranie materiału do analizy jest trudne, bądź nawet niemożliwe (ropnie narządów wewnętrznych). Dużo czulsze i dokładniejsze serologiczne metody diagnostyczne gronkowca złocistego wykorzystują zdolność specyficznych przeciwciał do rozpoznawania określonych elementów strukturalnych komórek Staphylococcus aureus (białka powierzchniowe, enterotoksyny). W tym celu do pozyskania specyficznych przeciwciał używa się całe komórki bakterii, którymi immunizuje się następnie zwierzęta. Główną techniką, w której stosuje się uzyskane przeciwciała do detekcji S. aureus we krwi (bądź w produktach żywnościowych) są testy ELISA bądź western blotting [Joost I., Jacob S., Utermohlen O., Schubert U., Patti J.M., Ong M.F., Gross J., Justinger C., Renno J.H., Preissner K.T., Bischoff M., Herrmann M., FEMS Immunol Med Microbiol. 2011, 62(1):23-31; Kumar A, Ray P, Kanwar M, Sharma M, Varma S., Int J Med Sci. 2005, 2(4): 129-36; Fey H, Pfister H, Ruegg O., J Clin Microbiol. 1984, 19(1):34-8]. Inne metody diagnostyczne oparte są na wykrywaniu określonych genów specyficznych dla gatunku Staphylococcus aureus [Hussain M., von Eiff C., Sinha B., Joost I., Herrmann M., Peters G., Becker K., J Clin Microbiol. 2008, 46(2):470-6].

W międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr WO 2009023043 opisano sposób otrzym ywania mysich przeciwciał skierowanych przeciwko białku Efb ze Staphylococcus aureus, jednak nie przedstawiono ich zastosowania w diagnostyce infekcji gronkowcem złocistym.

Ewolucyjnym przodkiem ssaczych przeciwciał klas IgG oraz IgE są przeciwciała IgY pełniące analogiczne funkcje u ptaków, gadów oraz płazów. Występują one we krwi, a także transportowane są do woreczka żółtkowego jaj, co zapewnia młodym organizmom ochronę przed patogenami. Dzięki obecności wysokiej ilości przeciwciał IgY w żółtku jaj kurzych wykorzystuje się je jako alternatywne źródło przeciwciał do zastosowań zarówno w diagnostyce, jak i terapii. Technologia oparta na przeciwciałach IgY ma szereg korzyści - nie ma potrzeby skrwawiania zwierząt w celu pozyskania przeciwciał; wysoka odpowiedź na podany antygen utrzymuje się do końca życia zwierzęcia; ze względu na dużą odległość filogenetyczną między ssakami a ptakami możliwe jest otrzymanie specyficznych przeciwciał skierowanych wobec konserwatywnym białkom ssaków. Dodatkowo stosunkowa łatwość izolacji przeciwciał, a także ilość jaką można uzyskać z jednego jaja sprawiają, iż coraz częściej wykorzystuje się immunoglobuliny Y. Analiza biochemiczna i funkcjonalna przeciwciał klasy IgY ujawniła

PL 222 576 B1 szereg zalet ich stosowania w diagnostyce chorób. W przeciwieństwie do ssaczych przeciwciał klasy IgG przeciwciała kurze nie aktywują ludzkiego systemu dopełniacza, nie reagują z ludzkim czynnikiem reumatoidalnym czy przeciwciałami HAMA co prowadzi do znacznego zmniejszenia fałszywie pozytywnych wyników uzyskiwanych w testach serologicznych.

Dotychczas nie opisano w literaturze przeciwciał IgY specyficznych wobec białka Efb ze Staphylococcus aureus.

Przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec białka Efb izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci rekombinowanego białka Efb pochodzącego ze Staphylococcus aureus o sekwencji przedstawionej wzorem 1.

Korzystnie przeciwciała mają masę cząsteczkową od 175000 do 200000 daltonów.

Sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec białka Efb polega na tym, że immunizuje się drób, korzystnie kury ras hodowlanych, białkowym antygenem w postaci rekombinowanego białka Efb pochodzącego ze Staphylococcus aureus o sekwencji przedstawionej wzorem 1, przy czym immunizację prowadzi się w trzech osobnych dawkach, a jako adiuwantu używa się pełnego adiuwantu Freund'a, po czym znaną metodą izoluje się przeciwciała z wydajnością 100-160 mg/jajko i czystością 85-95%.

Korzystnie w celu wzbogacenia wyizolowanych przeciwciał o specyficzne przeciwciała anty-Efb stosuje się metodę chromatografii powinowactwa, która polega na tym, że białko Efb wiąże się kowalencyjne z nośnikiem, korzystnie z ω-aminobutylo agarozą, a następnie na złoże nanosi się mieszaninę poliklonalnych przeciwciał IgY o specyficzności anty-Efb, po czym po usunięciu niezwiązanych niespecyficznych przeciwciał, otrzymuje się przeciwciała o pożądanej specyficzności.

Korzystnie roztwór przeciwciał IgY specyficznych wobec białka Efb poddaje się dializie wobec buforu węglanowego, równolegle peroksydazę chrzanową w buforze węglanowym miesza się z chlorkiem cyjanurowym, po czym mieszaninę reakcyjną poddaje się dializie wobec buforu węglanowego, w kolejnym etapie otrzymany po dializie roztwór peroksydazy chrzanowej miesza się z roztworem przeciwciała IgY otrzymanym w pierwszym etapie przez 4 godziny w temperaturze 37°C, pH mieszaniny reakcyjnej doprowadza się do wartości 7,2-7,4 przy użyciu 1 M roztworu kwasu cytrynowego, dodaje się równą objętość glicerolu i otrzymuje się koniugaty IgY-HRP.

Zastosowanie przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec białka Efb do wykrywania in vitro bakterii Staphylococcus aureus.

Wyizolowane przeciwciała poddaje się analizie biochemicznej w celu określenia ich czystości, miana przeciwciał, specyficzności antygenowej i stężenia. W trakcie procesu immunizacji analizę przeciwciał przeprowadzano dla każdego pobranego jaja w okresie 22 tygodni. Odpowiedź organizmu w postaci produkcji specyficznych przeciwciał IgY pojawiła się po 7 tygodniu od momentu immunizacji.

Sposób według wynalazku cechuje niska inwazyjność, ponieważ nie wymaga skrwawiania zwierząt w określonych odstępach czasu w celu izolacji przeciwciał.

Przeciwciała według wynalazku mogą znaleźć zastosowanie w immunoterapii ludzi i zwierząt przeciw infekcjom Staphylococcus aureus, zarówno pasywnej immunizacji jak i zastosowań w infekcjach zewnętrznych, skórnych.

Diagnostyczne wykorzystanie otrzymanych przeciwciał anty-Efb IgY polega na ich zdolności do specyficznego wiązania z docelowym antygenem. Dzięki związaniu przeciwciał IgY możliwa jest p ośrednia detekcja białka Efb przy użyciu handlowo dostępnych drugorzędowych przeciwciał anty-IgY (np. królicze przeciwciała IgG anty-lgY) zawierających dowolny znacznik (peroksydaza chrzanowa, fosfataza alkaliczna, biotyna, fluoresceina).

Otrzymano także koniugaty specyficznych przeciwciał IgY anty-Efb i peroksydazy chrzanowej (anty-Efb IgY-HRP) do zastosowań w immunodiagnostycznych testach bezpośredniej detekcji.

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładach realizacji oraz na rysunku, na którym:

Fig. 1 - Analiza elektroforetyczna (SDS-PAGE) w warunkach nieredukujących otrzymanych przeciwciał IgY. Barwienie wykonano przy użyciu barwnika Coomassie R 250.

Fig. 2 - Wykres przedstawiający odpowiedź w postaci produkcji specyficznych wobec białka Efb przeciwciał IgY. Strzałkami oznaczono czas immunizacji.

Fig. 3 - Detekcja białka Efb przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY (obraz uzyskany w technice western blotting).

PL 222 576 B1

Fig. 4 - Wykres przedstawiający zdolność przeciwciał IgY do wykrywania białka Efb; Abs* przedstawione wartości absorbancji po odjęciu wartości absorbancji otrzymanych dla roztworów kontrolnych przeciwciał IgY.

Fig. 5 - Wykres przedstawiający zdolność przeciwciał IgY (różnych rozcieńczeń) do wykrywania białka Efb; Abs* - przedstawione wartości absorbancji po odjęciu wartości absorbancji otrzymanych dla roztworów kontrolnych przeciwciał IgY.

Fig. 6 - Zdolność detekcji białka Efb przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY (western blotting).

Fig. 7 - Detekcja białka Efb przez otrzymane specyficzne przeciwciała klasy IgY (western blotting).

Fig. 8 - Określenie poziomu niespecyficznego wiązania otrzymanych przeciwciał IgY wobec wybranych białek (western blotting).

Fig. 9 - Wyniki analizy western blotting hodowli bakterii Staphylococcus aureus w celu określenia obecności białka Efb przy zastosowaniu otrzymanych przeciwciał IgY; rEfb - rekombinowane białko Efb użyte do immunizacji; nEfb - natywne białko Efb; h - płyn hodowlany (24 h hodowla); o - osad z płynu hodowlanego (24 h hodowla): A - szczepy E006 i A385 (24 h i 48 h hodowla, medium hodowlane); B - szczepy E025, E048 i E058 (24 h hodowla); C - szczepy A009, E006 i E023 (24 h hodowla).

Fig. 10 - Wykres przedstawiający detekcję koniugatów IgY-HRP przez królicze przeciwciała IgG anty-IgY; Abs* - przedstawione wartości absorbancji po odjęciu wartości absorbancji otrzymanych dla roztworów kontrolnych.

Fig. 11 - Bezpośrednia detekcja białka Efb przez przeciwciała IgY sprzężone z peroksydazą chrzanową (IgY-HRP): rozcieńczenie 1:200 oraz 1:400 (western blotting).

Fig. 12 - Detekcja białka Efb przez przeciwciała IgY przed i po ich oczyszczeniu metodą chromatografii powinowactwa (western blotting).

P r z y k ł a d 1

1.1. Przygotowanie antygenu do immunizacji

Białko Efb (rekombinowane, 17,4 kDa o sekwencji przedstawionej wzorem 1) rozpuszczono w buforze fosforanowym o pH 7,4 a następnie zliofilizowano. Białko rozpuszczono ponownie tuż przed wykonaniem iniekcji w mieszaninie sterylnego roztworu soli fizjologicznej i pełnego adiuwantu Freund'a w stosunku 1:1 (i/i).

1.2. lmmunizacja zwierząt

Kury hodowlane, rasy White Leghorn immunizuje się przez podanie domięśniowe antygenu w ilości 40 μg/zwierzę (300 μΊ) Immunizację powtarza się następnie po 5 i 8 tygodniach stosując antygen, w ilości 10 μg na zwierzę. Grupa kontrolna otrzymuje iniekcję roztworu soli fizjologicznej zawier ającej pełny adiuwant Freund'a (1:1, u/u, 300 μl/zwierzę).

1.3. Pobieranie i przechowywanie materiału biologicznego

Jaja kolekcjonowane były codziennie od następnego dnia po immunizacji przez 4 miesiące i przechowywane w temperaturze 4°C do czasu izolacji przeciwciał.

1.4. Izolacja przeciwciał IgY

Zebrane jaja zostały najpierw umyte 50% roztworem izopropanolu, a następnie rozdzielono żółtko od białka. Po usunięciu błony białkowej otaczającej worek żółtkowy płynną zawartość rozcieńczono pięciokrotnie buforem fosforanowym (100 mM, pH 7,4), a następnie dodano glikol polietylenowy 6000 do końcowego stężenia 3,5%. Po dokładnym wymieszaniu całość wirowano w 11 000 rpm przez 15 min w 4°C a otrzymany supernatant filtrowano przez sączek bibułowy. Do supernatantu dodano następnie PEG 6000 do końcowego stężenia 12%. Po dokładnym wymieszaniu wytrącony osad odw irowano (11 000 rpm przez 15 min w 4°C). Supernatant odrzucono, a osad zawierający przeciwciała klasy IgY rozpuszczono dokładnie w buforze fosforanowym (pH 7,4) w objętości 5 ml. Po wykonaniu analiz biochemicznych roztwory przeciwciał przechowywano w temperaturze -20°C. Stężenie otrzymanych białek określono spektrofotometrycznie (A280).

P r z y k ł a d 2. Analiza czystości wyizolowanych przeciwciał klasy IgY.

Czystość wyizolowanych przeciwciał określono wykonując rozdział elektroforetyczny otrzym anych białek w warunkach nieredukujących. W tym celu na studzienki żelu poliakrylamidowego (SDS PAGE, 4%-12%) naniesiono 10 μl otrzymanego roztworu analizowanego białka rozcieńczonego 100-krotnie. Wizualizację białek wykonano przy użyciu barwnika Coomassie R 250. Na podstawie analizy obrazów elektroforetycznych oznaczono czystość uzyskanych przeciwciał, która mieściła się w zakresie od 85% do 95%.

PL 222 576 B1

P r z y k ł a d 3. ELISA - ogólny opis wykonania testu

W celu potwierdzenia obecności przeciwciał specyficznych wobec białka Efb wykonano test ELISA dla każdego z otrzymanych preparatów. Płytki mikrotitracyjne 96-cio dołkowe pokryto antygenem rozpuszczonym w buforze węglanowym (50 mM, pH 9,6) i inkubowano w temperaturze 4°C przez 12 godzin. Po odmyciu niezwiązanego antygenu wolne miejsca zablokowano przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% (v/v) Tween-20. Blokowanie wykonuje się w temperaturze 37°C w czasie 60-120 minut. Po odmyciu czynnika blokującego specyficzne oraz kontrolne przeciwciała rozcieńczone w 0,5% roztworze mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% (,/,) Tween-20 (100 mM, pH 7,4) naniesiono na opłaszczoną antygenem płytkę mikrotitracyjną (100 pl) i inkubowano w czasie 1-2 godzin w temperaturze 37°C. Detekcję kompleksów białko Efb-przeciwciało IgY wykonano przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach.

P r z y k ł a d 4. Analiza odpowiedzi na podany antygen

Do analizy odpowiedzi immunologicznej immunizowanych zwierząt i określenia miana produkowanych przeciwciał zastosowano test ELISA według sposobu opisanego powyżej dla każdego wyizolowanego przeciwciała w rozcieńczeniu 1:100, 1:1000 oraz 1:10000. Obecność specyficznych przeciwciał wyrażono jako stosunek wartości absorbancji uzyskanej dla specyficznych wobec białka Efb przeciwciał IgY do wartości absorbancji roztworu przeciwciał wyizolowanych z grupy kontrolnej. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach dla każdego przeciwciała i każdego rozcieńczenia. Ilość antygenu użytego w teście wynosiła 50 ng/studzienkę płytki mikrotitracyjnej.

P r z y k ł a d 5. Analiza specyficzności - western blotting

W celu potwierdzenia specyficzności otrzymanych przeciwciał specyficznych wobec białka Efb wykonano analizę western blotting. W tym celu przeprowadzono rozdział elektroforetyczny w warunkach denaturujących (SDS PAGE, 4%-12%) białka Efb rozpuszczonego w buforze do próbek zawierającym czynnik redukujący (200 ng białka na studzienkę). Następnie przeprowadzono elektrotransfer białek na membranę nitrocelulozową w aparacie do transferu półsuchego. Blokowanie wolnych miejsc wiążących na membranie nitrocelulozowej wykonano przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% Tween-20 (iA) przez 12 h w temperaturze 4°C. Następnie specyficzne wobec białka Efb przeciwciała rozcieńczono (1:100) w 0,5% roztworze mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% Tween-20 (iA) i inkubowano z membraną w czasie 1 -2 h w temperaturze 37°C. Po wypłukaniu membrany buforem PBST detekcję związanych z antygenem specyficznych przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-lgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD.

P r z y k ł a d 6. Limit detekcji Efb - ELISA

W celu określenia limitu detekcji białka Efb przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY wykorzystano enzymatyczny test immunosorpcyjny fazy stałej (ELISA) w sposób opisany powyżej. W tym celu 96-cio dołkową płytkę mikrotitracyjną opłaszczono białkiem Efb w różnych stężeniach w przedziale od 2000 ng/ml do 250 pg/ml (100 pl/studzienkę). Po wypłukaniu dołków dodano roztwór specyficznego wobec Efb przeciwciała rozcieńczonego 2500-krotnie roztworem mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% (iA) Tween-20. Detekcję kompleksów Efb-IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-lgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach.

P r z y k ł a d 7. Limit detekcji - miano przeciwciał (rozcieńczenia) - ELISA

Miano otrzymanych przeciwciał specyficznych wobec użytego antygenu Efb określono przy użyciu testu ELISA. Płytkę opłaszczono antygenem w ilości 125 ng/studzienkę. Przygotowano następnie serię rozcieńczeń przeciwciał IgY (specyficznych wobec białka Efb oraz kontrolnych) w zakresie od 1:10 do 1:100 000 i inkubowano z opłaszczoną antygenem płytką. Detekcję kompleksów Efb-IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-lgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenyIodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Jako miano specyficznych

PL 222 576 B1 wobec białka Efb przeciwciał uznano najwyższe rozcieńczenie, dla którego obserwowano wartość absorbancji minimum 2,1 razy wyższą niż wartość absorbancji roztworu przeciwciała wyizolowanego z żółtka jaja kur nieimmunizowanych. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach.

P r z y k ł a d 8. Limit detekcji Efb - western blotting

W celu określenia limitu detekcji białka Efb w technice western blotting w pierwszym etapie w ykonano rozdział elektroforetyczny (SDS PAGE, 4%-12%) białka Efb w warunkach redukujących w ilości mieszczącej się w zakresie od 800 ng do 31,25 ng/studzienkę. Następnie wykonano transfer półsuchy białek na membranę nitrocelulozową. Po zablokowaniu wolnych miejsc wiążących przy uż yciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze PBST membranę inkubowano z roztworem otrzymanego specyficznego wobec białka Efb przeciwciała IgY rozcieńczonego w stosunku 1:10000 0,5% roztworem odtłuszczonego mleka w buforze PBST. Po wypłukaniu membrany buforem PBST detekcję związanych z antygenem specyficznych przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-lgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD.

P r z y k ł a d 9. Limit detekcji - miano przeciwciał (rozcieńczenia) - western blotting

W celu określenia zakresu stężeń otrzymanych przeciwciał klasy IgY w technice western blotting niezbędnego do detekcji białka Efb na studzienki żelu poliakrylamidowego naniesiono białko Efb w ilości 200 ng/studzienkę a następnie wykonano rozdział elektroforetyczny białek w warunkach redukujących (SDS PAGE, 4-12%). Po półsuchym transferze białek na membranę nitrocelulozową i blokowaniu wolnych miejsc przy użyciu 5% roztworu odtłuszczonego mleka w buforze PBST paski membrany inkubowano przez 1 h z roztworami specyficznego wobec białka Efb przeciwciała IgY rozcieńczonego w zakresie od 1:100 do 1:10000 buforem PBST zawierającego 0,5% odtłuszczonego mleka. Po wypłukaniu pasków membrany buforem PBST detekcję związanych z antygenem specyficznych przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-lgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD.

P r z y k ł a d 10. Niespecyficzne wiązanie przeciwciał IgY - western blotting

W celu określenia możliwości niespecyficznego wiązania otrzymanych przeciwciał IgY do innych niż Efb białek wykorzystano test western blotting. W tym celu roztwory białek w warunkach redukujących naniesiono na żel poliakrylamidowy (4%-12%, SDS PAGE) w ilości 1 pg/studzienkę i wykonano półsuchy transfer białek na membranę nitrocelulozową. Po zablokowaniu wolnych miejsc wiążących membranę inkubowano z roztworem specyficznego wobec białka Efb otrzymanego przeciwciała IgY rozcieńczonego w stosunku 1:100 w buforze PBST zawierającym 0,5% mleka odtłuszczonego. Po wypłukaniu membrany buforem PBST detekcję związanych z białkami specyficznych przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-lgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD.

P r z y k ł a d 11. Detekcja białka Efb w hodowli S.aureus

W celu określenia zdolności otrzymanych przeciwciał klasy IgY do detekcji białka Efb w hodowli bakterii Staphylococcus aureus wykorzystano izolaty środowiskowe pochodzące z kolekcji Katedry Epizootiologii z Kliniką Ptaków i Zwierząt Egzotycznych Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu: A385 (torebka stawowa kury), E006 (kloaka gołębia), E025 (oczy kota), E009 (stawy brojler kurzy), E048 (kał gołębi), E058 (skóra konia), E023 (oczy kota) - wykorzystano technikę western blotting. Jako medium hodowlane użyto: pepton sojowy (3 g/l), pepton kazeinowy (17 g/l), chlorek sodu (3 g/l), wodorofosforan potasu (2,5 g/l), pirogronian sodu (10 g/l), pH 7,3. Hodowlę bakterii prowadzono w temperaturze 37°C. Po 24 h i 48 h z hodowli pobrano medium hodowlane i wykonano rozdział elektroforetyczny w warunkach redukujących (4%-12%, SDS PAGE). Przeprowadzono także analizę obecności białka Efb w osadzie hodowlanym. W tym celu 25 ml płynu hodowlanego odwirowano (4500 obr./min, 4°C, 15 min). Osad rozpuszczono następnie w 2% roztworze SDS w wodzie i gotowano przez 5 min, a następnie żwirowano (4500 obr./min, 4°C, 15 min) i pobrany supernatant ponownie odwirowano (4500 obr./min, 4°C, 15 min) i przeniesiono do czystej probówki. W celu przeprowadzenia analizy western blotting wykonano jego rozdział w warunkach redukujących. Po rozdziale elektroforetycznym wykonano transfer półsuchy białek na membranę nitrocelulozową. Po zablokowaniu miejsc wiążących przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze PBST membranę inkubowano z roztworem przeciwciała IgY (1:1000) specyficznego wobec antygenu Efb. Po wypłukaniu membran y

PL 222 576 B1 buforem PBST detekcję związanych z białkiem Efb specyficznych przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-lgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD.

P r z y k ł a d 12. Otrzymywanie koniugatów IgY-HRP

W pierwszym etapie roztwór specyficznych wobec białka Efb przeciwciał IgY poddaje się dializie wobec buforu węglanowego (50 mM, pH 9,6) i rozcieńcza do stężenia 5 mg/ml. W drugim etapie do probówki odważa się peroksydazę chrzanową w ilości 2,4 mg (stężenie 6 mg/ml) i rozpuszcza w zimnym (4°C) buforze węglanowym (50 mM, pH 9,6) i przenosi do probówki zawierającej 1340 pg chlorku cyjanurowego. Całość delikatnie miesza się w temperaturze pokojowej przez 6 h, po czym mieszaninę reakcyjną poddaje się dializie wobec buforu węglanowego (50 mM, pH 9,6). W kolejnym etapie cały otrzymany po dializie roztwór peroksydazy chrzanowej miesza się z 180 pl roztworu przeciwciała IgY otrzymanym w pierwszym etapie i delikatnie miesza przez 4 godziny w temperaturze 37°C. Po tym czasie doprowadza się pH mieszaniny reakcyjnej do wartości 7,2-7,4 przy użyciu 1M roztworu kwasu cytrynowego, a następnie dodaje się równą objętość glicerolu i przechowuje w temperaturze -20°C.

W celu potwierdzenia obecności koniugatów IgY-HRP wykonuje się test ELISA. W tym celu studzienki 96-cio dołkowej płytki mikrotitracyjnej pokryto króliczym przeciwciałem IgG anty-lgY rozpuszczonym w buforze węglanowym (50 mM, pH 9,6) w rozcieńczeniu 1:5000 i inkubowano w temperaturze 4°C przez 12 godzin. Po odmyciu niezwiązanego przeciwciała wolne miejsca zablokowano przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% (i/ι) Tween-20. Blokowanie wykonuje się w temperaturze 37°C w czasie 60-120 minut. Po odmyciu czynnika blokującego otrzymany koniugat IgY-HRP rozcieńczony w 0,5% roztworze mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% (</i) Tween-20 (</i) (100 mM, pH 7,4) naniesiono na opłaszczoną antygenem płytkę mikrotitracyjną (100 pl) i inkubowano w czasie 1-2 godzin w temperaturze 37°C. Detekcję kompleksów IgG-IgY-HRP wykonano przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach.

P r z y k ł a d 13. Bezpośrednia detekcja białka Efb przy zastosowaniu koniugatu IgY-HRP western blotting.

W celu potwierdzenia specyficzności oraz zdolności rozpoznania białka Efb przez otrzymane koniugaty IgY-HRP wykorzystano technikę western blotting - na studzienki żelu poliakrylamidowego naniesiono białko Efb w ilości 100 ng/studzienkę a następnie wykonano rozdział elektroforetyczny białek w warunkach redukujących (SDS PAGE, 4%-12%). Po półsuchym transferze białek na membranę nitrocelulozową i blokowaniu wolnych miejsc przy użyciu 5% roztworu odtłuszczonego mleka w buforze PBST paski membrany inkubowano przez 1 h z roztworem koniugatu IgY-HRP w rozcieńczeniu 1:200 lub 1:400 w buforze PBST (5 ml) zawierającym 0,5% odtłuszczonego mleka. Po wypłukaniu pasków membrany buforem PBST detekcję kompleksów Efb-IgY-HRP przeprowadzono przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD.

P r z y k ł a d 14. Izolacja specyficznych wobec białka Efb przeciwciał IgY.

Jako stałego nośnika białka w metodzie chromatografii powinowactwa użyto ω-aminobutylo agarozy (5,2 pmol/ml). W pierwszym etapie grupy aminowe nośnika podstawiono grupami S-acetylotiooctowymi przy użyciu W-bursztynimido-S-acetylotiooctanu, a następnie usunięto grupę S-acetylową przy zastosowaniu 0,5 M roztworu hydroksyloaminy w buforze PBS zawierającego 25 mM EDTA.

Wolne grupy tiolowe nośnika zmodyfikowano heterodwufunkcyjnym łącznikiem GMBS (10-krotny nadmiar molowy) i po wypłukaniu nadmiaru łącznika zawiesinę nośnika w buforze PBS inkubowano z białkiem Efb. Reakcję prowadzi się w czasie 2-6 h w temperaturze pokojowej delikatnie mieszając. Reakcję przerywa się następnie 1 M roztworem glicyny i całość przemywa się buforem PBS. Na tak przygotowane złoże (75 pl) nanosi się mieszaninę przeciwciał IgY specyficznych wobec białka Efb (200 pl) i przemywa buforem PBS. Po wypłukaniu całości niezwiązanych przeciwciał na szczyt kolumny nanosi się bufor cytrynianowy (20 mM, pH 2,5) w ilości 500 pl i neutralizuje każdą frakcję przy użyciu 1 M Tris-base (pH 8,5). Obecność przeciwciał w zebranych frakcjach potwierdza się przy zastosowaniu elektroforezy (SDS PAGE, warunki nieredukujące) oraz barwienia srebrem. Frakcje zawierające przeciwciała łączy się i określa stężenie białka. W celu określenia immunoreaktywności otrzymanych przeciwciał wobec białka Efb wykonuje się test western blotting w sposób

PL 222 576 B1 opisany powyżej. Na studzienki żelu poliakrylamidowego nanosi się białko Efb w ilości 100 ng/studzienkę. Po przeprowadzonym rozdziale elektroforetycznym przeprowadza się półsuchy transfer białek na membranę nitrocelulozową i wolne miejsca wiążące blokuje się 5% roztworem mleka odtłuszczonego w buforze PBST (4°C, 12 h). Po wypłukaniu membrany buforem PBST detekcję białka Efb przeprowadza się przy użyciu otrzymanych przeciwciał IgY o specyficzności anty-Efb przed i po wykonaniu chromatografii powinowactwa. W tym celu przeciwciało (przed oczyszczaniem metodą chromatografii powinowactwa) w ilości 10 μg oraz oczyszczone przeciwciało w ilości 10 μg lub 5 μg odmierza się do 10 ml 0,5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze PBST i inkubuje z paskami membrany nitrocelulozowej zawierającej przeniesione z żelu poliakrylamidowego białko Efb (37°C, 1 h). Po wypłukaniu membrany buforem PBST detekcję związanych z białkami specyficznych przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-lgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zast osowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę.

Claims (8)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec białka Efb izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci rekombinowanego białka Efb pochodzącego ze Staphylococcus aureus o sekwencji przedstawionej wzorem 1.
2. 2. Przeciwciała według zastrz. 1, znamienne tym, że mają masę cząsteczkową od 175000 do 200000 daltonów.
3. 3. Sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec białka Efb, znamienny tym, że immunizuje się drób białkowym antygenem w postaci rekombinowanego białka Efb pochodzącego ze Staphylococcus aureus o sekwencji przedstawionej wzorem 1, przy czym immunizację prowadzi się w trzech osobnych dawkach, a jako adiuwantu używa się pełnego adiuwantu Freund'a, po czym znaną metodą izoluje się przeciwciała z wydajnością 100-160 mg/jajko i czystością 85-95%.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że immunizuje się kury ras hodowlanych.
5. 5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że w celu wzbogacenia wyizolowanych przeciwciał o specyficzne przeciwciała anty-Efb stosuje się metodę chromatografii powinowactwa, która polega na tym, że białko Efb wiąże się kowalencyjne z nośnikiem, a następnie na złoże nanosi się mieszaninę poliklonalnych przeciwciał IgY o specyficzności anty-Efb, po czym po usunięciu niezwiązanych niespecyficznych przeciwciał, otrzymuje się przeciwciała o pożądanej specyficzności.
6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako nośnik stosuje się ω-aminobutylo agarozę.
7. 7. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że roztwór przeciwciał IgY specyficznych wobec białka Efb poddaje się dializie wobec buforu węglanowego, równolegle peroksydazę chrzanową w buforze węglanowym miesza się z chlorkiem cyjanurowym, po czym mieszaninę r eakcyjną poddaje się dializie wobec buforu węglanowego, w kolejnym etapie otrzymany po dializie roztwór peroksydazy chrzanowej miesza się z roztworem przeciwciała IgY otrzym anym w pierwszym etapie przez 4 godziny w temperaturze 37°C, pH mieszaniny reakcyjnej doprowadza się do wartości 7,2-7,4 przy użyciu 1 M roztworu kwasu cytrynowego, dodaje się równą objętość glicerolu i otrzymuje się koniugaty IgY-HRP.
8. 8. Zastosowanie przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec białka Efb do wykrywania in vitro bakterii Staphylococcus aureus.