PL224459B1 - Test diagnostyczny do detekcji białka Map(186-203) - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest test diagnostyczny do detekcji białka Map(186-203) znajdujący zastosowanie w wykrywaniu białka Map wydzielanego przez bakterie Staphylococcus aureus. Test diagnostyczny do detekcji białka Map(186-203) zawiera jako czynnik detekcyjny przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec epitopu białka Map(186-203) izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci koniugatu fragmentu epitopowego białka Map(186-203) o sekwencji CLEGKVKGVLESNRGITDVDLRL z białkiem nośnikowym - hemocyjnaniną.

Description

Przedmiotem wynalazku jest test diagnostyczny do detekcji białka Map(186-203) znajdujący zastosowanie w wykrywaniu białka Map oraz bakterii Staphylococcus aureus.

Białko Map (ang. MHC class II analogue protein), znane również jako Eap lub p70, jest zewnątrzkomórkowym białkiem adhezyjnym wytwarzanym konstytutywnie przez bakterie Staphylococcus aureus [Kreikemeyer B, McDevitt D, Podbielski A., Int J Med Microbiol. 2002, 292(3-4):283-95]. Ze względu na swoje strukturalne i funkcjonalne podobieństwo do ludzkich białek głównego układu zgodności tkankowej (MHC II), białko Map wykazuje zdolność do deregulacji ludzkiego układu odpornościowego [Jahreis A, Beckheinrich P, Haustein UF., Br J Dermatol. 2000, 142(4):680-7; Jonsson K, McDevitt D, McGavin MH, Patti JM, Hook M. J Biol Chem. 1995, 270(37): 21457-21460]. Wysoka specyficzność gatunkowa białka Map wykorzystywana jest w diagnostyce infekcji S. aureus metodami opartymi o PCR, w których potwierdza się obecność genu map w płynach ustrojowych [Hussain M, von Eiff C, Sinha B, Joost I, Herrmann M, Peters G, Becker K., J Clin Microbiol. 2008, 46(2):470-6]. Pomimo wysokiej czułości metod PCR w detekcji infekcji bakteryjnych, ze względu na wysokie wymagania technologiczne laboratorium, jak i na trudność wykonania samej analizy, nie są to jeszcze metody powszechnie używane. Najczęściej stosowanymi metodami identyfikacji infekcji bakteryjnych są techniki mikrobiologiczne, które w głównej mierze oparte są na badaniach mikroskopowych oraz hodowli w mediach różnicujących. Jednakże klasyczne metody wykazują szereg ograniczeń, jak np. czas wykonania analizy, trudność pozyskania materiału do badań lub nieprawidłowe wyniki u osób po antybiotykoterapii [Colque-Navarro P, Soderquist B, Holmberg H, Blomqvist L, Olcen P, Mollby R. J. Med. Microbiol, 47, 1998, 217-25].

Epitop białka Map(186-203) charakteryzuje się α-helikalną strukturą drugorzędową oraz dostępnością do środowiska, co potencjalnie zwiększa jego charakter immunogenny. Fragment ten obejmuje reszty 186 do 203 (numeracja zgodna z sekwencją gi: 258421047 bazy GenBank) o sekwencji CLEGKVKGVLESNRGITDVDLRL.

U ptaków, gadów, płazów oraz ryb prapłaźcokształtnych za funkcje obronne układu odpornościowego (humoralnej odpowiedzi układu odpornościowego) odpowiadają przeciwciała klasy IgY, które uznaje się za ewolucyjnych przodków ssaczych przeciwciał klas IgG oraz IgE. Przeciwciała IgY funkcjonalnie najbardziej zbliżone są do przeciwciał IgG ssaków. Oprócz funkcji odpornościowej, ptaki, gady i płazy wykształciły mechanizm transportu przeciwciał IgY do żółtka jaj, co stanowi swoisty mechanizm pasywnej immunizacji zapewniający ochronę młodym pisklętom. Zjawisko to wykorzystuje się do produkcji specyficznych przeciwciał - po immunizacji specyficzne przeciwciała zostają przetransportowane do żółtka jaj, skąd są następnie izolowane. Ilość antygenowo specyficznych przeciwciał w żółtku jaj wynosić nawet może 10% wszystkich przeciwciał, co, w porównaniu z produkcją przeciwciał króliczych, gdzie ilość przeciwciał specyficznych nie przekracza 5%, stanowi ogromną zaletę. Ponadto, w porównaniu do klasycznych metod pozyskiwania przeciwciał ssaczych, nie ma potrzeby okresowego pobierania krwi. Istotną zaletą stosowania przeciwciał IgY w testach diagnostycznych jest brak ich wiązania z czynnikiem reumatoidalnym, białkiem A i G, brak aktywacji systemu dopełniacza czy brak reaktywności z przeciwciałami HAMA, ograniczając przez to uzyskiwanie fałszywie pozytywnych wyników.

Z amerykańskiego zgłoszenia patentowego nr US2002164337 znane są monoklonalne przeciwciał klasy IgG o specyficzności anty-Map pochodzących z organizmu myszy.

Test diagnostyczny na bazie immunoglobulin Y specyficznych wobec epitopu białka Map(186-203) zdolnych do detekcji natywnego białka Map ze Staphylococcus aureus nie został dotychczas opisany w literaturze.

Istotą wynalazku jest test diagnostyczny do detekcji białka Map(186-203) który zawiera jako czynnik detekcyjny przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec epitopu białka Map (186-203) izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci koniugatu fragmentu epitopowego białka Map(186-203) o sekwencji CLEGKVKGVLESNRGITDVDLRL z białkiem nośnikowym - hemocyjnaniną.

Korzystnie przeciwciała mają masę cząsteczkową od 175000 do 200000 daltonów.

Po etapie izolacji, przeciwciała poddaje się analizie biochemicznej, której celem jest określenie czystości przeciwciał, stężenia, a widności, mianowanie przeciwciał oraz określenie limitu detekcji epitopu białka Map(186-203). W trakcie procesu immunizacji analizę biochemiczną przeciwciał przePL 224 459 B1 prowadzono dla każdego zebranego jaja w czasie 18 tygodni. Odpowiedź w postaci produkcji specyficznych przeciwciał pojawia się w 4 tygodniu od momentu pierwszej immunizacji.

Sposób otrzymywania przeciwciał cechuje duża ilości izolowanych przeciwciał oraz niska inwazyjność, ponieważ nie wymaga skrwawiania zwierząt w określonych odstępach czasu w celu izolacji przeciwciał.

Test diagnostyczny według wynalazku znajduje zastosowanie w diagnostyce infekcji wywołanych przez bakterie Staphylococcus aureus, które prowadzić mogą do poważnych stanów chorobowych, między innymi zakażenia skóry i tkanek podskórnych (np. czyraki, zakażenia ran pooperacyjnych), zakażenia układowe (np. zapalenia tchawicy, mięśnia sercowego, żył) czy zakażenia wywołane przez produkowane przez bakterię toksyny np. zespół wstrząsu toksycznego. Zastosowanie przeciwciał specyficznych wobec epitopu białka Map(186-203) w diagnostyce polega na ich zdolności do specyficznego wiązania z antygenem, którym może być pełne białko Map lub epitop białka Map(186-203). Dzięki związaniu przeciwciał IgY do antygenu możliwa jest pośrednia detekcja białka Map przy użyciu handlowo dostępnych drugorzędowych przeciwciał anty-IgY (np. królicze przeciwciała IgG anty-IgY) zawierających dowolny znacznik (peroksydaza chrzanowa, fosfataza alkaliczna, biotyna, fluoresceina).

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładach oraz na rysunku na którym

Fig. 1 przedstawia analizę elektroforetyczną (SDS-PAGE, 4-12%) w warunkach nie redukujących otrzymanych przeciwciał IgY specyficznych wobec epitopu białka Map(186-203). Barwienie wykonano przy użyciu barwnika Coomassie R 250.

Fig. 2 przedstawia wykres przedstawiający odpowiedź w postaci produkcji specyficznych wobec epitopu białka Map(186-203) przeciwciał IgY. Strzałkami oznaczono czas immunizacji. Abs* - przedstawione wartości absorbancji po odjęciu wartości absorbancji otrzymanych dla kontrolnych przeciwciał IgY.

Fig. 3 przedstawia detekcję epitopu białka Map(186-203) przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY (western blotting).

Fig. 4 przedstawia wykres przedstawiający zdolność przeciwciał IgY do wykrywania epitopu białka Map(186-203).

Fig. 5 przedstawia wykres mianowania przeciwciał IgY do detekcji epitopu białka Map(186-203).

Fig. 6 przedstawia zdolność detekcji epitopu białka Map(186-203) przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY.

Fig. 7 przedstawia miano przeciwciał IgY specyficznych wobec epitopu białka Map(186-203).

Fig. 8 przedstawia zdolność krzyżowej detekcji białka Map przez otrzymane przeciwciała IgY specyficzne wobec epitopu białka Map(186-203).

Fig. 9 przedstawia detekcję białka Map przez przeciwciała specyficzne wobec epitopu białka Map(186-203).

P r z y k ł a d 1

1.1 Synteza peptydu.

Peptyd o sekwencji CLEGKVKGVLESNRGITDVDLRL otrzymano wykorzystując technikę syntezy na podłożu stałym z użyciem żywicy H-L-Leu-2-Cl-Trt (0,79 mmol/g). Etapy sprzęgania kolejnych aminokwasów prowadzono z wykorzystaniem strategii Fmoc/Boc z użyciem HBTU jako czynnika sprzęgającego w obecności DIPEA. Do usunięcia grupy ochronnej Fmoc stosowano 20% roztwór piperydyny w DMF. W celu odłączenia peptydu od żywicy zastosowano mieszaninę TFA/TIPS/ /EDT/fenol w stosunku 92,5:2,5:2.5:2,5 (v/v). Otrzymany peptyd oczyszczono z wykorzystaniem techniki HPLC, a masę cząsteczkową potwierdzono przy pomocy wysokorozdzielczej spektrometrii mas.

1.2 Synteza koniugatu Map(186-203)-KLH

Do roztworu białka KLH w 10 mM buforze fosforanowym (PB, pH 7,0) dodano roztwór GMBS w DMSO. Reakcję prowadzono 2 h w temperaturze pokojowej po czym zaktywowane białko KLH-MB oczyszczono z wykorzystaniem chromatografii żelowej. Frakcje zawierające białko połączono, a następnie rozcieńczono acetonitrylem aż jego końcowe stężenie wyniosło 25%. Do roztworu KLH-MB dodano roztwór peptydu w 50% acetonitrylu. Wartość pH mieszaniny utrzymywano w granicach 7,2-7,4 przy pomocy 1M wodnego roztworu NaOH. Postęp reakcji monitorowano przy użyciu chromatografii HPLC.

1.3 Synteza koniugatu Map(186-203)-BSA

Do roztworu albuminy wołowej (BSA) w buforze PB dodano roztwór GMBS w DMSO. Reakcję prowadzono 30 min w temperaturze pokojowej po czym zaktywowane białko BSA-MB oczyszczono

PL 224 459 B1 z wykorzystaniem chromatografii żelowej. Frakcje zawierające białko połączono, a następnie rozcieńczono acetonitrylem do końcowego stężenia 25%. Do roztworu BSA-MB dodano roztwór peptydu w 50% acetonitrylu. Wartość pH mieszaniny utrzymywano w granicach 7,0-7,4 przy pomocy 1M wodnego roztworu NaOH. Postęp reakcji monitorowano przy użyciu chromatografii HPLC.

P r z y k ł a d 2.

2.1 Przygotowanie antygenu do immunizacji

Koniugat Map(186-203)-KLH (o sekwencji przedstawionej wzorem 1) rozpuszcza się tuż przed wykonaniem iniekcji w mieszaninie sterylnego roztworu soli fizjologicznej i pełnego adiuwantu Freund'a (przy pierwszej immunizacji) oraz niepełnego adiuwantu Freund'a (przy dawkach przypominających) w stosunku 1:1 (v/v).

2.2 Immunizacja kurcząt

Kury hodowlane rasy White Leghorn immunizuje się poprzez podanie domięśniowe antygenu w ilości 100 μg/zwierzę (300 μΐ). Immunizację powtarza się po 4 i 8 tygodniach stosując antygen w dawce 50 μg/zwierzę. Grupę kontrolną stanowią kury otrzymujące iniekcję roztworu pełnego adiuwantu Freund'a w soli fizjologicznej w stosunku 1:1 (v/v).

2.3 Pobieranie i przechowywanie materiału biologicznego

Jaja kolekcjonuje się codziennie od następnego dnia po immunizacji przez 20 tygodni. Jaja przechowywane są w temperaturze 4°C do momentu izolacji przeciwciał.

2.4 Izolacja przeciwciał IgY

Jaja przemywa się 50% roztworem izopropanolu. Rozdziela się żółtko od białka, a następnie usuwa się błonę białkową otaczającą worek żółtkowy. Płynną zawartość żółtka rozcieńcza się czterokrotnie buforem fosforanowym (PBS, 10 mM, pH 7,4) z 4,75% dodatkiem glikolu polietylenowego 6000 (PEG 6000). Po dokładnym wymieszaniu, całość wiruje się przez 15 min przy 11 000 rpm w 4°C. Otrzymany supernatant filtruje się przez sączek bibułowy, a następnie do przesączu dodaje się PEG 6000 do końcowego stężenia wynoszącego 12%. Po dokładnym wymieszaniu wytrącony osad odwirowuje się przy 11 000 rmp przez 15 min w 4°C. Supernatant odrzuca się, pozostały osad rozpuszcza się w 10 ml buforu fosforanowego (pH 7,4). Do mieszaniny dodaje się glikol polietylenowy do końcowego stężenia 12%. Po dokładnym wymieszaniu, całość wiruje się przy 11 000 rpm przez 15 min w 4°C. Supernatant odrzuca się, a osad zawierający przeciwciała klasy IgY rozpuszcza się w 5 ml buforu fosforanowego. Po wykonaniu analiz biochemicznych przeciwciała przechowuje się w temperaturze -20°C.

2.5 Analiza czystości i stężenia przeciwciał

Stężenie otrzymanych białek oznacza się spektrofotometrycznie (A280) . Czystość otrzymanych przeciwciał sprawdza się poprzez wykonanie analizy elektroforetycznej SDS-PAGE (4-12%) w warunkach nieredukujących (Fig. 1). Czystość otrzymanych przeciwciał zawiera się w zakresie 86-95%.

P r z y k ł a d 3. Analiza odpowiedzi immunologicznej na podany antygen oraz awidność przeciwciał anty-Map(186-203) w czasie procesu immunizacji - test ELISA.

W celu wykonania analizy odpowiedzi immunologicznej immunizowanych zwierząt na podany antygen zastosowano test ELISA. W tym celu 96-cio dołkowe płytki mikrotitracyjne pokryto koniugatem Map(186-203)-BSA (50 ng peptydu na 100 μΐ) rozpuszczonym w buforze węglanowym (50 mM, pH 9,6) i inkubowano przez 12 godzin w temperaturze 4°C. Wolne miejsca zablokowano przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w PBS-T (37°C, 60 min). Po odmyciu czynnika blokującego na płytkę mikrotitracyjną naniesiono przeciwciała specyficzne lub kontrolne w rozcieńczeniu 1:100 (0,5% roztwór odtłuszczonego mleka w PBS-T) i inkubowano przez 60 min w temperaturze 37°C. Detekcję kompleksów epitop Map(186-203)-IgY prowadzono z wykorzystaniem króliczych przeciwciał detekcyjnych anty-IgY sprzężonych z peroksydazą chrzanową. Jako chromogenicznego substratu użyto O-fenylenodiaminy. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (Fig. 2).

P r z y k ł a d 4. Analiza specyficzności przeciwciał IgY anty-Map(186-203) w czasie immunizacji - western blotting.

W celu potwierdzenia specyficzności otrzymanych przeciwciał specyficznych wobec epitopu białka Map(186-203) wykonano analizę western blotting. Po rozdziale elektroforetycznym koniugatu Map(186-203)-BSA (50 ng peptydu na studzienkę) w warunkach redukujących (SDS PAGE, 4%-12%) przeprowadzono elektrotransfer na membranę nitrocelulozową. Blokowanie wolnych miejsc wiążących na membranie nitrocelulozowej wykonano przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w PBS-T przez 12 h w temperaturze 4°C. Po inkubacji membran w roztworze specyficznych przeciwPL 224 459 B1 ciał IgY lub przeciwciał kontrolnych, rozcieńczonych w stosunku 1:100 (0,5% roztwór mleka odtłuszczonego w PBS-T) przez 1 h w temperaturze 37°C. Po wypłukaniu membrany buforem PBST detekcję związanych z antygenem specyficznych przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY sprzężonego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (Fig. 3).

P r z y k ł a d 5. Limit detekcji epitopu białka Map(186-203) w teście ELISA.

W celu określenia limitu detekcji epitopu białka Map(186-203) przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY wykorzystano enzymatyczny test immunosorpcyjny fazy stałej (ELISA) w sposób opisany powyżej. W tym celu 96-cio dołkową płytkę mikrotitracyjną opłaszczono koniugatem Map(186-203)-BSA w zakresie stężeń peptydu od 1 μg/ml do 50 ng/ml (100 μΐ/studzienkę). Następnie inkubowano z roztworem specyficznych wobec epitopu Map(186-203) przeciwciałami IgY w rozcieńczeniu 1:100 (w 0,5% roztworze mleka odtłuszczonego w PBS-T). Detekcję kompleksów Map(186-203)-IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylenodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Jako kontroli użyto przeciwciała z grupy kontrolnej w analogicznych rozcieńczeniach. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (Fig. 4).

P r z y k ł a d 6. Miano przeciwciał - test ELISA.

Miano przeciwciał specyficznych wobec epitopu białka Map(186-203) określono przy użyciu testu ELISA. Płytkę mikrotitracyjną opłaszczono koniugatem Map(186-203)-BSA w ilości 50 ng peptydu na studzienkę. Po inkubacji z antygenem (12 h, 4°C) i zablokowaniu wolnych miejsc (5% odtłuszczone mleko w buforze PBST) przygotowano serię rozcieńczeń specyficznych oraz kontrolnych przeciwciał IgY w zakresie od 1:10 do 1:5000 i inkubowano z opłaszczoną antygenem płytką. Detekcję kompleksów Map(186-203)-IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylcnodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (Fig. 5).

P r z y k ł a d 7. Określenie limitu detekcji epitopu białka Map(186-203) - western blotting.

W celu określenia limitu detekcji fragmentu białka Map(186-203) w technice western blotting w pierwszym etapie wykonano rozdział elektroforetyczny (SDS PAGE, 4%-12%) koniugatu Map(186-203)-BSA w warunkach redukujących w zakresie od 250 ng do 125 pg peptydu na studzienkę. Następnie wykonano transfer białek na membranę nitrocelulozową. Po zablokowaniu wolnych miejsc wiążących przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w PBST membranę inkubowano z roztworem specyficznych wobec epitopu Map(186-203) przeciwciała IgY w rozcieńczeniu 1:100 (0,5% odtłuszczone mleko w PBST). Detekcję kompleksów Map(186-203)-IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (Fig. 6).

P r z y k ł a d 8. Miano przeciwciał IgY anty Map(186-203) - western blotting.

W celu określenia zakresu stężeń otrzymanych przeciwciał klasy IgY w technice western blotting niezbędnego do detekcji epitopu białka Map(186-203) wykonano rozdział elektroforetyczny koniugatu Map(186-203)-BSA (SDS PAGE, 4-12%, 100 ng peptydu na studzienkę). Po transferze białek na membranę nitrocelulozową i blokowaniu wolnych miejsc paski membrany inkubowano z roztworem specyficznych wobec epitopu białka Map(186-203) przeciwciała IgY rozcieńczonego w zakresie od 1:100 do 1:25000 (w 0,5% roztworze mleka odtłuszczonego w PBS-T). Detekcję związanych z antygenem specyficznych przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (Fig. 7).

P r z y k ł a d 9. Zdolność przeciwciał IgY specyficznych wobec epitopu Map(186-203) do detekcji pełnego białka Map.

Zdolność przeciwciał specyficznych wobec epitopu Map(186-203) do rozpoznawania pełnego białka Map potwierdzono testem western blotting. W tym celu przeprowadzono rozdział elektroforetyczny (SDS-PAGE, 4%-12%) białka Map w warunkach redukujących (200 ng/studzienkę). Następnie wykonano elektrotransfer na nitrocelulozową membranę i zablokowano wolne miejsca wiążące przy

PL 224 459 B1 użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w PBS-T. Membranę inkubowano z roztworami przeciwciał specyficznych wobec epitopu białka Map(186-203) lub przeciwciałami IgY specyficznymi wobec natywnego białka Map lub przeciwciałami IgY z grupy kontrolnej, w rozcieńczeniu 1:100 (0.5% mleko odtłuszczone w PBS-T). Detekcję kompleksów Map-IgY przeprowadzono z wykorzystaniem przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (Fig. 8).

P r z y k ł a d 10. Detekcja natywnego białka Map przy użyciu przeciwciał IgY specyficznych wobec epitopu Map(186-203) w teście ELISA.

W celu określenia zdolności detekcji natywnego białka Map przez otrzymane przeciwciała IgY specyficzne wobec epitopu Map(186-203) płytkę mikrotitracyjną opłaszczono białkiem Map w ilości 50 ng na studzienkę. Następnie inkubowano z roztworem przeciwciał specyficznych wobec epitopu Map(186-203) lub przeciwciał IgY specyficznych wobec natywnego białka Map lub przeciwciał IgY z grupy kontrolnej, rozcieńczonych 50-krotnie 0,5% roztworem mleka odtłuszczonego w PBS-T. Detekcję kompleksów Map-IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydaza chrzanową przy zastosowaniu O-fenylenodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek (Fig. 9).

P r z y k ł a d 11. Test diagnostyczny do wykrywania białka Map w teście ELISA.

Surowicę pacjenta rozcieńcza się 100-krotnie buforem PBS i nanosi na płytkę mikrotitracyjną w dwóch powtórzeniach. Równocześnie przygotowuje się roztwór białka Map(186-203)-BSA w zakresie stężeń peptydu od 1 μg/ml do 0,03125 μg/ml i nanosi na płytkę w dwóch powtórzeniach. Płytkę inkubuje się następnie w temperaturze 37°C przez 1 h po czym płucze, blokuje wolne miejsca wiążące przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze PBS-T. Po 2 godzinnej inkubacji w 37°C płytkę płucze się i inkubuje z roztworem specyficznych przeciwciał IgY otrzymanych po immunizacji koniugatem Map(186-203)-KLH. Płytkę inkubuje się w 37°C przez 1 h, płucze a następnie inkubuje z dowolnym przeciwciałem specyficznym, wobec IgY zawierającym dowolny enzym znacznikowy (peroksydaza chrzanowa, fosfataza alkaliczna) lub znacznik fluorescencyjny (fluoresceina). Po 1 h inkubacji w temperaturze 37°C płytkę, płucze się i dodaje dowolny substrat enzymatyczny lub, w przypadku zastosowania znacznika fluorescencyjnego, analizę wykonuje się spektrofluorymetrycznie. Wynik uzyskany dla badanej próbki porównuje się z wynikami krzywej standardowej i na tej podstawie potwierdza się obecność białka Map oraz określa jego ilość.

P r z y k ł a d 12. Test diagnostyczny do wykrywania białka Map w teście western blotting.

Próbkę badanej surowicy rozcieńcza się 100-krotnie, a następnie poddaje się rozdziałowi elektroforetycznemu (SDS PAGE) w warunkach redukujących. Równolegle rozdziałowi poddaje się białko. Map (50 ng/studzienkę) oraz białko Map(186-203)-BSA (50 ng peptydu/studzienkę). Po wykonaniu elektroforezy białka przenosi się na membranę nitrocelulozową, blokuje wolne miejsca wiążące 5% roztworem mleka odtłuszczonego w buforze PBS-T (2 h, 37°C) a następnie membranę płucze się buforem PBS-T. Wypłukaną membranę inkubuje się następnie z roztworem przeciwciał IgY otrzymanych po immunizacji koniugatem Map(186-203)-KLH (1 h, 37°C). Detekcję kompleksów białka Map lub jego fragmentu z przeciwciałami IgY prowadza się z wykorzystaniem dowolnych przeciwciał zawierających dowolny enzym znacznikowy (peroksydazą chrzanowa, fosfataza alkaliczna) lub znacznik fluorescencyjny (fluoresceina) przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego lub chromogennego substratu, lub światła o odpowiedniej długości fali wzbudzenia dla znaczników fluorescencyjnych. Na podstawie uzyskanych, wyników określa się czy analizowana próbka zawiera białko Map lub fragmenty jego degradacji.

Claims (2)

1. Test diagnostyczny do detekcji białka Map(186-203), znamienny tym, że zawiera jako czynnik detekcyjny przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec epitopu białka Map(186-203) izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci koniugatu fragmentu epitopowego białka Map(186-203) o sekwencji CLEGKVKGVLESNRGITDVDLRL z białkiem nośnikowym - hemocyjnaniną.

2. Test według zastrz., 1, znamienny tym, że przeciwciała mają masę cząsteczkową od 175000 do 200000 daltonów.