CN111132734A

CN111132734A - 兽用产品

Info

Publication number: CN111132734A
Application number: CN201880060392.7A
Authority: CN
Inventors: J·C·桑切斯; R·M·罗伯; L·R·勒奇; P·B·考贝特; A·P·罗德里格斯
Original assignee: Lettie Personal Lab
Current assignee: Lettie Personal Lab; Laboratorios Leti SA
Priority date: 2017-07-31
Filing date: 2018-07-30
Publication date: 2020-05-08
Also published as: CA3070652A1; IL272348B; CO2020001990A2; JP2023109975A; RU2020105299A3; AU2018310629A1; JP2020529476A; EP3661603A1; AU2024202327A1; BR112020002023A2; IL272348A; MX2020001353A; RU2020105299A; US20210085782A1; WO2019025388A1; JP7341138B2; CL2020000265A1; US20230145876A1; AU2018310629B2

Abstract

本发明涉及一种富集的经纯化的兽过敏原提取物。具体而言，本发明涉及一种富含Der f 15和Der f 18的经纯化的兽过敏原提取物。本发明进一步涉及所述过敏原提取物作为兽用产品的用途，及其在治疗哺乳动物、更特别地是犬的过敏、特别是屋尘螨过敏中的用途。

Description

兽用产品

技术领域

本发明涉及富集的经纯化的兽过敏原提取物。具体而言，本发明涉及富含Der f15和Der f 18的经纯化的兽过敏原提取物。本发明进一步涉及所述过敏原提取物作为兽用产品的用途，及其在治疗哺乳动物、更特别地是犬的过敏、特别是屋尘螨过敏中的用途。

背景技术

特应性皮炎是一种瘙痒性过敏性皮肤疾病，它影响大约10％的犬，并且与针对环境过敏原的IgE抗体的产生相关。在犬中非季节性过敏的主要原因是屋尘螨(HDM)，特别是物种粉尘螨(Dermatophagoides farinae)。过敏犬用控制症状的药物治疗，但是替代治疗包括特异性免疫疗法(SIT)，其涉及越来越大剂量的过敏原提取物的给予，旨在诱导免疫耐受性。过敏原免疫疗法调节对过敏原的免疫反应，而不是减轻由过敏反应诱发的症状，并且可以减少用药需求、减轻症状的严重性或完全消除超敏反应。

已经报道了关于人和犬HDM过敏原图谱的相关差异。人的主要过敏原(Der f 1和Der f 2)是分子量相对较低的蛋白质，然而特应犬中粉尘螨(D.farinae)的最重要的过敏原(Der f 15和Der f 18)则包括在第15和18组(属于螨的高分子量部分)中。尽管存在这些差异，犬的过敏原特异性免疫疗法始终直接用针对人类免疫疗法开发和表征的过敏原提取物来制备。用针对人类免疫疗法开发和表征的过敏原提取物治疗犬的一个问题在于犬很可能对先前无害的过敏原(例如Der f 1和Der f 2)敏感。

因此，需要开发一种用于兽用(特别是用于犬)的针对屋尘螨的特异性免疫疗法。

发明内容

诸位发明人已经开发了一种富含高分子量部分的兽螨提取物。此部分含有由来自螨致敏犬的血清样品识别的过敏原。

在本发明的第一方面，提供了一种富含分子量高于50kDa的蛋白质的兽螨提取物。

在一个实施方案中，相对于人提取物，所述兽螨提取物富含过敏原Der f 15和Derf 18。

在一个实施方案中，相对于人提取物，所述提取物具有低水平的过敏原Der f 1和Der f 2。

在本发明的进一步方面，提供了一种用于产生兽螨过敏原提取物的方法，其包括：

a)使包含兽螨过敏原的源材料(原材料)与过敏原提取剂接触，以产生溶解于液相的过敏原和包含非过敏原性残留物的固相的混合物；

b)使所述混合物经受分离步骤以分离溶解于所述液相中的过敏原，以产生粗过敏原提取物；

c)使所述粗过敏原提取物经受中等分子部分去除步骤，以去除尺寸小于50kDa的分子，并且在所述去除步骤期间施加1.8巴的压力；

d)在3℃-5℃下执行步骤c)直到所述过敏原提取物的电导率低于1050μS/cm为止，如在室温下测量的，和/或直到已经使用特定体积的蒸馏水为止，以获得经纯化的天然过敏原提取物。

根据本发明的第三方面，提供了一种兽螨过敏原提取物，用作治疗过敏的活性治疗物质。

附图说明

图1示出了粉尘螨提取物的10μg蛋白质的SDS-PAGE：低范围MW标准品(1)；人提取物(2)；提取物1(3)；提取物2(4)；以及提取物3(5)。

图2示出了粉尘螨提取物的10μg蛋白质的任何kD TGX凝胶中的SDS-PAGE：HiMark预染标记物(LifeTechnologies)(1)；人提取物(2)；提取物1(3)；提取物2(4)；提取物3(5)；以及宽范围MW标准品(Bio-Rad)(6)。

图3示出了在清洗程序后5μl的粉尘螨提取物的SDS-PAGE：低范围MW标准品(1)；提取物1(2)；提取物2(3)；以及提取物3(4)。

图4示出了粉尘螨的170μg蛋白质的2D图：提取物1(A)；提取物2(B)；提取物3(C)；人提取物(D)；在每块凝胶中均标明了低范围MW标准品。

图5示出了粉尘螨提取物的色谱图：人提取物(A)；提取物1(B)；提取物2(C)；以及提取物3(D)。

图6示出了来自提取物1(A、B)、提取物2(C、D)以及提取物3(E、F)兽提取物的Der f15(A、C、E)(SEQ ID NO.1)和Der f 18(B、D、F)(SEQ ID NO.2)的经测序的肽。

图7示出了粉尘螨提取物的10μg蛋白质的免疫印迹：低范围MW标准品(1)；人提取物(2)；提取物1(3)；提取物2(4)；以及提取物3(5)。

图8示出了与人(PRI 6756LN批次)和兽(分别针对提取物1、2和3中的每一种的080616LN、090616LN、290616LN)粉尘螨提取物一起孵育的犬血清库(pool)的特异性IgE光密度。

图9示出了针对兽粉尘螨提取物4和人粉尘螨提取物的个别血清样品的特异性IgE光密度。

图10示出了针对兽粉尘螨提取物4的ELISA效价测定(样品一式两份)。

图11示出了针对人粉尘螨提取物和兽粉尘螨提取物4的ELISA效价测定。

图12示出了由ImageQuant分析的免疫印迹图像。粉尘螨提取物：兽提取物4(2)、人提取物(3)以及兽提取物2(4)。1：低范围MW标准品(kDa)。标记了对应于Der f 15和Der f18的条带。

图13示出了由ImageQuant分析的免疫印迹图像。粉尘螨提取物：兽提取物5(2)、兽提取物4(3)以及人提取物(4)。1：低范围MW标准品(kDa)。标记了对应于Der f 15和Der f18的条带。

图14示出了在来自图12(左侧图像)和图13(右侧图像)的免疫印迹图像中鉴定的条带。

图15示出了人粉尘螨提取物和兽粉尘螨提取物4的10μg蛋白质的免疫印迹。STD：低范围MW标准品。A)阳性血清1、2；B)阳性血清3、4和阴性对照C1；C)阳性血清5-7和阴性对照C2。

图16示出了与阴性对照、人提取物或兽提取物2一起孵育24(IL-10)或48(IFN-γ)小时后，由来自特应组和对照组的外周血单核细胞(PBMC)产生的IL-10和IFN-γ(显著差异(p值)标明在每个图中，显示了中值和四分位距)。

具体实施方式

本文所述的方法产生了兽螨过敏原提取物，其表现出来自患有由粉尘螨引起的特应性皮炎的哺乳动物的血清样品的IgE结合增加。

本发明的过敏原提取物源自包含螨过敏原的任何源材料，已知所述螨过敏原在动物中引起IgE介导的免疫反应。具体而言，所述源材料是螨过敏原，已知所述螨过敏原在犬中引起IgE介导的免疫反应。

在本发明的第一方面，提供了一种富含分子量大于50kDa的蛋白质的兽螨提取物。

在一个实施方案中，所述兽螨提取物源自粉尘螨。

在一个实施方案中，相对于人提取物，所述兽螨提取物富含过敏原Der f 15和Derf 18。过敏原Der f 15和Der f 18是特应犬中粉尘螨的主要过敏原，并且在其他螨物种(例如户尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus))中也可能是重要的过敏原。

在一个实施方案中，相对于人提取物，所述提取物具有较低水平的过敏原Der f 1和Der f 2。所述提取物中存在的过敏原水平可以通过光密度测定分析从SDS确定。对于Derf 1和Der f 2，这些过敏原也可以通过商业试剂盒(例如可从Indoor BiotechnologiesInc(美国弗吉尼亚州夏洛茨维尔)获得的那些)定量。

术语“富集”意指如通过光密度测定分析从SDS确定的，当与人提取物相比时，兽螨过敏原提取物具有更高浓度的分子量大于50kDa的蛋白质，具体而言，具有更高水平的过敏原Der f 15和Der f 18。

术语“人提取物”意指从本文公开的步骤a)至d)获得的提取物，但是其中步骤c)通过使用3kDa的分子量截留透析膜去除尺寸小于3kDa的分子，并且仅施加大约1巴的压力。

在一个实施方案中，在50％抑制ELISAIgE测定中，本发明第一方面的兽螨过敏原提取物比人提取物有效至少1.5倍，优选地至少2.0倍，最优选地2.0-2.5倍。

在另一个实施方案中，在免疫印迹光密度测定分析中，在所述兽螨过敏原提取物中，Der f 15的浓度比人提取物高至少1.5倍，优选地至少2.0倍，最优选地2.0-3.0倍，和/或其中Der f 18的浓度比人提取物高至少1.5倍，优选地至少2.0倍，最优选地2.0-3.5倍。

在又另一个实施方案中，所述兽螨过敏原提取物包含重组Der f 15和Der f 18，优选地所述重组Der f 15和Der f 18分别与非重组Der f 15和Der f 18具有至少70％、更优选地至少80％、甚至更优选地至少90％的同源性，并且所述兽螨过敏原提取物上调外周血单核细胞中的IFN-γ和IL-10的表达。

根据本发明，重组蛋白质可以使用蛋白质表达系统(例如细菌、酵母、昆虫、植物、禽鸟或哺乳动物表达系统)来表达。合适的系统是本领域技术人员所熟悉的。如本领域技术人员已知的，例如如在Structural Genomics Consortium等人,“Protein Production andPurification”,Nature methods,5,2,135(2008)中概述的，进行蛋白质表达和纯化。在一些实施方案中，所述蛋白质可以被糖基化。

a)使包含螨过敏原的源材料与过敏原提取剂接触，以产生溶解于液相的过敏原和包含非过敏原性残留物的固相的混合物；

d)在3℃-5℃下执行步骤c)直到所述过敏原提取物的电导率低于1050μS/cm为止，和/或直到已经使用特定体积的蒸馏水为止，以获得富集的过敏原提取物。

所述源材料可以选自尘螨科(Pyroglyphidae)，其包括物种粉尘螨、户尘螨和埋内宇尘螨(Euroglyphus maynei)；和/或粉螨科(Acaridae)。

在一个实施方案中，所述源材料是粉尘螨。

在本发明的优选实施方案中，所述源材料是具有＞80％的粉尘螨体的螨培养物。剩余百分比的所述源材料可以包含螨粪便和/或培养基。螨体的百分比可以通过在显微镜下观察螨培养物并且计数螨体相对于螨培养物中其他颗粒的数目来确定。

过敏原是通过用过敏原提取剂提取从所述源材料中获得的，以产生包含溶解于液相中的过敏原和包含“不需要的”非过敏原性残留物的固相的粗过敏原提取物。所述过敏原提取剂可以是水性溶液，并且优选地包含缓冲剂。所述过敏原提取剂可以包含PBS和/或NaCl(例如0.01M PBS/0.15M NaCl的溶液)或碳酸氢铵(NH₄)HCO₃和/或NaCl(例如0.125M(NH₄)HCO₃/0.15M NaCl的溶液)。可以按任何比率在所述过敏原提取剂中提取所述源材料，其中所述过敏原提取剂的重量超过所述源材料的重量，例如1:2、1:3、1:5、1:10、1:20、1:50、1:80。优选地，以1:10的源材料:过敏原提取剂(wt/wt)的比率在所述过敏原提取剂中提取所述源材料。所述提取步骤(步骤a)中源材料与过敏原提取剂的比率可以变化，但是应当使得所述源材料残留物中的过敏原可以溶解于所述过敏原提取剂中。优选地用所述过敏原提取剂提取所述源材料持续足够长的时间，以使所述源材料残留物中的过敏原溶解于所述过敏原提取剂中，所述提取可以持续30分钟至12小时之间，优选地1至6小时之间，更优选地2至5小时之间，并且最优选地约4小时。所述过敏原提取步骤可以在20℃至25℃之间进行，但是优选地在2℃至6℃之间、最优选地在3℃至5℃之间冷进行。在所述过敏原提取步骤期间，优选地将所述源材料与所述过敏原提取剂一起搅拌或搅动。

在所述过敏原提取步骤之后，将溶解于所述液相中的过敏原与所述源材料残留物分离，以产生粗过敏原提取物。所述分离步骤优选地是离心，但是许多将固体与液体分离的技术是可适用的，这些技术为本领域技术人员所熟知。优选地，将溶解于液相中的过敏原在2℃至6℃之间、优选地在3℃至5℃之间离心足够的时间(例如在1分钟至1小时之间或超过1小时)，以使所述源材料残留物沉积为沉淀物。所述粗过敏原提取物(即含有经溶解的过敏原的上清液)可以在2℃至6℃之间储存。可以使用与第一过敏原提取步骤(步骤a)相同的条件，用所述过敏原提取剂进一步提取所述源材料残留物沉淀物，并且优选地持续更长的提取时间，例如4至8小时之间、8至12小时之间或超过12小时。在第二过敏原提取步骤之后，可以将溶解于液相中的过敏原与所述源材料残留物分离，以产生粗过敏原提取物。优选地将来自第一和第二过敏原提取步骤的粗过敏原提取物合并以用于进一步处理。

可以例如使用0.8-1.2μm孔径的过滤器过滤所述粗过敏原提取物。然后使所述粗过敏原提取物经受中等分子部分去除步骤，以去除具有中等分子尺寸的分子，例如低分子量过敏原、盐和其他非过敏原性化合物。在步骤c)中，可以去除分子尺寸小于50kDa的分子。

在所述中等分子部分去除步骤期间，将压力固定在1.2与1.8巴之间。在中等分子部分去除的过程期间施加约1.2至1.8巴的压力的步骤对于本发明是重要的。与在1巴下的现有技术提取方法相比，施加增加的压力提高了所述方法的效率。优选地，将所述压力固定在1.8巴。

所述中等分子部分去除步骤优选地在3℃至5℃下继续进行，直到所述过敏原提取物的电导率小于1050μS/cm、或小于900μS/cm、或小于800μS/cm、或小于700μS/cm、或小于600μS/cm、或优选地小于500μS/cm(在室温下测量)为止。另外，或可替代地，继续进行所述中等分子部分去除步骤，直到已经使用特定体积的蒸馏水为止。渗滤所需的蒸馏水的合适体积可以使用以下公式计算：ml经过滤的提取物x 10＝蒸馏水体积。所得物是富含较高分子量蛋白质的经纯化的天然过敏原提取物。

所述中等分子量去除步骤可以包括超滤步骤、渗滤步骤、渗析步骤或过滤。优选地，所述中等分子量去除步骤(步骤c)包括渗滤步骤。

可以例如使用0.22μm孔径过滤所得的天然过敏原提取物，并且可以将其冷冻或冷冻干燥以进行储存。

本发明进一步包括用于兽螨过敏的治疗和用于兽螨过敏的诊断提取物，二者均包含通过本发明的方法产生的过敏原提取物作为活性成分。如本文所论述，所述兽螨过敏原可能与暴露于螨过敏原(例如粉尘螨)相关，所述螨过敏原引起IgE介导的过敏反应。

根据本发明的进一步方面，提供了一种通过本文描述的方法获得或根据本文描述的方法可获得的兽螨过敏原提取物。

所述兽螨过敏原提取物可以用于治疗动物的螨过敏。在优选的实施方案中，所述过敏原提取物可以用于治疗犬的螨过敏。在另一个优选的实施方案中，所述过敏原提取物可以用于治疗猫的螨过敏，其中所述猫包含血清IgE抗体，所述抗体在免疫印迹测定中与分子量高于40kDa并且包含Der f 15和Der f 18或重组Der f 15和Der f 18的粉尘螨过敏原反应，优选地所述重组Der f 15和Der f 18分别与非重组Der f 15和Der f 18具有至少70％、更优选地至少80％、甚至更优选地至少90％的同源性。

本发明的过敏原提取物可以通过以下物理化学和生物学特性来表征：

i.通过Bradford方法确定的，相对于粉尘螨人提取物，蛋白质含量增加；

ii.在还原条件下通过SDS-PAGE作为条带鉴定的，相对于人提取物，分子量低于30kDa的蛋白质含量降低，除了仍存在于兽提取物中的约20kDa的条带外；

iii.如通过来自Indoor的定量ELISA试剂盒确定的，相对于人提取物，Der f 1(约30kDa)和Der f 2(约15kDa)的含量降低；

iv.在还原条件下通过免疫印迹鉴定的，与人提取物相比，分子量低于30kDa的IgE识别条带减少，除了约20kDa的条带外；

v.通过尺寸排阻色谱法确定的，相对于人提取物，分子量(MW)分布图改变；

vi.通过使用来自致敏个体的特定血清库的IgE ELISA实验确定的，相对于人提取物，IgE结合增加；

vii.通过质谱法鉴定的，存在犬主要过敏原Der f 15和Der f 18；

viii.通过靶向蛋白质组学进行的相对蛋白质定量确定的，相对于人提取物，Derf 15的含量增加；

ix.通过使用来自致敏个体的特定血清库的免疫印迹光密度测定分析确定的，相对于人提取物，Der f 15和Der f 18的含量增加；

x.通过使用来自致敏个体的特定血清库的ELISA50％抑制测定确定的，相对于人提取物，生物效价提高；

xi.在来自对粉尘螨敏感的犬的外周血单核细胞中诱导IL-10和IFN-γ细胞因子的产生。

本发明的过敏原提取物可以用作治疗过敏动物的药物的活性组分，旨在诱导对某些螨过敏原的耐受性。

提供了根据本发明的过敏原提取物在诊断免疫学障碍中(优选地用于检测过敏性疾病)的用途。提供了根据本发明的过敏原提取物用于治疗螨过敏或在制造用于治疗螨过敏的药物中的用途。所述用途可以用于免疫疗法。所述用途可以用于标准化、诊断、合成和疫苗接种目的。所述用途可以用于动物的治疗性治疗，优选地用于免疫疗法。所述用途可以用于在免疫疗法期间监测动物。

根据本发明的进一步方面，提供了一种药物组合物，其包含根据本发明的过敏原提取物。还提供了一种用于治疗螨过敏的药物组合物，其包含药学有效量的根据本发明的兽螨过敏原提取物作为活性成分和至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。提供了一种用于螨过敏的诊断组合物，其包含诊断有效量的根据本发明的过敏原提取物作为活性成分。

根据本发明的进一步方面，提供了一种疫苗，其包含根据本发明的兽螨过敏原提取物。所述药物组合物和疫苗还可以包含一种或多种佐剂、稀释剂、防腐剂或其混合物。所述药物组合物或疫苗可以包含生理上可接受的载体。如本文所用，短语“药学上可接受的”优选地意指经政府监管机构批准，或在欧洲或美国药典或另一种公认的用于动物的药典中列出。

此类药学上可接受的载体可以是无菌液体，例如水和油，所述油包括石油、动物、植物或合成源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。盐水溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括甘露糖醇、淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、碳酸镁、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇水溶液(glycol water)、乙醇等。

提供了一种根据本发明的第一方面的方法可获得的疫苗。所述疫苗可以用于皮下、舌下或表皮使用。

提供了根据本发明的疫苗在治疗螨过敏或在制造用于治疗螨过敏的药物中的用途。

根据本发明的进一步方面，提供了一种预防过敏原致敏的方法，其包括以下步骤：使动物暴露于有效量的本发明的过敏原提取物、药物组合物或疫苗。

根据本发明的进一步方面，提供了一种治疗致敏哺乳动物的螨过敏的方法，其包括向所述哺乳动物给予有效量的本发明的过敏原提取物、药物组合物或疫苗。所述过敏原提取物、所述药物组合物或所述疫苗可以皮下或舌下给予，并且可以作为递增或恒定剂量给予。术语“哺乳动物”不包括人类。

优选地，所述哺乳动物是犬。优选地，所述哺乳动物是猫，其中所述猫包含血清IgE抗体，所述抗体在免疫印迹测定中与分子量高于40kDa并且包含Der f 15和Der f 18或重组Der f 15和Der f 18的粉尘螨过敏原反应，优选地所述重组Der f 15和Der f 18分别与非重组Der f 15和Der f 18具有至少70％、更优选地至少80％、甚至更优选地至少90％的同源性。

通过以下实施例说明本发明，所述实施例详述了用于制备包含过敏原的提取物的方法。

实施例

用于提取物产生的源材料(其也可以称为原材料)是由Laboratorios LETI培养的具有>80％粉尘螨体的螨培养物，并且是可商购获得的。根据以下方法制备了这三种兽提取物：

A.提取I

●对要提取的原材料称重并且记录下重量；

●使用以下公式计算所需的提取剂(PBS 0.01M-NaCl 0.15M)的体积：

原材料(g)x 20＝ml提取剂；

●将原材料置于含有一半提取剂体积(在前述步骤中计算得出)的容器中，并且在3℃-5℃下在磁力搅拌下提取4小时：

ml提取剂(总体积)÷2＝ml提取剂(体积I)；

●将混合物在5℃下在10,000rpm下离心至少30分钟；

●然后回收上清液并且记录下体积。将上清液在经标记的密闭容器中保持在3℃-5℃下。注意避免沉淀物的剩余部分进入上清液，以确保最大的澄清度。

B.提取II

●将来自提取I的沉淀物添加到含有提取剂体积的剩余部分(体积II)的容器中。将混合物在3℃-5℃下搅动提取至少8小时；

●然后将混合物在5℃下在10,000rpm下离心至少30分钟；

●回收上清液并且记录下体积并且弃去沉淀物；

●合并来自提取I和II的上清液并且记录下合并体积；

●通过0.8-1.2μm过滤器过滤合并的上清液。记录下过滤后获得的体积。

C.渗滤

●在50kDa的超滤盒膜中进行提取物溶液的渗滤。在此步骤中，去除分子尺寸小于50kDa的分子；

●根据以下公式计算渗滤所需的蒸馏水的体积：

ml经过滤的提取物x 10＝蒸馏水体积；

●一旦开始渗滤，将压力固定在1.8巴并且将提取物溶液保持在冰上并且连续搅动；

●然后检查经渗滤的提取物的电导率，看其是否小于1050μS/cm。如果电导率较高，则用另外体积的水继续渗滤；

●通过0.22μm过滤器过滤经渗滤的提取物；

●然后将经过滤的提取物等分到黄玉晶体小瓶中并且然后冷冻至-80℃。将小瓶保持在-40℃或以下持续最多15天；

●然后将提取物冷冻干燥。

最终产品由冷冻干燥的兽提取物组成，将其在冷冻干燥条件下在4℃下储存。

免疫化学表征

蛋白质含量

按照制造商的说明，通过Bradford方法确定蛋白质含量。

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

在2.67％C、15％T丙烯酰胺-双丙烯酰胺凝胶中，在还原条件下(将样品与β-巯基乙醇一起孵育并且在95℃下加热10分钟)通过SDS-PAGE鉴定蛋白质谱。将样品和低分子量标准品(BioRad Laboratories，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯)在同一凝胶中跑胶。将凝胶用0.1％考马斯亮蓝R-250(BioRad)染色。还使用任何kD TGX凝胶(BioRad)分析蛋白质谱。将样品、HiMark预染标记物(LifeTechnologies，美国加利福尼亚州)和宽范围分子量标准品(Bio-Rad)在同一凝胶中跑胶。

2D

对于2-D电泳，将提取物纯化并且在2个单独的步骤中用硫酸铵溶液浓缩，直到达到40％和80％的饱和百分比。然后，将样品离心，并且收集沉淀物并且在超纯水中重构。按照制造商的说明，使用ReadyPrep 2-D Cleanup试剂盒(BioRad)洗涤经浓缩的提取物。使用Protean IEF Cell(BioRad)，在pH范围为3至10的ReadyStrip IPG条带(BioRad)上，根据其等电点分离蛋白质。在第一维度之后，将条带用ReadyPrep 2-D试剂盒缓冲液(BioRad)平衡，并且根据其分子量在第二维度中分离蛋白质。按照制造商的说明，将凝胶用Oriole荧光溶液(BioRad)染色。

碳水化合物含量

碳水化合物含量的确定是基于“Current Protocols in Food AnalyticalChemistry E.1.1.1.-E.1.1.8,Eric Fourier(2001)”中所述的程序。简而言之，制备了不同葡萄糖浓度(0-1mg/ml)和从4mg/ml的螨提取物开始的至少四种稀释液的标准曲线。向所有样品中添加体积为0.5ml的苯酚4％和2.5ml的H₂SO₄，涡旋并且在室温下孵育20分钟。然后，在495nm下测量吸光度。用葡萄糖样品结果获得标准曲线，并且内插样品浓度以获得结果。

内毒素含量

通过基于鲎变形细胞溶解物测定的比色技术并且使用Endoscan V系统(CharlesRiver Laboratories)确定内毒素含量(EU/ml)。出于此目的，将样品以1mg/ml溶解于无内毒素的水中，并且制备1/100和1/500的稀释液。

酶活性

按照制造商的说明，用APY-Zym系统(Biomérieux)在粉尘螨提取物中评价了19种不同酶(如下所述)的酶活性。此外，按照制造商的说明，用几丁质酶测定试剂盒(Sigma-Aldrich)分析几丁质酶活性。

免疫印迹

将电泳分离的蛋白质(通过SDS-PAGE)转移到PVDF(聚偏氟乙烯)膜(Trans-

Turbo TM Transfer Pack，BioRad)上，用在磷酸盐缓冲溶液(PBS)0.01mol/L-Tween 0.1％中的5％脱脂乳封闭1小时，并且与在0.01M PBS-0.1％Tween中稀释的来自对过敏原呈阳性的犬的血清一起孵育过夜。用过氧化物酶偶联的抗体抗犬-IgE-PO(Abd Serotec)检测与提取物的特异性IgE结合，用鲁米诺溶液(Western Immun-Star^TM Western C^TM试剂盒，Bio-Rad)显影并且通过化学发光法(ChemiDoc XRS，Bio-Rad)检测。

主要过敏原定量

使用酶联免疫吸附测定检测试剂盒(Indoor Biotechnologies，美国弗吉尼亚洲)，使用ELISA夹心法对主要过敏原进行定量。简而言之，将Nunc Maxisorp板(ThermoScientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)用在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH＝9.6)中稀释的特异性单克隆抗体包被，并且在4℃下孵育过夜。之后，将板用在PBS 0.01M-Tween 0.05％中的BSA(牛血清白蛋白)1％封闭。然后，将样品和标准品添加到用在PBS 0.01M-Tween0.05％中的BSA 1％稀释的系列一半稀释液中。添加第二特异性单克隆抗体(生物素化的)，并且最后使用链霉亲和素。用硫酸终止后，在450nm的光密度(OD)下测量与显影溶液(色原)的反应。通过最小二乘法使用4参数逻辑拟合获得标准曲线，其中内插样品浓度以获得结果。

ELISA测定

通过直接ELISA在血清库中测量对粉尘螨的特异性IgE。简而言之，将微孔板(Immulon IV；Thermo Scientific)用等量的粉尘螨提取物的蛋白质包被，并且在室温下孵育过夜。将板用在PBS 0.01mol/L-Tween 0.1％中的5％脱脂乳封闭1h。将血清库连续稀释并且孵育2h。洗涤后，添加由山羊抗犬IgE:HRP(辣根过氧化物酶)组成的二抗(以1:10000稀释)。最后，洗涤微孔板，使反应显影，并且在自动ELISA读板仪上在450nm下测量OD。

尺寸排阻色谱法

将提取物溶解于40mM pH 7.4磷酸盐缓冲液；NaCl 150mM中，并且通过0.45μm过滤器过滤。将提取物的1mg蛋白质上样到Superdex 75 16/60(GE Healthcare)柱中，并且在

系统(GE Healthcare)中分析。在120分钟期间记录在280nm下的吸光度，并且将色谱图用Unicorn软件分析。

过敏原鉴定

将条带从SDS-PAGE凝胶(考马斯染色的)上切下，用DTT 10mM还原，用碘乙酰胺处理并且用胰蛋白酶消化。通过与5600TRIPLE TOFF质谱分光光度计结合的液相色谱法分析获得的肽。针对NCBI Acari数据库，用MASCOT服务器分析原始数据。

相对蛋白质定量

蛋白质消化：将提取物重悬于50mM NH₄HCO₃(pH 8.5)中。将蛋白质通过超声探头分散-溶解提取，沉淀并且将沉淀物重悬于8M尿素/50mM NH₄HCO₃(pH 8.5)中。将蛋白质还原(DTT 20mM)并且烷基化(碘乙酰胺35mM)。之后，将样品用猪胰蛋白酶消化、纯化、干燥并且在-20℃下储存，直到随后的nanoUPLC-质谱法分析为止。

LC-MSMS分析：在与LTQ-Orbitrap Velos(Thermo Scientific)质谱仪连接的nanoAcquity液相色谱仪(Waters)中分析肽混合物。将肽捕获于Symmetry C18TM捕获柱(Waters)上，并且使用C18反相毛细管柱(Waters)分离。

数据依赖分析(DDA)：使经洗脱的肽在发射器针(PicoTipTM，New Objective)中经受电喷雾电离。在数据依赖模式下分析肽质量(m/z 300-1700)，其中在Orbitrap中获得了全扫描MS。用Thermo Xcalibur(v.2.2)收集所生成的原始数据文件，并且针对粉尘螨数据库进行搜索。

靶向分析：在Skyline(v.3.1)中评价了获得的数据和搜索。选择在测试过程中证明是稳定的以高置信度鉴定的肽。出于定量目的，使用以平行反应监测为目标的MS/MS方法一式三份地获得样品。出于归一化目的，将纤维蛋白肽B标准品(Glufib)(Waters)添加到每种样品中。

用学生T检验与肽水平上的95％置信度，通过利用两种条件之间的统计学显著性，将查询样品(兽提取物)与对照样品(人提取物)进行比较。

ELISA效价测定

简而言之，将微孔板(Immulon IV；Thermo Scientific)用兽粉尘螨提取物(2μg/孔)包被，并且在室温下孵育过夜。将板用在PBS 0.01mol/L；Tween 0.1％中的5％脱脂乳封闭1h。对于抑制测定，在添加到Immulon IV中之前，将血清与抑制提取物的系列稀释液在Nunc板(Thermo Scientific)中一起预孵育2小时。将血清库孵育2h。洗涤后，添加由山羊抗犬IgE:HRP组成的二抗(以1:10000稀释)。最后，洗涤微孔板，使反应显影，并且在自动ELISA读板仪上在450nm下测量光密度(OD)。相对于logμg提取物表示血清抑制的百分比，以计算产生50％抑制的μg。

猫免疫印迹

将兽和人粉尘螨提取物经过电泳分离(通过SDS-PAGE)并且转移到PVDF(聚偏氟乙烯)膜(Trans-

Turbo TM Transfer Pack，BioRad)上，通过在室温下干燥膜封闭1小时并且与在0.01M PBS中以1/6稀释的来自猫的血清一起孵育过夜。通过将膜与生物素化的抗体抗猫IgE(Greer)一起孵育2小时检测膜与提取物的特异性IgE结合，然后与链霉亲和素孵育1小时，用鲁米诺溶液(Western Immun-StarTM Western CTM试剂盒，Bio-Rad)显影并且通过化学发光(ChemiDoc XRS，Bio-Rad)检测。

SDS-PAGE

在还原条件下，用15％丙烯酰胺凝胶(图1)和TGX商业凝胶(Bio-Rad)(图2)，通过SDS-PAGE分析冻干样品的10μg蛋白质。图中标明了在样品中鉴定的主要过敏原。

在兽提取物1、2和3中观察到相同的蛋白质谱(图1)，其中相对于人提取物，Der f2条带(约15kDa)和Der f 1条带(约30kDa)显著减少，并且高于40kDa的蛋白质强度增强。在这三种兽提取物中，相对于人提取物，在先前研究中被鉴定为铁蛋白的约20kDa的条带也更为明显。

关于TGX凝胶(图2)，在提取物1、2和3中观察到相同的蛋白质谱。此外，在人和兽提取物之间也观察到相关过敏原的相同差异。

2D

作为对兽提取物蛋白质谱分析的另一项研究，进行了2D电泳。纯化每种提取物的相同量的蛋白质，并且通过SDS-PAGE分析(图3)。

然后，将170μg的每种样品进行第一维度等电聚焦。接下来，通过SDS-PAGE对所有提取物进行第二维度分析，并且进行Oriole染色。如在图4可以观察到的，针对这三种兽提取物获得了几乎相同的蛋白质谱。与人提取物相比，在兽提取物中观察到更高比例的20-100kDa之间和酸性pH下的蛋白质(人提取物的2D蛋白质谱来自先前的研究)。

尺寸排阻色谱法

最后，作为兽提取物相对于人提取物的MW分布改变的补充分析，所有样品均通过尺寸排阻色谱法分析。将每种提取物的相同量的蛋白质(1mg)注入Superdex 75 16/60柱中，并且在

explorer系统中分析，以获得每种样品在非还原条件下的MW分布。将提取物溶解于磷酸盐缓冲液40mM pH 7.4NaCl 150mM中，并且将大约2ml的体积注入柱中。针对所有提取物获得的色谱图均示于图5中。

针对所有提取物均获得了两个主要色谱峰，一个在大约56min的时间，并且第二个在100min的时间。然而，当将来自兽提取物的色谱图(图5B-D)与人提取物获得的色谱图(图5A)进行比较时，可以观察到，兽提取物在较高洗脱时间(其对应于较低MW蛋白质)下呈现出280nm Abs信号的减少(峰2)。另一方面，与人提取物相比，兽提取物的含有高MW蛋白质的峰1有所增加。

主要过敏原定量

与人提取物相比，在这三种兽提取物中对人主要过敏原Der f 1和Der f 2进行定量。以μg/mg冻干提取物计的两种过敏原的平均含量示于表1中。

表1：人提取物和兽提取物的Der f 1和Der f 2含量(μg/mg±SD)(n＝2)

在这三种兽提取物中，Der f 1低于4μg/mg，并且相对于人提取物，平均减少了4.5倍。发现在所有兽提取物中的Der f 2均低于1.5μg/mg，其表示相对于人提取物减少了22倍。

碳水化合物含量

用硫酸和苯酚作为试剂，通过分光光度法确定所有提取物中相当于葡萄糖的碳水化合物含量。以μg葡萄糖/mg冻干提取物获得的结果示于表2中。

表2：人提取物和兽提取物的葡萄糖含量(μg/mg±SD)(n＝2)

与人提取物相比，这三种兽提取物呈现出非常相似的碳水化合物含量，但是提取物3在测定之间示出了较高的可变性。

内毒素含量

确定提取物的内毒素含量。将这四种提取物以1mg/ml的浓度溶解。在每种情况下均使用1/100和1/500的稀释液。表3示出了每种稀释液和每种提取物获得的以EU/ml和EU/mg冻干提取物计的平均内毒素含量。

表3：人和兽提取物的内毒素含量(n＝2)

提取物1在两种测试的稀释液之间呈现出较高的可变性。然而，所有内毒素含量值均在相似的范围内，在30-90EU/mg冻干提取物之间，并且提取物之间的差异可能是由于用于每种提取物产生的不同的原材料。

酶活性

大多数螨过敏原具有酶活性，因此分析提取物的酶活性很重要。将API-ZYM系统用于评价19种不同酶的活性：碱性磷酸酶、酯酶(C4)、酯酶脂肪酶(C8)、脂肪酶(C14)、亮氨酸芳基酰胺酶、缬氨酸芳基酰胺酶、胱氨酸芳基酰胺酶、胰蛋白酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、N-乙酰基-β-氨基葡糖苷酶、α-甘露糖苷酶和α-岩藻糖苷酶。在蒸馏水中以1mg蛋白质/ml制备样品。在将每种样品与底物一起孵育之后，酶活性显色持续了10分钟。根据说明手册以光学方式解释结果，范围为0到5(0意指无颜色，5意指非常强烈的颜色)。结果为2或以下被认为是阴性的。根据所分析的酶的种类，将不同酶活性的半定量确定结果分为几组。

磷酸酶(表4)在所有提取物中均为阳性，是酸性磷酸酶中发现的最强的活性。在人和兽提取物之间未发现差异。

表4：通过APIZYM确定的人和兽提取物的磷酸酶活性

关于蛋白酶(表5)，在任何提取物中均未发现半胱氨酸芳基酰胺酶活性，然而在所有的提取物中缬氨酸和亮氨酸芳基酰胺酶均为阳性并且相似。与人提取物相比，兽提取物中的胰蛋白酶活性更低或甚至为阴性，并且在所有提取物中α-胰凝乳蛋白酶均为阳性(这与Morales等人(Enzymatic Activity of Allergenic House Dust and Storage MiteExtracts,J.Med.Entonol.,2013,50,147-54)获得的结果相反，其在人粉尘螨提取物中未发现α-胰凝乳蛋白酶活性)。

表5.通过APIZYM确定的人和兽提取物的蛋白酶活性

表6含有关于脂肪酶的信息。在提取物中未发现脂肪酶活性，然而在所有提取物中酯酶和酯酶脂肪酶均为阳性并且相似，除了提取物2对酯酶呈阴性。

表6.通过APIZYM确定的人和兽提取物的脂肪酶活性

最后，表7总结了葡糖苷酶活性。此活性在所有提取物中均明显，对所有测试的酶类型均呈阳性。在人和兽提取物之间未发现相关差异，除了β-半乳糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶外，与人提取物(水平4)相比，在所有兽提取物中，它们呈现出5的APIZYM水平。

表7.通过APIZYM确定的人和兽提取物的葡糖苷酶活性

因此，通常可以说，在人和兽提取物之间就酶活性而论存在一些差异。此结果通过在透析过程期间兽提取物中一些类型的蛋白质的损失来解释，其中许多所述蛋白质可能具有酶活性。另一方面，这三种兽提取物呈现出非常相似的酶活性谱，这证明了产品的高度一致性。

除APIZYM系统外，还按照制造商的说明，用几丁质酶测定试剂盒(Sigma-Aldrich)评价提取物的几丁质酶活性。所述试剂盒是基于几丁质酶底物的酶水解，其释放对硝基苯酚，在405nm下在碱性pH下可以测量对硝基苯酚。所述试剂盒提供了三种不同的底物，以用于检测各种类型的几丁质分解活性。以5mg/ml的浓度制备样品用于测试。表8示出了每种样品和每种水解底物的几丁质酶活性。

表8.人和兽提取物对三种不同底物的几丁质酶活性(n＝2)

底物1：4-硝基苯基N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷；底物2：4-硝基苯基N,N′-二乙酰基-β-D-壳二糖苷；底物3：4-硝基苯基β-D-N,N’,N”-三乙酰基壳三糖。

关于底物1和3，在提取物之间在以mU/mg蛋白质计的几丁质酶活性方面没有相关差异。对于底物3，可能由于不同的孵育时间，在测定之间观察到高标准偏差。与兽提取物相比，在人提取物中的底物2(其适合于外切几丁质酶活性检测)更高。因此，尽管事实是Der f15和Der f 18被描述为几丁质酶，但是在兽提取物中未检测到几丁质酶活性的增加。

过敏原鉴定(质谱法测序)

为了证实犬主要过敏原Der f 15和Der f 18在这三种兽提取物中的存在，从用考马斯染色的SDS凝胶上切下预期MW为109/96kDa(Der f 15)和60kDa(Der f 18)的蛋白质条带，并且送至CSIC的蛋白质组学部门(Proteomics Unit)(“国家生物技术中心(CentroNacional de Biotecnología)”，西班牙马德里)。将蛋白质用胰蛋白酶消化，并且通过质谱法对获得的肽测序，并且通过MASCOT与知识库进行比较。

在图6中，对于每种兽提取物，具有匹配的肽的从Der f 15(SEQ ID NO.1)和Der f18(SEQ ID NO.2)获得的序列加下划线显示，并且显示了序列覆盖百分比。

过敏原的相对定量

为了证明在兽提取物中实现了犬主要过敏原Der f 15和Der f 18的增加，开发了一种通过靶向蛋白质组学(LC-MS/MS)进行相对蛋白质定量的新的方法。此研究是由“巴塞罗那公园中心(Parc Cientific de Barcelona)”的蛋白质组学部门(西班牙巴塞罗那)进行的。

为了此目的，选择人提取物作为标准品，并且选择兽提取物提取物2作为查询样品。将两种样品均用胰蛋白酶消化，并且将获得的肽溶液根据上述方法通过nanoUPLC-质谱法分析来分析。针对Uniprot粉尘螨数据库对获得的原始数据文件进行搜索。选择来自Derf 15的三种肽和来自Der f 18的两种肽(表9)用于定量测定，这五种肽在整个过程中证明是稳定的，并且不存在可检测性、降解或非最佳电离的问题。计算在三种不同分析中获得的每种肽的峰面积，并且将其用于统计学分析。

表9.用于定量测定的所获得的肽的特征

与人提取物相比，在兽提取物提取物2中，对于Der f 15，有显著的2.97倍的增加(即x 2.97)，而与人提取物相比，在提取物2中，对于Der f 18，有0.24显著倍数变化(即x0.24)。

这些结果证实，与人粉尘螨提取物相比，兽提取物含有更高含量的Der f 15过敏原。

免疫印迹

用来自对这种螨敏感的犬的血清库(以1/5稀释)通过免疫印迹分析每种提取物的10μg蛋白质(图7)。免疫印迹结果证实了在人和兽提取物之间蛋白质识别谱的改变，并且突出了在这三种提取物之间的一致性。

直接ELISA

所有提取物还用同一血清库通过直接ELISA分析(将每种提取物的8μg蛋白质/ml用于包被板)。与人提取物相比，发现这三种兽提取物的特异性IgE水平更高(图8)，这显示了对于兽提取物，来自患有特应性皮炎的犬的血清库具有更高的亲和力。

总结

从三种粉尘螨一致性提取物的产生和表征中获得的主要结果如下：

●如通过不同分析程序证明的，使用50k

膜和高压的经优化的超滤方法允许获得具有高度一致性的三种粉尘螨提取物；

●在制造过程中，相对于人提取物，兽提取物产量较低但是蛋白质含量较高；

●如通过电泳、尺寸排阻色谱法和人主要过敏原定量证明的，相对于人提取物，这三种提取物呈现出改变的蛋白质谱，具有更高比例的高MW蛋白质以及显著减少的人主要过敏原；

●关于其他提取物特征，例如碳水化合物和内毒素含量，在人和兽提取物之间未发现相关差异。在人和兽提取物之间在一些酶活性方面存在细微差异，但是就几丁质酶活性而论，兽提取物中的这种酶活性没有增加；

●通过质谱法在所有提取物中均鉴定到了犬主要过敏原Der f 15和Der f 18。此外，优化了先前从未用于表征提取物的新的方法，用于通过靶向蛋白质组学进行相对蛋白质定量。此技术允许用其中一种兽提取物证明相对于人提取物，在此样品中，Der f 15显著增加；

●从免疫学角度来看，与人天然提取物相比，对于这三种兽提取物，来自对这种螨敏感的犬的血清库呈现出更高的特异性IgE水平。

兽粉尘螨提取物标准化

1.1体内研究

将兽提取物4(以与之前的兽提取物1至3相同的方式制备)用于制备对粉尘螨敏感的犬的皮内测试溶液。出于此目的，在SSFA(含有白蛋白的盐水加酚溶液)中制备浓度为1mg/ml的提取物溶液，在搅动下保持2小时，并且用0.22μm过滤器过滤。与兽提取物4一起，用盐酸组胺0.05mg/ml(阳性对照)和作为阴性对照的SSFA对犬进行测试。

●在研究中包括如下动物：

十四只在1与6岁之间的犬，临床诊断为特应性皮炎，并且针对粉尘螨呈现出>1000ELISA吸光度单位(EAU)的特异性IgE(来自Greer Laboratories的ELISA测试)。排除具有以下特征的犬：用皮质类固醇、环孢霉素A、免疫抑制化合物治疗的犬；用免疫疗法治疗的犬；患有细菌、病毒或寄生虫感染、免疫缺陷或免疫病理学疾病的犬。

从每只动物中抽取5ml血清样品用于体外分析。

●皮内测试程序：

将50μl的提取物溶液以1mg/ml或对照一式两份地皮内注射到先前剃毛的动物的胸腔区。注射15分钟后，将产生的风团抽出并且转移到纸上。

●风团尺寸分析：

用PC Draft(Microspot)软件测量风团的面积。如果面积≥7mm²，则风团尺寸被认为是阳性的。

结果：

所有动物均对兽提取物4呈阳性，平均风团尺寸为115.3±66.8mm²。

1.2体外研究

●血清样品表征

通过直接ELISA(先前已经描述了方法)针对先前使用的兽提取物4和人提取物分析了每种血清样品的特异性IgE。相对于人粉尘螨提取物，对于兽提取物4，所有血清样品均呈现出显著更高的特异性IgE值(图9)。

●生物效价

将所有血清样品用于制备库，以通过ELISA效价测定进行体外标准化。在表10中示出了从5种不同的测定中获得血清库的50％抑制所必需的兽提取物4的量(μg)。

表10：从5种不同的测定中获得犬血清库的50％抑制所必需的兽提取物4的量(μg)

针对50％抑制获得的平均值是0.062±0.006μg。在此测定中获得的曲线的例子示于图10中。针对如前所述制备的不同批次的兽提取物(提取物5)，计算50％抑制。获得的值是0.066μg。此结果证明了不同兽提取物批次在生物效价(IgE总过敏原活性)方面的一致性。

兽提取物相对于人提取物的生物效价比较

将先前描述的ELISA效价测定用于分析兽提取物4相对于人提取物的效价。图11示出了在此测定中获得的曲线。

达到50％抑制特应犬(以与在“兽粉尘螨提取物标准化”下所述相同的方式选择)血清库所必需的人提取物的量是0.132μg，这表示相对于兽提取物4(0.062μg)增加了2.13倍，这证明在生物效价方面，兽提取物4相对于人提取物大约两倍有效。

用于估算Der f 15和Der f 18含量的免疫印迹光密度测定分析

通过光密度测定法对蛋白质和过敏原谱进行分析可以用作估算提取物中过敏原含量的方法。因此，分析了在“兽提取物相对于人提取物的生物效价比较”中描述的用血清库获得的过敏原谱中的Der f 15和Der f 18过敏原的条带强度。通过ImageQuant软件(GEHealthcare)分析对应于不同兽提取物和人粉尘螨提取物的免疫印迹实验的图像。在不同样品中分析并且比较了每个蛋白质条带的光密度测定体积及其分子量。

图12和图13示出了通过ImageQuant软件分析的免疫印迹图像，显示了分析中包括的样品以及主要过敏原Der f 15和Der f 18。图14示出了通过ImageQuant软件在两个图像中均鉴定到的条带。针对所分析的不同参数以及针对每种样品获得的值示于表11和表12中。

表11.在来自图12的图像中鉴定的每个条带的体积和MW。对应于Der f 15(编号1和2)和Der f 18(编号4)过敏原的条带以粗体标记。

表12.在来自图13的图像中鉴定的每个条带的体积和MW。对应于Der f 15(编号1和2)和Der f 18(编号4)过敏原的条带以粗体标记。

来自表11和表12的1号和2号条带对应于所有样品中的Der f 15过敏原，然而Derf 18对应于4号条带。表13和表14总结了对应于这些过敏原的体积(强度)的信息以及相对于人提取物的倍数增加：

表13.Der f 15和Der f 18的体积以及相对于人提取物的倍数增加(在括号中)(图12)。

表14.Der f 15和Der f 18的体积以及相对于人提取物的倍数增加(在括号中)(图13)。

显示出对Der f 15和Der f 18过敏原的识别的强度体积显示了兽提取物相对于人提取物的高度增加(在2.2至与3.4倍之间的增加，即在x 2.2与x 3.4之间的增加)。这些结果支持相对于粉尘螨人提取物，兽提取物中这些过敏原的量增加。

用于治疗其他哺乳动物的过敏的兽提取物：猫

为了评价兽提取物是否可以用于治疗除犬以外的哺乳动物的过敏，分析了对粉尘螨过敏的猫的敏感特性。

在研究中包括对粉尘螨呈阳性(EAU>150；来自Greer Laboratories的ELISA测试)的七只动物(1-7)和两个阴性对照(C1、C2)(EAU<150)。

图15示出了在研究中包括的不同动物的过敏原谱。在兽提取物4和/或人提取物中，所有阳性动物(1-7号)均识别出分子量从14至100kDa以上的条带，然而阴性对照(C1、C2)未显示任何识别条带。

在阳性动物中发现了两个主要的过敏原谱，其中识别的条带的MW明显不同。两只动物识别出低MW的条带，然而几只动物主要识别出高于40kDa的蛋白质。2号猫主要识别出20kDa的条带，并且7号猫识别出30和14kDa的条带，这可能与人主要过敏原Der f 1和Der f2相对应。相比之下，1、3、4和6号猫主要识别出高于40kDa的蛋白质，包括犬主要过敏原Derf 15和Der f 18。最后，5号猫识别出高和低MW的蛋白质。

根据此信息，可以用兽螨过敏原提取物治疗如下那些猫，所述猫呈现出高于40kDa的条带的过敏原谱，并且包括Der f 15和Der f 18过敏原。

体外细胞测定

此研究的目的是评价兽粉尘螨提取物2和人粉尘螨提取物在来自特应犬和非特应犬的外周血单个核细胞(PBMC)中诱导细胞因子产生的能力。

1.1.方法

从四只特应犬和三只健康对照获得PBMC培养上清液。这四只特应犬呈现出特应性皮炎的临床病史和针对粉尘螨>1000EAU(来自Greer Laboratories的ELISA测试)的特异性IgE水平。排除具有以下特征的犬：用皮质类固醇、环孢霉素A和免疫抑制化合物治疗的犬；用免疫疗法治疗的犬；患有细菌、病毒或寄生虫感染、免疫缺陷或免疫病理学疾病的犬。这三只健康的犬没有呈现出任何临床症状，并且具有针对粉尘螨<150EAU的特异性IgE水平。

通过根据制造商的说明进行的基于ELISA的

Mag Dog试剂盒(Millipore)测量上清液中的细胞因子含量。简而言之，用人提取物或兽提取物2(40μg蛋白质/ml)一式三份地刺激来自供体(四只特应的和三只非特应对照)的PBMC(2.5x10⁶个细胞/孔)，并且在37℃下在5％CO₂气氛中培养24和48小时后，一式两份地测量培养上清液中的IFN-γ和IL-10的产生。将培养基RPMI-1640(Sigma-Aldrich)用作阴性对照，并且将伴刀豆球蛋白A(Con A，3μg/ml)和LPS(脂多糖，3μg/ml)用作阳性对照。

对于细胞因子定量，相对于五参数逻辑曲线调整标准数据，并且进行U Mann-Whitney统计学分析。p值<0.05被认为是统计学显著的。

1.2.结果

细胞研究显示，在特应犬和对照犬中，人和兽提取物对IFN-γ和IL-10的诱导相似(图16)。24小时后，人和兽药提取物诱导的IL-10水平比阴性对照显著更高(人提取物的中值(IQ)为1170[559-1502]pg/ml，兽提取物的中值(IQ)为1748[1122-1998]pg/ml)。孵育48小时后，来自用人(52.1[15-113.2]pg/ml)和兽提取物(50.4[20-76.3]pg/ml)治疗的特应犬的细胞中的IFN-γ也比阴性对照显著更高。

在所有情况下，来自阳性对照(ConA和LPS)的结果均比阴性对照显著更高(p<0.05)，数据未显示。

还比较了特应犬和非特应犬。相对于特应犬，在用人和兽提取物治疗的非特应犬中观察到两种细胞因子的水平更高。

成功的过敏原免疫疗法应当伴有调节性T细胞(Treg)的诱导以及从Th2反应向Th1反应的转变。此外，免疫疗法的成功与过敏原疫苗特异性刺激IL-10和IFN-γ产生以及IL-4降低的能力相关，IL-10和IFN-γ分别参与Treg和Th1反应。此研究证明了人和兽粉尘螨提取物在来自对这种螨敏感的犬的PBMC中诱导IL-10和IFN-γ的产生(表明诱导Th1和Treg反应，并且因此诱导可能导致耐受性的有益的免疫反应)的能力。

由于在研究中包括的犬先前未用免疫疗法进行过治疗，因此与用人提取物治疗的那些犬相比，目前未观察到用兽提取物治疗的犬的Th1能力的改变是正常的。然而，IL-10的上调证明兽提取物具有重新建立平衡Th1-Th2的能力。与免疫疗法治疗后用人提取物治疗的犬相比，用兽提取物治疗的犬中的IFN-γ水平预计显著提高。

非特应动物处于免疫状态，其中Th2/Th1反应之间具有正确的平衡，并且因此，细胞因子产生的特性也不同。因此，在非特应犬中观察到较高水平的IL-10和IFN-γ，因为在基础状态下，它们比特应犬产生更多的这些调节性细胞因子，并且在用人和兽粉尘螨提取物刺激后，产生进一步增加。

序列表

<110> LABORATORIOS LETI, S.L. Unipersonal

<120> 兽用产品

<130> P8753WO1

<150> EP17382527.4

<151> 2017-07-31

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 555

<212> PRT

<213> 粉尘螨

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> gi5815436 Der f 15

<400> 1

Met Lys Thr Ile Tyr Ala Ile Leu Ser Ile Met Ala Cys Ile Gly Leu

1 5 10 15

Met Asn Ala Ser Ile Lys Arg Asp His Asn Asp Tyr Ser Lys Asn Pro

20 25 30

Met Arg Ile Val Cys Tyr Val Gly Thr Trp Ser Val Tyr His Lys Val

35 40 45

Asp Pro Tyr Thr Ile Glu Asp Ile Asp Pro Phe Lys Cys Thr His Leu

50 55 60

Met Tyr Gly Phe Ala Lys Ile Asp Glu Tyr Lys Tyr Thr Ile Gln Val

65 70 75 80

Phe Asp Pro Tyr Gln Asp Asp Asn His Asn Ser Trp Glu Lys Arg Gly

85 90 95

Tyr Glu Arg Phe Asn Asn Leu Arg Leu Lys Asn Pro Glu Leu Thr Thr

100 105 110

Met Ile Ser Leu Gly Gly Trp Tyr Glu Gly Ser Glu Lys Tyr Ser Asp

115 120 125

Met Ala Ala Asn Pro Thr Tyr Arg Gln Gln Phe Ile Gln Ser Val Leu

130 135 140

Asp Phe Leu Gln Glu Tyr Lys Phe Asp Gly Leu Asp Leu Asp Trp Glu

145 150 155 160

Tyr Pro Gly Ser Arg Leu Gly Asn Pro Lys Ile Asp Lys Gln Asn Tyr

165 170 175

Leu Ala Leu Val Arg Glu Leu Lys Asp Ala Phe Glu Pro His Gly Tyr

180 185 190

Leu Leu Thr Ala Ala Val Ser Pro Gly Lys Asp Lys Ile Asp Arg Ala

195 200 205

Tyr Asp Ile Lys Glu Leu Asn Lys Leu Phe Asp Trp Met Asn Val Met

210 215 220

Thr Tyr Asp Tyr His Gly Gly Trp Glu Asn Phe Tyr Gly His Asn Ala

225 230 235 240

Pro Leu Tyr Lys Arg Pro Asp Glu Thr Asp Glu Leu His Thr Tyr Phe

245 250 255

Asn Val Asn Tyr Thr Met His Tyr Tyr Leu Asn Asn Gly Ala Thr Arg

260 265 270

Asp Lys Leu Val Met Gly Val Pro Phe Tyr Gly Arg Ala Trp Ser Ile

275 280 285

Glu Asp Arg Ser Lys Leu Lys Leu Gly Asp Pro Ala Lys Gly Met Ser

290 295 300

Pro Pro Gly Phe Ile Ser Gly Glu Glu Gly Val Leu Ser Tyr Ile Glu

305 310 315 320

Leu Cys Gln Leu Phe Gln Lys Glu Glu Trp His Ile Gln Tyr Asp Glu

325 330 335

Tyr Tyr Asn Ala Pro Tyr Gly Tyr Asn Asp Lys Ile Trp Val Gly Tyr

340 345 350

Asp Asp Leu Ala Ser Ile Ser Cys Lys Leu Ala Phe Leu Lys Glu Leu

355 360 365

Gly Val Ser Gly Val Met Val Trp Ser Leu Glu Asn Asp Asp Phe Lys

370 375 380

Gly His Cys Gly Pro Lys Asn Pro Leu Leu Asn Lys Val His Asn Met

385 390 395 400

Ile Asn Gly Asp Glu Lys Asn Ser Phe Glu Cys Ile Leu Gly Pro Ser

405 410 415

Thr Thr Thr Pro Thr Pro Thr Thr Thr Pro Thr Thr Pro Thr Thr Thr

420 425 430

Pro Thr Thr Pro Ser Pro Thr Thr Pro Thr Thr Thr Pro Ser Pro Thr

435 440 445

Thr Pro Thr Thr Thr Pro Ser Pro Thr Thr Pro Thr Thr Thr Pro Ser

450 455 460

Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Ala Pro Thr Thr Ser

465 470 475 480

Thr Pro Ser Pro Thr Thr Thr Glu His Thr Ser Glu Thr Pro Lys Tyr

485 490 495

Thr Thr Tyr Val Asp Gly His Leu Ile Lys Cys Tyr Lys Glu Gly Asp

500 505 510

Ile Pro His Pro Thr Asn Ile His Lys Tyr Leu Val Cys Glu Phe Val

515 520 525

Asn Gly Gly Trp Trp Val His Ile Met Pro Cys Pro Pro Gly Thr Ile

530 535 540

Trp Cys Gln Glu Lys Leu Thr Cys Ile Gly Glu

545 550 555

<210> 2

<211> 462

<212> PRT

<213> 粉尘螨

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> gi27550039 Der f 18

<400> 2

Met Thr Arg Phe Ser Leu Thr Val Leu Ala Val Leu Ala Ala Cys Phe

1 5 10 15

Gly Ser Asn Ile Arg Pro Asn Val Ala Thr Leu Glu Pro Lys Thr Val

20 25 30

Cys Tyr Tyr Glu Ser Trp Val His Trp Arg Gln Gly Glu Gly Lys Met

35 40 45

Asp Pro Glu Asp Ile Asp Thr Ser Leu Cys Thr His Ile Val Tyr Ser

50 55 60

Tyr Phe Gly Ile Asp Ala Ala Thr His Glu Ile Lys Leu Leu Asp Glu

65 70 75 80

Tyr Leu Met Lys Asp Leu His Asp Met Glu His Phe Thr Gln His Lys

85 90 95

Gly Asn Ala Lys Ala Met Ile Ala Val Gly Gly Ser Thr Met Ser Asp

100 105 110

Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Val Glu His Tyr Arg Glu Thr Phe Val

115 120 125

Val Ser Thr Val Asp Leu Met Thr Arg Tyr Gly Phe Asp Gly Val Met

130 135 140

Ile Asp Trp Ser Gly Met Gln Ala Lys Asp Ser Asp Asn Phe Ile Lys

145 150 155 160

Leu Leu Asp Lys Phe Asp Glu Lys Phe Ala His Thr Ser Phe Val Met

165 170 175

Gly Val Thr Leu Pro Ala Thr Ile Ala Ser Tyr Asp Asn Tyr Asn Ile

180 185 190

Pro Ala Ile Ser Asn Tyr Val Asp Phe Met Asn Val Leu Ser Leu Asp

195 200 205

Tyr Thr Gly Ser Trp Ala His Thr Val Gly His Ala Ser Pro Phe Pro

210 215 220

Glu Gln Leu Lys Thr Leu Glu Ala Tyr His Lys Arg Gly Ala Pro Arg

225 230 235 240

His Lys Met Val Met Ala Val Pro Phe Tyr Ala Arg Thr Trp Ile Leu

245 250 255

Glu Lys Met Asn Lys Gln Asp Ile Gly Asp Lys Ala Ser Gly Pro Gly

260 265 270

Pro Arg Gly Gln Phe Thr Gln Thr Asp Gly Phe Leu Ser Tyr Asn Glu

275 280 285

Leu Cys Val Gln Ile Gln Ala Glu Thr Asn Ala Phe Thr Ile Thr Arg

290 295 300

Asp His Asp Asn Thr Ala Ile Tyr Ala Val Tyr Val His Ser Asn His

305 310 315 320

Ala Glu Trp Ile Ser Phe Glu Asp Arg His Thr Leu Gly Glu Lys Ala

325 330 335

Lys Asn Ile Thr Gln Gln Gly Tyr Ala Gly Met Ser Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Ser Asn Glu Asp Val His Gly Val Cys Gly Asp Lys Asn Pro Leu Leu

355 360 365

His Ala Ile Gln Ser Asn Tyr Tyr His Gly Val Val Thr Glu Pro Thr

370 375 380

Val Val Thr Leu Pro Pro Val Thr His Thr Thr Glu His Val Thr Asp

385 390 395 400

Ile Pro Gly Val Phe His Cys His Glu Glu Gly Phe Phe Arg Asp Lys

405 410 415

Thr Tyr Cys Ala Thr Tyr Tyr Glu Cys Lys Lys Gly Asp Phe Gly Leu

420 425 430

Glu Lys Thr Val His His Cys Ala Asn His Leu Gln Ala Phe Asp Glu

435 440 445

Val Ser Arg Thr Cys Ile Asp His Thr Lys Ile Pro Gly Cys

450 455 460

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 粉尘螨

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> Der f 15 835.38

<400> 3

Phe Asp Gly Leu Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Gly Ser Arg

1 5 10

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> 粉尘螨

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> Der f 15 776.38

<400> 4

Val Asp Pro Tyr Thr Ile Glu Asp Ile Asp Pro Phe Lys

1 5 10

<210> 5

<211> 14

<212> PRT

<213> 粉尘螨

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> Der f 15 813.89

<400> 5

Ile Trp Val Gly Tyr Asp Asp Leu Ala Ser Ile Ser Cys Lys

1 5 10

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> 粉尘螨

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> Der f 18 505.99

<400> 6

Thr Val His His Cys Ala Asn His Leu Gln Ala Phe Asp Glu Val Ser

1 5 10 15

Arg

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 粉尘螨

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> Der f 18 383.19

<400> 7

Gly Asp Phe Gly Leu Glu Lys

1 5

Claims

1.一种兽螨过敏原提取物，其富含分子量大于50kDa的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的兽螨过敏原提取物，其中所述提取物源自粉尘螨(Dermatophagoides farinae)。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的兽螨过敏原提取物，其中相对于人提取物，所述提取物富含过敏原Der f 15和Der f 18，和/或其中相对于人提取物，所述提取物具有更低水平的过敏原Der f 1和Der f 2。

4.根据任一项前述权利要求所述的兽螨过敏原提取物，其中在50％抑制ELISA IgE测定中，所述兽螨过敏原提取物比人提取物有效至少1.5倍，优选地至少2.0倍，最优选地2.0-2.5倍。

5.根据任一项前述权利要求所述的兽螨过敏原提取物，其中在免疫印迹光密度测定分析中，Der f 15的浓度比人提取物高至少1.5倍，优选地至少2.0倍，最优选地2.0-3.0倍，和/或其中Der f 18的浓度比人提取物高至少1.5倍，优选地至少2.0倍，最优选地2.0-3.5倍。

6.根据前述权利要求中任一项所述的兽螨过敏原提取物，其中所述兽螨过敏原提取物包含重组Der f 15和Der f 18，优选地所述重组Der f 15和Der f 18分别与非重组Der f15和Der f 18具有至少70％、更优选地至少80％、甚至更优选地至少90％的同源性，并且所述兽螨过敏原提取物上调外周血单核细胞中的IFN-γ和IL-10的表达。

7.一种用于产生兽螨过敏原提取物的方法，其包括：

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述螨过敏原是粉尘螨。

9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述分离步骤是离心。

10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中所述中等分子部分去除步骤包括超滤步骤、渗滤步骤、渗析步骤或过滤。

11.一种通过根据权利要求7至10中任一项所述的方法获得或根据权利要求7至10中任一项所述的方法可获得的兽螨过敏原提取物。

12.根据权利要求11所述的兽螨过敏原提取物，其中所述源材料是粉尘螨。

13.根据权利要求1至6、11或12中任一项所述的兽螨过敏原提取物，用于治疗动物、优选地哺乳动物、更优选地犬和/或猫的螨过敏，其中所述猫包含血清IgE抗体，所述抗体在免疫印迹测定中与分子量高于40kDa并且包含Der f 15和Der f 18或重组Der f 15和Der f18的粉尘螨过敏原反应，优选地所述重组Der f 15和Der f 18分别与非重组Der f 15和Der f 18具有至少70％、更优选地至少80％、甚至更优选地至少90％的同源性。

14.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至6、11或12中任一项所述的兽螨过敏原提取物。

15.一种疫苗，其包含根据权利要求1至6、11或12中任一项所述的兽螨过敏原提取物。