RU2819906C2

RU2819906C2 - Ветеринарный продукт

Info

Publication number: RU2819906C2
Application number: RU2020105299A
Authority: RU
Inventors: Херонимо Карнес САНЧЕС; Ракель Мойя ЛОБО; Лаура Рамио ЛЬЮЧ; Пилар Брасис КАУБЕТ; Анна Пучдемон РОДРИГЕС
Original assignee: Лети Фарма, С.Л.
Priority date: 2017-07-31
Filing date: 2018-07-30
Publication date: 2024-05-28

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен ветеринарный экстракт клещевых аллергенов для лечения аллергии на клещевые аллергены, где экстракт обогащен аллергенами Der f 15 и Der f 18 и содержит менее 4 мкг/мг Der f 1 и менее 1,5 мкг/мг Der f 2. Также предложены способ получения указанного экстракта, фармацевтическая композиция и вакцина для лечения аллергии на клещевые аллергены, содержащие эффективное количество указанного экстракта. Изобретение обеспечивает повышение связывания IgE образцов сыворотки от млекопитающих, страдающих от атопического дерматита, вызванного Dermatophagoides farinae. 5 н. и 5 з.п. ф-лы, 16 ил., 14 табл.

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к обогащенному очищенному ветеринарному экстракту аллергенов. В частности, данное изобретение относится к очищенному ветеринарному экстракту аллергенов, обогащенному Der f 15 и Der f 18. Данное изобретение также относится к применению экстракта аллергенов в качестве ветеринарного продукта и к его применению в лечении аллергии, в частности аллергии на домашних пылевых клещей у млекопитающих, более конкретно собак.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Атопический дерматит представляет собой зудящее аллергическое кожное заболевание, которое поражает примерно 10% собак и связано с продуцированием антител IgE против аллергенов окружающей среды. Главной причиной несезонных аллергий у собак являются домашние пылевые клещи (HDM), в частности вида Dermatophagoides farinae. Аллергических собак лечат лекарственными средствами для контролирования симптомов, но альтернативные виды лечения включают специфическую иммунотерапию (SIT), которая включает введение возрастающих доз экстракта аллергенов с целью индуцирования иммунологической толерантности. Иммунотерапия аллергенами модулирует иммунный ответ на аллерген, но не устраняет симптомы, индуцированные аллергической реакцией, и может либо уменьшать потребность в лекарственной терапии, уменьшать тяжесть симптомов, либо полностью устранять гиперчувствительность.

Описаны существенные различия в отношении профиля человеческих и собачьих аллергенов HDM. В то время как главными аллергенами для человека (Der f 1 и Der f 2) являются белки с относительно низкой молекулярной массой, самые важные аллергены D. farinae у атопических собак (Der f 15 и Der f 18), принадлежащие высокомолекулярной фракции клещей, включены в группы 15 и 18. Несмотря на эти различия, аллерген-специфическую иммунотерапию для собак всегда готовили непосредственно с экстрактами аллергенов, разработанными и охарактеризованными для иммунотерапии человека. Одной проблемой при лечении собак экстрактами аллергенов, разработанными и охарактеризованными для иммунотерапии человека, является то, что собаки могут становиться сенсибилизированными к ранее не провоцирующим аллергенами, такими как Der f 1 и Der f 2.

Следовательно, существует потребность в разработке специфической иммунотерапии против домашних пылевых клещей для ветеринарного применения, в частности для собак.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения разработали ветеринарный экстракт клещей, обогащенный высокомолекулярными фракциями. Данная фракция содержит аллергены, распознаваемые образцами сыворотки от собак, сенсибилизированных клещами.

В первом аспекте данного изобретения предложен ветеринарный экстракт клещей, обогащенный белками с молекулярными массами более 50 кДа.

В одном воплощении данный ветеринарный экстракт клещей обогащен аллергенами Der f 15 и Der f 18 по сравнению с экстрактом для человека.

В одном воплощении данный экстракт имеет низкие уровни аллергенов Der f 1 и Der f 2 по сравнению с экстрактом для человека.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения ветеринарного экстракта клещевых аллергенов, включающий:

а) приведение в контакт исходного материала, содержащего ветеринарный клещевой аллерген (сырье), с агентом на основе экстракта аллергенов с получением смеси аллергенов, растворенных в жидкой фазе, и твердой фазы, содержащей неаллергенный остаток;

б) подвергание данной смеси стадии разделения для выделения аллергенов, растворенных в жидкой фазе, с получением неочищенного экстракта аллергенов;

в) подвергание неочищенного экстракта аллергенов стадии удаления молекулярной фракции среднего размера для удаления молекул, имеющих размер менее 50 кДа, и приложение давления 1,8 бар (180 кПа) во время стадии удаления;

г) проведение стадии (в) при 3-5°С, пока экстракт аллергенов не имеет проводимость ниже 1050 мкСм/см, при измерении при комнатной температуре, и/или пока не использован конкретный объем дистиллированной воды, с получением очищенного экстракта природного аллергена.

Согласно третьему аспекту изобретения предложен ветеринарный экстракт клещевых аллергенов для применения в качестве активного терапевтического вещества в лечении аллергии.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фиг. 1 показан SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) 10 мкг белка экстрактов D. farinae: стандарт MW (молекулярная масса) в диапазоне низких масс (1); экстракт для человека (2); Экстракт 1 (3); Экстракт 2 (4) и Экстракт 3 (5).

На фиг. 2 показан SDS-PAGE на гелях Any kD TGX 10 мкг белка экстрактов D. farinae: предварительно окрашенный маркер HiMark (LifeTechnologies) (1); экстракт для человека (2); Экстракт 1 (3); Экстракт 2 (4), Экстракт 3 (5) и стандарт MW в диапазоне больших масс (Bio-Rad) (6).

На фиг. 3 показан SDS-PAGE 5 мкг экстрактов D. farinae после процедуры очистки: стандарт MW в диапазоне низких масс (1); Экстракт 1 (2); Экстракт 2 (3) и Экстракт 3 (4).

На фиг. 4 показано 2D (в двух измерениях) разделение 170 мкг белка D. farinae: Экстракт 1 (А); Экстракт 2 (Б); Экстракт 3 (В); экстракт для человека (Г); стандарт MW в диапазоне низких масс показан на каждом геле.

На фиг. 5 показаны хроматографические профили экстракта D. farinae: экстракт для человека (А); Экстракт 1 (Б); Экстракт 2 (В) и Экстракт 3 (Г).

На фиг. 6 показаны секвенированные пептиды для Der f 15 (А, В, Д) (SEQ ID NO. 1) и Der f 18 (Б, Г, Е) (SEQ ID NO. 2) из Экстракта 1 (А, Б); Экстракта 2 (В, Г) и Экстракта 3 (Д, Е) ветеринарных экстрактов.

На фиг. 7 показан иммуноблот 10 мкг белка экстрактов D. farinae: стандарт MW в диапазоне низких масс (1); экстракт для человека (2); Экстракт 1 (3); Экстракт 2 (4) и Экстракт 3 (5).

На фиг. 8 показана оптическая плотность специфичного IgE пула сыворотки собак, инкубированной с экстрактом для человека (партия PRI 6756LN) и ветеринарными (080616LN, 090616LN, 290616LN для каждого из экстрактов 1, 2 и 3 соответственно) экстрактами D. farinae.

На фиг. 9 показана оптическая плотность специфичного IgE индивидуальных образцов сыворотки против ветеринарного экстракта 4 D. farinae и экстракта для человека D. farinae.

На фиг. 10 показан анализ активности посредством ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) для ветеринарного экстракта 4 D. farinae (образец в двойной повторности).

На фиг. 11 показан анализ активности посредством ELISA для экстракта для человека D. farinae и ветеринарного экстракта 4 D. farinae.

На фиг. 12 показано изображение иммуноблота, проанализированного посредством ImageQuant. Экстракты D. farinae: ветеринарный экстракт 4 (2), экстракт для человека (3) и ветеринарный экстракт 2 (4). 1: стандарт MW в диапазоне низких масс (кДа). Отмечены полосы, соответствующие Der f 15 и Der f 18.

На фиг. 13 показано изображение иммуноблота, проанализированного посредством ImageQuant. Экстракты D. farinae: ветеринарный экстракт 5 (2), ветеринарный экстракт 4 (3) и экстракт для человека (4). 1: стандарт MW в диапазоне низких масс (кДа). Отмечены полосы, соответствующие Der f 15 и Der f 18.

На фиг. 14 показаны полосы, идентифицированные на изображениях иммуноблотов из Фиг. 12 (левое изображение) и фиг. 13 (правое изображение).

На фиг. 15 показан иммуноблот 10 мкг белка экстракта для человека D. farinae и ветеринарного экстракта 4 D. farinae. STD: стандарт MW в диапазоне низких масс. А) позитивные сыворотки 1, 2; Б) позитивные сыворотки 3, 4 и негативный контроль C1; В) позитивные сыворотки 5-7 и негативный контроль С2.

На фиг. 16 показаны IL-10 (интерлейкин-10) и IFN-γ (интерферон-гамма), продуцированные мононуклеарными клетками периферической крови (РВМС) от атопической и контрольной групп, после 24 (IL-10) или 48 (IFN-γ) ч. инкубации с негативным контролем, человеческим экстрактом или ветеринарным экстрактом 2 (значимые различия (значение р) указаны на каждом графике, показывая медианное значение и межквартильный интервал).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Описанный здесь способ обеспечивает получение ветеринарного экстракта клещевых аллергенов, который демонстрирует повышенное связывание IgE образцов сыворотки от млекопитающих, страдающих от атопического дерматита, вызванного D. farinae.

Экстракты аллергенов по изобретению происходят из любого исходного материала, содержащего клещевые аллергены, которые, как известно, вызывают IgE-опосредованную иммунную реакцию у животного. В частности, исходное вещество представляет собой клещевой аллерген, который, как известно, вызывает IgE-опосредованную иммунную реакцию у собаки.

В одном воплощении данный ветеринарный экстракт клещей происходит из D. farinae.

В одном воплощении ветеринарный экстракт клещей обогащен аллергенами Der f 15 и Der f 18 по сравнению с экстрактом для человека. Аллергены Der f 15 и Der f 18 представляют собой главные аллергены D. farinae у атопических собак и также могут быть важными аллергенами у других видов клещей, например Dermatophagoides pteronyssinus.

В одном воплощении данный экстракт имеет более низкие уровни Der f 1 и Der f 2 по сравнению с экстрактом для человека. Уровень аллергенов, присутствующих в данном экстракте, может быть определен из SDS посредством денситометрического анализа. Для Der f 1 и Der f 2 данные аллергены также могут быть количественно измерены с помощью имеющихся в продаже наборов, таких как наборы, имеющиеся у Indoor Biotechnologies Inc (Charlottesville, Вирджиния, США).

Термин «обогащенный» означает ветеринарный экстракт клещевых аллергенов с более высокой концентрацией белков с молекулярными массами выше 50 кДа по сравнению с экстрактом для человека, в частности с более высокими уровнями аллергенов Der f 15 и Der f 18 при определении из SDS посредством денситометрического анализа.

Термин «экстракт для человека» означает экстракт, который получается в результате осуществления раскрытых здесь стадий (а)-(г), но где стадия (в) удаляет молекулы, имеющие размер менее 3 кДа путем использования диализной мембраны с порогом отсечения молекулярной массы 3 кДа, и применяется давление только 1 бар (100 кПа).

В одном воплощении в анализе ELISA 50%-ного ингибирования IgE ветеринарный экстракт клещевых аллергенов по первому аспекту данного изобретения является по меньшей мере в 1,5 раза, предпочтительно по меньшей мере в 2,0 раза, наиболее предпочтительно в 2,0-2,5 раза более эффективным, чем экстракт для человека.

В другом воплощении при денситометрическом анализе иммуноблота в ветеринарном экстракте клещевых аллергенов концентрация Der f 15 по меньшей мере в 1,5 раза, предпочтительно по меньшей мере в 2,0 раза, наиболее предпочтительно в 2,0-3,0 раза выше, чем в экстракте для человека, и/или концентрация Der f 18 по меньшей мере в 1,5 раза, предпочтительно по меньшей мере в 2,0 раза, наиболее предпочтительно в 2,0-3,5 раза выше, чем в экстракте для человека.

В еще одном воплощении ветеринарный экстракт клещевых аллергенов содержит рекомбинантный Der f 15 и Der f 18, предпочтительно рекомбинантный Der f 15 и Der f 18 имеет по меньшей мере 70%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 80%-ную, даже более предпочтительно по меньшей мере 90%-ную гомологию с нерекомбинантным Der f 15 и Der f 18 соответственно, и ветеринарный экстракт клещевых аллергенов активирует экспрессию IFN-γ и IL-10 в мононуклеарных клетках периферической крови.

Рекомбинантные белки, согласно данному изобретению, могут экспрессироваться с использованием системы экспрессии белка, такой как бактериальная, дрожжевая система экспрессии, система экспрессии насекомых, растений, птиц или млекопитающих. Подходящие системы известны специалистам в данной области. Экспрессию и очистку белка проводят, как известно специалистам в данной области, например, как описано в Structural Genomics Consortium et al. "Protein Production and Purification", Nature methods, 5, 2, 135 (2008). В некоторых воплощениях белки могут быть гликозилированными.

а) приведение исходного материала, содержащего клещевой аллерген, в контакт с агентом для экстракции аллергенов с получением смеси аллергенов, растворенной в жидкой фазе, и твердой фазы, содержащей неаллергенный остаток;

б) подвергание данной смеси стадии разделения с выделением аллергенов, растворенных в жидкой фазе, с получением неочищенного экстракта аллергенов;

в) подвергание неочищенного экстракта аллергенов стадии удаления фракции со средней молекулярной массой для удаления молекул, имеющих размер менее 50 кДа, и применение во время стадии удаления давления 1,8 бар (180 кПа);

г) проведение стадии (в) при 3-5°С, пока экстракт аллергенов не имеет проводимость ниже 1050 мкСм/см и/или пока не использован конкретный объем дистиллированной воды, с получением обогащенного экстракта аллергенов.

Исходный материал может быть выбран из семейства Pyroglyphidae, которое включает виды Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides pteronyssinus и Euroglyphus maynei, и/или семейства Acaridae.

В одном воплощении исходный материал представляет собой Dermatophagoides farinae.

В предпочтительном воплощении данного изобретения исходный материал представляет собой культуру клеща, содержащую более 80% телец D. farinae. Остальная процентная доля исходного материала может содержать экскременты клещей и/или культуральную среду. Процентное содержание телец клещей может быть определено посредством наблюдения культуры клещей под микроскопом и подсчета числа телец клещей относительно других частиц в культуре клещей.

Аллергены получаю из исходного материала посредством экстракции агентом для экстракции аллергенов с получением неочищенного экстракта аллергенов, содержащего аллергены, растворенные в жидкой фазе, и твердой фазы, содержащей «нежелательный» неаллергенный остаток. Агент для экстракции аллергенов может представлять собой водный раствор и предпочтительно содержит буферный агент. Агент для экстракции аллергенов может содержать PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) и/или NaCl, например раствор 0,01 М PBS/0,15 М NaCl или бикарбонат аммония (NH₄)HCO₃ и/или NaCl, например раствор 0,125 М (NH₄)HCO₃/0,15 М NaCl. Исходный материал может быть экстрагирован в агенте для экстракции аллергенов в любом соотношении, где масса агента для экстракции аллергенов превышает массу исходного материала, например в соотношении 1:2, 1:3, 1:5, 1:10, 1:20, 1:50, 1:80. Предпочтительно исходный материал экстрагируют в агенте для экстракции аллергенов в соотношении исходный материал: агент для экстракции аллергенов 1:10 (масс./масс.). Отношение исходного материала к агенту для экстракции аллергенов на стадии экстракции (стадия (а)) может варьироваться, но должно быть таким, чтобы аллергены в остатке исходного материала могли растворяться в агенте для экстракции аллергенов. Экстракцию исходного материала агентом для экстракции аллергенов предпочтительно проводят в течение времени, достаточного для растворения аллергенов исходного материала в агенте для экстракции аллергенов, которое может составлять от 30 мин до 12 ч., предпочтительно от 1 до 6 ч., более предпочтительно от 2 до 5 ч., и наиболее предпочтительно в течение примерно 4 ч. Стадию экстракции аллергенов можно осуществлять при 20-25°С, но предпочтительно ее проводят на холоде от 2 до 6°С, и, наиболее предпочтительно, от 3 до 5°С. Во время стадии экстракции аллергенов исходный материла предпочтительно перемешивают или встряхивают с агентом для экстракции аллергенов.

После стадии экстракции аллергенов аллергены, растворенные в жидкой фазе, отделяют от остатка исходного материла с получением неочищенного экстракта аллергенов. Стадия отделения предпочтительно представляет собой центрифугирование, хотя для отделения твердого вещества от жидкости применимы многие методы, хорошо известные специалисту в данной области. Предпочтительно, аллергены, растворенные в жидкой фазе, центрифугируют при 2-6°С и предпочтительно при 3-5°С в течение времени, достаточного для осаждения остатка исходного материла в виде осадка, например от 1 мин до 1 ч., или более 1 ч.. Неочищенный экстракт аллергенов (т.е. супернатант, содержащий растворенные аллергены) можно хранить при 2-6°С. Осадок остатка исходного материала можно дополнительно экстрагировать агентом для экстракции аллергенов с использованием таких же условий, что и на первой стадии экстракции аллергенов (стадия (а)), и предпочтительно в течение более длительного периода экстракции, например от 4 до 8 ч., от 8 до 12 ч. или более 12 ч. После второй стадии экстракции аллергенов, аллергены, растворенные в жидкой фазе, могут быть отделены от остатка исходного материала с получением неочищенного экстракта аллергенов. Неочищенные экстракты аллергенов с первой и второй стадий экстракции аллергенов предпочтительно объединяют для дальнейшей обработки.

Неочищенный экстракт аллергенов можно фильтровать, например с использованием фильтров с размером пор 0,8-1,2 мкм. Неочищенный экстракт аллергенов затем подвергают стадии удаления фракции со средней молекулярной массой для удаления молекул, имеющих средний размер молекул, таких как аллергены с низкой молекулярной массой, соли и другие неаллергенные соединения. На стадии (в) могут быть удалены молекулы, имеющие размер молекул менее 50 кДа.

Во время стадии удаления фракции со средней молекулярной массой фиксируют давление от 1,2 до 1,8 бар (120-180 кПа). Стадия применения давления примерно от 1,2 до 1,8 бар (120-180 кПа) во время процесса удаления фракции со средней молекулярной массой является важной для настоящего изобретения. Применение повышенного давления, по сравнению со способами экстракции из уровня техники при 1 бар (100 кПа) улучшает эффективность данного процесса. Предпочтительно давление фиксируют на уровне 1,8 бар (180 кПа).

Стадию удаления фракции со средней молекулярной массой предпочтительно продолжают при 3-5°С, пока проводимость экстракта аллергенов не составляет менее 1050 мкСм/см, или менее 900 мкСм/см, или менее 800 мкСм/см, или менее 700 мкСм/см, или менее 600 мкСм/см, или, предпочтительно, менее 500 мкСм/см (при измерении при комнатной температуре). Кроме того или альтернативно, стадию удаления фракции со средней молекулярной массой продолжают, пока не использован конкретный объем дистиллированной воды. Подходящий объем дистиллированной воды, необходимый для диафильтрации, может быть рассчитан с использованием следующей формулы: мл отфильтрованного экстракта × 10 = объем дистиллированной воды. Результатом является очищенный экстракт природных аллергенов, обогащенный белками с более высокой молекулярной массой.

Стадия удаления фракции со средней молекулярной массой может включать стадию ультрафильтрации, стадию диафильтрации, стадию диализа, или фильтрацию. Предпочтительно стадия удаления фракции со средней молекулярной массой (стадия (в)) включает стадию диафильтрации.

Полученный экстракт природных аллергенов может быть отфильтрован, например с использованием размера пор 0,22 мкм, и может быть заморожен или лиофилизирован для хранения.

Настоящее изобретение дополнительно включает лечение ветеринарной аллергии на клещей и диагностический экстракт для ветеринарной аллергии на клещей, где и то, и другое включает экстракты аллергенов, полученные способами по настоящему изобретению, в качестве активного ингредиента. Ветеринарная аллергия на клещей может быть ассоциирована с воздействием клещевых аллергенов, таких как D. farinae, которые вызывают аллергический ответ, опосредованный IgE, как обсуждалось в данном описании изобретения.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен ветеринарный экстракт клещевых аллергенов, полученный или получаемый согласно способам, описанным в данном описании.

Ветеринарный экстракт клещевых аллергенов может быть предназначен для применения в лечении аллергии на клещей у животных. В предпочтительном воплощении данный экстракт аллергенов может быть предназначен для применения в лечении аллергии на клещей у собак. В другом предпочтительном воплощении данный экстракт аллергенов может быть предназначен для применения в лечении аллергии на клещей у кота, где кот имеет сывороточные антитела IgE, которые в анализе иммуноблоттинга взаимодействуют с аллергенами Dermatophagoides farinae с молекулярными массами выше 40 кДа и включающими Der f 15 и Der f 18 или рекомбинантные Der f 15 и Der f 18, предпочтительно данные рекомбинантные Der f 15 и Der f 18 имеют по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, даже более предпочтительно по меньшей мере 90% гомологии с нерекомбинантными Der f 15 и Der f 18 соответственно.

Экстракт аллергенов по настоящему изобретению может отличаться следующими физико-химическими и биологическими свойствами:

1. Повышенное содержание белка, определенное методом Бредфорда, по сравнению с экстрактом D. farinae для человека.

2. Уменьшение содержания белка с молекулярной массой ниже 30 кДа, идентифицированного в виде полос посредством SDS-PAGE в восстанавливающих условиях, по сравнению с экстрактом для человека, за исключением полосы примерно 20 кДа, которая все еще присутствует в ветеринарном экстракте.

3. Уменьшение содержания Der f 1 (примерно 30 кДа) и Der f 2 (примерно 15 кДа) по сравнению с экстрактом для человека при определении при помощи наборов ELISA для количественного определения от Indoor.

4. Уменьшение полос распознавания IgE с молекулярной массой ниже 30 кДа, идентифицированных посредством иммуноблоттинга в восстанавливающих условиях, за исключением полосы примерно 20 кДа, по сравнению с экстрактом для человека.

5. Модификация профиля распределения молекулярной массы (MW) по сравнению с экстрактом для человека, определенного посредством гель-фильтрации.

6. Увеличение связывания IgE относительно человеческого экстракта, определенное посредством экспериментов ELISA на IgE с использованием специфичного пула сыворотки от сенсибилизированных субъектов.

7. Присутствие главных аллергенов собаки Der f 15 и Der f 18, определенное при помощи масс-спектрометрии.

8. Увеличение содержания Der f 15 по сравнению с экстрактом для человека, определенное посредством количественного определения относительного содержания белка посредством таргетной протеомики.

9. Увеличение содержания Der f 15 и Der f 18 по сравнению с экстрактом для человека, определенное посредством денситометрического анализа иммуноблота с использованием специфичного пула сыворотки от сенсибилизированных субъектов.

10. Увеличение биологической эффективности по сравнению с экстрактом для человека, определенное посредством анализа 50%-ного ингибирования с помощью ELISA с использованием специфичного пула сыворотки от сенсибилизированных субъектов.

11. Индукция продуцирования цитокинов IL-10 и IFN-γ в мононуклеарных клетках периферической крови собак, сенсибилизированных D. farinae.

Экстракты аллергенов по настоящему изобретению могут быть предназначены для применения в качестве активного компонента лекарственного средства для лечения аллергичного животного с целью индуцирования толерантности к некоторым клещевым аллергенам.

Предложено применение экстракта аллергенов согласно настоящему изобретению в диагностике иммунологических расстройств, предпочтительно для выявления аллергического заболевания. Предложено применение экстракта аллергенов согласно настоящему изобретению для лечения аллергии на клещей или в изготовлении лекарственного средства для лечения аллергии на клещей. Данное применение может быть предназначено для иммунотерапии. Данное применение может быть предназначено для стандартизации, диагностики, синтеза и вакцинации. Данное применение может заключаться в терапевтическом лечении животных, предпочтительно в иммунотерапии. Данное применение может заключаться в мониторинге животных во время иммунотерапии.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая экстракт аллергенов согласно настоящему изобретению. Также предложена фармацевтическая композиция для лечения аллергии на клещей, которая содержит в качестве активного ингредиента фармацевтически эффективное количество ветеринарного экстракта клещевых аллергенов согласно настоящему изобретению и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Предложена диагностическая композиция для аллергии на клещей, которая содержит в качестве активного ингредиента диагностически эффективное количество экстракта аллергенов согласно настоящему изобретению.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена вакцина, содержащая ветеринарный экстракт клещевых аллергенов согласно настоящему изобретению. Данная фармацевтическая композиция и вакцина может дополнительно содержать один или более адъювант, разбавитель, консервант или их смеси. Данная фармацевтическая композиция или вакцина может содержать физиологически приемлемый носитель. При использовании здесь выражение «фармацевтически приемлемый» предпочтительно означает одобрение надзорным органом правительства, или перечисление в Европейской фармакопее или Фармакопее США, или в другой общепризнанной фармакопее для применения у животных.

Такие фармацевтически приемлемые носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, включающие масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобные. В качестве жидких носителей, особенно для инъекционных растворов, также можно использовать физиологические растворы и водные растворы декстрозы и глицерина. Подходящие фармацевтические эксципиенты включают маннит, крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, карбонат магния, стеарат магния, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, водно-гликолевую смесь, этанол и тому подобное.

Предложена вакцина, получаемая согласно способу по первому аспекту настоящего изобретения. Данная вакцина может быть предназначена для подкожного, подъязычного или накожного применения.

Предложено применение вакцины согласно настоящему изобретению в лечении аллергии на клещей или в изготовлении лекарственного средства для лечения аллергии на клещей.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ предупреждения сенсибилизации аллергеном, включающий стадию воздействия на животное эффективного количества экстракта аллергенов, фармацевтической композиции или вакцины по настоящему изобретению.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ лечения аллергии на клещей у сенсибилизированного млекопитающего, включающий введение данному млекопитающему эффективного количества экстракта аллергенов, фармацевтической композиции или вакцины по настоящему изобретению. Экстракт аллергенов, фармацевтическую композицию или вакцину можно вводить подкожно или подъязычно и можно вводить в виде возрастающей или постоянной дозировки. Термин «млекопитающее» исключает людей.

Предпочтительно млекопитающее представляет собой собаку. Предпочтительно млекопитающее представляет собой кошку, где кошка имеет сывороточные антитела IgE, которые в анализе иммуноблоттингом взаимодействуют с аллергенами Dermatophagoides farinae с молекулярными массами выше 40 кДа и включающими Der f 15 и Der f 18 или рекомбинантные Der f 15 и Der f 18, предпочтительно рекомбинантный Der f 15 и Der f 18 имеет по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90% гомологию с нерекомбинантными Der f 15 и Der f 18 соответственно.

Настоящее изобретение проиллюстрировано следующими примерами, в которых подробно описаны способы получения экстрактов, содержащих аллергены.

ПРИМЕРЫ

Исходный материал, который также может называться сырьем, используемый для получения экстракта, представлял собой культуру клещей с более чем 80% телец D. farinae, культивируемых Laboratories LETI, и он имеется в продаже. Три ветеринарных экстракта готовили согласно следующему способу:

А. Экстракция I

- сырье, подлежащее экстракции, взвешивали и записывали массу;

- требующийся объем экстрагирующего агента (0,01 М PBS - 0,15 М NaCl) рассчитывали с использованием следующей формулы:

Сырье (г) × 20 = мл экстрагирующего агента;

- сырье помещали в контейнер с половиной объема экстрагирующего агента, рассчитанного на предыдущей стадии, и экстрагировали при 3-5°С при магнитном перемешивании в течение 4 ч.:

мл экстрагирующего агента (общий об.) ÷ 2 = мл экстрагирующего агента (Объем I);

- данную смесь центрифугировали при 10000 об./мин при 5°С в течение по меньшей мере 30 мин;

- затем отделяли супернатант и записывали объем. Супернатант выдерживали при 3-5°С в помеченном закрытом контейнере. Соблюдали осторожность, чтобы избежать попадания остатка осадка в супернатант, для обеспечения максимальной прозрачности.

Б. Экстракция II

- осадок от экстракции I добавляли в контейнер с остатком объема экстрагирующего агента (Объем II). Данную смесь экстрагировали со встряхиванием при 3-5°С в течение по меньшей мере 8 ч.;

- данную смесь затем центрифугировали при 10000 об./мин при 5°С в течение по меньшей мере 30 мин;

- отделяли супернатант, записывали объем и отбрасывали осадок;

- супернатанты от экстракций I и II объединяли и записывали общий объем;

- объединенные супернатанты фильтровали через фильтры 0,8-1,2 мкм. Записывали объем, полученный после фильтрации.

В. Диафильтрация

- диафильтрацию раствора экстракта проводили на мембране кассеты для ультрафильтрации с порогом отсечения 50 кДа. На данной стадии удаляли молекулы, имеющие размер молекул менее 50 кДа;

- объем дистиллированной воды, необходимый для диафильтрации, рассчитывали согласно следующей формуле:

мл отфильтрованного экстракта × 10 = объем дистиллированной воды;

- как только начиналась диафильтрация, фиксировали давление на уровне 1,8 бар (180 кПа) и раствор экстракта выдерживали на льду с постоянным встряхиванием;

- затем проверяли проводимость диафильтрованного экстракта, чтобы увидеть, составляет ли она менее 1050 мкСм/см. Если проводимость была выше, диафильтрацию продолжали с дополнительным объемом воды;

- диафильтрованный экстракт фильтровали через фильтры 0,22 мкм;

- отфильтрованный экстракт затем аликвотировали во флаконы из кристалла топаза и затем замораживали при -80°С. Флаконы выдерживали при -40°С или менее в течение максимального периода 15 сут.;

- экстракт затем лиофилизировали.

Конечный продукт состоит из лиофилизированного ветеринарного экстракта, который хранят при 4°С в лиофилизированном состоянии.

Иммунохимическая характеристика

Содержание белка

Содержание белка определяли методом Бредфорда, следуя инструкциям изготовителя.

Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE)

Профили белка определяли посредством SDS-PAGE в восстанавливающих условиях (образцы инкубировали с β-меркаптоэтанолом и нагревали в течение 10 мин при 95°С) в 2,67% С, 15% Т акриламид-бисакриламидных гелях. На том же самом геле разделяли образцы и стандарты с низкой молекулярной массой (BioRad Laboratories, Hercules, СА, США). Гели окрашивали 0,1% кумасси бриллиантовым синим R-250 (BioRad). Профили белка также анализировали с использованием гелей Any kD TGX (BioRad). Образцы, предварительно окрашенный маркер HiMark (LifeTechnologies, Калифорния, США) и стандарт молекулярной массы в диапазоне больших масс (BioRad) разделяли на том же самом геле.

2D

Для 2-D (двумерный) электрофореза экстракты очищали и концентрировали с использованием раствора сульфата аммония на 2 отдельных стадиях, пока не достигали процентных значений насыщения 40% и 80%. Затем образцы центрифугировали, осадки отбирали и растворяли в ультрачистой воде. Концентрированные экстракты промывали с использованием набора для очистки ReadyPrep 2-D Cleanup Kit (BioRad), следуя инструкциям изготовителя. Белки разделяли согласно их изоэлектрической точке на полосках ReadyStrip IPG (BioRad) с интервалом рН от 3 до 10, используя ячейку для изоэлектрофокусировки Protean IEF Cell (BioRad). После первого измерения полоски уравновешивали с использованием буферов из набора ReadyPrep 2-D kit (BioRad), и белки разделяли во втором измерении согласно их молекулярной массе. Гели окрашивали флуоресцентным раствором Oriole (BioRad), следуя инструкциям изготовителя.

Содержание углеводов

Определение содержания углеводов основано на методике, описанной в "Current Protocols in Food Analytical Chemistry E.1.1.1.-E.1.1.8, Eric Fourier (2001)". Вкратце, получали стандартную кривую разных концентраций глюкозы (0-1 мг/мл) и по меньшей мере четырех разведений, начиная с 4 мг/мл клещевых экстрактов. Во все образцы добавляли 0,5 мл объем 4%-ного фенола и 2,5 мл H₂SO₄, встряхивали и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем измеряли поглощение при 495 нм. Получали стандартную кривую с результатами образцов для глюкозы и интерполировали концентрации образцов для получения результатов.

Содержание эндотоксинов

Содержание эндотоксинов (EU(эндотоксиновая единица)/мл) определяли посредством колориметрического метода на основе анализа лизата амебоцитов мечехвоста и используя систему Endoscan V (Charles River Laboratories). С этой целью образцы растворяли в концентрации 1 мг/мл в воде, не содержащей эндотоксины, и готовили разведения 1/100 и 1/500.

Ферментативная активность

Ферментативную активность 19 разных ферментов (описанных ниже) оценивали в экстрактах D. farinae с использованием системы APY-Zym следуя инструкциям изготовителя. Кроме того, активность хитиназы анализировали с использованием набора для анализа хитиназы (Sigma-Aldrich), следуя инструкциям изготовителя.

Иммуноблоттинг

Электрофоретически разделенные белки (посредством SDS-PAGE) переносили на PVDF (поливинилидендифторид) мембрану (пакет для переноса Trans-Blot® Turbo ТМ Transfer Pack, BioRad), блокировали в течение 1 ч. 5%-ным обезжиренным молоком в растворе фосфатного буфера (PBS) 0,01 моль/л - 0,1% Tween и инкубировали в течение ночи с сыворотками от позитивных к аллергену собак, разбавленными в 0,01 М PBS-0,1% Tween. Специфическое связывание IgE с экстрактом определяли с использованием антител, конъюгированных с пероксидазой, антитело против собачьего IgE-PO (пероксидаза) (Abd Serotec), проявляли с использованием растворов люминола (набор Western Immun-Star™ Western С™, BioRad) и выявляли посредством хемилюминисценции (ChemiDoc XRS, Bio-Rad).

Количественное измерение главного аллергена

Главные аллергены количественно измеряли с использованием метода "сэндвич" ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), используя наборы для выявления в ходе твердофазного иммуноферментного анализа (Indoor Biotechnologies, VA, США). Вкратце, планшеты Nunc Maxisorp (Thermo Scientific, Waltham, MA, США) покрывали специфичным моноклональным антителом, разведенным в карбонатном/бикарбонатном буфере (рН 9,6), и инкубировали в течение ночи при 4°С. Затем планшеты блокировали 1% BSA (бычий сывороточный альбумин) в 0,01 М PBS-0,05% Tween. Затем образцы и стандарт добавляли в серийных разведениях в два раза с использованием 1% BSA в 0,01 М PBS-0,05% Tween. Добавляли вторичное специфичное моноклональное антитело (биотинилированное) и, наконец, использовали стрептавидин. Взаимодействие с проявочным раствором (хромоген) измеряли как оптическую плотность (OD) при 450 нм после остановки серной кислотой. Стандартную кривую получали с использованием 4-параметрической логистической аппроксимации методом наименьших квадратов, где для получения результатов интерполировали концентрации образцов.

Анализы ELISA

Специфичные IgE к D. farinae определяли в пуле сывороток посредством прямого ELISA. Вкратце, микропланшеты (Immulon IV; Thermo Scientific) покрывали одинаковым количеством белка экстрактов D. farinae и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. Планшеты блокировали в течение 1 ч 5%-ным обезжиренным молоком в 0,01 моль/л PBS - 0,1% Tween. Пул сывороток серийно разводили и инкубировали в течение 2 ч. После промывки добавляли вторичное антитело (разведенное 1:10000), состоящее из антитела козы против собачьего IgE:HRP (пероксидаза хрена). Наконец, микропланшеты промывали, проявляли реакцию, и измеряли OD при 450 нм на автоматическом планшет-ридере для ELISA.

Гель-фильтрация

Экстракты растворяли в 40 мМ фосфатном буфере, рН 7,4; 150 мМ NaCl, и фильтровали через фильтры 0,45 мкм. Один мг белка экстрактов загружали на колонку Superdex 75 16/60 (GE Healthcare) и анализировали в системе (GE Healthcare). Поглощение при 280 нм регистрировали на протяжении 120 мин, и хроматограммы анализировали с использованием программы Unicorn.

Идентификация аллергенов

Полосы вырезали из геля SDS-PAGE (окрашенного кумасси), восстанавливали в помощью 10 мМ DTT (дитиотреитол), обрабатывали йодацетамидом и расщепляли трипсином. Полученные пептиды анализировали при помощи жидкостной хроматографии в сочетании с 5600 TRIPLE TOFF (времяпролетный) масс-спектрометром. Необработанные данные анализировали с использованием сервера MASCOT относительно базы данных Acari NCBI (Национальный центр биотехнологической информации).

Относительное количественное определение белка

Расщепление белка: экстракты ресуспендировали в 50 мМ NH₄HCO₃ (рН 8,5). Белки экстрагировали посредством разъединения-солюбилизации с помощью ультразвукового преобразователя, осаждали и осадок ресуспендировали в смеси 8 М мочевины/50 мМ NH₄HCO₃ (рН 8,5). Белки восстанавливали (20 мМ DTT) и алкилировали (35 мМ йодацетамид). Затем образец расщепляли свиным трипсином, осветляли, сушили и хранили при -20°С до последующего анализа посредством наноUPLC(сверхэффективная жидкостная хроматография)-масс-спектрометрии.

Анализ LC-MSMS (жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия): смеси пептидов анализировали в жидкостном хроматографе nanoAcquity (Waters), соединенном с масс-спектрометром LTQ-Orbitrap Velos (Thermo Scientific). Пептиды захватывали на захватывающей колонке Symmetry С18ТМ (Waters) и разделяли с использованием капиллярной С18 колонки с обращенной фазой (Waters).

Информационно-зависимый анализ (DDA): элюированные пептиды подвергали электрораспылительной ионизации в игле эмиттера (PicoTipTM, New Objective). Массы пептидов (m/z 300-1700) анализировали в информационно-зависимом режиме, где МС (масс-спектр) полного сканирования получали в Orbitrap. Полученные файлы необработанных данных собирали с использованием Thermo Xcalibur (v.2.2) и осуществляли поиск относительно базы данных Dermatophagoides farinae.

Целевой анализ: полученные данные и поиски оценивали в Skyline (v.3.1). Отбирали пептиды, с высокой достоверностью идентифицированные как стабильные по ходу анализов. Образцы получали в тройной повторности с использованием способа целевой МС/МС с параллельным мониторингом реакции для количественного измерения. Добавляли в каждый образец стандарт фибринопептида В (Глуфиб) (Waters) для нормализации.

Запрашиваемые образцы (ветеринарный экстракт) сравнивали относительно контрольных образцов (экстракт для человека), используя статистическую значимость среди двух условий с использованием t-критерия Стьюдента, с 95%-ной значимостью на уровне пептидов.

Анализы эффективности посредством ELISA

Вкратце, микропланшеты (Immulon IV; Thermo Scientific) покрывали ветеринарным экстрактом D. farinae (2 мкг/лунку) и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. Планшеты блокировали в течение 1 ч 5%-ным обезжиренным молоком в 0,01 моль/л PBS; 0,1% Tween. Для анализа ингибирования сыворотки предварительно инкубировали с серийными разведениями ингибирующего экстракта в планшете Nunc (Thermo Scientific) в течение 2 ч. перед добавлением Immulon IV. Пул сывороток инкубировали в течение 2 ч. После промывки добавляли вторичное антитело (разведенное 1:10000), состоящее из антитела козы против собачьего IgE, конъюгированного с HRP. Наконец, микропланшеты промывали, проявляли реакцию и измеряли оптическую плотность (OD) при 450 нм на автоматическом планшет-ридере для ELISA. Процентное ингибирование сыворотки представляли относительно log мкг экстракта для расчета количества мкг, которые обеспечивают 50%-ное ингибирование.

Иммуноблоттинг у кошек

Ветеринарные экстракты и экстракт для человека D. farinae электрофоретически разделяли (посредством SDS-PAGE) и переносили на PVDF (поливинилидендифторид) мембрану (пакет для переноса Trans-Blot® Turbo ТМ Transfer Pack, BioRad), блокировали в течение 1 ч. посредством сушки мембраны при комнатной температуре и инкубировали в течение ночи с сыворотками от кошек, разведенными 1/6 в 0,01 М PBS. Обнаруживали специфичное связывание IgE с экстрактом, инкубируя данную мембрану 2 ч. с биотинилированными антителами против кошачьего IgE (Greer), затем инкубировали со стрептавидином в течение 1 ч., проявляли с использованием растворов люминола (набор Western Immun-StarTM Western СТМ, BioRad) и обнаруживали по хемилюминисценции (ChemiDoc XRS, Bio-Rad).

SDS-PAGE

Десять мкг белка из лиофилизированных образцов анализировали посредством SDS-PAGE в восстанавливающих условиях с использованием 15%-ных акриламидных гелей (фиг. 1) и имеющихся в продаже гелей TGX (Bio-Rad) (фиг. 2). Главные аллергены, идентифицированные в образцах, указаны на фигурах.

Такой же профиль белка наблюдали (фиг. 1) в ветеринарных экстрактах 1, 2 и 3, со значительным уменьшением полосы Der f 2 (примерно 15 кДа) и полосы Der f 1 (примерно 30 кДа) и увеличением интенсивности белков с массой более 40 кДа по сравнению с экстрактом для человека. Полоса при примерно 20 кДа, идентифицированная в предыдущих исследованиях как ферритин, также была более интенсивной в трех ветеринарных экстрактах по сравнению с экстрактом для человека.

Что касается гелей TGX (фиг. 2), такой же профиль белка наблюдали в экстрактах 1, 2 и 3. Кроме того, также наблюдали такие же различия в релевантных аллергенах экстракта для человека и ветеринарных экстрактов.

2D

В качестве дополнительного исследования по анализу профиля белков ветеринарных экстрактов проводили 2D (двумерный) электрофорез. Одинаковое количество белка каждого экстракта осветляли и анализировали посредством SDS-PAGE (фиг. 3).

Затем 170 мкг каждого образца подвергали разделению в первом измерении - изоэлектрофокусировке. Затем все экстракты подвергали разделению во втором измерении посредством SDS-PAGE и окрашивания Oriole. Для трех ветеринарных экстрактов был получен почти идентичный профиль белка, как можно видеть на фиг. 4. В ветеринарных экстрактах по сравнению с человеческим экстрактом (2D-профиль белка экстракта для человека был получен из предыдущего исследования) наблюдали более высокую долю белков с массой от 20 до 100 кДа и при кислотном рН.

Гель-фильтрационная хроматография

Наконец, в качестве дополнительного анализа модификации распределения MW (молекулярная масса) ветеринарных экстрактов по сравнению с экстрактом для человека, все образцы анализировали посредством гель-фильтрационной хроматографии. Одинаковое количество белка каждого экстракта (1 мг) инъецировали в колонку Superdex 75 16/60 и анализировали в системе explorer с получением распределения MW для каждого образца в невосстанавливающих условиях. Экстракты разбавляли в 40 мМ фосфатном буфере, рН 7,4, 150 мМ NaCl, и инъецировали в колонку объем примерно 2 мл. Хроматографический профиль, полученный для всех экстрактов, показан на фиг. 5.

Для всех экстрактов были получены два главных хроматографических пика - один примерно во время 56 мин, а второй - во время 100 мин. Однако при сравнении хроматографических профилей из ветеринарных экстрактов (фиг. 5Б-Г) с профилем, полученным для экстракта для человека (фиг. 5А), можно видеть, что у ветеринарных экстрактов присутствовало уменьшение сигнала Abs (поглощения) при 280 нм при большем времени элюирования (Пик 2), что соответствует белкам с меньшей MW. С другой стороны, Пик 1, содержащий белки с высокой MW, был увеличенным для ветеринарных экстрактов по сравнению с экстрактом для человека.

Количественное измерение главных аллергенов

Главные человеческие аллергены - Der f 1 и Der f 2 - количественно определяли в трех ветеринарных экстрактах по сравнению с экстрактом для человека. Среднее содержание обоих аллергенов в мкг/мг лиофилизированного экстракта показано в таблице 1.

Содержание Der f 1 составляло менее 4 мкг/мг в трех ветеринарных экстрактах и было сниженным в среднем в 4,5 раза по сравнению с экстрактом для человека. Обнаружили то, что уровень Der f 2 во всех ветеринарных экстрактах составлял менее 1,5 мкг/мг, что представляло 22-кратное снижение по сравнению с экстрактом для человека.

Содержание углеводов

Содержание углеводов, эквивалентное глюкозе, для всех экстрактов определяли спектрофотометрическим способом с серной кислотой и фенолом в качестве реактивов. Результаты, полученные в мкг глюкозы/мг лиофилизированного экстракта, показаны в таблице 2.

У трех ветеринарных экстрактов было очень похожее содержание углеводов по сравнению с экстрактом для человека, хотя Экстракт 3 демонстрировал большую вариабельность между анализами.

Содержание эндотоксинов

Определяли содержание эндотоксинов в экстрактах. Четыре экстракта растворяли в концентрации 1 мг/мл. В каждом случае использовали разведения 1/100 и 1/500. В таблице 3 показано среднее содержание эндотоксинов в EU(эндотоксиновая единица)/мл и значения EU/мг лиофилизированного экстракта, полученное для каждого разведения и каждого экстракта.

Экстракт 1 представлял большую вариабельность среди двух проанализированных разведений. Однако все значения содержаний эндотоксинов находились в пределах аналогичного интервала - от 30 до 90 EU/мг лиофилизированного экстракта, и различия между экстрактами могли быть обусловлены разным сырьем, использованным для получения каждого экстракта.

Ферментативная активность

Большинство клещевых аллергенов имеют ферментативную активность, по этой причине важно анализировать ферментативную активность экстрактов. Систему API-ZYM использовали для оценки активности 19 разных ферментов: щелочной фосфатазы, эстеразы (С4), эстеразы липазы (С8), липазы (С14), лейцинариламидазы, валинариламидазы, цистинариламидазы, трипсина, α-галактозидазы, β-галактозидазы, α-глюкуронидазы, α-глюкозидазы, β-глюкозидазы, N-ацетил-β-глюкозаминидазы, α-маннозидазы и α-фукозидазы. Образцы готовили в концентрации 1 мг белка/мл в дистиллированной воде. После инкубации каждого образца с субстратами ферментативные активности развивались в течение 10 мин. Результаты интерпретировали оптически согласно руководству с инструкциями в диапазоне от 0 до 5 (0 означает отсутствие цвета, 5 означает очень интенсивный цвет). Результат 2 или ниже считали отрицательным. Результаты полуколичественного определения разных ферментативных активностей разделяли на группы, в зависимости от вида проанализированного фермента.

Фосфатазы (таблица 4) были позитивными во всех экстрактах, причем самая интенсивная активность была обнаружена для кислой фосфатазы. Не обнаружено различий между экстрактом для человека и ветеринарными экстрактами.

Что касается протеаз (таблица 5), ни в одном из экстрактов не была обнаружена активность цистеинариламидазы, в то время как валин- и лейцинариламидазы были позитивными и аналогичными во всех экстрактах. Активность трипсина была ниже или даже отрицательной в ветеринарных экстрактах по сравнению с экстрактом для человека, и α-химотрипсин был позитивным во всех экстрактах (это противоречит результатам, полученным Morales et al. (Enzymatic Activity of Allergenic House Dust and Storage Mite Extracts, J. Med. Entonol., 2013, 50, 147-54), которые не обнаружили активности α-химотрипсина в экстракте D. farinae для человека).

Таблица 6 содержит информацию о липазах. В экстрактах не была обнаружена активность липазы, тогда как активности эстеразы и эстеразы липазы были позитивными и аналогичными во всех экстрактах, за исключением Экстракта 2, который был негативным в отношении эстеразы.

Наконец, в таблице 7 обобщена глюкозидазная активность. Данная активность была очевидной во всех экстрактах, будучи позитивной для всех типов проанализированных ферментов. Не обнаружено релевантных различий между экстрактом для человека и ветеринарными экстрактами, за исключением β-галактозидазы и α-глюкуронидазы, которые представляли уровень APIZYM 5 во всех ветеринарных экстрактах по сравнению с экстрактом для человека (уровень 4).

Таким образом, в общем, можно сказать, что имелись некоторые различия между экстрактом для человека и ветеринарными экстрактами в отношении ферментативной активности. Данный результат объясняется потерей некоторых типов белков, причем многие из них, вероятно, обладают ферментативной активностью, в ветеринарных экстрактах во время процесса диализа. С другой стороны, три ветеринарных экстракта демонстрировали очень похожие профили ферментативной активности, демонстрируя высокую однородность продукта.

Помимо системы APIZYM, хитиназную активность экстрактов оценивали с использованием набора для анализа хитиназы (Sigma-Aldrich), следуя инструкциям изготовителя. Данный набор основан на ферментативном гидролизе субстратов хитиназы, высвобождающем n-нитрофенол, который можно измерять при 405 нм при щелочном значении рН. Данный набор предоставляет три разных субстрата для выявления различных типов хитинолитической активности. Для данного анализа образцы готовили в концентрации 5 мг/мл. В таблице 8 показана хитиназная активность для каждого образца и для каждого гидролизованного субстрата.

Субстрат 1: 4-нитрофенил-N-ацетил-β-D-глюкозаминид; субстрат 2: 4-нитрофенил-N,N'-диацетил-β-D-хитобиозид; субстрат 3: 4-нитрофенил-β-D-N,N',N''-триацетилхитотриоза.

Что касается субстратов 1 и 3, не было релевантных различий в величине мU/мг белка для хитиназной активности между экстрактами. Для субстрата 3 наблюдали высокое стандартное отклонение между анализами, возможно, из-за разного времени инкубации. Уровень с субстратом 2, который подходит для обнаружения экзохитиназной активности, был выше в экстракте для человека по сравнению с ветеринарными экстрактами. Таким образом, несмотря на то, что Der f 15 и Der f 18 были описаны как хитиназы, в ветеринарных экстрактах не было обнаружено никакого увеличения хитиназной активности.

Идентификация аллергенов (масс-спектрометрическое секвенирование)

Чтобы подтвердить присутствие главных собачьих аллергенов Der f 15 и Der f 18 в трех ветеринарных экстрактах, вырезали из SDS-геля, окрашенного кумасси, полосы белков с ожидаемыми MW 109/96 кДа (Der f 15) и 60 кДа (Der f 18) и отправляли в протеомный блок Proteomic Unit of CSIC («Национальный центр биотехнологии», Мадрид, Испания). Белки расщепляли трипсином, и полученные пептиды секвенировали при помощи масс-спектрометрии и сравнивали с базами известных белков посредством MASCOT.

На фиг. 6 последовательности, полученные из Der f 15 (SEQ ID NO. 1) и Der f 18 (SEQ ID NO. 2) с совпадающими пептидами показаны подчеркнутыми, а также показаны проценты перекрытия последовательностей для каждого ветеринарного экстракта.

Относительное количественное измерение аллергенов

Чтобы продемонстрировать, что в ветеринарных экстрактах достигается увеличение главных собачьих аллергенов Der f 15 и Der f 18, разработали новую методологию для относительного количественного определения белков посредством целевой протеомики (LC-MS/MS). Данное исследование было проведено Подразделением протеомики "Pare Cientific de Barcelona" («Научного парка Барселоны», Барселона, Испания).

С этой целью экстракт для человека был выбран как стандарт, а ветеринарный экстракт - Экстракт 2 - в качестве запрашиваемого образца. Оба образца расщепляли трипсином, и полученный раствор пептидов анализировали посредством анализа наноUPLC-масс-спектрометрии согласно методологии, описанной выше. Полученные файлы с необработанными данными подвергали поиску относительно базы данных D. farinae Uniprot. Для анализов количественного определения выбирали три пептида из Der f 15 и два из Der f 18 (Таблица 9), которые оказались стабильными по ходу постановок и не представляли проблем с обнаруживаемостью, деградацией или неоптимальной ионизацией. Рассчитывали площади пиков каждого полученного пептида в трех разных анализах и использовали для статистического анализа.

Для Der f 15 имелось значимое 2,97-кратное увеличение, т.е. ×2,97, в ветеринарном экстракте - Экстракте 2 - по сравнению с экстрактом для человека, тогда как для Der f 18 имелось значимое 0,24-кратное увеличение, т.е. ×0,24, в Экстракте 2 по сравнению с экстрактом для человека.

Данные результаты подтверждают, что ветеринарные экстракты имеют более высокое содержание аллергена Der f 15 по сравнению с экстрактом D. farinae для человека.

Иммуноблоттинг

10 мкг белка каждого экстракта анализировали посредством иммуноблоттинга с использованием пула сыворотки (разведенной 1/5) от собак, сенсибилизированных в отношении данного клеща (фиг. 7). Результат иммуноблоттинга подтвердил модификацию в распознаваемом профиле белка между экстрактом для человека и ветеринарными экстрактами и подчеркнул согласованность между этими тремя экстрактами.

Прямой ELISA

Все экстракты также анализировали посредством прямого ELISA (для покрытия планшета использовали 8 мкг белка каждого экстракта/мл) с таким же пулом сыворотки. Для трех ветеринарных экстрактов были обнаружены более высокие уровни специфичных IgE по сравнению с экстрактом для человека (фиг. 8), что указывает на более высокую аффинность пула сыворотки от собак с атопическим дерматитом для ветеринарных экстрактов.

Заключение

Главными результатами, полученными в результате получения и характеристики трех однородных экстрактов D. farinae, являются следующие:

- оптимизированный способ ультрафильтрации с использованием мембран 50k Pellicon^® и высокого давления обеспечивал получение трех экстрактов D. farinae с высокой однородностью, что продемонстрировано разными аналитическими процедурами;

- данные ветеринарные экстракты имели более низкие выходы в процессе изготовления, но более высокое содержание белка по сравнению с экстрактом для человека;

- эти три экстракта представляли модифицированный профиль белка по сравнению с экстрактом для человека с более высокой долей белков с высокой MW и со значительным снижением главных человеческих аллергенов, что продемонстрировано электрофорезом, гель-фильтрационной хроматографией и количественным измерением главных человеческих аллергенов;

- относительно других характеристик экстракта, таких как содержание углеводов и эндотоксинов, не было обнаружено значимых различий между экстрактом для человека и ветеринарными экстрактами. Имелись небольшие различия в некоторых ферментативных активностях между экстрактом для человека и ветеринарными экстрактами, но, в отношении хитиназной активности, не было увеличения данной ферментативной активности в ветеринарных экстрактах;

- во всех экстрактах посредством масс-спектрометрии были идентифицированы главные собачьи аллергены Der f 15 и Der f 18. Кроме того, была оптимизирована новая методика относительного количественного определения белка посредством целевой протеомики, которая ранее не использовалась для характеристики экстрактов. Данная методика обеспечила демонстрацию на одном из ветеринарных экстрактов того, что уровень Der f 15 был значительно повышен в данном образце по сравнению с экстрактом для человека;

- с иммунологической точки зрения пул сыворотки от собак, сенсибилизированных к данному клещу, демонстрировал более высокие уровни специфичного IgE для трех ветеринарных экстрактов по сравнению с природным экстрактом для человека.

Стандартизация ветеринарного экстракта Dermatophagoides farinae

1.1 Исследование in vivo

Ветеринарный экстракт 4, полученный таким же способом, что и ветеринарные экстракты 1-3 ранее, использовали для получения раствора для внутрикожного тестирования у собак, сенсибилизированных к D. farinae. С этой целью раствор экстракта в концентрации 1 мг/мл готовили в SSFA (фенолированный физиологический раствор с альбумином), поддерживали при встряхивании в течение 2 ч. и фильтровали с использованием фильтров 0,22 мкм. Наряду с ветеринарным экстрактом 4 собак тестировали с 0,05 мг/мл гистамина гидрохлорида (позитивный контроль) и SSFA в качестве негативного контроля.

- Животные, включенные в данное исследование:

Четырнадцать собак в возрасте от 1 до 6 лет с клиническим диагнозом атопический дерматит и демонстрирующих уровень специфичных IgE против D. farinae более 1000 единиц поглощения ELISA (EAU) (анализ ELISA от Greer Laboratories). Исключали собак со следующими характеристиками: собаки, которых лечили кортикоидами, циклоспорином А, иммунодепрессантами; собаки, которых лечили иммунотерапией; собаки, страдающие от бактериальных, вирусных или паразитарных инфекций, иммунной недостаточности или иммунопатологических заболеваний.

От каждого животного отбирали образец 5 мл сыворотки для анализа in vitro:

- Методика внутрикожного тестирования:

50 мкл раствора экстракта в концентрации 1 мг/мл или контроли внутрикожно инъецировали в двойной повторности в предварительно выбритую грудную область животных. Через 15 мин после инъекции полученный волдырь аспирировали и переносили на бумагу.

- Анализ размера волдырей:

Площадь волдырей измеряли с использованием программы PC Draft (Microspot). Размеры волдырей считали положительными, если площадь составляла 7 мм² или более.

Результаты:

Все животные были позитивными в отношении ветеринарного экстракта 4 со средним размером волдыря 115,3 плюс/минус 66,8 мм².

1.2 Исследование in vitro

- Характеристика образцов сыворотки

Специфический IgE каждого образца сыворотки анализировали посредством прямого ELISA (методика была описана ранее) относительно ранее использованных ветеринарного экстракта 4 и экстракта для человека. Все образцы сыворотки демонстрировали значительно более высокие значения специфичных IgE для ветеринарного экстракта 4 по сравнению с экстрактом D. farinae для человека (фиг. 9).

- Биологическая эффективность

Все образцы сыворотки использовали для получения пула для осуществления стандартизации in vitro посредством анализа эффективности ELISA. В таблице 10 показано количество ветеринарного экстракта (4 мкг), необходимое для получения 50%-ного ингибирования пула сыворотки из 5 разных анализов.

Среднее значение, полученное для 50%-ного ингибирования, составляло 0,062 плюс/минус 0,006 мкг. Пример кривых, полученных в данном анализе, показан на фиг. 10. 50%-ное ингибирование рассчитывали для другой партии ветеринарного экстракта, полученной, как описано ранее (экстракт 5). Полученное значение составляло 0,066 мкг. Данный результат демонстрирует однородность разных партий ветеринарного экстракта в показателях биологической эффективности (общая аллергенная активность IgE).

Сравнение биологической эффективности ветеринарного экстракта по сравнению с экстрактом для человека

Ранее описанный анализ эффективности посредством ELISA использовали для анализа эффективности ветеринарного экстракта 4 по сравнению с экстрактом для человека. На фиг. 11 показаны кривые, полученные в данном анализе.

Количество экстракта для человека, необходимое для достижения 50%-ного ингибирования пула сыворотки атопических собак (выбранного таким же способом, как описано в «Стандартизации ветеринарного экстракта Dermatophagoides farinae») составляло 0,132 мкг, что представляет собой 2,13-кратное увеличение относительно ветеринарного экстракта 4 (0,062 мкг) и демонстрирует, что ветеринарный экстракт 4 является примерно в два раза более эффективным по сравнению с экстрактом для человека в показателях биологической эффективности.

Денситометрический анализ иммуноблотов для оценки содержания Der f 15 и Der f 18

Анализ профилей белков и аллергенов посредством денситометрии можно использовать в качестве подхода для оценки количества аллергенов в экстрактах. По этой причине анализировали интенсивность полос аллергенов Der f 15 и Der f 18 в профилях аллергенов, полученных с использованием пула сыворотки, описанного в «Сравнении биологической эффективности ветеринарного экстракта по сравнению с экстрактом для человека». Изображения, соответствующие экспериментам по иммуноблоттингу разных ветеринарных экстрактов и экстракта D. farinae для человека, анализировали при помощи программы ImageQuant (GE Healthcare). Денситометрический объем каждой полосы белка, а также его молекулярную массу анализировали и сравнивали в разных образцах.

На фиг. 12 и фиг. 13 показаны изображения иммуноблотов, проанализированных программой ImageQuant, показывающие образцы, включенные в анализ, и главные аллергены Der f 15 и Der f 18. На фиг. 14 показаны полосы, идентифицированные программой ImageQuant на обоих изображениях. Значения, полученные для разных проанализированных параметров и для каждого из образцов, показаны в таблицах 11 и 12.

Полосы 1 и 2 из таблиц 11 и 12 соответствуют аллергену Der f 15 во всех образцах, тогда как Der f 18 соответствует полосе номер 4. В таблицах 13 и 14 обобщена информация, соответствующая объему (интенсивности) данных аллергенов и кратности увеличения по сравнению с экстрактом для человека:

Объем интенсивности, показывающий распознавание аллергенов Der f 15 и Der f 18, демонстрировал большое увеличение в ветеринарных экстрактах (2,2-3,4-кратное увеличение, т.е. увеличение от 2,2 до 3,4 раз) по сравнению с экстрактом для человека. Данные результаты подтверждают увеличение количества данных аллергенов в ветеринарном экстракте относительно экстракта D. farinae для человека.

Ветеринарный экстракт для лечения аллергии других млекопитающих: кошки

Чтобы оценить, можно ли использовать данный ветеринарный экстракт для лечения аллергий у млекопитающих, отличных от собак, анализировали профиль сенсибилизации котов, сенсибилизированных в отношении D. farinae.

В данное исследование включали семь животных (1-7), позитивных в отношении D. farinae (EAU более 150; анализ ELISA от Greer Laboratories), и два негативных контроля (C1, С2) (EAU менее 150).

На фиг. 15 показан аллергенный профиль разных животных, включенных в данное исследование. У всех позитивных животных (номер 1-7) распознавались полосы с молекулярными массами от 14 до более 100 кДа в ветеринарном экстракте 4 и/или в экстракте для человека, тогда как негативные контроли (C1, С2) не демонстрировали какой-либо распознаваемой полосы.

Среди позитивных животных было обнаружено два главных аллергенных профиля с явными отличиями в MW распознаваемых полос. У двух животных распознавались полосы с низкими MW, тогда как у нескольких животных распознавались, главным образом, белки с массой более 40 кДа. У кота номер 2 распознавалась, главным образом, полоса 20 кДа, и у кота номер 7 распознавалась полосы 30 и 14 кДа, которые могли соответствовать главным человеческим аллергенам Der f 1 и Der f 2. С другой стороны, у котов номер 1, 3, 4 и 6, главным образом, распознавались белки с массой более 40 кДа, включая главные собачьи аллергены Der f 15 и Der f 18. Наконец, у кота номер 5 распознавались белки с высокой и низкой MW.

Согласно данной информации, котов, демонстрирующих аллергенный профиль с полосами выше 40 кДа и включающим аллергены Der f 15 и Der f 18, можно лечить данным ветеринарным экстрактом клещевых аллергенов.

Клеточные анализы in vitro

Целью данного исследования была оценка способности ветеринарного экстракта 2 Dermatophagoides farinae и экстракта Dermatophagoides farinae для человека индуцировать продукцию цитокинов в мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС) от атопических и неатопических собак.

1.1. Методика

Супернатанты культуры РВМС получали от четырех атопических собак и трех здоровых контролей. Четыре атопические собаки имели атопический дерматит в клиническом анамнезе и уровень специфичного IgE против D. farinae выше 1000 EAU (анализ ELISA от Greer Laboratories). Собаки со следующими характеристиками были исключены: собаки, которых лечили кортикоидами, циклоспорином А и иммуносупрессивными соединениями; собаки, которых лечили иммунотерапией; собаки, страдающие от бактериальных, вирусных или паразитарных инфекций, иммунной недостаточности или иммунопатологических заболеваний. Три здоровые собаки не демонстрировали каких-либо клинических симптомов и имели уровень специфичного IgE против D. farinae ниже 150 EAU.

Содержание цитокинов в супернатантах измеряли при помощи набора для собак на основе ELISA Milliplex^® Mag God kit (Millipore), осуществляя анализ согласно инструкциям изготовителя. Вкратце, РВМС (2,5×10⁶ клеток на лунку) от доноров (четыре атопических и три неатопических контроля) стимулировали в тройной повторности экстрактом для человека или ветеринарным экстрактом 2 (40 мкг белка/мл), и продуцирование IFN-γ и IL-10 измеряли в двойной повторности в супернатантах культуры через 24 и 48 ч. инкубации при 37°С в атмосфере 5% СО₂. В качестве негативного контроля использовали культуральную среду RPMI-1640 (Sigma-Aldrich), и в качестве позитивных контролей использовали конканавалин А (Con А, 3 мкг/мл) и LPS (липополисахариды, 3 мкг/мл).

Для количественного измерения цитокинов стандартные данные аппроксимировали к пятипараметрической логистической кривой, и проводили статистический анализ по U-критерию Манна-Уитни. Значение р менее 0,05 считали статистически значимым.

1.2. Результаты

Клеточные исследования показали аналогичное индуцирование IFN-γ и IL-10 экстрактом для человека и ветеринарными экстрактами у атопических и контрольных собак (фиг. 16). Через 24 ч. экстракт для человека и ветеринарные экстракты индуцировали значимо большие уровни IL-10, чем негативный контроль (медиана (IQ) 1170 [559-1502] пг/мл для экстракта для человека и 1748 [1122-1998] пг/мл для ветеринарного экстракта). Уровень IFN-γ после 48 ч. инкубации также был значимо выше, чем в негативном контроле, в клетках от атопических собак, обработанных экстрактом для человека (52,1 [15-113,2] пг/мл) и ветеринарными экстрактами (50,4 [20-76,3] пг/мл).

Результаты от позитивных контролей (Con А и LPS) во всех случаях были значимо выше, чем для негативного контроля (р менее 0,05), данные не показаны.

Также сравнивали атопических и неатопических собак. Более высокие уровни обоих цитокинов наблюдались у неатопических собак с использованием экстракта для человека и ветеринарных экстрактов относительно атопических собак.

Успешная иммунотерапия аллергенами должна сопровождаться индукцией регуляторных Т-клеток (Treg) и сдвигом от Th2-ответа к Th1-ответу. Кроме того, успех иммунотерапии был связан со способностью аллергенных вакцин специфично стимулировать продуцирование IL-10 и IFN-γ, которые вовлечены в ответы Treg и Th1 соответственно, и уменьшение уровня IL-4. Данное исследование демонстрирует способность экстракта для человека и ветеринарных экстрактов D. farinae индуцировать продукцию IL-10 и IFN-γ в РВМС от собак, сенсибилизированных в отношении данного клеща, свидетельствуя об индукции ответов Th1 и Treg, и, следовательно, о полезном иммунном ответе, который может приводить к толерантности.

Так как собаки, включенные в данное исследование, ранее не подвергались лечению иммунотерапией, на данный момент является нормальным отсутствие наблюдения изменения Th1-опосредованной способности собак, обработанных ветеринарным экстрактом, по сравнению с собаками, обработанными экстрактом для человека. Однако стимуляция IL-10 демонстрирует, что ветеринарный экстракт имеет способность изменить равновесие Th1-Th2. Следует ожидать, что уровни IFN-γ у собак, обработанных ветеринарным экстрактом, будут значительно выше по сравнению с собаками, обработанными экстрактом для человека, после иммунотерапевтического лечения.

Неатопические животные находятся в иммунологическом статусе, когда имеется правильный баланс между ответами Th2/Th1, и, следовательно, профиль продуцирования цитокинов также отличается. Таким образом, наблюдались более высокие уровни IL-10 и IFN-γ у неатопических собак, так как в базальном состоянии они продуцируют больше таких регуляторных цитокинов, чем атопические собаки, и после стимуляции экстрактом для человека и ветеринарными экстрактами D. farinae продуцирование дополнительно увеличивается.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> LABORATORIOS LETI, S.L. Unipersonal

<120> ВЕТЕРИНАРНЫЙ ПРОДУКТ

<130> P8753WO1

<150> EP17382527.4

<151> 2017-07-31

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 555

<212> PRT

<213> Dermatophagoides farinae

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> gi5815436 Der f 15

<400> 1

Met Lys Thr Ile Tyr Ala Ile Leu Ser Ile Met Ala Cys Ile Gly Leu

1 5 10 15

Met Asn Ala Ser Ile Lys Arg Asp His Asn Asp Tyr Ser Lys Asn Pro

20 25 30

Met Arg Ile Val Cys Tyr Val Gly Thr Trp Ser Val Tyr His Lys Val

35 40 45

Asp Pro Tyr Thr Ile Glu Asp Ile Asp Pro Phe Lys Cys Thr His Leu

50 55 60

Met Tyr Gly Phe Ala Lys Ile Asp Glu Tyr Lys Tyr Thr Ile Gln Val

65 70 75 80

Phe Asp Pro Tyr Gln Asp Asp Asn His Asn Ser Trp Glu Lys Arg Gly

85 90 95

Tyr Glu Arg Phe Asn Asn Leu Arg Leu Lys Asn Pro Glu Leu Thr Thr

100 105 110

Met Ile Ser Leu Gly Gly Trp Tyr Glu Gly Ser Glu Lys Tyr Ser Asp

115 120 125

Met Ala Ala Asn Pro Thr Tyr Arg Gln Gln Phe Ile Gln Ser Val Leu

130 135 140

Asp Phe Leu Gln Glu Tyr Lys Phe Asp Gly Leu Asp Leu Asp Trp Glu

145 150 155 160

Tyr Pro Gly Ser Arg Leu Gly Asn Pro Lys Ile Asp Lys Gln Asn Tyr

165 170 175

Leu Ala Leu Val Arg Glu Leu Lys Asp Ala Phe Glu Pro His Gly Tyr

180 185 190

Leu Leu Thr Ala Ala Val Ser Pro Gly Lys Asp Lys Ile Asp Arg Ala

195 200 205

Tyr Asp Ile Lys Glu Leu Asn Lys Leu Phe Asp Trp Met Asn Val Met

210 215 220

Thr Tyr Asp Tyr His Gly Gly Trp Glu Asn Phe Tyr Gly His Asn Ala

225 230 235 240

Pro Leu Tyr Lys Arg Pro Asp Glu Thr Asp Glu Leu His Thr Tyr Phe

245 250 255

Asn Val Asn Tyr Thr Met His Tyr Tyr Leu Asn Asn Gly Ala Thr Arg

260 265 270

Asp Lys Leu Val Met Gly Val Pro Phe Tyr Gly Arg Ala Trp Ser Ile

275 280 285

Glu Asp Arg Ser Lys Leu Lys Leu Gly Asp Pro Ala Lys Gly Met Ser

290 295 300

Pro Pro Gly Phe Ile Ser Gly Glu Glu Gly Val Leu Ser Tyr Ile Glu

305 310 315 320

Leu Cys Gln Leu Phe Gln Lys Glu Glu Trp His Ile Gln Tyr Asp Glu

325 330 335

Tyr Tyr Asn Ala Pro Tyr Gly Tyr Asn Asp Lys Ile Trp Val Gly Tyr

340 345 350

Asp Asp Leu Ala Ser Ile Ser Cys Lys Leu Ala Phe Leu Lys Glu Leu

355 360 365

Gly Val Ser Gly Val Met Val Trp Ser Leu Glu Asn Asp Asp Phe Lys

370 375 380

Gly His Cys Gly Pro Lys Asn Pro Leu Leu Asn Lys Val His Asn Met

385 390 395 400

Ile Asn Gly Asp Glu Lys Asn Ser Phe Glu Cys Ile Leu Gly Pro Ser

405 410 415

Thr Thr Thr Pro Thr Pro Thr Thr Thr Pro Thr Thr Pro Thr Thr Thr

420 425 430

Pro Thr Thr Pro Ser Pro Thr Thr Pro Thr Thr Thr Pro Ser Pro Thr

435 440 445

Thr Pro Thr Thr Thr Pro Ser Pro Thr Thr Pro Thr Thr Thr Pro Ser

450 455 460

Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Ala Pro Thr Thr Ser

465 470 475 480

Thr Pro Ser Pro Thr Thr Thr Glu His Thr Ser Glu Thr Pro Lys Tyr

485 490 495

Thr Thr Tyr Val Asp Gly His Leu Ile Lys Cys Tyr Lys Glu Gly Asp

500 505 510

Ile Pro His Pro Thr Asn Ile His Lys Tyr Leu Val Cys Glu Phe Val

515 520 525

Asn Gly Gly Trp Trp Val His Ile Met Pro Cys Pro Pro Gly Thr Ile

530 535 540

Trp Cys Gln Glu Lys Leu Thr Cys Ile Gly Glu

545 550 555

<210> 2

<211> 462

<212> PRT

<213> Dermatophagoides farinae

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> gi27550039 Der f 18

<400> 2

Met Thr Arg Phe Ser Leu Thr Val Leu Ala Val Leu Ala Ala Cys Phe

1 5 10 15

Gly Ser Asn Ile Arg Pro Asn Val Ala Thr Leu Glu Pro Lys Thr Val

20 25 30

Cys Tyr Tyr Glu Ser Trp Val His Trp Arg Gln Gly Glu Gly Lys Met

35 40 45

Asp Pro Glu Asp Ile Asp Thr Ser Leu Cys Thr His Ile Val Tyr Ser

50 55 60

Tyr Phe Gly Ile Asp Ala Ala Thr His Glu Ile Lys Leu Leu Asp Glu

65 70 75 80

Tyr Leu Met Lys Asp Leu His Asp Met Glu His Phe Thr Gln His Lys

85 90 95

Gly Asn Ala Lys Ala Met Ile Ala Val Gly Gly Ser Thr Met Ser Asp

100 105 110

Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Val Glu His Tyr Arg Glu Thr Phe Val

115 120 125

Val Ser Thr Val Asp Leu Met Thr Arg Tyr Gly Phe Asp Gly Val Met

130 135 140

Ile Asp Trp Ser Gly Met Gln Ala Lys Asp Ser Asp Asn Phe Ile Lys

145 150 155 160

Leu Leu Asp Lys Phe Asp Glu Lys Phe Ala His Thr Ser Phe Val Met

165 170 175

Gly Val Thr Leu Pro Ala Thr Ile Ala Ser Tyr Asp Asn Tyr Asn Ile

180 185 190

Pro Ala Ile Ser Asn Tyr Val Asp Phe Met Asn Val Leu Ser Leu Asp

195 200 205

Tyr Thr Gly Ser Trp Ala His Thr Val Gly His Ala Ser Pro Phe Pro

210 215 220

Glu Gln Leu Lys Thr Leu Glu Ala Tyr His Lys Arg Gly Ala Pro Arg

225 230 235 240

His Lys Met Val Met Ala Val Pro Phe Tyr Ala Arg Thr Trp Ile Leu

245 250 255

Glu Lys Met Asn Lys Gln Asp Ile Gly Asp Lys Ala Ser Gly Pro Gly

260 265 270

Pro Arg Gly Gln Phe Thr Gln Thr Asp Gly Phe Leu Ser Tyr Asn Glu

275 280 285

Leu Cys Val Gln Ile Gln Ala Glu Thr Asn Ala Phe Thr Ile Thr Arg

290 295 300

Asp His Asp Asn Thr Ala Ile Tyr Ala Val Tyr Val His Ser Asn His

305 310 315 320

Ala Glu Trp Ile Ser Phe Glu Asp Arg His Thr Leu Gly Glu Lys Ala

325 330 335

Lys Asn Ile Thr Gln Gln Gly Tyr Ala Gly Met Ser Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Ser Asn Glu Asp Val His Gly Val Cys Gly Asp Lys Asn Pro Leu Leu

355 360 365

His Ala Ile Gln Ser Asn Tyr Tyr His Gly Val Val Thr Glu Pro Thr

370 375 380

Val Val Thr Leu Pro Pro Val Thr His Thr Thr Glu His Val Thr Asp

385 390 395 400

Ile Pro Gly Val Phe His Cys His Glu Glu Gly Phe Phe Arg Asp Lys

405 410 415

Thr Tyr Cys Ala Thr Tyr Tyr Glu Cys Lys Lys Gly Asp Phe Gly Leu

420 425 430

Glu Lys Thr Val His His Cys Ala Asn His Leu Gln Ala Phe Asp Glu

435 440 445

Val Ser Arg Thr Cys Ile Asp His Thr Lys Ile Pro Gly Cys

450 455 460

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> Dermatophagoides farinae

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Der f 15 835.38

<400> 3

Phe Asp Gly Leu Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Gly Ser Arg

1 5 10

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> Dermatophagoides farinae

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Der f 15 776.38

<400> 4

Val Asp Pro Tyr Thr Ile Glu Asp Ile Asp Pro Phe Lys

1 5 10

<210> 5

<211> 14

<212> PRT

<213> Dermatophagoides farinae

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Der f 15 813.89

<400> 5

Ile Trp Val Gly Tyr Asp Asp Leu Ala Ser Ile Ser Cys Lys

1 5 10

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> Dermatophagoides farinae

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Der f 18 505.99

<400> 6

Thr Val His His Cys Ala Asn His Leu Gln Ala Phe Asp Glu Val Ser

1 5 10 15

Arg

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> Dermatophagoides farinae

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Der f 18 383.19

<400> 7

Gly Asp Phe Gly Leu Glu Lys

1 5

<---

Claims

1. Ветеринарный экстракт клещевых аллергенов для лечения аллергии на клещевые аллергены, обогащенный белками с молекулярными массами выше 50 кДа,

где экстракт происходит из Dermatophagoides farinae,

где экстракт обогащен аллергенами Der f 15 и Der f 18 по сравнению с экстрактом для человека,

где данный экстракт имеет более низкие уровни аллергенов Der f 1 и Der f 2 по сравнению с экстрактом для человека,

где ветеринарный экстракт клещевых аллергенов содержит менее 4 мкг/мг Der f 1 и менее 1,5 мкг/мг Der f 2, и

где экстракт для человека является получаемым способом, включающим:

а) приведение в контакт исходного материала, содержащего клещевой аллерген, с агентом на основе экстракта аллергенов с получением смеси аллергенов, растворенных в жидкой фазе, и твердой фазы, содержащей неаллергенный остаток;

в) подвергание неочищенного экстракта аллергенов стадии удаления молекулярной фракции для удаления молекул, имеющих размер менее 3 кДа, и приложение давления примерно 1 бар (100 кПа) на протяжении стадии удаления;

г) проведение стадии (в) при 3-5°С до тех пор, пока экстракт аллергенов не имеет проводимость ниже 1050 мкСм/см и/или пока не был использован конкретный объем дистиллированной воды, с получением обогащенного экстракта аллергенов, где конкретный объем дистиллированной воды рассчитывают с использованием следующей формулы: мл отфильтрованного экстракта × 10 = объем дистиллированной воды.

2. Ветеринарный экстракт клещевых аллергенов по п. 1, который в анализе ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) 50%-ного ингибирования IgE по меньшей мере в 1,5 раза, предпочтительно по меньшей мере в 2,0 раза, наиболее предпочтительно в 2,0-2,5 раза более эффективен, чем экстракт для человека, содержащий аллергены Der f 1 и Der f 2.

3. Ветеринарный экстракт клещевых аллергенов по п. 1 или 2, где в денситометрическом анализе иммуноблотов концентрация Der f 15 по меньшей мере в 1,5 раза, предпочтительно по меньшей мере в 2,0 раза, наиболее предпочтительно в 2,0-3,0 раза выше, чем в экстракте для человека, содержащем аллергены Der f 1 и Der f 2, и/или где концентрация Der f 18 по меньшей мере в 1,5 раза, предпочтительно по меньшей мере в 2,0 раза, наиболее предпочтительно в 2,0-3,5 раза выше, чем в экстракте для человека, содержащем аллергены Der f 1 и Der f 2.

4. Способ получения ветеринарного экстракта клещевых аллергенов, включающий:

а) приведение в контакт исходного материала, содержащего клещевой аллерген, с водным экстрагирующим аллергены агентом с получением смеси аллергенов, растворенных в жидкой фазе, и твердой фазы, содержащей неаллергенный остаток;

в) подвергание неочищенного экстракта аллергенов стадии удаления молекулярной фракции среднего размера для удаления молекул, имеющих размер менее 50 кДа, и приложение давления 1,2-1,8 бар (120-180 кПа) на протяжении стадии удаления;

г) проведение стадии (в) при 3-5°С до тех пор, пока экстракт аллергенов не имеет проводимость ниже 1050 мкСм/см и/или пока не был использован конкретный объем дистиллированной воды, с получением обогащенного экстракта аллергенов, где конкретный объем дистиллированной воды рассчитывают с использованием следующей формулы: мл отфильтрованного экстракта × 10 = объем дистиллированной воды;

где ветеринарный экстракт клещевых аллергенов содержит Der f 1, Der f 2, Der f 15 и Der f 18; и

где ветеринарный экстракт клещевых аллергенов содержит менее 4 мкг/мг Der f 1 и менее 1,5 мкг/мг Der f 2.

5. Способ по п. 4, где стадия разделения представляет собой центрифугирование.

6. Способ по любому из п. 4 или 5, где стадия удаления молекулярной фракции среднего размера включает стадию ультрафильтрации, стадию диафильтрации, стадию диализа или фильтрование.

7. Ветеринарный экстракт клещевых аллергенов для лечения аллергии на клещевые аллергены, содержащий Der f 1, Der f 2, Der f 15 и Der f 18, где содержание Der f 1 составляет менее 4 мкг/мг ветеринарного экстракта клещевых аллергенов и содержание Der f 2 составляет менее 1,5 мкг/мг ветеринарного экстракта клещевых аллергенов, и где ветеринарный экстракт клещевых аллергенов получен способом по любому из пп. 4-6.

8. Ветеринарный экстракт клещевых аллергенов по любому из пп. 1-3 или 7, для использования в лечении аллергии на клещей у животного, предпочтительно млекопитающего, более предпочтительно собаки и/или кошки, где кошка имеет сывороточные антитела IgE, которые в анализе иммуноблоттинга взаимодействуют с аллергенами Dermatophagoides farinae с молекулярными массами выше 40 кДа и включающими Der f 15 и Der f 18 или рекомбинантный Der f 15 и Der f 18, предпочтительно рекомбинантный Der f 15 и Der f 18 имеют по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%-ную гомологию с нерекомбинантным Der f 15 и Der f 18 соответственно.

9. Фармацевтическая композиция для лечения аллергии на клещевые аллергены, содержащая эффективное количество ветеринарного экстракта клещевых аллергенов по любому из пп. 1-3 или 7.

10. Вакцина для лечения аллергии на клещевые аллергены, содержащая эффективное количество ветеринарного экстракта клещевых аллергенов по любому из пп. 1-3 или 7.