EA024470B1 - Способ получения препарата костного белка и препарат костного белка - Google Patents

Способ получения препарата костного белка и препарат костного белка Download PDF

Info

Publication number
EA024470B1
EA024470B1 EA201390030A EA201390030A EA024470B1 EA 024470 B1 EA024470 B1 EA 024470B1 EA 201390030 A EA201390030 A EA 201390030A EA 201390030 A EA201390030 A EA 201390030A EA 024470 B1 EA024470 B1 EA 024470B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
bone
protein preparation
protein
matrix
bone protein
Prior art date
Application number
EA201390030A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201390030A1 (ru
Inventor
Ханна Тёлли
Юха-Матти Нярхи
Харри Лумме
Элли Бирр
Ойли Хиетала
Микко Виитанен
Мерья Хайкола
Пекка Яловаара
Бо Кеннет Сандстрём
Original Assignee
Ббс-Биоэктив Боун Сабститьютс Ой
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ббс-Биоэктив Боун Сабститьютс Ой filed Critical Ббс-Биоэктив Боун Сабститьютс Ой
Publication of EA201390030A1 publication Critical patent/EA201390030A1/ru
Publication of EA024470B1 publication Critical patent/EA024470B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1875—Bone morphogenic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/32—Bones; Osteocytes; Osteoblasts; Tendons; Tenocytes; Teeth; Odontoblasts; Cartilage; Chondrocytes; Synovial membrane
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A61K38/1738—Calcium binding proteins, e.g. calmodulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1841—Transforming growth factor [TGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/39—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/44—Oxidoreductases (1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A61K38/4833—Thrombin (3.4.21.5)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/167—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction with an outer layer or coating comprising drug; with chemically bound drugs or non-active substances on their surface
    • A61K9/1676—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction with an outer layer or coating comprising drug; with chemically bound drugs or non-active substances on their surface having a drug-free core with discrete complete coating layer containing drug
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A61L27/3608—Bone, e.g. demineralised bone matrix [DBM], bone powder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3641—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3645—Connective tissue
    • A61L27/365—Bones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A61L27/3687—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by the use of chemical agents in the treatment, e.g. specific enzymes, detergents, capping agents, crosslinkers, anticalcification agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/252—Polypeptides, proteins, e.g. glycoproteins, lipoproteins, cytokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

В изобретении предложен препарат костного белка, включенный в матрицу полиэтиленгликоль/глицерин (PEG-GLY), для обеспечения остеоиндуктивного эффекта, полученный способом, включающим a) деминерализацию кости и экстракцию костного матрикса растворителем гуанидингидрохлоридом с получением экстракта костного белка; b) фильтрование экстракта микрофильтром с отсекаемым размером частиц от 0,1 до 10 мкм (номинальное значение в микронах), достаточным для удаления крупных частиц и небелкового материала, но обеспечивающим прохождение белков; c) фильтрование фильтрата кассетным ультрафильтром, имеющим отсекаемый размер частиц от примерно 5 до примерно 10 кДа, с выделением препарата костного белка; d) включение препарата костного белка, полученного на стадии с), в матрицу полиэтиленгликоль/глицерин. Также предложен препарат костного белка, включенный в матрицу полиэтиленгликоль/глицерин (PEG-GLY) и содержащий матриксный Gla-белок, SPP-24 (секретируемый фосфопротеин), ВМР-2, ВМР-7 и TGF-β1 в количествах, достаточных, чтобы обеспечить остеоиндуктивный эффект при ведении. Кроме того, в изобретении предложены гранула, пеллета и остеогенное устройство, содержащие данные препараты костного белка, и способ лечения расстройств с их использованием.

Description

Аспекты настоящего изобретения относятся к способам получения препаратов костного белка. Несколько форм осуществления также относится к препаратам костного белка, полученным этим способом, и к композициям, содержащим один или более чем один из этих препаратов, включая остеогенные устройства.
Предшествующий уровень техники
В областях ортопедической и периодонтальной хирургии в высокой степени желательно найти эффективные системы для лечения пациентов со скелетными расстройствами и деформациями, включающего исправление крупных дефектов костей в результате травмы, удаления опухолей и врожденных пороков, реконструкцию изношенного костного вещества посредством имплантированного эндопротеза при ревизионных операциях и заживление медленно срастающихся или не срастающихся переломов.
Аутологический трансплантат (аутотрансплантат) является традиционным подходом к регенерации кости, но извлечение костных трансплантатов может привести к осложнениям, таким как кровотечение, боль и инфекция. Аутотрансплантаты также обладают ограниченной доступностью, поэтому в качестве альтернативы используют многие неорганические материалы. Фосфаты кальция, такие как гидроксиапатит (ГАП) и трикальцийфосфаты (ТКФ) и их вариации, являются общеизвестными материалами заменителей костной ткани. Эти материалы обеспечивают остеокондуктивный каркас для формирования новой кости.
Биологическую активность неорганических материалов можно повысить путем добавления остеогенного стимула в наполнитель костного трансплантата. Во многих различных исследованиях показано, что аллотрансплантаты, деминерализованные костные матриксы (беттегайхеб Ьоие тайтсек, ЭВМ) и нативные костные экстракты повышают способность к заживлению кости и усиливают интеграцию. Показано, что комбинации бычьих факторов роста костной ткани в носителях на основе коллагена и ЭВМ или кораллового ГАП (гидроксиапатита) обладают настолько же хорошим эффектом, что и аутогребни подвздошной кости, при исследовании скоростей сращения в позвоночном артродезе у кроликов и обезьян.
Имеющиеся в продаже синтезированные биоматериалы разработаны и могут применяться в качестве заполняющего материала или внутренней, а также наружной опоры. К сожалению, у этих материалов отсутствует биологическая активность, необходимая для инициации регенерации кости. Синтетические носители, полученные из таких материалов, включая полимеры молочной кислоты и гиалуроновые кислоты, описаны, например, в патенте И8 5366508. Костный морфогенетический белок (Ьопе тотрйодепебс рго1е1п, ВМР) считают важным фактором в остеогенных устройствах, и он активно участвует в процессе имплантации.
В ЕР 0883410В1 раскрыт способ получения модифицированного комплекса костного морфогенетического белка (ВМР) для остеогенного устройства, где этот модифицированный комплекс ВМР может быть получен способом, включающим стадии (а) тонкого измельчения деминерализованного костного вещества; (Ь) экстракции костного вещества на стадии (а) гуанидиния гидрохлоридом (СиНС1); (с) проведения фильтрации с использованием системы тангенциального потока; (б) проведения гельфильтрации, посредством которой получают частично очищенный комплекс ВМР, демонстрирующий три пика, содержащих три различных белковых фракции, которые характеризуются тем, что имеют различные молекулярные массы, где фракцию I составляет белок высокой молекулярной массы М\У (100700 кДа) с остеоиндуктивной активностью ВМР, фракцию II составляет белок средней М\У (25-55 кДа), иммуногенный белок, у которого отсутствует активность ВМР, и фракцию III составляет белок низкой М\У (15-25 кДа) с остеоиндуктивной активностью ВМР; и (е) удаления из частично очищенного ВМР фракции с иммуногенными и воспалительными свойствами, имеющей М\У 25-55 кДа, что определяют с помощью гель-фильтрации.
Необходимость в дополнительных остеогенных материалах, которые полезны для ряда применений при регенерации кости, в частности, в материалах, совместимых с материалами носителей, обычно используемых в вышеописанных областях применения, очевидна.
Краткое изложение изобретения
Неожиданно обнаружено, что экстракт костного белка, содержащий факторы роста, среди других белков, обеспечивает уникальные остеогенные свойства. Экстракт костного белка, например, может ускорить десорбцию каркаса или носителя, в который включен этот экстракт.
Соответственно, несколько форм осуществления включают способы получения препарата костного белка, которые осуществляют на практике путем:
a) деминерализации кости и экстракции костного матрикса гуанидингидрохлоридом с получением экстракта костного белка;
b) фильтрования экстракта с помощью микрофильтра с отсекаемым размером частиц, достаточным для удаления крупных частиц и небелкового вещества, но обеспечивающим прохождение белков;
c) фильтрования фильтрата с помощью кассетного ультрафильтра, имеющего отсекаемый размер частиц примерно 5-10 кДа, с выделением препарата костного белка.
Несколько форм осуществления, описанных в данной работе, включает препарат костного белка, полученный одним или более чем одним из вышеупомянутых способов.
- 1 024470
Некоторые формы осуществления включают препарат костного белка, содержащий факторы роста, факторы дифференциации и сигнальные молекулы, которые обеспечивают при их комбинировании синергический эффект и/или активность, которая может быть полезна для остеоиндуктивных целей, например, чтобы усилить преимущественные свойства стимулирования роста кости. Факторы роста, факторы дифференциации и сигнальные молекулы могут включать белки, определенные в данной работе, такие как костный морфогенетический белок (белки) (ВМР) и белки, находящиеся в нативных деминерализованных костных экстрактах. В одной форме осуществления препарат костного белка, содержащий факторы роста, факторы дифференциации и сигнальные молекулы, получают любым способом, описанным в данной работе.
Аспекты настоящего изобретения также включают препарат костного белка, содержащий один или более чем один из белков, описанных в данной работе, например, некоторые формы осуществления включают или по существу состоят из матриксного С1а-белка, 8РР-24 (5ссгс1сб ρΙιοφΙιορίΌΐοίη, секретируемого фосфопротеина), ВМР-2, ВМР-7 и/или ТСР-βΙ.
Аспекты изобретения также включают пасты или гели, такие как инъекционная паста или гель, содержащие один или более чем один из препаратов костного белка, описанных в данной работе. Паста или гель могут быть формуемыми, и их форма может также называться мастикой.
Соответственно, некоторые формы осуществления включают мастику, пеллету (пилюлю), диск, блок или гранулу, содержащие препарат костного белка, который включает один или более чем один из белков, описанных в данной работе, например, некоторые формы осуществления включают или по существу состоят из матриксного С1а-белка, 8РР-24 (секретируемого фосфопротеина), ВМР-2, ВМР-7 и/или ТСР-βΙ.
Некоторые формы осуществления также включают остеогенное устройство, такое как костный имплантат, содержащий один или более чем один из препаратов костного белка, описанных в данной работе, например, которым пропитана матрица, такая как пористая матрица. Таким образом, некоторые формы осуществления представляют собой остеогенные устройства, которые содержат один или более чем один из белков, описанных в данной работе, например, некоторые формы осуществления включают или по существу состоят из матриксного С1а-белка, 8РР-24 (секретируемого фосфопротеина), ВМР-2, ВМР-7 и/или ТСР-βΙ.
В некоторых формах осуществления один или более чем один из препаратов костного белка, описанных в данной работе, можно применять для лечения, ослабления, ингибирования или предупреждения расстройства или состояния, относящегося к дефектам кости, хряща, сухожилия или зуба, где желательна их регенерация, репарация или рост, такого как рак.
Некоторые формы осуществления, описанные в данной работе, включают фармацевтическую композицию, содержащую один или более чем один из препаратов костного белка, описанных в данной работе. Эти фармацевтические композиции можно применять для лечения, ослабления, ингибирования или предупреждения расстройства или состояния, относящегося к дефектам кости, хряща, сухожилия или зуба, где желательна их регенерация, репарация или рост, такого как рак.
В некоторых формах осуществления рассмотрены способы стимулирования (индукции) образования кости, хряща, сухожилия или зубов, ίη νίίτο или ίη νίνο, и эти способы осуществляют на практике путем предоставления или введения одного или более чем одного из костных препаратов, описанных в данной работе (желательно в остеогенном устройстве или подходящей матрице), субъекту, нуждающемуся в этом, например человеку или животному (включая домашних животных и животныхкомпаньонов). Необязательно, субъект может быть идентифицирован или классифицирован как субъект, нуждающийся в агенте, который индуцирует образование кости, хряща, сухожилия или зубов, и такую оценку может осуществить врач, стоматолог или хирург путем клинической диагностики. Необязательно, эти способы также могут включать анализ, наблюдение, измерение или клиническую оценку образования кости, хряща, сухожилия или зубов до и/или после предоставления или введения одного или более чем одного из костных препаратов, описанных в данной работе (желательно в остеогенном устройстве или подходящей матрице), субъекту, нуждающемуся в этом.
В следующих формах осуществления рассмотрены способы лечения, ослабления, ингибирования или предупреждения расстройства или состояния, относящегося к дефектам кости или хряща, такого как рак. Эти способы можно осуществлять на практике путем предоставления или введения одного или более чем одного из костных препаратов, описанных в данной работе (желательно в остеогенном устройстве или подходящей матрице), субъекту, нуждающемуся в этом, например, человеку или животному (включая домашних животных и животных-компаньонов). Необязательно, субъект может быть идентифицирован или классифицирован как субъект, нуждающийся в агенте, который лечит, ослабляет, ингибирует или предупреждает расстройство или состояние, относящееся к дефектам кости или хряща, такое как рак, и такую оценку может осуществить врач, стоматолог или хирург путем клинической диагностики. Необязательно, эти способы также включают анализ, наблюдение, измерение или клиническую оценку образования кости, хряща, сухожилия или зубов до и/или после предоставления или введения одного или более чем одного из костных препаратов, описанных в данной работе (желательно в остеогенном
- 2 024470 устройстве или подходящей матрице), субъекту, нуждающемуся в этом. Необязательно, эти способы также могут включать анализ, наблюдение, измерение или клиническую оценку прогрессирования, ингибирования, ослабления или лечения заболевания, расстройства или состояния, связанного с ними, и эти анализы, наблюдения или измерения можно проводить путем клинической оценки или диагностических методов.
Кроме того, в следующих формах осуществления один или более чем один экстракт костного белка, описанный в данной работе, комбинируют с каркасом или носителем, таким как трикальцийфосфат или кальция сульфат, и полученную в результате композицию применяют для ускорения десорбции каркаса или носителя, улучшая посредством этого процесс заживления кости у субъекта, нуждающегося в заживлении кости. Соответственно, рассмотрены способы ускорения образования кости, хряща, сухожилия или зубов ίη νίΐτο или ίη νίνο, и эти способы осуществляются путем предоставления или введения композиции, содержащей один или более чем один из экстрактов костного белка, описанных в данной работе, и трикальцийфосфат или кальция сульфат, субъекту, нуждающемуся в этом, например, человеку или животному (включая домашних животных и животных-компаньонов). Необязательно, субъект может быть идентифицирован или классифицирован как субъект, нуждающийся в агенте, который ускоряет образование кости, хряща, сухожилия или зубов, и такую оценку может осуществить врач, стоматолог или хирург путем клинической диагностики. Необязательно, эти способы также могут включать анализ, наблюдение, измерение или клиническую оценку образования кости, хряща, сухожилия или зубов до и/или после предоставления или введения одного или более чем одного из костных препаратов, описанных в данной работе (желательно в остеогенном устройстве или подходящей матрице), субъекту, нуждающемуся в этом.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 показаны изменения в потоке фильтрата в течение 1000 кДа фильтрации. Суммарный объем партии составлял 45 л.
На фиг. 2 показана концентрация суммарного белка (мг/мл) в потоках пермеата и ретентата в течение микрофильтрации. Взятие образцов всегда осуществляли, когда накапливалось 4 л пермеата и в конечной точке.
На фиг. 3 показаны скорости потока в течение ультрафильтрации через фильтры типа V 10 кДа. А обозначает 22-литровую партию, а В - 23-литровую партию.
На фиг. 4 показан анализ с помощью δΌδ-ΡΑΟΕ электрофореза (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, ДСН-ПААГ) конечного пермеата в результате фильтрации через кассетный фильтр типа V 10 кДа (дорожка 2). Электрофорез проводили, используя восстанавливающие условия и постоянное напряжение 200 В, в течение 50 мин. Размеры белков-стандартов молекулярной массы (дорожка 1), начиная сверху, составляют 250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 20, 15 и 10 кДа.
На фиг. 5 показано определение критического потока для микрофильтрации. Поток (сверху) и ТМР (1гапктетЬгапе ргеккиге, трансмембранное давление) (снизу) при начальных скоростях поперечного потока 1,15 л/мин (А) и 1,66 л/мин (В).
На фиг. 6 показано определение критического потока для микрофильтрации через 1000 кДа кассетный фильтр. Поток (сверху) и ТМР (снизу) при начальных скоростях поперечного потока 2,15 л/мин (А) и 2,75 л/мин (В).
На фиг. 7 показаны кривые оптимизации потока в зависимости от ТМР в случае νΕΡ (уо1ите1пс сопсейгайоп ГасЮг, коэффициент объемной концентрации) 1 для ультрафильтрации через кассетный фильтр типа V 10 кДа. Используемые начальные скорости поперечного потока составляли 1,15 л/мин (А), 1,66 л/мин (В), 2,15 л/мин (С) и 2,75 л/мин (Ό).
Фиг. 8 показана оптимизация потока в зависимости от ТМР в случае νΕΡ 10 для ультрафильтрации через кассетный фильтр типа V 10 кДа. Используемые начальные скорости поперечного потока составляли 1,66 л/мин (А) и 2,75 л/мин (В).
На фиг. 9 приведено краткое описание модели, подобранной с использованием метода частных наименьших квадратов (ΡΌδ) в программе ΜΟΌΌΕ. Два результата в модели представляли собой время и концентрацию белка (выход).
На фиг. 10 показано воздействие изучаемых параметров на продолжительности ультрафильтрации, рассчитанное с использованием программы ΜΟΌΌΕ. Сокращение рит относится к скорости подачи, геС к блокированию потока ретентата, Тетр к температуре фильтрации, Мет(А) к мембране А (полиэфирсульфоновый фильтр Вютах типа С) и Мет(В) к мембране В (фильтр из регенерированной целлюлозы иНгасе1 типа С).
На фиг. 11 показаны профили белка четырех пермеатов ультрафильтрации, построенные с использованием программы ΜΟΌΌΕ. Анализ с помощью электрофореза в δΌδ-ΡΑΟΕ проводили, используя невосстанавливающие условия и постоянное напряжение 200 В, в течение 50 мин. Дорожка 1: Стандарт молекулярной массы, дорожка 2: пермеат из пробега 1 (мембрана В), дорожка 3: пермеат из пробега 4 (мембрана В), дорожка 4: пермеат из пробега 7 (мембрана А) и дорожка 5: пермеат из пробега 10 (мембрана А). Размеры белков-стандартов молекулярной массы (дорожка 1), начиная сверху, составляют 250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 20, 15 и 10 кДа.
- 3 024470
На фиг. 12 показаны кривые для оптимизации потока в зависимости от ТМР для кассеты ультрафильтрации Вютах типа С. УСР составлял 1, и начальные скорости поперечного потока составляли 0,945 л/мин (А), 1,125 л/мин (В) и 1,350 л/мин (С).
На фиг. 13 показаны кривые для оптимизации потока в зависимости от ТМР для кассеты ультрафильтрации Вютах типа С. УСР составлял 5, и начальные скорости поперечного потока составляли 0,945 л/мин (А) и 1,350 л/мин (В).
На фиг. 14 показаны кривые для оптимизации потока в зависимости от ТМР для кассеты ультрафильтрации и11гаее1 типа С. УСР составлял 1, и начальные скорости поперечного потока составляли 0,730 л/мин (А), 0,945 л/мин (В) и 1,125 л/мин (С).
На фиг. 15 показаны кривые для оптимизации потока в зависимости от ТМР для кассеты ультрафильтрации И11гасе1 типа С. УСР составлял 5, и начальные скорости поперечного потока составляли 0,945 л/мин (А) апй 1,125 л/мин (В).
На фиг. 16 показано восстановление ΝνΡ (погтаП/ей \\а1ег регтеаЬййу, нормализованной водопроницаемости) фильтров Вютах и ийгасе1 типа С после цикла промывки 0,1 М ΝαΟΗ при 37°С в течение 30 мин. Предшествующие фильтрации проводили, используя объем подачи 3 л при УСР 10.
На фиг. 17 показана диаграмма иллюстративной установки в маломасштабном процессе получения.
На фиг. 18 показана блок-схема иллюстративного способа получения экстракта костного белка.
На фиг. 19 показан электрофорез в δΌδ-ΡΑΟΕ нативного экстракта, деминерализованного муравьиной кислотой. Полосы белка выделяли из δΌδ-ΡΑΟΕ и анализировали с помощью Μδ-ΜΑΕΌΙ-ТОР (времяпролётной масс-спектрометрии с лазерной ионизацией и десорбцией из матрицы).
На фиг. 20 показан электрофорез в δΌδ-ΡΑΟΕ нативного экстракта, деминерализованного НС1. Полосы белка выделяли из δΌδ-ΡΑΟΕ и анализировали с помощью Μδ-ΜΑΕΌΙ-ТОР.
На фиг. 21 показаны объемы кости, измеренные из изображений микроКТ (компьютерной томографии). При статистических сравнениях все остальные группы были значимо лучше, чем группа деминерализованного костного матрикса (Огайои Ρ1ιΐ5® ΌΒΜ) (ар<0,02). Во всех группах имплантата экстракта костного белка, в группе аутотрансплантата, а также в других контрольных группах, за исключением группы ΌΒΜ, заживление было значимо лучше, чем в необработанных дефектах (Ьр<0,02). Группа аутотрансплантата была значимо лучше по объему кости, чем группа пасты 4 (ср<0,02). Контрольные группы отмечены как прик-паттерн.
На фиг. 22 представлено гистологическое исследование, которое показывает, что биологическая активность и образование новой кости для дозы 3 мг экстракта костного белка северного оленя в желатиновой капсуле в мышиной модели кармана. В = кость. (Исходное увеличение 10х).
На фиг. 23 представлено гистологическое исследование, которое показывает образование новой кости и ответ имплантата в мышиной модели кармана с использованием различных носителей с экстрактом костного белка северного оленя: (а) ГАП/ТКФ/КС 30:60:10 активное вещество, (Ь) ГАП/ТКФ/КС 30:60:10 контроль без экстракта костного белка, (с) КС полугидрат активное вещество, (й) КС полугидрат контроль, (е) КС дигидрат + стеариновая кислота активное вещество и (ί) КС дигидрат + стеариновая кислота контроль. С = кальцинированные хрящевые клетки, В = кость, М = мышца, Р = фиброзная ткань и Ι = носитель имплантата. (Исходное увеличение 10х).
На фиг. 24 показана радиографическая оценка образования новой кости в мышиной модели кармана с использованием различных носителей с экстрактом костного белка северного оленя. Контроль без экстракта костного белка был расположен на правой стороне, а активный имплантат был расположен на левой стороне: (а) ГАП/ТКФ/КС 30:60:10, (Ь) КС полугидрат и (с) КС дигидрат + стеариновая кислота.
На фиг. 25 показаны примеры микроКТ групп КС активное вещество (Р2.1) и КС контроль (Р2.2) после 3 недель наблюдения. Пеллеты резорбированы и видно некоторое костеобразование.
На фиг. 26 показаны примеры микроКТ групп КС активное вещество (Р7.1) и контроль (Ρ3υ.3) после 8 недель наблюдения. На активной стороне видно большее костеобразование по сравнению с контрольной стороной.
На фиг. 27 показаны примеры микроКТ групп β-ТКФНП активное вещество (Р2.3) и контроль (Р2.4) после 3 недель наблюдения. Видно некоторое костеобразование вокруг гранул. Резорбция гранул еще медленная.
На фиг. 28 показаны примеры микроКТ групп β-ТКФНП активное вещество (Р7.3) и контроль (Р7.4) после 8 недель наблюдения. Большинство гранул ТКФ резорбировано на активной стороне и замещено новой костью. Н£ контрольной стороне гранулы резорбируются медленнее, и костеобразование можно обнаружить только вокруг гранул. В активной группе костеобразование явно больше, чем в контрольной группе.
На фиг. 29 показан пример микроКТ группы β-ТКФВП активное вещество после 3 недель наблюдения. Гранулы еще не резорбированы, и костеобразование можно обнаружить вокруг гранул. Контрольный пример отсутствует.
На фиг. 30 показаны примеры микроКТ групп β-ТКФВП активное вещество (Р9.1) и контроль (Р10.3) после 8 недель наблюдения. Костеобразование более эффективно, и резорбция гранул быстрее на
- 4 024470 активной стороне по сравнению с контрольной стороной.
На фиг. 31 показан пример микроКТ группы пустого дефекта после 3 недель наблюдения. Дефектный сайт пустой, и костеобразования не видно.
На фиг. 32 показаны примеры микроКТ групп пустого дефекта после 8 недель наблюдения. Нормальное, очень малое костеобразование видно по краям дефекта, но дефект не заживлен.
На фиг. 33 показан гистологический срез КС активное вещество, 3 недели наблюдения (окрашивание МС, исходное увеличение 6,3 х, ВР = область образования новой кости). Видно небольшое костеобразование.
На фиг. 34 показаны гистологические срезы КС активное вещество, 8 недель наблюдения (окрашивание МС, исходное увеличение 6,3х, ВР = образование новой кости). В дефектном сайте видно образование большого количества кости.
На фиг. 35 показан гистологический срез КС контроль, 3 недели наблюдения (окрашивание МС, исходное увеличение 6,3х, РК = остатки пеллетов (Кешиайъ о£ ре11е(8)). Остатки пеллетов видны в дефектном сайте, но нет признаков образования новой кости.
На фиг. 36 показаны гистологические срезы КС контроль, 8 недель наблюдения (окрашивание МС, исходное увеличение 6,3х, ВР = образование новой кости). В дефектном сайте видно некоторое образование новой кости. Сечения срезов не являются параллельными по оси дефекту.
На фиг. 37 показан гистологический срез β-ТКФНП активное вещество, 3 недели наблюдения (окрашивание МС, исходное увеличение 6,3х, ВР = образование новой кости, Сг = гранула ТКФ). Видно начало резорбции гранул, и образование новой кости видно вокруг гранул.
На фиг. 38 показаны гистологические срезы β-ТКФНП активное вещество, 8 недель наблюдения (окрашивание МС, исходное увеличение 6,3х, ВР = образование новой кости, Сг = гранула ТКФ). Дефект хорошо заполнен новой костью, и видна заметная резорбция гранул.
На фиг. 39 показан гистологический срез β-ТКФНП контроль, 3 недели наблюдения (окрашивание МС, исходное увеличение 6,3х, ВР = образование новой кости, Сг = гранула ТКФ). Имеется лишь небольшой признак резорбции гранул и небольшое образование новой кости вокруг гранул.
На фиг. 40 показаны гистологические срезы β-ТКФНП контроль, 8 недель наблюдения (окрашивание МС, исходное увеличение 6,3х, ВР = образование новой кости, Сг = гранула ТКФ). Видны гранулы и образование новой кости вокруг гранул. Но количество образовавшейся кости значительно ниже, и резорбция гранул значительно медленнее по сравнению с активной группой β-ТКФНП (фиг. 38).
На фиг. 41 показан гистологический срез β-ТКФВП активное вещество, 3 недели наблюдения (окрашивание МС, исходное увеличение 6,3х, ВР = образование новой кости, Сг = гранула ТКФ). Видно начало резорбции гранул и образование новой кости вокруг гранул.
На фиг. 42 показаны гистологические срезы β-ТКФВП активное вещество, 8 недель наблюдения (окрашивание МС, исходное увеличение 6,3х, ВР = образование новой кости, Сг = гранула ТКФ). Видны небольшие остатки гранул и отличное образование новой кости. Дефект полностью заполнен новой костью, и резорбция гранул очень высокая.
На фиг. 43 показан гистологический срез β-ТКФВП контроль, 3 недели наблюдения (окрашивание МС, исходное увеличение 6,3х, ВР = образование новой кости, Сг = гранула ТКФ). Резорбция гранул идет медленно, и видно небольшое образование новой кости вокруг гранул.
На фиг. 44 показаны гистологические срезы β-ТКФВП контроль, 8 недель наблюдения (окрашивание МС, исходное увеличение 6,3х, ВР = образование новой кости, Сг = гранула ТКФ). Видны гранулы и образование новой кости вокруг гранул. Костеобразование значительно меньше, и резорбция гранул медленнее, чем в активной группе (фиг. 42).
На фиг. 45 показан гистологический срез пустого дефекта, 3 недели наблюдения (окрашивание МС, исходное увеличение 6,3 х). Пустой дефект пуст.
На фиг. 46 показан гистологический срез пустого дефекта, 3 недели наблюдения (окрашивание МС, исходное увеличение 6,3 х). Пустой дефект пуст (некоторое образование нормальной кости видно по краям дефекта).
На фиг. 47 показана резорбция гранул ТКФНП контроль (слева) и активное вещество (справа) (окрашивание МС, исходное увеличение 10х, Сг = гранула ТКФ).
На фиг. 48 показана резорбция гранул ТКФВП контроль (слева) и активное вещество (справа) (окрашивание МС, исходное увеличение 10х, Сг = гранула ТКФ).
- 5 024470
Описание изобретения
Аспекты настоящего изобретения относятся к способам получения препарата костного белка, которые осуществляют на практике путем:
a) деминерализации кости и экстракции костного матрикса гуанидингидрохлоридом с получением экстракта костного белка;
b) фильтрования экстракта с помощью микрофильтра с отсекаемым размером частиц, достаточным для удаления крупных частиц и небелкового вещества, но обеспечивающим прохождение белков;
c) фильтрования фильтрата с помощью кассетного ультрафильтра, имеющего отсекаемый размер частиц примерно от 5 до 10 кДа, с получением препарата костного белка.
В одной форме осуществления обработку раствором гуанидингидрохлорида на стадии а) можно заменить обработкой раствором мочевины, которая является известным эквивалентом. Как правило, можно использовать раствор 4 М гуанидингидрохлорида.
Термин микрофильтр на стадии Ь) относится к любому подходящему фильтру, который является достаточным для удаления крупных частиц и небелкового материала, но обеспечивает прохождение белков. Эта стадия может быть также названа осветлением или предварительным фильтрованием, которую проводят с целью удаления, например, суспендированных частиц, коллоидов, макромолекул, клеток и клеточного дебриса из раствора. Молекулы, представляющие интерес, пройдут через микрофильтр. Примеры таких фильтров или способов фильтрования включают фильтрование с нормальным потоком (ΝΡΡ, Ыогта1 Γ1ο\ν ййгайои, Мййроге) и фильтрование с тангенциальным потоком (ТРР, Таидеийа1 Πο\ν ΠΙίΓαΙίοη). Указанный отсекаемый размер частиц на стадии Ь) может находиться в диапазоне от 0,1 до 10 мкм (номинальное значение в микронах), например приблизительно от 0,22 до 0,1 мкм или приблизительно 1000 кДа.
На стадии ультрафильтрации с) может быть применим даже диапазон отсекаемого размера частиц 1-500 кДа. Ультрафильтр может представлять собой фильтр из регенерированной целлюлозы или полиэфирсульфоновый фильтр.
В одной форме осуществления настоящего изобретения препарат костного белка подвергают диализу, например, водой, чтобы сконцентрировать и дополнительно очистить его.
В другой форме осуществления препарат костного белка дополнительно подвергают диализу раствором цитрата, чтобы способствовать правильной укладке белков.
Еще в одной другой форме осуществления кость представляет собой кость млекопитающего. Еще в одной другой форме осуществления кость представляет собой кость северного оленя. Еще в одной другой форме осуществления кость представляет собой кость оленьего рога. Еще в одной другой форме осуществления кость представляет собой длинную (трубчатую) кость.
Аспекты изобретения также включают препарат костного белка, содержащий, например, один или более чем один белок, находящийся в нативном экстракте, деминерализованном НС1, препарат которого описан в данной работе, включая бигликан, тромбин, ламин А/С, виментин, остеонектин, лизилоксидазу, 8РР-24 (секретируемый фосфопротеин), дерматопонтин, хондроадгерин и/или матриксный С1а-белок. По меньшей мере, перечисленные ниже белки рассматривают как стимулирующие, индуцирующие или ускоряющие остеоиндукцию: матриксный С1а-белок, 8РР-24 (секретируемый фосфопротеин), ВМР-2, ВМР-7 и/или ТСР-β 1. Соответственно, композиция костного белка может также содержать по меньшей мере одно из перечисленного: бигликан, тромбин, ламин А/С, виментин, хондроадгерин, белок внеклеточного матрикса 22К, лизилоксидазу, остеонектин, коллаген или дерматопонтин, в существенных количествах.
В некоторых формах осуществления композиция костного белка содержит, по меньшей мере, матриксный С1а-белок, бигликан, 8РР-24, хондроадгерин, белок внеклеточного матрикса 22К лизилоксидазу, остеонектин, коллаген, ВМР-2, ВМР-7 и/или ТСР-β 1. Также может быть включен один или более чем один из других белков, упомянутых в данной работе. Препарат костного белка содержит указанные белки в существенных количествах, например, в количестве, достаточном, чтобы обеспечить физиологический эффект, такой как остеоиндуктивный эффект, или активность. Другие белки могут также присутствовать в следовых количествах, таких как количество, слишком низкое, чтобы видеть на окрашенном δΌδ-РАСЕ или секвенировать, и такие белки не являются существенными или необходимыми для остеоиндуктивной или ускоряющей активности белкового препарата или композиции, содержащей этот белковый препарат. Например, в табл. 14 белки в нативном экстракте, деминерализованном НС1, приведено руководство, как получать костный препарат по настоящему изобретению. Эти препараты могут быть получены вышеописанным способом, но можно также использовать любой другой подходящий способ.
В следующих формах осуществления препарат костного белка включают в матрицу, либо пропитывают им матрицу, такую как пористая матрица. Матрица, носитель или каркас, где эти слова можно использовать взаимозаменяемо, усиливает активность и терапевтический потенциал экстракта костного белка в сайте применения (например, матрица, носитель или каркас при добавлении к экстракту костного белка дает возможность постепенного высвобождения активных белков и снижает миграцию этих факторов).
- 6 024470
Желательно матрица-носитель удовлетворяет нескольким критериям. Предпочтительно эта матрица является биосовместимой, биорассасывающейся, пластичной и стерилизуемой. Желательные материалы являются структурно прочными, иммунологически инертными, в высокой степени остеокондуктивными и вариабельно биоразлагаемыми. Примеры известных органических и неорганических матриц описаны Ктгкег-Неаб, С.А.: ΡοΙοηΐίαΙ аррйсаНоик апб беПуегу 51га1с§1С5 Гог Ьоие тогрйодешс ргоЮиъ. Абуаисеб Эгид ОеПуегу Кеу1еш8 43 (2000), 65-92, и Мооге е! а1., 8уп1ЬеИс Ьоие дгай киЬкШШек, ΑΝΖ I. §игд. (2001), 71, 354-361, где все статьи полностью точно включены в данную работу посредством ссылки.
В другой форме осуществления препарат костного белка, полученный, как описано в данной работе, включен в гранулы. Еще в одной другой форме осуществления эти гранулы представляют собой гранулы β-трикальцийфосфата (ТКФ), либо эти гранулы содержат β-трикальцийфосфат. Еще в одной другой форме осуществления эти гранулы представляют собой гранулы кальция сульфата, либо эти гранулы содержат кальция сульфат. Еще в одной другой форме осуществления эти гранулы представляют собой гранулы гидроксиапатита, либо эти гранулы содержат гидроксиапатит. В другой форме осуществления препарат костного белка, полученный, как описано в данной работе, включен (встроен) в матрицу. Еще в одной другой форме осуществления препарат костного белка включен (встроен) в гранулы в матрице. В одной форме осуществления матрица представляет собой полиэтиленгликоль/глицериновую матрицу (ΡΕΟ-ОЬУ). В следующей форме осуществления данный препарат содержит стеариновую кислоту. Все эти формы осуществления могут быть применены в любой из областей применения, в любых способах или применениях, описанных в данной работе.
Еще в одной другой форме осуществления препарат костного белка, полученный, как описано в данной работе, находится в форме лиофилизата.
Некоторые формы осуществления также включают пасту, такую как инъекционная паста или гель, содержащую один или более чем один из препаратов костного белка, описанных в данной работе. Паста может быть также формуемой, где ее форма может также быть названа мастикой. Соответственно, некоторые формы осуществления включают мастику, содержащую один или более чем один из препаратов костного белка, полученных способом, описанным в данной работе. Также некоторые формы осуществления включают пеллету (пилюлю), диск, блок или гранулу, содержащую один или более чем один из препаратов костного белка, полученных способом, описанным в данной работе. В другой форме осуществления препарат костного белка представлен в виде покрытия на пеллете, диске, блоке или грануле.
Несколько форм осуществления также включает остеогенное устройство, такой как костный имплантат, содержащий один или более чем один из препаратов костного белка, описанных в данной работе, например, матрица, такая как пористая матрица, пропитанная или покрытая одним или более чем одним из препаратов костного белка, полученных способом, описанным в данной работе.
В некоторых формах осуществления препарат костного белка, полученный, как описано в данной работе, применяют в качестве лекарственного средства, например, для лечения расстройств, относящихся к дефектам кости, хряща, сухожилия или зуба, где желательна их регенерация, репарация или рост, либо других заболеваний.
Также рассмотрена фармацевтическая композиция, содержащая данные препараты костного белка. Предпочтительно данные фармацевтические композиции содержат терапевтически эффективное количество одного или более чем одного из препаратов костного белка, полученных, как описано в данной работе, и фармацевтически приемлемый растворитель, носитель и/или наполнитель. Данную фармацевтическую композицию можно применять для лечения расстройств, относящихся к дефектам кости, хряща, сухожилия или зуба, где желательна их регенерация, репарация или рост, либо других заболеваний, таких как рак.
В аспектах настоящего изобретения также предложен способ стимулирования (индукции) образования кости, хряща, сухожилия, зуба или тому подобного, ίη уйго или ίη у1уо, где кость, хрящ, сухожилие, зуб или т.п. обрабатывают одним или более чем одним из препаратов костного белка, описанным в данной работе, либо остеогенным устройством, либо другой формой применения, содержащейся в нем.
Дополнительные формы осуществления включают способы лечения расстройств, относящихся к дефектам кости, хряща, сухожилия или зуба, где желательна их регенерация, репарация или рост, либо других заболеваний, таких как рак, путем введения данного изолированного препарата костного белка пациенту, страдающему этими расстройствами.
Термин расстройства, относящиеся к дефектам кости, хряща, сухожилия или зуба, как он использован в данной работе, относится в целом к любому известному расстройству, где желательно заживление или реконструкция, например, регенерация, кости, хряща, сухожилия или периодонта. Не ограничивающими примерами методов лечения расстройств, относящихся к кости, хрящу, сухожилию, или периодонтальных дефектов или заболеваний или тому подобного является регенерация, репарация (восстановление) и рост кости и периодонтальной ткани; регенерация, репарация и рост кости у млекопитающих, таких как человек или любое другое животное; лечение аномалий формирования или регенерации кости; заживление раны, эктопическая индукция кости и заживление сегментарных дефектов кости у позвоночных; лечение скелетных расстройств и деформаций; репарация крупных дефектов кости в результате травмы, удаления опухолей или врожденных пороков, восстановление изношенного костного
- 7 024470 вещества с помощью имплантируемого эндопротеза при ревизионных операциях и сращивание медленно срастающихся или не срастающихся переломов; репарация дефектов кости и хряща, таких как дефекты критического размера, дефекты некритического размера, несрастающиеся переломы, сегментарные несрастающиеся переломы; острые переломы, хондральные дефекты, остеохондральные дефекты, субхондральные дефекты; локальное образование кости и хряща; дефекты в результате дегенеративных заболеваний; стоматологические применения, такие как репарация периодонтальных тканей, альвеолярной кости, цементного вещества, околозубной ткани корня зуба, заполнение корневого канала зуба и улучшение или усиление фиксации зубного имплантата. Примеры таких расстройств можно найти в Апп Кйеит Όίδ, Уо1. 62, 2003, 73-78: Кеббу АН: СагШаде тогркодепейс рго1еш8: го1е ίη _)от1 беуе1ортеШ. Ьотоео81а818 апб гедепегайоп, где весь документ полностью явным образом включен в данную работу посредством ссылки.
В одной форме осуществления предложено остеогенное устройство, такое как имплантат, содержащее препарат костного белка. Остеогенное устройство может содержать биосовместимую матрицу, такую как кальция фосфат, карбоксиметилцеллюлоза или коллагеновая матрица, или их комбинации. В одной форме осуществления кальцийфосфатная матрица представляет собой гидроксиапатитную матрицу. Данная матрица может обеспечить медленное высвобождение препарата костного белка и/или подходящую окружающую среду для подачи препарата костного белка. Остеогенное устройство может также содержать металлический имплантат, окруженный биосовместимой матрицей. Одним из примеров такого металла является титан. Некоторые примеры такого остеогенного устройства раскрыты в работе ДОО 98/51354, которая полностью явным образом включена в данную работу посредством ссылки.
Неограничивающими примерами различных каркасных материалов, носителей или каркасов для формования, например, различных видов остеогенных устройств или тому подобного с белком по настоящему изобретению являются среды в форме порошка, губки, полоски, пленки, геля, сетки, либо раствора или суспензии; полутвердый жидкий носитель, пригодный для внутримышечной, внутривенной, интрамедуллярной или внутрисуставной инъекции; изолированные мезенхимные стволовые клетки; любой фармацевтически приемлемый растворитель; покрытый ауто- или аллотрансплантат; любая фармацевтически приемлемая матрица; материал, выбранный из группы, включающей гидроксиапатит, коллаген, полимеры (например, полимер молочной кислоты, полимер гликолевой кислоты), синтетические полимеры, гиалуроновая кислота, α-ΒδΜ, кальция фосфат, трикальцийфосфат, непористые керамические биополимеры, непористые резорбируемые биополимеры, коралл, деминерализованная кость, биокерамика, любой биоразлагаемый материал и их комбинации; связующие агенты, выбранные из группы, включающей маннит, декстраны, белый петролатум, алкил- и метилцеллюлозы, увлажняющие агенты, такие как натриевая соль, фибриновый клей, фибриноген и тромбин млекопитающих и их комбинации и смеси. Остеогенное устройство может представлять собой, например, структурно стабильный, трехмерный имплантат в форме куба, цилиндра или блока или в форме анатомической формы или инъекционной формы. Примеры остеогенных устройств, полезных материалов и методов раскрыты в книге 8ке1е1а1 гесоп81гис1юп апб Ыо1тр1ап1а1юп (Т. 8ат Ьшбко1т, 1997, §ргтдег-Уег1ад, Не1бе1Ьегд, Оегтапу), которая полностью явным образом включена в данную работу посредством ссылки.
В дополнительной форме осуществления предложен способ стимулирования (индукции) образования кости, хряща, сухожилия, зуба или тому подобного, где кость, хрящ, сухожилие, зуб или т.п. обрабатывают препаратом костного белка, ш уйго или ш νί\Ό. Еще в одной другой форме осуществления предложен способ лечения расстройств, описанных в данном описании, включающий введение препарата костного белка пациенту, страдающему этими расстройствами. Данный препарат костного белка можно вводить в виде фармацевтической композиции или остеогенного устройства, описанного выше. Дополнительные морфогенетические белки или другие полезные агенты можно вводить вместе с данным препаратом костного белка, как описано выше, для усиления терапевтического эффекта.
Примеры
Оптимизация и масштабирование фильтрования экстракта костного белка с тангенциальным потоком.
Нижеописанное исследование основано на кандидатской диссертации ОрОпп/аОоп апб 8са1е-ир оГ 1апдепйа1 Г1о\у йИгайоп оГ Ьопе рго!ет ех!гас1, Уй1апеп, Μ. ИтуегеНу оГ Ои1и, 2010, которая полностью точно включена в данную работу посредством ссылки.
Цель данного исследования состояла в изучении микро и ультрафильтрации с тангенциальным потоком экстракта костного белка животных. Эти способы были оптимизированы и основаны на результатах, масштабированных до промышленного масштаба.
В биофармацевтических применениях раствор, содержащий желаемые компоненты, часто подвергают фракционированию и концентрированию. Обычно эти стадии осуществляют с использованием фильтрования. Фильтрование с тангенциальным потоком является отличным выбором для фильтрования больших объемов, поскольку фильтр не закупоривается настолько легко, как при традиционном тупиковом фильтровании. Это связано с тем, что поток подачи параллелен мембране, и, следовательно, уносит частицы.
Во время данного исследования параметры процесса микро- и ультрафильтрации экстракта костного белка были оптимизированы, чтобы достичь насколько возможно эффективного процесса. Для целей
- 8 024470 ультрафильтрации также сравнивали две различные мембраны и два типа канала подачи. Для разработки экспериментов и оптимизации использовали программное обеспечение, чтобы изучить действие переменных процесса.
Результаты показывают, что экстракт костного белка животных можно эффективно обрабатывать, используя фильтрование с тангенциальным потоком. Выход белка был хорошим, как при микро-, так и при ультрафильтрации. Ни один из протестированных материалов мембраны не обладал значительной закупоркой. Однако были различия в максимальных потоках фильтрации. Эти процессы можно даже дополнительно оптимизировать. На основании полученных результатов были проведены вычисления для масштабирования процесса фильтрования до промышленного масштаба. Эти вычисления показывают, что процесс можно осуществлять в желаемый период времени и при разумных затратах.
1. Введение.
Фильтрование с тангенциальным потоком широко применяют в биофармацевтической и во многих других отраслях промышленности, например, для концентрирования или фракционирования белков путем ультрафильтрации, либо для удаления микроорганизмов и клеток путем микрофильтрации. В данном исследовании оценивали микрофильтрацию и ультрафильтрацию экстракта костного белка. Фильтрование с тангенциальным потоком при использовании кассетных фильтров может быть идеальным методом для крупномасштабной обработки экстракта, полученного из данного типа ткани.
Исследование начали с изучения технической осуществимости обеих стадий, микрофильтрации и ультрафильтрации. Сравнивали различные кассетные фильтры для ультрафильтрации. Для планирования эксперимента использовали программу системного проектирования и моделирования (ΜΟΌΌΕ). Детализированную оптимизацию параметров процесса проводили для всех тестируемых фильтров. Наконец, были проведены вычисления для масштабирования процесса на основании полученных результатов.
По результатам экспериментов по оптимизации доступны немногие опубликованные данные, которые непосредственно соответствуют данному исследованию. Большинство из них охватывают ультрафильтрацию молочной сыворотки. Обычно данный вид информации создается фирмами, имеющими фильтрацию в качестве стадии процесса. Следовательно, ее необязательно публикуют. Кроме того, каждый способ биологической фильтрации уникален, при этом решение, присущее конкретному случаю, включает выбор материала мембраны и других характеристик. Поведение системы трудно предсказать, и всегда необходима оптимизация для каждого конкретного случая.
2. Фильтрование с тангенциальным потоком.
2.1. Общее описание фильтрования с тангенциальным потоком.
Фильтрование можно в целом разделить на две различные операционные категории. Они представляют собой фильтрование с нормальным потоком (Яогта1 Лоте ййтайоп, ΝΡΡ) и фильтрование с тангенциальным потоком (Тапдепйа1 йоте йИтайои, ТРР). При ΝΡΡ раствор течет посредством давления или даже самотеком в перпендикулярном направлении к мембране или объемному фильтру. Частицы крупнее определенного размера будут задерживаться на поверхности мембраны или внутри сетчатой структуры объемного фильтра. Однако накопление частиц будет, в конечном счете, закупоривать фильтр. ΝΡΡ обычно используют для стерильного фильтрования и предварительного фильтрования перед микро- или ультрафильтрацией.
В противоположность ΝΡΡ, ТРР использует подающий поток, который параллелен мембране. Это создает уносящий эффект, который предотвращает закупоривание мембраны частицами. Поток пермеата, который означает поток, проходящий через мембрану, создается за счет давления. Молекулы меньшего размера, чем поры мембраны, пройдут с пермеатом, а более крупные сконцентрируются в потоке ретентата. Как правило, ТРР используют для концентрирования растворов и/или разделения молекул или частиц на основе различия их размера. Разделение молекул посредством мембраны обычно следует распределению Гаусса вокруг среднего размера пор (отсекаемая величина). Кроме теоретического размера молекул, форма и заряд также оказывают влияние на их прохождение через поры (МПйроге Сотротайоп 1992). Нижеследующий раздел относится к различным типам процессов ТРР, фильтровальным устройствам, мембранам и факторам, влияющим на них, где особое внимание уделено ультрафильтрации.
2.2. Определение процессов мембранного разделения.
Процессы разделения можно классифицировать в соответствии с диапазоном размеров разделяемых частиц. Общепринято используемые определения включают микрофильтрацию (МФ), ультрафильтрацию (УФ), нанофильтрацию (НФ) и обратный осмос (ОО), который также назван гиперфильтрацией в более старой литературе. Фильтрование частиц часто используют в качестве стадии предварительного фильтрования перед микро- или ультрафильтрацией с целью удаления крупных твердых частиц и коллоидных веществ, которые могут вызвать закупоривание каналов подачи последующих фильтров. Границы между классами не являются точными.
2.2.1. Микрофильтрация.
Отсекающий размер пор мембраны (номинальное значение в микронах), используемый в большинстве применений микрофильтрации, находится в диапазоне от 0,1 до 10 мкм. Микрофильтрацию используют для отделения суспендированных частиц, коллоидов и макромолекул от растворов. Микрофильтрацию широко используют, например, в химической и минеральной промышленности и в применениях
- 9 024470 очистки воды. В биотехнологической промышленности ее часто используют для отделения клеток и клеточного дебриса от среды после периода ферментации. Продукты могут представлять собой рекомбинантные белки, метаболиты организма или сами клетки, как при культивировании пекарских дрожжей. МФ можно также использовать как способ стерильного фильтрования растворов. В этом случае обычно используют отсекающий размер пор менее 0,45 мкм либо может быть выбран отсекаемый размер 0,2 мкм, если желательно полное удерживание.
2.2.2. Ультрафильтрация.
Ультрафильтрация является отличным выбором для концентрирования и фракционирования белков. Данный способ является менее агрессивным для белков по сравнению с выпариванием и более экономичным по сравнению с гельпроникающей хроматографией. При УФ диапазон разделения составляет от 1 до 500 кДа. Многие изготовители мембран предлагают УФ кассеты с отсекающим размером 1000 кДа, эквивалентным примерно 0,1 мкм. Диапазон давления при УФ обычно составляет примерно 1,5-6,5 бар.
УФ широко применяют в биофармацевтической промышленности при выделении и очистке моноклональных антител и рекомбинантных белков. Молочная промышленность была одной из первых, где этот метод широко адаптирован. Характерные применения метод находит в сыроделии и при фракционировании сырной сыворотки.
3. Цели работы.
Цели данной работы состояли в изучении пригодности мембранных кассетных фильтров для микро- и ультрафильтрации экстракта костного белка и в оптимизации этих процессов в малом масштабе. Выбор типа мембраны был одной из главных целей. Работа была в большей степени сфокусирована на ультрафильтрации, поскольку она является более критической и сложной с точки зрения оптимизации. Микрофильтрация служила, в основном, в качестве стадии очистки для удаления частиц и макромолекул большего размера, чем типичные белки. Хотя в данной работе она отнесена к категории микрофильтрации, эту стадию выполняли, используя фильтр, имеющий тип мембраны, подобный фильтрам, используемым для ультрафильтрации. Однако этот фильтр имел настолько большой размер пор, что оптимизация проведена, как для микрофильтров.
Сначала были проведены предварительные эксперименты по микро- и ультрафильтрации с использованием одного типа фильтра. На основании результатов и приобретенного опыта для дальнейших исследований были выбраны два новых и несколько различающихся ультрафильтра. Программу планирования эксперимента (МОЭНЕ) использовали для изучения различных параметров, влияющих на процесс ультрафильтрации. Кроме типа фильтра, изучаемыми параметрами были температура, давление и скорость подачи с объемной дозировкой. Фильтры подвергали различным протоколам оптимизации, чтобы найти лучшие установки и, следовательно, сделать крупномасштабный процесс по возможности более экономичным.
Процесс микрофильтрации был также оптимизирован по отношению к критическому потоку. На протяжении всего исследования отдельное слово поток означает поток фильтрата.
Регенерацию мембран после стадии очистки, следующей за фильтрованием, изучали физическими и химическими методами. На основании результатов оценивали методы очистки. Наконец, были проведены вычисления для масштабирования процесса с использованием данных, полученных в маломасштабных экспериментах.
4. Оборудование.
Эксперименты по фильтрации проводили при Университете Оулу, лаборатория биотехнологии консорциума университета Каяани в Соткамо.
4.1. Оборудование для фильтрации.
4.1.1. Лабораторное устройство МИйроте ВеисЬ8са1е.
В данном исследовании лабораторное устройство МДНроге Веисй§са1е (МИНроте Согр., υδΑ) использовали исключительно в целях предварительного фильтрования и для измерений целостности фильтра. Устройство имело 2-литровый контейнер подачи, который считали слишком маленьким для планируемых объемов опытных партий фильтрования. Капсульный фильтр для предварительного фильтрования был присоединен к шлангу насоса.
4.1.2. Устройство МДНроге Рто8са1е.
Эксперименты по фильтрованию проводили, используя устройство МДНроге Рто8са1е. Оно имеет 10-литровый стеклянный контейнер подачи. Если нужны большие объемы, раствор выкачивали из дополнительного контейнера. В данном случае поток ретентата направляли в этот контейнер, чтобы гарантировать правильное смешивание раствора. Нагревание и охлаждение устройства Рто8са1е было достигнуто с помощью циркуляции горячей или холодной водопроводной воды в теплообменнике.
4.2. Мембраны.
Все мембраны, используемые в данном исследовании, были получены от фирмы Мййроте Согр., υδΆ. В соответствии с рекомендацией изготовителя раствор предварительно фильтровали через фильтр по меньшей мере 100 мкм перед фильтрованием МФ и/или УФ. Всегда использовали капсульный фильтр ОрОсар™ ХЬ со средой Ро1удатб® СК (МПНроте Согр., υδΑ) с отсекающим размером 50 мкм.
- 10 024470
Каждый капсульный фильтр использовали максимум два раза. Между фильтрованиями капсулы автоклавировали при 121°С в течение 20 мин.
4.2.7. Мембрана для микрофильтрации.
Для микрофильтраций раствор белка фильтровали через кассету РеШеои® 2 Рюшах®, имеющую отсекаемое значение молекулярной массы (М\УС.'О) 1000 кДа. Площадь фильтрования составляла 0,1 м2, и фильтр представлял собой фильтр У-сетчатого типа. Материалом мембраны был полиэфирсульфон. Фирма Мййроте классифицирует каналы подачи мембраны как У, С и А. Тип У имеет максимально открытую геометрическую форму канала подачи, тогда как форма А является самой плотной.
4.2.2. Мембраны для ультрафильтрации.
В данном исследовании тестировали три различных кассеты для ультрафильтрации, которые перечислены в табл. 1. Предварительные эксперименты проводили, используя кассету Вютах У-сетчатого типа. Тип У был выбран, поскольку было ничего не известно о возможном эффекте закупорки или образовании агрегатов во время фильтрования в случае данного конкретного раствора. Каналы подачи являются наиболее открытыми в кассетах типа У, в связи с чем они не закупориваются слишком легко. Кассеты типа С, имеющие более узкий диаметр канала подачи, были выбраны для дальнейших экспериментов на основании полученных положительных результатов.
Таблица. 1
Кассеты, используемые для экспериментов ультрафильтрации
Марка фильтра Материал фильтра ммсо кДа Площадь фильтрования, м2 Тип сетки
Вютах Полиэфирсульфон 10 0,1 V
Вютах Полиэфирсульфон 10 о,1 С
иИгасе! Регенерированная целлюлоза 10 0,1 с
5. Эксперименты.
Эксперименты проводили в лаборатории биотехнологии консорциума университета Каяани в Соткамо в четыре этапа. На первом этапе проводили тесты технической осуществимости, чтобы определить, как система ведет себя в целом. Второй этап экспериментов включал стадии оптимизации потока и трансмембранного давления (ТМР) для обеих кассет 1000 и 10 кДа (тип У).
На третьем этапе использовали проектный план эксперимента, созданный с использованием программы моделирования и планирования ΜΟΌΌΕ. Цель состояла в определении факторов, которые обладают самым сильным воздействием на ультрафильтрацию, включая тип мембраны. Кассеты, исследуемые на этом этапе, представляли собой кассеты фирмы Вютах и и11гасе1 типа С. На конечном этапе обе кассеты типа С 10 кДа (Вютах и И11тасе1) подвергали тестам оптимизации потока в зависимости от ТМР.
Перед каждым фильтрованием кассеты промывали водой обратного осмоса (00), так, что со стороны пермеата собирали по меньшей мере 5 л. Затем систему уравновешивали путем циркуляции 1 л чистого четырехмолярного (4 М) раствора ОиНС1 в системе в течение 10 мин. Затем систему опорожняли, после чего экстракт белка наливали в контейнер подачи. После каждого фильтрования канал ретентата опорожняли и промывали известным объемом 4 М ОиНС1 перед очисткой.
5.1. Первый этап: Тесты технической осуществимости.
Фильтруемость предварительно профильтрованного экстракта белка через кассету 1000 кДа исследовали сначала путем фильтрования одной партии 45 л. Использовали частоту вращения насоса 5 Гц. Диапазон ТМР оставался от 0,65 до 0,73 бар. Образцы для анализа белка всегда брали из потоков пермеата и ретентата, когда собирали 4 л пермеата. Когда собирали 44 л пермеата, в контейнер подачи добавляли 1 л 4 М ОиНС1. Это так называемое вытеснение использовали, чтобы повысить выход белка в пермеате. Фильтрование продолжали до тех пор, пока не собирали еще один литр пермеата. Образцы также отбирали по окончании вытеснения. Коэффициент объемной концентрации (УСЕ, уо1шпе1пс соисейтабои ГасЮг) фильтрования составлял 45.
Пермеат из предшествующего фильтрования 1000 кДа подвергали ультрафильтрации. Проводили две отдельные фильтрации, используя объемы партии 22 и 23 л. Применяемые УСЕ составляли 10,5 и 8,5 соответственно. В обоих прогонах было получено ТМР 0,75-0,78 путем использования частоты вращения насоса 12 Гц. Образцы отбирали для анализа таким же способом, как использован при выполнении микрофильтрации.
5.2. Второй этап: Оптимизация потока и ТМР для кассет типа У.
5.2.1. Оптимизация потока и ТМР для кассеты микрофильтрации.
Для открытых мембран, подобных тем, которые общепринято используют при микрофильтрации, критический поток определяют в полном режиме рециркуляции. В данном исследовании 5 л предварительно профильтрованного экстракта белка подвергали циркуляции в системе, используя четыре различные скорости подающего потока. Частоты вращения насоса 5, 7,5, 10 и 12,5 Гц использовали для созда- 11 024470 ния скоростей подающего потока примерно 1,15, 1,66, 2,15 и 2,75 л/мин соответственно. Поскольку поток фильтрата был слишком незначительным в начале эксперимента, эти значения также соответствуют первоначальным скоростям поперечного потока. Термин скорость поперечного потока относится к скорости потока ретентата, и ее обычно используют в контексте кривых потока в зависимости от ТМР. Исходно штуцерный кран пермеата был закрыт. При данной скорости потока в результате простого открытия клапана поток несколько увеличился. Системе давали возможность стабилизироваться в течение 10-20 мин. Поток и ТМР регистрировали через 5-минутные интервалы. Эту операцию продолжали до тех пор, пока клапан не был полностью открыт и ТМР больше не было линейным по отношению к потоку. В последнем случае было достигнуто критическое значение для потока (потока фильтрата).
5.2.2. Оптимизация потока и ТМР для кассеты ультрафильтрации типа V.
Оптимизация параметров для кассеты ультрафильтрации отличается от таковой для микрофильтрации. В данном исследовании кривые потока в зависимости от ТМР определяли для экстракта, подвергнутого микрофильтрации, при двух концентрациях (νΟΡ 1 и 10), используя пару различных скоростей подающего потока.
В случае νΟΡ 1 скорости подающего потока (и исходные скорости поперечного потока) составляли 1,15, 1,66 и 2,75 л/мин. Соответствующие частоты вращения насоса составляли 5, 7,5, 10 и 12,5 Гц. В случае νΟΡ 10 используемые скорости подающего потока составляли 1,66 и 2,75 л/мин соответственно.
Эксперименты начинали путем циркуляции 10 л белкового экстракта в полном режиме рециркуляции. При каждой скорости потока ТМР прогрессивно повышали через 5-10-мин интервалы путем закрытия штуцерного крана ретентата. Регистрировали изменения в потоке. Если наклон кривой потока в зависимости от ТМР начинал снижаться, была достигнута оптимальная точка ТМР. После проведения операции со всеми четырьмя скоростями поперечного потока белковый экстракт концентрировали до νΟΡ 10. Затем вышеописанную операцию повторяли.
5.3. Третий этап: План эксперимента с использованием ΜΘΌΌΕ.
Системный план экспериментов создавали, используя программное обеспечение моделирования и планирования ΜΘΌΌΕ (ΜΘΌΌΕ 8, итейтск АВ, Итеа, 5>\ус4сп). Все факторы, вовлеченные в процесс ультрафильтрации, сначала суммировали в диаграмме Исикавы (Ынка\уа). также известной как причинно-следственная диаграмма. Четыре фактора, выбранные для экспериментов, перечислены в табл. 2. Эти факторы могут быть либо качественными, либо количественными. Значение количественного фактора можно регулировать. Тип мембраны является характерным примером качественного фактора. Ответами, измеренными во время тестов, были продолжительность каждого фильтрования и выход (суммарная концентрация белка в концентрированном растворе).
Таблица 2
Факторы, выбранные для экспериментов ΜΘΌΌΕ, и их свойства
Фактор Количественный/Ка явственный Контролируемый Циапазон
Частота вращения насоса (скорость подающего потока) Количественный Да з-е гц
Т емпература Количественный Да 15-30° С
Блокировка потока ретентата Количественный Да 20-80%
Мембрана Качественный Да А или В
Вся установка тестов представлена в табл. 3. Всего было 11 тестовых прогонов. Во время исследования мембрану Вютах С обозначали как мембрану А, а мембрану иНгасе1 С - как мембрану В. Диапазон блокирования потока ретентата (20-80%) определяли как процент закрытия штуцерного крана ретентата. Скорости вращения насоса 3, 4,5 и 6 Гц создавали скорости потока 730, 1035 и 1350 мл/мин соответственно. Температура от 15 до 30°С была четвертым выбранным фактором.
Некоторые факторы, а именно объем, исходную концентрацию, различия партий и блокирование потока пермеата, игнорировали. Обнаружено, что различия между партиями несущественны (результаты не представлены). Объем и концентрация экстракта белка будут постоянны в конечном процессе фильтрования. Использование блокирования потока пермеата только замедлит процесс, поэтому не было причин изучать его влияние. Считали, что оператор и оборудование, за исключением мембран, обладает пренебрежимо малым воздействием на результат фильтрования.
Серию из 11 фильтраций в рандомизированном порядке создавали, используя программное обеспечение и выбирая Скрининг для параметра и линейный Дробный факторный эксперимент для модели планирования. Разрешение составляло IV. Затем этот план был выполнен с использованием исходного объема 3 л при каждом фильтровании. Затем применяли νΟΡ 10, что останавливало фильтрование, когда собирали 2,7 л пермеата. Регистрировали время, необходимое для фильтрования (точность 1 мин), и образцы отбирали из пермеата и концентрата для определения суммарной концентрации белка. Профиль белка также анализировали для некоторых из прогонов (см. глава 5.6.2). Результаты оценивали с помощью ΜΘΌΌΕ, используя методы частных наименьших квадратов (рагОа1 1еа<1 кдиагек, РЬ§). Эксперимен- 12 024470 ты по фильтрованию 9, 10 и 11 представляли собой так называемые прогоны центральной точки. Процесс повторяли три раза, используя те же параметры установки факторов. В прогонах центральной точки значения факторов всегда находятся в середине диапазона каждого фактора. Эти повторяющиеся прогоны используют для оценки вариабельности тестов, включая аналитические способы.
Таблица 3
План тестов по фильтрованию, созданный с использованием программы МОЭЭЕ
Эксп. № Эксп. название Порядок прогона Вкп./иекл. Насос ГЦ Блокирование потока ретентата % Темп. °С Мембрана
1 N1 5 Вкл. 3,0 20,0 15 А
2 N2 1 Вкл. 6,0 20,0 15 В
3 N3 2 Вкл. 3,0 80,0 15 В
4 N4 6 Вкл. 6,0 80,0 15 А
5 N5 3 Вкл. 3,0 20,0 30 В
е N6 7 Вкл. 6,0 20,0 30 А
7 N7 8 Вкл. 3,0 80,0 30 А
8 N8 4 Вкл. 6,0 80,0 30 В
9 N9 9 Вкл. 4,5 50,0 22,5 А
10 N10 11 Вкл. 4,5 50,0 22,5 А
11 N11 10 Вкл. 4,5 50,0 22,5 А
5.4. Четвертый этап: Оптимизация потока и ТМР для кассет ультрафильтрации типа С.
По сравнению с кассетами типа V каналы подачи в кассетах типа С являются более плотными. Следовательно, для создания значений ТМР, равных кассетам типа V необходима более низкая скорость потока. В данном исследовании кривые потока в зависимости от ТМР определяли при двух концентрациях (УСР 1 и 5).
Значения исходных скоростей подающего потока для обеих кассет и УСР представлены в табл. 4. Кассету Вютах называют мембраной А, а кассету И11гасе1 - мембраной В. Эксперименты начинали с 5 л экстракта белка в полном режиме рециркуляции. Альтернативно методика является такой же, как описано в главе 5.2.3. Одним дополнительным пунктом была проверка так называемого гистерезиса: Когда была достигнута самая высокая точка ТМР, ТМР постепенно снижалось. Если поток возвращался к своему исходному значению, мембрана не была закупорена.
Таблица 4
Выбранные характеристики для оптимизации потока в зависимости от ТМР кассет типа С 10 кДа
Насос/скорость подающего потока (Гц/л/мин)
Мембрана/ УСР 3/0,730 4/0,945 5/1,125 6/1,350
АЛ/СР1 X X X
АЛ/СР5 X X
ВЛ/СР1 X X X
ВЛ/СР5 X X
5.5. Протокол очистки мембраны.
После каждого цикла фильтрования мембраны подвергали очистке. Объем раствора для очистки составлял 1 л (10 л/м2 площади мембраны). Раствор подвергали циркуляции в системе и температуру регулировали посредством теплообменника. Использовали диапазон температуры примерно от 35 до 45°С. Гидроксид натрия (ЫаОН) использовали в качестве очищающего агента при концентрации от 0,1 до 0,4 М. Диапазон времени контакта составлял 30, 45 или 60 мин в зависимости от ситуации. Систему промывали водой ОО, так что на выходе собирали суммарно от 5 до 7 л пермеата. Затем измеряли значение нормализованной водопроницаемости (Ы^Р, погтаП/еб \\а1ег реттеаЬбЬу), как описано в главе 5.6.4. При необходимости очистку повторяли, возможно, в более жестких условиях.
5.6г Проведенные измеренияг
Образцы для анализа концентрации белка и электрофореза в δΌδ-РАСЕ были проведены в финской фирме Оулу. Другие измерения проводили в лаборатории биотехнологии при консорциуме университета Каяани. Должно быть отмечено, что не все измерения обязательно проводили для каждого образца.
5.6.1. Концентрация белка.
Образцы из тестов на техническую осуществимость (первого этапа) анализировали на их концентрацию белка, используя устройство ЫапоЭгор 2000 (ТЬегто 8с1епййс, И8А). Этот анализ основан на УФ-спектрометрии. Определение концентрации суммарного белка из всех других образцов проводили,
- 13 024470 используя колориметрический анализ по Бредфорду (ВгабГогб 1976). Используемый реагент для окрашивания покупали в фирме Βίο-Раб БаЪогаЮпех, υδΑ, и бычий сывороточный альбумин (БСА) приобретали в фирме МР Вютебюак, υδΑ. БСА использовали в качестве стандартного белкового материала для построения стандартных кривых концентрации белка. Однако результаты варьировались в зависимости от используемого способа тестирования. Поэтому результаты, полученные из предварительных тестов с использованием ЫапоИгор, использовали только в целях скрининга.
5.6.2. Анализ с помощью электрофореза в δΌδ-РАСЕ.
Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (δΌδ-РАСЕ) является общепринятым способом разделения белков в соответствии с их размером. Профиль белка можно визуализировать на геле, используя краситель, специфичный для белка. В процессах фильтрования электрофорез в δΌδ-РАСЕ обеспечивает отличную информацию о том, насколько успешно фильтрование. Например, можно четко увидеть, функционирует ли фильтр в соответствии с его номинальным отсекаемым значением молекулярной массы. В данном исследовании электрофорез в δΌδ-РАСЕ проводили, используя устройство Вю-Раб Мпп-Рго1еап II в соответствии с инструкциями изготовителя (Вю-Раб ЬаЪога1опе8, υδΑ). Этот способ основан на системе, описанной Лэммли (1970).
Поскольку СиНС1 препятствует анализу в δΌδ-РАСЕ, образцы из экспериментов по фильтрованию сначала необходимо подвергнуть диализу против воды. Во время диализа большая часть белков в экстракте осаждается. Поэтому осадок и супернатант лиофилизировали вместе после диализа. Часть лиофилизированного белкового материала взвешивали и растворяли в 6 М мочевине. Концентрацию белка измеряли, используя метод Бредфорда (1976). Затем готовили образцы для электрофореза в δΌδ-РАСЕ в соответствии с инструкциями изготовителя (Вю-Раб БаЪогаЮпех, υδΛ). В случае пермеата фильтрации количество лиофилизированного материала иногда было настолько мало, что взвешивание было невозможно. Вместо этого их случайным образом растворяли в 6 М мочевине, а затем анализировали концентрацию белка.
В лунки геля обычно наносили пятнадцать микрограммов белка. В случае образцов пермеата количество может быть ниже. В качестве стандарта молекулярной массы использовали Ргесыоп Р1и8 Оиа1 Со1ог Рго!еш δΡ-η^Ηύ (ВюРаб ЬаЪога1ог1е8, О). Электрофорез проводили, используя постоянное напряжение 200 В, и среднее время пробега составляло примерно 50 мин.
5.6.3. Скорости потока и трансмембранное давление.
Система МППроге Рго§са1е была оборудована цифровым расходомером пермеата. Скорость потока ретентата или скорость поперечного потока измеряли, используя контрольный таймер и градуированный стеклянный цилиндр на 1 или 2 л. Скорость потока пермеата измерялась в кг/мин, но по измерениям она была достаточно близка к л/мин, также при использовании растворов 4 М гуанидингидрохлорида. Скорость подающего потока можно вычислить путем сложения вместе скоростей потока ретентата и пермеата. Трансмембранное давление (ТМР) показано непосредственно в системе Р^οδса1е. но также может быть вычислено с использованием уравнения (1):
ТМР (бар) = --- - р„!гтеак (1) где Р£ееб представляет собой давление подачи (бар);
Рге1еп1а1е представляет собой давление ретентата (бар);
Ррегтеа£е представляет собой давление пермеата (бар).
5.6.4. Нормализованная водопроницаемость.
Когда фильтр используют в первый раз, должна быть определена его исходная нормализованная водопроницаемость. Она будет представлять собой значение, с которым сравнивают последние измерения. Целесообразно всегда использовать одни и те же параметры процесса для определения ЖУР. Уравнение (2) используют для вычисления ЖУР:
МБР = (2)
ТМР А ' ' где О|)е|11|е,|1е представляет собой скорость потока пермеата (л/ч);
А представляет собой общую площадь фильтра (м2);
ТМР представляет собой трансмембранное давление (бар);
Р представляет собой коэффициент поправки на температуру из Приложения 1.
Измерение ЖУР всегда проводили после промывки и перед фильтрованиями. Измерение ЖУР представляет собой самую прямую демонстрацию эффективности промывки. Чем ближе оно может быть восстановлено до его исходного значения, тем лучше эффективность очистки.
5.6.5. Целостность фильтра.
Для подтверждения целостности фильтров должен регулярно проводиться тест удельного потока воздуха. Фильтровальный модуль был присоединен к лабораторной системе МППроге ВепсП8са1е, и тест проводили в соответствии с методикой, предложенной изготовителем (МППроге СогрогаПоп 1998).
Кратко, промытый и высушенный фильтровальный модуль присоединяли к регулируемой подаче
- 14 024470 газа (воздуха или азота). Газ пропускали от подающей стороны фильтра при давлении, специфичном для мембраны. Пластмассовую трубку соединяли с выходом пермеата. Другой конец трубки вводили в перевернутый градуированный стеклянный цилиндр, наполненный водой. Этот цилиндр помещали в контейнер большего объема, наполненный водой. Тогда скорость потока воздуха можно определить путем измерения объема воздуха, вытесняемого в стеклянный цилиндр в данный период времени. Каждый тип и размер мембраны имел собственный максимальный предел потока воздуха для выполнения требований к целостности.
5.6.6. Закупорка мембраны.
В характерном случае степень закупорки мембраны можно вычислить, используя приведенное ниже уравнение (3):
Закупорка % = р1о^~р1™™> . Ю0% (3) где Р1о№84аг1 представляет собой поток пермеата в начале фильтрования;
Р1о\\е||,| представляет собой поток пермеата в конце фильтрования.
Одним из способов вычисления закупорки мембраны является сравнение скоростей потоков воды до и после фильтрования перед промывкой. В данном исследовании многие из белков в экстракте осаждаются, когда вступают в контакт с водой. Таким образом, вычисленные проценты закупорки необязательно указывают на закупорку, которая происходит в процессе фильтрования. Мониторинг общей закупорки можно также проводить по время фильтрования, наблюдая уменьшение потока. Эффект закупорки можно вычислить по снижению потока в данный период, используя уравнение (3).
5.6.7. Баланс массы.
Чтобы понять, как белки распределяются в данном процессе, проводят вычисление баланса массы. Полезным уравнением для этой цели является уравнение (4):
где Уге1 представляет собой объем ретентата (л);
С.е. представляет собой концентрацию белка ретентата (мг/мл или г/л);
Урегт представляет собой объем пермеата (л);
Срегт представляет собой концентрацию белка пермеата (мг/мл или г/л);
Уйи* представляет собой объем раствора, используемого для промывки системы (л);
Сг1и8ь представляет собой концентрацию белка раствора, используемого для промывки системы (мг/мл или г/л);
У1ш41а1 представляет собой объем исходного подаваемого раствора (л);
С1ш11а1 представляет собой концентрацию белка исходного подаваемого раствора (мг/мл или г/л).
По многим причинам процент баланса массы редко составляет 100. Некоторая часть белков будет осаждаться на мембране. Всегда имеется некоторый удерживаемый объем в кассете и оборудовании. Способы определения также не являются точными.
6. Результаты
6.1. Целостность фильтров.
Целостность всех анализируемых мембранных фильтров находилась на допустимом уровне. Результаты этих тестов в данной работе не представлены.
6.2. Техническая осуществимость кассетной микрофильтрации.
Техническую осуществимость для полиэфирсульфонового кассетного фильтра на 1000 кДа исследовали, используя объем партии 45 л и конечную УСР 45. На фиг. 1 показано, как изменялся поток фильтрата в ходе фильтрования. Четко видно, что поток сохраняет от 36 до 30 л/м2/ч большую часть времени. Падение в конце, вероятно, связано с повышенной поляризацией концентрации. В конце фильтрования был резкий подъем суммарной концентрации белка в потоке ретентата (фиг. 2). Концентрация в пермеате оставалась почти постоянной в ходе фильтрования.
6.2.1. Баланс массы при микрофильтрации.
Определяли баланс массы микрофильтрации. Результаты суммированы в табл. 5. Процент баланса массы, вычисленный с использованием уравнения (4), составлял 94, что означает, что 6% белка какимлибо путем теряется в ходе фильтрования. Всегда существует некоторая потеря в связи с удерживаемым объемом фильтровальной кассеты, трубок и насоса. Некоторая потеря, вероятно, происходит в результате закупорки мембраны. Удерживаемый объем кассет, используемых в данной работе, находится в пределах 30 мл. После стадии промывки количество белка в удерживаемом объеме, следовательно, считали незначительным.
- 15 024470
Таблица 5
Вычисление баланса массы для фильтрования 1000 кДа
Фракция Суммарный объем (1) Сбелок (мг/мл) Суммарный белок (г) Процентное значение (%)
Подача 45 0,625 28,125 100
Пермеат 45 0,513 23,085 82
Концентрат 0,5 3,945 1,973 7
Промывка 0,4 3,680 1,472 5
Баланс массы % 94
6.3. Техническая осуществимость кассетной ультрафильтрации.
Партии 22 и 23 л после микрофильтрации подвергали ультрафильтрации, используя фильтр типа V 10 кДа. Достижение VСΡ 10,5 и 8,5 соответственно занимало 5 ч. Две фильтрации проявляли в целом сходные характеристики, что видно из скоростей потока (фиг. 3А и В). В обоих случаях падение потока в пределах первых 10 мин составляло 6-7%. Это обычно вызвано поляризацией концентрации и, возможно, закупоркой. Когда были достигнуты конечные VСΡ, потоки составляли 72 и 73% (39 и 38,4 л/м2/ч) от исходных значений 54 и 52,8 л/м2/ч соответственно.
6.3.1. Балансы массы при ультрафильтрациях.
Балансы масс в результате двух ультрафильтраций были очень близкими друг к другу. Проценты потери баланса масс составляли 3 и 5%. Большую часть белка можно было обнаружить в концентрате (ретентате), что видно в табл. 6. Одно резкое различие составляла концентрация белка (Сеелка) в подаче. Измеренные концентрации составляли 0,47 и 0,555 мг/мл, хотя материал был одинаковым. Это могло быть связано с вариациями в способе анализа.
Таблица 6
Вычисление баланса массы для двух фильтраций 10 кДа (кассета типа V)
Фракция Суммарный объем (л) Сбелок (мг/мл) Суммарный белок (г) Процентное значение (%)
Подача 22 0,47 10,43 100
23 0,555 12,77 100
Пермеат 19,2 0,05 0,96 9
20 0,05 1,0 8
Концентрат 2,1 4,1 8,61 83
2,75 3,88 10,67 84
Промывка 0,4 1,535 0,61 6
0,4 1,225 0,49 4
Суммарный баланс массы 98 95
6.3.2. Анализ пермеата при ультрафильтрации с помощью электрофореза в δΌδ-ΡΑΟΕ.
Профиль белка пермеата отлично показывает, насколько хорошо мембрана отвечает ее спецификациям. Тест на целостность обычно выявляет, если мембрана потеряла свою селективность, но анализ с помощью электрофореза в δΌδ-ΡΑΟΕ также показывает подробности для интактной кассеты. На фиг. 4 показан профиль белка пермеата из 23-литровой ультрафильтрации. Четко видно, что отсутствуют белки большего размера, чем примерно 13 кДа. Это является очень хорошим результатом для кассеты с отсекаемым размером частиц 10 кДа.
6.4. Оптимизация потока и ТМР для кассеты микрофильтрации.
Оптимизация характеристик потока для микрофильтрации описана в главе 5.2.2. Цель состояла в том, чтобы определить условия, при которых был достигнут самый стабильный поток. Использовали четыре различных скорости поперечного потока. Результаты представлены на фиг. 4 и 5.
Общим признаком всех четырех случаев было падение потока в начале экспериментов. Это, вероятно, связано с эффектом закупорки или с поляризацией концентрации. После первых 15 мин видно, что поток стабилизируется. Из фиг. 5 невозможно сделать вывод, что критический поток был достигнут с использованием скоростей поперечного потока 1,15 или 1,66 л/мин. Однако в момент времени примерно 70 мин происходило снижение потока при постоянном ТМР в обоих случаях. При полном открытии крана пермеата на последующем этапе потоки, по-видимому, стабильны.
При использовании скоростей поперечного потока 2,15 и 2,75 л/мин (фиг. 6) сделать выводы более сложно. Имеется некоторое снижение потока в течение первых 15 мин каждой стадии. Однако более значительное снижение в обоих случаях видно в течение последней стадии. Критические потоки можно, таким образом, определить около 60-66 л/м2/ч, когда исходная скорость поперечного потока составляет 2,15 л/мин, и около 72-78 л/м2/ч, когда скорость поперечного потока составляет 2,75 л/мин.
- 16 024470
6.5. Оптимизация потока и ΤΜΡ для кассеты ультрафильтрации типа У.
Как описано в главе 5.2.2, поток в зависимости от ТМР исследовали, используя четыре различные скорости поперечного потока и два значения УСР (1 и 10). Полученные кривые представлены на фиг. 7 (УСР 1) и 8 (УСР 10).
Когда УСР была равна 1, наклон кривой начинал снижаться только при скоростях поперечного потока 1,15 и 1,66 л/мин (фиг. 7А и В). Это происходило в обоих случаях при ТМР около 2,5 бар, и соответствующие оптимальные потоки составляли примерно 84 и 96 л/м2/ч соответственно. При самом высоком давлении промывка поверхности мембраны могла быть недостаточной для этих двух более низких скоростей поперечного потока. При более высоких скоростях поперечного потока (2,15 и 2,75 л/мин) это явление не наблюдали (фиг. 7С и Ό). ТМР могло подняться больше, но давление подачи уже составляло почти 3 бар, когда ТМР составляло 2,36 и 2,27 бар соответственно. Потоки при этих давлениях составляют 105 и 108 л/м2/ч и находятся в линейном диапазоне.
При использовании более высокой концентрации раствора белка (УСР 10) снижение наклона было более четко видно. Как показано на фиг. 8А, оптимальное ТМР составляет 1,8 бар, что дает поток 60 л/м2/ч при скорости поперечного потока 1,66 л/мин. Когда скорость поперечного потока составляла 2,75 л/мин, сравнимыми значениями являются 2 бар для ТМР и примерно 78 л/м2/ч для потока (фиг. 8А). Все эти результаты, включая результаты для УСР 1, суммированы в табл. 7.
Таблица 7
Оптимальные ТМР и соответствующие значения потока для различных исходных скоростей поперечного потока и УСР
УСР Скорость поперечного потока (л/мин) Оптимальное ТМР (бар) Поток (л/м2/час)
1 1,15 2,5 85
1 1,66 2,65 99
1 2,15 >2,36 >105
1 2,75 >2,27 >108
10 1,66 1,8 60
10 2,75 2 78
6.6. План эксперимента с использованием ΜΟΌΌΕ.
Провели серию экспериментов, спланированных с использованием программного обеспечения ΜΟΌΌΕ. Она состояла из 11 ультрафильтраций с различными комбинациями параметров. Измеряемые ответы представляли собой продолжительность концентрирования 3 л экстракта белка до УСР 10 и конечную концентрацию белка. Прямые результаты представлены в табл. 8. Значения ТМР варьировались в зависимости от частоты вращения насоса и блокирования потока ретентата. Диапазон составлял 0,51,45 бар в случае мембраны А и 0,65-1,85 в случае мембраны В.
Таблица 8
Суммирование параметров и ответов, полученных из экспериментов по ультрафильтрации, спланированных с использованием программного обеспечения ΜΟΌΌΕ
Эксп № Эксп. название Порядок прогона Зкл./искп. Насос Гц Блокирование потока ретентата % Темп. °С Мембрана Время мин. Конц. мг/мл
1 N1 5 Вкл. 3,0 20,0 15 А 51 2,02
2 N2 1 Вкл. 6,0 20,0 15 В 18 2,08
3 N3 2 Вкл. 3,0 80,0 15 В 30 2,2
4 N4 6 Вкл. 6,0 80,0 15 А 20 2,22
5 N5 3 Вкл. 3,0 20,0 30 В 31 2,28
6 N6 7 Вкл. 6,0 20,0 30 А 25 2,24
7 N7 8 Вкл. 3,0 80,0 30 А 40 2,4
8 N8 4 Вкл. 6,0 80,0 30 В 13 1,9
9 N9 9 Вкл. 4,5 50,0 22,5 А 33 2,18
10 N10 11 Вкл. 4,5 50,0 22,5 А 33 2,2
11 N11 10 Вкл. 4,5 50,0 22,5 А 33 2,02
6.7.1. Соответствие модели.
Значения ответов (время и концентрация белка, или выход) вводили в программу ΜΟΌΌΕ. Модель подбирали, используя метод частных наименьших квадратов (ΡΌδ), и подвергали анализу отклонения (ΑNΟУΑ). На фиг. 9 представлена диаграмма, названная Краткое изложение соответствий. Для каждого соответствующего ответа на диаграмме представлено 4 столбика. Согласно руководству к программе ΜΟΌΌΕ значения для К2 и О2 обеспечивают лучшее краткое изложение модели. Переменная К2 описы- 17 024470 вает, насколько модель регрессии может быть приведена в соответствие с необработанными данными и названа качество соответствия. Переменная р2 названа качество предсказания и описывает предсказательную способность модели. Как правило, К2 и р2 должны быть высокими и не разделенными более чем на 0,2-0,3. Столбик МУ на фиг. 20 описывает адекватность модели. Если значение составляет ниже 0,25, ошибка модели является значимо большей, чем воспроизводимость, представленная столбиком КЕ (Ите1г1С8 АВ 2003).
Для значения времени все оцениваемые параметры являются хорошими за исключением адекватности модели (фиг. 9). Адекватность модели невозможно вычислить, поскольку повторные прогоны центральной точки дали точно такой же результат (100% воспроизводимость). Для выхода (концентрации белка) качество модели и предсказания является низким или нулевым, что означает, что система фильтрования является очень надежной в отношении выхода: Изменения в пределах выбранного диапазона параметра, таким образом, не оказывают влияния на выход.
Табл. 9 (ΑΝΟνΑ для выхода) показывает, что отсутствие соответствия не является значимым при уровне значимости 95%, поскольку р более 0,05. Как видно также на фиг. 9, в отношении выхода ошибка модели отсутствует. Значение р регрессии составляет 0,730, что находится далеко за пределами критического значения 0,05. Таким образом, регрессия не является значимой при уровне значимости 95%, и выход не может быть предсказан с использованием модели. Для значения времени табл. ΑΝΟνΑ (табл. 10) выглядит иначе. Значение р для отсутствия соответствия (ошибки модели) не может быть определено. Все прогоны центральной точки привели в результате именно к одинаковым значениям времени. Следовательно, в модели нет действительной ошибки. Для регрессии р=0,000, что указывает на очень хорошую модель в отношении времени фильтрования.
Таблица 9
Таблица ΑΝΟνΑ для выхода.
ΌΡ представляет собой степень свободы, представляет собой сумму квадратов,
М3 представляет собой среднее квадратов, и 8Ό представляет собой стандартное отклонение
Выход 05 55 Μ5 (отклонение) Ρ Ρ 5ϋ
Суммарный 11 51,434 4,67582
Константа 1 51,2352 51,2352
Суммарный скорректированный 10 0,198757 0,0198757 0,140981
Регрессия 4 0,0506643 0,0126661 0,513167 0,730 0,112544
Остаточный 6 0,148093 0,0246822 0,157106
Отсутствие соответствия (ошибка модели) 4 0,128626 0,0321566 3,30375 0,246 0,179322
Чистая ошибка (ошибка воспроизведения) 2 0,0194667 0,00973334 0,0986577
N = 11 О2= 0,000 Сопб. Νο. = 1,049 ϋΡ = 6 Ρ2 = 0,255 Υ-ίτιΪ55 = 0 Сотр, = 2 Ρ2 Αφ = -0,242 Ρ50 = 0,1571
- 18 024470
Таблица 10
Таблица ΑΝΟνΑ для времени.
ЭР представляет собой степень свободы, представляет собой сумму квадратов,
Μδ представляет собой среднее квадратов, и 8Ό представляет собой стандартное отклонение
Время ϋδ 55 МЗ (отклонение) Р Р 5ϋ
Суммарный 11 10847 986,091
Константа 1 9720,82 9720,82
Суммарный скорректированный 10 1126,18 112,618 10,6122
Регрессия 4 1079,47 269,867 34,6618 0,000 16,4276
Остаточный 6 46,7143 7,78571 2,79029
Отсутствие соответствия (ошибка модели) 4 46,7143 11,6786 — — 3,41739
Чистая ошибка (ошибка воспроизведения) 2 0 0 —
N = 11 О2 = 0,738 Сопб. Νο. = 1,049 ϋΡ = 6 Ρ2 = 0,959 Υ-ΙΤΙΪ55 = 0 Сотр. = 2 Ρ2Α6ί = 0,931 Р5О = 2,79
6.7.2. Оценка результатов.
Время было единственным ответом, на который можно оказать влияние. На фиг. 10 показано, как каждый параметр влиял на время ультрафильтрации. Четко видно, что частота вращения насоса (т.е. скорость подающего потока) обладает основным воздействием на продолжительность фильтрования. Более высокая скорость приводит в результате к более быстрому фильтрованию. Блокирование потока ретентата обладает минимальным влиянием. Температура, по-видимому, не играет никакой роли, поскольку столбик ее ошибки даже больше, чем действительный столбик, описывающий эффект. При сравнении мембран кажется очевидным, что мембрана В является лучшим выбором. Выбор мембраны В обеспечивает более короткое время фильтрования более чем на 5 мин по сравнению со средним временем. Для мембраны А соответствующее время более чем на 5 мин больше.
Качество фильтрования является другим важным фактором. Это было исследовано путем отбора образцов из пермеатов и измерения концентрации белка в них. Во всех образцах концентрация была ниже 0,05 мг/мл за исключением пермеата прогона 4, где концентрация составляла 0,06 мг/мл. Профиль белка четырех пермеатов исследовали, используя анализ с помощью электрофореза в δΌδ-ΡΑΟΕ. Профили представлены на фиг. 11. Пермеаты из прогонов 1 и 4 (дорожки 2 и 3) были получены из ультрафильтраций с использованием мембраны В, а пермеаты из прогонов 7 и 10 (дорожки 4 и 5) были получены с использованием мембраны А. Видимые белки большего размера, чем 13 кДа, отсутствуют в любом из образцов. Это означает, что при всех фильтрациях, исследованных в данной работе, мембрана функционировала в соответствии с ее теоретическим значением отсекаемого размера частиц. В случае прогона 1 с трудом видны какие-либо белки.
6.8. Оптимизация потока в зависимости от ТМР для кассет ультрафильтрации типа С.
Доказано, что фильтры типа С являются хорошим выбором для ультрафильтрации экстракта костного белка. Они обеспечивают лучшую турбулентность и меньшее напряжение при сдвиге, чем фильтры типа ν, которые имеют более открытые каналы подачи. Сдвиг является более низким при фильтрах типа С, поскольку такое же ТМР, как для фильтра типа ν, получают при более низкой скорости подающего потока. Оптимизация потока в зависимости от ТМР была исследована в соответствии с планом, показанным в табл. 4. В случае фильтровальной кассеты Вютах результаты представлены на фиг. 12 для VСР 1 и на фиг. 13 для VСР 5. Для фильтровальной кассеты И11тасе1 соответствующими графическими материалами являются фиг. 14 и 15. В данном исследовании концентрирование с VСР 1 до VСР 5 не проводили, используя самые высокие возможные значения. Балансы массы определяли после экспериментов по оптимизации.
6.8.1. Фильтр Вютах.
В случае VСР 1 единственное четкое свидетельство о снижении потока наблюдали при исходной скорости поперечного потока 0,945 л/мин (фиг. 12А). Эти и все остальные значения, включая проверку гистерезиса, представлены в табл. 11. При ТМР 2,3 бар поток составлял примерно 108 л/м2/ч. При более высоких скоростях поперечного потока снижения потока не наблюдали при ТМР около 2,8 бар. Более высокие значения не тестировали, поскольку давление подачи уже составляло около 3,6 бар за счет блокирования потока ретентата. Следовательно, поток по меньшей мере 138 л/м2/ч может быть безопасно достигнут при скорости поперечного потока 1,125 л/мин и 132 л/м2/ч при 1,350 л/мин соответственно.
- 19 024470
При более высокой концентрации (УСР 5) экстракта белка, тестируемого при исходной скорости поперечного потока 0,945 л/мин, было небольшое снижение потока при высоких значениях ТМР (фиг. 13). Это может указывать на то, что точка критического потока находится близко. Опять же, эксперимент был остановлен в связи с высоким давлением подачи. При самой высокой скорости поперечного потока (1,350 л/мин) точку перегиба наблюдали, когда ТМР составляло 2,5 бар при потоке 108 л/м2/ч.
6.8.2. Фильтр иИгасеР
Фильтры ийгасе1 и Вютах различаются по материалу мембраны. Это вызывает различные характеристики потока. Влияние этих характеристик на события фильтрования зависит от ситуации. В данном исследовании с использованием экстракта костного белка равная скорость потока 0,945 л/мин приводила к исходному ТМР 1,04 бар и потоку 57 л/м2/ч в случае фильтра ийгасе1 по сравнению с исходным ТМР 0,62 бар и потоком 30 л/м2/ч для фильтра Вютах (фиг. 14В и 12А). При сравнении соответствующие значения для фильтра Вютах типа V даже при более высокой скорости поперечного потока (1,15 л/мин) составляли всего лишь 0,17 бар и практически нулевой поток (фиг. 7А). Это должно обосновывать использование кассеты ийгасе1 типа С.
Из фиг. 14 и 15 можно сделать вывод, что ни при одной из скоростей поперечного потока, использованных в данном исследовании, верхний предел ТМР и, следовательно, максимальный поток, не был достигнут. Это было в обоих случаях, УСР 1 и УСР 5. Данный результат связан с ограничениями в давлении подачи, которое превышало 3,6 бар. По-видимому, фильтр ийгасе1 не закупоривался легко даже при высоких давлениях и потоках. Проверка гистерезиса подтвердила это, поскольку после экспериментов был достигнут исходный поток. В табл. 16 суммированы все результаты.
6.8.3. Суммирование результатов оптимизации ультрафильтрации с использованием кассет типа С.
В табл. 11 суммированы результаты, полученные в ходе стадий оптимизации для кассетных фильтров Вютах и И11гасе1 типа С. Четко видно, что оптимальный поток был достигнут в нескольких случаях. Таким образом, оба типа мембран проявляют хорошие характеристики. В качестве сравнения, фильтр Вютах типа V показал критический поток 84 л/м2/ч при скорости поперечного потока 1,15 л/мин, тогда как критический поток фильтра типа С составляет более 138 л/м2/ч при почти равной скорости поперечного потока.
Результаты проверки гистерезиса указывают на то, что мембрана Вютах закупоривается легче, чем мембрана ийгасе1. Скорости потока фильтра И11гасе1 возвращались к исходным значениям во всех случаях, кроме одного. Для фильтра Вютах средние скорости потока составляли 97% от исходных значений, что является хорошим результатом. Однако следует провести дополнительные тесты прежде, чем сделать окончательные выводы.
Таблица 11
Суммирование результатов оптимизации потока в зависимости от ТМР для ультрафильтров типа С
МембранаЛ/СР Скорость поперечного потока (л/мин) Оптимальное ТМР (бар) Поток (л/м2/час) Г истерезис (% исходного потока)
Вютах /1 0,945 2,3 108 100
Вютах /1 1,125 >2,95 >138 92
Вютах /1 1,350 >2,8 >129 99
Вютах / 5 0,945 >2,85 >114 Но.
Вютах / 5 1,350 2,5 108 96
1Л1гасе1 /1 0,730 >2,7 >138 100
иИгасе! /1 0,945 >2,6 >144 100
иигасе! /1 1,125 >2,4 >138 100
11Игасе1 / 5 0,945 >2,7 >129 100
11Игасе1 / 5 1,125 >2,4 >117 98
Были вычислены балансы массы представленных выше экспериментов, и результаты представлены в табл. 12. В обоих случаях в пермеате не было обнаружено обнаружимого количества белка. Концентрации белка в промывающем растворе и растворе подачи были одинаковыми. Единственное отличие было обнаружено в концентрате, который содержал 87% суммарного белка, измеренного при подаче, в случае фильтра Вютах. Соответствующее значение для фильтра И11гасе1 составляло 95%. Это высокое значение привело в результате к 6% увеличению конечного баланса массы.
Однако это единственное сравнение не показывает достоверно, что фильтр ийгасе1 обеспечивает более высокий выход. При вычислении средних выходов из семи фильтрований с использованием фильтра Вютах и четырех фильтрований с использованием фильтра И11гасе1 (табл. 8) результаты составляют 2,18 и 2,12 мг/мл соответственно. Как уже оценено с использованием программы ΜΟΌΌΕ, заметные несоответствия в отношении выхода отсутствуют.
- 20 024470
Таблица 12
Вычисления баланса массы ультрафильтраций с использованием кассетных фильтров Вютах и И11тасе1 типа С
Фракция / мембрана Суммарный объем (л) Сбепок (мг/мл) Суммарный белок (г) Процентное значение(%)
Подача / Вютах 5 0,46 2,3 100
Подача / 1Л1гасе1 5 0,46 2,3 100
Пермеат / Вютах 4 0 (=0,05) 0 0
Пермеат / 1Л1гасе1 4 0 («=0,05) 0 0
Концентрат/ 1 2,01 2,01 87
Вютах 1 2,18 2,18 95
Концентрат/
1Л1гасе1
Промывка / Вютах 0,5 0,5 0,25 11
Промывка / иИгасе! 0,5 0,52 0,26 11
Баланс массы / Вютах 98
Баланс массы / 1Л1гасе1 106
6.9. Эффективность очистки мембран.
Значение ΝνΡ было измерено после стадии очистки, проводимой после каждого фильтрования. Результаты суммированы в данном разделе. Мембрана Вютах, по-видимому, закупоривается легче, чем мембрана И1!гасе1. На фиг. 16 показана эффективность очистки, оцениваемая по значениям ΝνΡ. Семь циклов фильтрования было проведено с использованием мембраны Вютах и четыре с использованием мембраны И1!гасе1. Фильтрование было описано в главе 5.3. Эксперименты по очистке проводили, используя 0,1 М №ЮН в течение 30 мин при 37°С. В случае фильтра ИИгасе1 ΝνΡ возвращалась почти к своему исходному значению при всех четырех очистках. Фильтр Вютах проявлял более низкое восстановление, хотя оно, как правило, составляло выше 90%, за исключением фильтрования номер 7. После экспериментов оптимизации потока в зависимости от ТМР (см. главу 6.8) с использованием тех же фильтров восстановление ΝνΡ составляло 99% для фильтра И11гасе1 и 72% для фильтра Вютах, когда очистку проводили с использованием 0,1 М Ν;·ιΟΗ в течение 30 мин при 37°С. Затем, когда фильтр Вютах подвергали более жесткой очистке 0,2 М Ν;·ιΟΗ в течение 60 мин при 45°С, ΝνΡ возвращалась к 78% ее исходного значения. Повышение концентрации Ν;·ιΟΗ до 0,3 М и циркуляция его в течение 45 мин при 45°С обеспечивали значение ΝνΡ 80%. Было обнаружено, что такой протокол необходим с целью восстановления ΝνΡ кассеты ультрафильтрации Вютах типа У и кассеты микрофильтрации типа У до значений выше 80% (результаты не представлены).
6.10. Масштабирование процесса фильтрования.
Кассетные фильтры являются линейно масштабируемыми. Следовательно, необходимую площадь мембраны и скорость подающего потока в конечном масштабе изготовления можно вычислить на основании результатов, полученных в малом масштабе. В данном исследовании вычисления для масштабирования процесса ультрафильтрации были проведены для фильтров Вютах и ИИгасе1 типа С. Использовали значения, полученные в экспериментах, описанных в главе 6.8. Значение УСЕ было равно 5. Абсолютный максимум для потоков фильтрата для фильтров Вютах и И11тасе1 в этих экспериментах не был достигнут. Самые высокие значения, представленные в табл. 11, используют при вычислениях масштабирования. Суммирование результатов масштабирования представлено в табл. 13.
6.10.1. Определение среднего потока фильтрата.
Поток обычно снижается в ходе фильтрования. Для целей масштабирования необходимо среднее значение. Средний поток фильтрата 1Г можно вычислить, используя уравнение (5):
Л =0-33-7^+0.67-7^ (5) где Ιιηιί13ι представляет собой исходный поток фильтрата (л/м2/ч);
!Г1па1 представляет собой поток фильтрата в конце фильтрования (л/м2/ч).
Таким образом, Ιιηιί13ι представляет собой поток, когда УСЕ равно 1, и ΙΓιη3ι в данном случае представляет собой поток для УСЕ 5. Самые высокие значения потока из табл. 11 для обеих УСЕ используют при вычислениях с использованием уравнения (5). Когда УСЕ равно 1, эти значения равны 138 л/м2/ч для Вютах и 144 л/м2/ч для ИИгасе1. Когда УСЕ равно 5, соответствующие значения равны 114 л/м2/ч и 129 л/м2/ч, соответственно. Подстановка этих значений в уравнение (5) дает 1Г 121 л/м2/ч для Вютах и 134 л/м2/ч для И1!гасе1. Если желательна очень надежная система, можно использовать исключительно 1Гта1 в качестве % Необходимо отметить, что, к сожалению, критический поток для Вютах в случае УСЕ 5 не тестировали для скорости подачи 1,125 л/мин. Использование данной скорости подачи привело к получению самых высоких значений потоков, когда УСЕ равно 1. Значение 114 л/м2/ч, полученное в
- 21 024470 результате скорости подачи 0,945 л/мин, используют в вычислениях, которые могут в некоторой степени искажать результаты.
6.10.2. Масштабирование площади мембраны.
Площадь мембраны, необходимая для фильтрования (концентрирования) определенного объема раствора в течение желаемого времени процесса, может быть определена из уравнения (6):
где УГ||||а1е представляет собой объем фильтрата, подлежащий обработке (л);
Ф представляет собой средний поток фильтрата (л/м2/ч), определенный в малом масштабе;
представляет собой желаемое время процесса фильтрования (ч).
Если объем фильтрата в масштабе изготовления составляет 800 л (УСР 5 из партии 1000 л), а желаемое время составляет четыре часа, необходимая площадь мембраны А может быть вычислена с использованием уравнения (6). Подстановка значений и, вычисленных выше, даст площадь мембраны 1,65 м2 для мембраны Вютах и 1,49 м2 для мембраны иИгасе1. Рекомендован дополнительный коэффициент запаса прочности 20% для площади мембраны (МПНроте 2008). Следовательно, значения равны 1,98 и 1,79 м2 На практике это означает использование четырех мембран по 0,5 м2 с получением конечной площади мембраны 2 м2. Масштабированная площадь мембраны может быть также вычислена с использованием уравнения (7). Конечный результат является таким же, как получен с помощью уравнения (6).
где Аехр представляет собой площадь мембраны, использованную в эксперименте (м2);
У8са1еа представляет собой объем крупномасштабного процесса (л);
Уехр представляет собой объем, использованный в эксперименте (л);
4зса1ел представляет собой желаемое время фильтрования в крупномасштабном процессе (ч);
1ехр представляет собой время фильтрования эксперимента (ч).
6.10.3. Вычисление скорости подачи в масштабированном процессе.
Для крупномасштабного процесса фильтрования скорость подачи также должна быть масштабирована. Ее можно определить из уравнения (8):
_ /'-г/,'.Ар
Й (δ) где О £еес1. ехр представляет собой скорость подачи, использованную в эксперименте (л/мин);
Аехр представляет собой площадь мембраны, использованную в эксперименте (м2);
А',са|е<| представляет собой площадь мембраны в крупномасштабном процессе (м2).
Скорости подачи, использованные в маломасштабных экспериментах, выбраны из табл. 16. Для самого высокого значения потока фильтрата с использованием фильтра Вютах это значение было равно 1,125 л/мин. Для фильтра И11гасе1 оно было равно 0,945 л/мин. Площадь мембраны Аехр в экспериментах была равна 0,1 м2 При введении значений масштабированных площадей мембраны, вычисленных в Главе 6.10.2, и округлении до следующего более высокого значения (2 м2 для обеих мембран) уравнение (8) дает 0гее,|, :,с,|1е,| 22,5 л/мин для Вютах и 18,9 л/мин для И11гасе1. В фильтровальном оборудовании конечного масштаба емкость насоса должна быть рассчитана, чтобы удовлетворять этим требованиям. Иначе приходится принимать увеличенное время процесса.
6.10.4. Суммирование результатов масштабирования.
Теоретический пример партии 1000 л и УСР 5 использовали при вычислениях для масштабирования процесса. Полномасштабное время процесса было установлено на 4 ч. Обычно рекомендуют временную рамку 3-4 ч (МППроте 2008). Результаты суммированы в табл. 13. Стоимости мембранных устройств представляют собой стартовые цены из веб-страниц МПйроте Сотротайоп (\у\у\у.тППроге.сот ). Линейная масштабируемость кассетных фильтров дает возможность быстрой регуляции вычислений. Например, если объем фильтрования удваивается, а время фильтрования поддерживают постоянным, это потребует удвоения площади мембраны. Как видно в табл. 13, различия между двумя мембранами не являются большими в данном эксперименте. Фильтр И11тасе1 является немного менее дорогостоящим, чем фильтр Вютах.
- 22 024470
Таблица 13
Суммирование факторов масштабирования процесса и стоимостей мембран
Мембрана Вютах 10 С Мембрана иИгасе! 10 С
Объем Уееа (Л) 1000 1000
Объем (1) 800 800
Время фильтрования ί (ч) 4 4
Скорость подачи О(ее() (л/мин) 22,5 18,9
Площадь мембраны А (мг) 2 (1,74) 2 (1,67)
Стоимость мембранного устройства (евро) 2227 2498
для фильтра 0,5 м2
Необходимое число мембранных устройств 4 4
Суммарная стоимость мембраны (евро) 8908 9992
7. Обсуждение.
Процессы фильтрования сложных биологических материалов всегда зависят от ситуации. Каждый материал имеет свой собственный состав белков и других элементов, и их воздействия невозможно предсказать. Кроме того, раствор и другие условия также влияют на результат. В данном исследовании экстракт костного белка подвергали микро- и ультрафильтрации и использовали серию экспериментов, чтобы оптимизировать, насколько возможно, этот процесс. Не найдено другого опубликованного исследования, которое непосредственно сравнимо с данным исследованием. Этот вид данных оптимизации обычно собирали внутри промышленности, и они необязательно опубликованы.
Первые тесты на техническую осуществимость показали, что кассетные фильтры можно эффективно использовать для микро- и ультрафильтрации экстракта белка. Значительного снижения в потоке фильтрата не наблюдали ни во время стадии микрофильтрации, ни во время стадии ультрафильтрации, как показано на фиг. 12 и 14. Коэффициент объемной концентрации достигал величин 45 для микрофильтрации и 10 для ультрафильтрации. Кроме того, процентные значения баланса массы были удовлетворительными: 94% для микрофильтрации и 95-98% для ультрафильтрации. Если суммарная масса выделенного продукта является меньшей, чем исходная масса продукта, это обычно связано с потерями при адсорбции и/или растворимости в ходе обработки (МПНроте Согрогайои 2007). Однако способ анализа белка, использованный в данном исследовании, не является абсолютно точным.
Одна из задач данного исследования состояла в выборе соответствующего фильтра для ультрафильтрации. В тестах на техническую осуществимость использовали фильтры, обладающие открытой геометрией канала подачи (типа V). Для данного типа фильтров необходима относительно высокая скорость подачи, чтобы обеспечить достаточный поток. В связи с этим фактом и положительными результатами, полученными в тестах на техническую осуществимость, было идентифицировано два ультрафильтра, Вютах и иИтасе1. Оба фильтра обладают более узкими каналами подачи (типа Α). Вютах основан на композитной полиэфирсульфоновой мембране, тогда как Б11гасе1 представляет собой композитный материал из регенерированной целлюлозы. Регенерированную целлюлозу часто выбирают для биофармацевтических применений в связи с ее свойством низкой закупорки.
Сравнивали обе мембраны ультрафильтрации, и в ходе одиннадцати различных экспериментов по фильтрованию подвергали скринингу другие параметры процесса. Эти эксперименты были спланированы с использованием программного обеспечения МОЭЭЕ. На основании результатов фильтр и11гасе1. как оказалось, дает более короткое время фильтрования. Увеличение скорости подачи также сокращало время фильтрования. Неожиданно блокирование потока ретентата не проявляло значительного эффекта. Однако это, вероятно, связано с тем фактом, что штуцерный кран не мог достаточно блокировать поток, даже когда он был закрыт на 80%. Это значение было максимальным в данных экспериментах. Очевидно, что ограничение потока ретентата вызывает увеличение потока фильтрата вплоть до определенной точки. Эксперимент можно повторно спланировать, используя более высокое значение η и пропуская факторы, которые не оказывают влияния (например, температуру), для получения более точных результатов. Оба протестированных фильтра показали равные выходы белка, поэтому возможное более сильное закупоривание мембраны Вютах не является достаточно значимым, чтобы вызвать обнаружимую потерю белков.
Для экстракта костного белка критический поток 138 л/м2/ч был достигнут при ТМР 2,95 бар с использованием полиэфирсульфоновой мембраны с отсекаемым размером частиц 10 кДа типа С (Вютах, МППроге Сотротайоп). В случае мембраны фирмы МППроге с отсекаемым размером частиц 10 кДа из регенерированной целлюлозы, типа С (и13гасе1) соответствующие значения составляли 144 л/м2/ч и 2,6 бар, соответственно. В обоих случаях абсолютное критическое значение для потока не было достигнуто вследствие ограничений давления подачи. Для сравнения Вютах типа V давал критический поток
- 23 024470
108 л/м2/ч при ТМР 2,5 бар.
Как наблюдали во время исследований по оптимизации, ультрафильтры типа С обеспечивали более высокие потоки при более низких скоростях подачи по сравнению с фильтрами типа V. Фильтры типа А имеют самые узкие и наиболее способствующие турбулентности каналы подачи. Поэтому с этими фильтрами могут быть получены высокие или даже более высокие потоки по сравнению с фильтрами типа С (и типа V). Это означает, что такая же эффективность может быть достигнута, но при более низких скоростях подачи или более низких эксплуатационных расходах. Меньше энергии требуется для работы насоса, и, кроме того, уменьшается сдвиговое напряжение насоса по отношению к продукту. Такой же вид дополнительной оптимизации можно применить к микрофильтрации. В данном исследовании использовали только один тип микрофильтра (Вютах типа V с отсекаемым размером 1000 кДа).
Анализ эффективности протоколов очистки мембраны посредством мониторинга изменений ЫДОР показал некоторые различия между полиэфирсульфоновой мембраной (Вютах) и мембраной из регенерированной целлюлозы (ийгасе1). Стандартный протокол очистки с использованием 1 л 0,1 М гидроксида натрия при 7°С в течение 30 мин был достаточен, чтобы восстановить исходную ЫДОР. Такой же протокол использовали для мембраны Вютах, и он был способен восстановить 90% исходной ЫДОР в большинстве случаев (фиг. 16). ЫДОР±20% исходной в характерном случае приводит в результате к воспроизводимости процесса (МПБроге 2000). Однако в тех случаях, когда достаточная ЫДОР не была достигнута, была необходима очистка 0,3 М ЫаОН при 45°С в течение 45 мин, чтобы восстановить 80% исходной ЖДОР. Это позволяет предположить закупоривание мембраны. Для фильтра Вютах время от времени может требоваться очистка гипохлоритом.
Исследована эффективность очистки фильтров Вютах и И1!гасе1 после фильтрования раствора, содержащего 2-25% сывороточного альбумина человека (МПйроге Согрогайоп 2000). Было показано, что очистка 0,25 М ЫаОН при 40°С в течение 60 мин была достаточна для мембраны ийгасе1, чтобы вернуть значения ЫДОР к уровням, близким к исходным. Подобный эффект был получен для мембраны Вютах с использованием такого же раствора, усиленного 250%о гипохлорита натрия. После очистки должно быть проверено удаление хлора из мембраны, что требует дополнительной стадии анализа.
Вычисления для масштабирования процесса ультрафильтрации, хотя они не являются окончательными, дают понятие о том, как можно проводить масштабирование. Предполагаемый 1000-литровый процесс может быть завершен в течение четырех ч. Это связано с тем, что целесообразно высокие потоки были получены с обеими мембранами (Вютах и И1!гасе1) даже по сравнению с потоками, приведенными в литературе.
8. Выводы.
Было обнаружено, что кассетные фильтры пригодны для микро- и ультрафильтрации с тангенциальным потоком экстракта костного белка. Только один тип фильтра подвергали исследованиям микрофильтрации. Используемый фильтр представлял собой фильтр Вютах, в котором в качестве материала мембраны использован полиэфирсульфон. Значение отсекаемой молекулярной массы составляло 1000 кДа, и тип канала сетки представлял собой тип V. Был достигнут критический поток примерно 75 л/м2/ч. Эти результаты могут быть улучшены путем введения фильтра, обладающего более плотными каналами подачи, такого как тип С или А. Альтернативно, для применения при микрофильтрации можно также исследовать фильтры на основе регенерированной целлюлозы. Было обнаружено, что при ультрафильтрации регенерированная целлюлоза менее склонна к закупорке, чем полиэфирсульфон.
Ультрафильтрация была исследована с использованием трех фильтров, имеющих значение отсекаемой молекулярной массы 10 кДа. Они представляли собой фильтры Вютах, имеющий тип канала сетки V или С, и И1!гасе1 с каналом сетки типа С. Материалы мембраны представляли собой полиэфирсульфон и регенерированную целлюлозу, соответственно. Было обнаружено, что тип С дает лучшее отношение потока фильтрата к скорости подачи. Поэтому дополнительно сравнивали фильтры Вютах и ийгасе1 типа С. Полученный средний критический поток составлял 121 л/м2/ч для Вютах и 134 л/м2/ч для ийгасеБ Полученные потоки не являлись максимальными значениями для этих фильтров, поскольку поток возрастал линейно с трансмембранным давлением в обоих случаях, когда был достигнут предел давления подачи оборудования. Это предполагает дальнейшее тестирование фильтров типа А. Они не обязательно дают более высокие средние критические потоки по сравнению с фильтрами типа С, но эти потоки могут быть достигнуты при более низких скоростях подачи.
Различные параметры, оказывающие влияние на процесс ультрафильтрации, были систематически изучены с использованием программного обеспечения (МОИИЕ) для планирования и анализа экспериментов. Параметрами, исследованными в отношении продолжительности каждого фильтрования и выхода, были температура, скорость подачи (частота вращения насоса), блокирование потока ретентата и мембрана. Значительных различий в выходе не наблюдали. Мембрана ИЙгасе1 давала более высокую скорость фильтрования по сравнению с фильтром Вютах. Увеличенная скорость подачи обладала подобным эффектом, как ожидали. Эксперимент планировали и оценивали способом, который не учитывает взаимодействия между параметрами. Для того чтобы полностью исследовать возможные взаимодействия, была бы необходима серия большего числа экспериментов.
- 24 024470
Между полиэфирсульфоновой мембраной (Вютах) и мембраной из регенерированной целлюлозы (И11гасе1) наблюдали различия в очистке. Результаты очистки оценивали путем сравнения значений ЖУР. Мембрана иИгасе1 эффективно очищалась путем использования 0,1 М ЖаОН в течение 30 мин при 37°С. Во многих случаях мембраны Вютах требовали очистки с использованием 0,3 М ЖаОН в течение 45 мин при 45°С. На основании литературных данных известно, что полиэфирсульфон более склонен к закупорке, чем регенерированная целлюлоза. Этот предмет можно систематически исследовать с использованием МОЭЭЕ. Использование хлора в качестве добавки для очистки полиэфирсульфоновых мембран является одним из путей улучшения результатов. Оно может сократить продолжительность очистки, а также дает возможность использовать более низкую температуру. Эти усовершенствования непосредственно влияют на экономичность процесса. Может быть протестирована даже очистка при комнатной температуре.
В данном исследовании использовали фильтры РеШсоп-2®, изготавливаемые фирмой МбЬроге Сотротайоп. Было бы возможно использовать и тестировать фильтры других изготовителей, если бы они обладали идентичными наружными размерами. Однако никакие данные, полученные в данном исследовании, не будут применимы к другим фильтрам. Внутренняя геометрия фильтров, мембрана и диапазон значений отсекаемой молекулярной массы различаются между изготовителями. Результаты, рекомендации и вычисления для масштабирования процесса, таким образом, действительны только для конкретных фильтров, оцененных в данном исследовании.
9. Краткое изложение.
Цель данной работы состояла в том, чтобы исследовать кассетное фильтрование с тангенциальным потоком экстракта костного белка. После дальнейшей обработки эти белки можно применять в ортопедических имплантатах для улучшения роста кости. Фильтрование с тангенциальным потоком уже длительное время применяют в различных промышленных областях применения. В биофармацевтических областях применения часто предпочитают кассетные фильтры в связи с их линейной масштабируемостью, высоким выходом и воспроизводимостью изготовления от партии к партии.
В теоретической части данного исследования были освоены различные конструкции фильтрационного оборудования, различные типы мембран и их свойства. Кассетная ультрафильтрация и ее использование в биофармацевтических областях применения было основным центром внимания данного исследования. Оно также относилось к закупорке, очистке и дезинфекции мембран.
Экспериментальная часть исследования состояла в различных экспериментах по фильтрованию, оценке эффективности очистки и проведении вычислений масштабирования процесса. Сначала экстракт фильтровали через кассету, имеющую отсекаемое значение молекулярной массы 1000 кДа. Эту стадию рассматривали как микрофильтрацию, хотя формат мембраны является таким же, как в ультрафильтре. Очень открытый размер пор, однако примерно приближен к нижней границе диапазона микрофильтрации (0,1 мкм). Протокол оптимизации параметров для открытой мембраны является таким же, как для микрофильтров. Затем пермеат микрофильтрации подвергали ультрафильтрации через кассету, имеющую отсекаемое значение 10 кДа. Параметры, влияющие на фильтрации, были тщательно исследованы и оптимизированы.
Две марки фильтров, исследованных для ультрафильтрации, представляли собой Вютах и и11тасе1. Вютах состоит из полиэфирсульфонового материала мембраны, тогда как мембрана и11тасе1 состоит из регенерированной целлюлозы.
Фильтр Вютах проявлял несколько большую закупорку, чем фильтр и11тасе1, однако, для него также требовались более жесткие условия очистки. В результате закупорки ийгасе1 давал несколько более высокие потоки и, следовательно, является лучшим выбором фильтра для конечного процесса. Абсолютные критические потоки фильтрата не могли быть достигнуты ни в одном из двух случаев. Необходимы дальнейшие исследования с использованием фильтров с более плотными каналами подачи как для микро-, так и для ультрафильтрации. Тогда при меньших давлениях могли бы быть достигнуты более высокие потоки фильтрата, что значительно улучшает экономичность процесса.
Вычисления для масштабированного процесса были основаны на 1000-литровом объеме партии и УСР 5. Для протестированных ультрафильтров процесс может быть завершен в течение 4 ч при использовании 2 м2 суммарной площади фильтра со стоимостью примерно 9000 €. Такие же фильтры можно часто использовать в течение нескольких лет. Таким образом, стоимость мембраны на партию является умеренной. Микрофильтрация не была оптимизирована так тщательно, как ультрафильтрация. Поэтому вычисления по масштабированию не проводили. Однако на основании уже полученных результатов общая стоимость стадии микрофильтрации должна находиться примерно в таком же диапазоне, как стоимости ультрафильтрации.
Ниже приведен экспериментальный протокол для экстракции кости северного оленя. Различные описанные стадии можно применять к другим подобным протоколам по отдельности. Примеры таких протоколов также раскрыты на фиг. 17 и 18. На фиг. 19 и 20 показаны электрофорезы в δΌδ-РАСЕ нативных экстрактов, деминерализованных с использованием либо муравьиной кислоты, либо НС1.
- 25 024470
1. Очистка и измельчение сырой кости до костных гранул (все стадии отмывки проводили при температуре менее 10°С).
1.1. Кости, которые хранили при -20°С, взвешивают и эпифизарные концы костей отрезают и отбрасывают. Наружную поверхность промывают водой при высоком давлении.
1.2. Кости режут медицинской пилой до длин примерно 10 см и внутренние поверхности промывают водой при высоком давлении. Промывку осуществляют с целью удаления костного мозга и мягких тканей.
1.3. После промывки очищенные кортикальные слои костей замораживают в жидком азоте в течение примерно 20 мин, а затем измельчают до размера частиц 1,0 мм3, используя режущую мельницу Неауу-Эи1у Сийпд МШ δΜ 2000 (Ре1ксН ОтЬН, Наап, Оегтапу).
1.4. Костные гранулы хранят при -20°С.
1.5. Берут образец из каждой измельчаемой партии для последующего подсчета общего числа жизнеспособных аэробных микроорганизмов (1о1а1 \заЫе аегоЫс соип1, ^Α^).
2. Деминерализация костных гранул.
2.1. Примерно 30 кг костных гранул промывают три раза в холодной воде из обратного осмоса (ОО) (менее 10°С) при времени перемешивания примерно 5 мин на промывку. Затем костные гранулы деминерализуют за три стадии разбавленной 0,6 М НС1.
2.2. На первой стадии деминерализации к промытым костным гранулам добавляют примерно 120 кг воды 00 и примерно 40 кг 2,4 М соляной кислоты (НС1) до достижения концентрации НС1 0,6 М. Скорость подачи НС1 составляет примерно 2,4 л/мин. Перемешивание осуществляют в контейнере, изготовленном по заказу, с охлаждением (ΒΒδ Оу, Вюепдшеегшд) и непрерывно перемешивают. Температуру для этой стадии и всех последующих стадий добавления НС1 поддерживают ниже 10°С. Мониторинг рН и температуры осуществляют непрерывно.
2.3. После завершения подачи НС1 и дополнительно еще 15 мин перемешивания мешалку останавливают и костным гранулам дают возможность осесть в течение 20 мин. Водную смесь после деминерализации удаляют перистальтическим насосом и отбрасывают как отходы.
2.4. Вторую деминерализацию проводят идентично первой стадии деминерализации.
2.5. Третью стадию деминерализации проводят путем добавления 120 кг воды к смеси костных гранул, а затем добавления примерно 20 кг 2,4 М НС1 за период 1 ч. Перемешивание продолжают в течение примерно 16 ч до тех пор, пока рН остается постоянным от 2,8 до 3,0 в течение по меньшей мере 2 ч. Затем водную смесь после деминерализации удаляют перистальтическим насосом и отбрасывают как отходы.
2.6. Деминерализованную кость промывают пять раз примерно 60 кг воды 00 в течение 15 мин. рН воды при последней стадии промывки должен составлять от 2,4 до 2,6.
3. Экстракция костного матрикса гуанидингидрохлоридом (ОиНС1)
3.1. Примерно 100 кг 4 М ОиНС1 (ОиНС1, Ν10υ СНепие ОтЬН) добавляют к деминерализованной кости и перемешивают в течение 22 ч с целью экстракции костного белка. Деминерализованным и экстрагированным костным гранулам дают возможность осесть в течение 20 мин, после чего экстракт белка ОиНС1 собирают в качестве продукта рН и температуру измеряют непрерывно.
3.2. Вторую экстракцию проводят таким же способом путем добавления примерно 100 кг 4 М ОиНС1 к экстрагированной кости и путем перемешивания в течение 22 ч. Полученный экстракт белка ОиНС1 объединяют с первым экстрактом. Измеряют рН, и он должен составлять от рН 3,9 до 4,5.
3.3. Концентрацию суммарного белка экстракта белка ОиНС1 определяют методом Бредфорда как после первой, так и после второй экстракции, и она должна составлять примерно 56 мг/мл±10%.
4. Центрифугирование для удаления твердой фазы и гелевых компонентов
4.1. Экстракт белка ОиНС1 поддерживают при температуре ниже 10°С при непрерывном перемешивании в течение 24 ч, после чего его осветляют, используя центрифугирование с непрерывным потоком (СЕРА 2ейпГиде Ζ 41). Отделенный материал отбрасывают как отходы.
5. Фильтрование.
5.1. Полученный экстракт белка ОиНС1 фильтруют, используя капсульные фильтры однократного применения (капсула 20 м2 δΤΑΧ со средой ΕΚδΡ, Ρа11 ЬгГе δ^ΐ'^) или альтернативно используя 2 мкм МФ-фильтрацию (ТеШсоп, Μ^11^рο^е СогрогаНоп).
5.2. Профильтрованный экстракт белка ОиНС1 концентрируют с помощью УФ-фильтрации при температуре ниже 10°С, используя кассетные фильтры 10 кДа (Ρе11^сοη. Μ^11^рο^е СогрогаНоп).
5.3. По окончании стадии УФ-фильтрации примерно 26 кг УФ-концентрата собирают и хранят при температуре ниже 10°С. УФ-пермеат отбрасывают как отходы.
6. Водный диализ.
6.1. Водный диализ осуществляют, используя изготовленное по заказу оборудование для диализа (ΒΒδ Оу/Вюеп§шеегш§), содержащее 10 трубчатых диализных мембран. Диализные мембраны (Ьрес1га/Рог О1а1у515 ΜетЬ^аηе, 34 мл/см, Μ\νί'Ό: 12-14,000 δресΐтт) обрабатывают дистиллированной водой в течение 20 мин перед сборкой.
- 26 024470
6.2. Диализные мембраны заполняют концентрированным экстрактом белка СиНС1 через асептические мембраны, примерно 3 л на мембрану.
6.3. Установки параметров для водного диализа представляют собой: 10 продолжительность 47 ч, температура ниже 10°С, количество перекачиваемой воды ОО 16 л/ч. Проводимость с внутренней стороны мембраны измеряют непрерывно с конечной проводимостью 2,2-3,5 мСм/см. Нерастворимый в воде осадок тонет на дне мембраны во время диализа.
6.4. Осадок и водную фазу центрифугируют при температуре ниже 10°С (СЕРА ΖοηΙπΓιίβο СЬЕ) и осадок собирают в качестве влажного экстракта. Количество влажного экстракта составляет примерно 160 г.
7. Повторное растворение и фильтрование перед цитратным диализом.
7.1. Влажный экстракт повторно растворяют в 4 М СиНС1 и перемешивают магнитной мешалкой в течение 16-20 ч. Измеряют рН и проводимость. Проводимость доводят до 230 мСм/см 6 М фильтрованным СиНС1. Температура во время перемешивания ниже 10°С.
7.2. Повторно растворенный экстракт фильтруют в вакууме через дисковые фильтры 0,45 мкм (СИ-6 стерильный, РАТЬ) и 0,2 мкм (§ирог 200, стерильный, РАТЬ).
8. Цитратный диализ.
8.1. Цитратный диализ осуществляют, используя изготовленное по заказу оборудование для диализа (ВВ§ Оу/Вюеидшеегтд).
8.2. Диализную мембрану (4 §рес!га/Рог Όίαίνδίδ МетЬгаие, 18 мл/см, М\УСО: 12-14000, §рес!гит) обрабатывают 0,25 М цитратным буфером (рН 3,1) в течение 20 мин перед сборкой.
8.3. Установки параметров для диализа представляют собой: 47 ч, 9°С, 200 кг 0,25 М цитратного буфера, производительность насоса 1,6 л/ч. Проводимость с внутренней стороны мембраны измеряют непрерывно. Конечная проводимость обычно составляет 9,5-10 мСм/см.
8.4. Материал, нерастворимый в цитратном буфере, центрифугируют (цилиндрический ротор) при температуре ниже 10°С.
8.5. Чистый цитратный буфер декантируют в отходы, и осадок сохраняют.
9. Промывание и лиофилизация осадка.
9.1. Осадок промывают три раза водой для инъекций. Между промывками воду удаляют центрифугированием.
9.2. Промытый осадок взвешивают и отбирают образцы для анализа. Количество осадка составляет примерно 80 г с допустимым содержанием сухого вещества 36%.
9.3. К осадку добавляют наполнители (полисорбат 20, трегалозу, глицин, маннит) в качестве лиопротекторов, а затем заполняют в лотки для лиофилизации (Ьуодиагй).
9.4. Сушку вымораживанием (лиофилизацию) проводят при -20°С в лиофилизаторе (СНгМ НР8П.ОХ 2- 10Ό Ь8С).
Таблица 14
Белки в нативном экстракте, деминерализованном НС1
Секвенированные белки в нативном экстракте Определение Функция
Тромбин Белок свертывания крови Стимуляция резорбции кости
Виментин Филаментный белок клетки Стабилизация цитоскелета
Витронектин Гликопротеин во внеклеточном матриксе Стимулирует клеточную адгезию и диффузию, ингибирует эффекты, повреждающие мембрану
Секретируемый фосфопротеин 2, 24 кДа (8рр24) Белок костного матрикса, содержит домен гомологии рецептора II ΤΘΡβ (ΤΚΗ1) Остеоиндуктивный продукт распада (18,5 кДа)
Остео не ктин Кальций-связывающий гликопротеин Инициирует минерализацию, ремоделирование кости
- 27 024470
Тромбоспондин Белки внеклеточного матрикса в кости Связывающие/активирующие факторы роста, регенерация кости
Лизилоксидаза Внеклеточный медьсодержащий фермент Синтез коллагена и эластина (сшивание)
Хондроад герин Матриксный белок хряща Опосредует адгезию хондроцитов, связывается с коллагеном
Бигликан Протеогликан с богатыми лейцином повторами (5ШР) Ремоделирование и минерализация кости, действует вместе с ТСЗР-β и ВМР-4
Дерматопонтин (22К белок внеклеточного матрикса) Белок внеклеточного матрикса с протеогликаном Регулирует взаимодействие ΤΟΕ-β и декорина, вовлечен в организацию коллагенового матрикса, стимулирует минерализацию кости и ингибирует эффекты ВМР-2 на предшественники остеобластов
Матриксный С1абелок Кальций- связывающий белок внеклеточного матрикса Ингибирует кальцинирование внеклеточного матрикса в артериях и эпифизарной ростовой пластинке, регуляторный белок для ВМР-2
Коллаген типа 1 Фибриллярный структурный белок Репарирует поврехздение ткани, обеспечивает прочность, целостность и структуру
Трансформирующий фактор роста бета 1(тер-р 1) Изоформа фактора роста ΤΟΕβ; синтезируется скелетными клетками Ремоделирование кости, контролирует пролиферацию и клеточную дифференциацию
Ламин А/С (Ι_ΜΝΑ) Белки ядерной пластинки Формирует ядерную пластинку, фактор, необходимый для дифференциации остеобластов
Витрин Белок внеклеточного матрикса Стабилизирует внеклеточный матрикс
РЕОР, фактор пигментного эпителия Внеклеточный гликопротеин Регуляция образования хряща, кости и ангиогенеза
Оценка различных солей кальция в качестве каркасов для экстракта костного белка в заменителях костной ткани.
1. Введение.
Нативная кость содержит факторы роста и дифференциации и сигнальные молекулы, такие как костные морфогенетические белки (ВМР), которые важны для регенерации кости и хряща. Эти факторы и молекулы и их конкретные концентрации требуются для различных фаз всего процесса заживления перелома. Таким образом, в качестве лечения перелома кости для добавленного экстракта костного белка требуется подходящая система доставки или носитель, чтобы предотвратить миграцию из сайта применения, с постепенным высвобождением, что приводит в результате к образованию новой кости.
Оптимальная матрица носителя должна удовлетворять нескольким критериям. Матрица должна быть биосовместимой, биорассасываемой, пластичной и стерилизуемой. Неорганические вещества удовлетворяют этим требованиям, поскольку большинство из них является структурно прочными, иммунологически инертными, высоко остеокондуктивными и вариабельно биоразлагаемыми. Соли кальция в качестве неорганических материалов годами используют в различных вариантах, поскольку композиция этого материала близка к природной композиции кости.
Показано, что трикальцийфосфат (ТКФ) является полезным носителем для рекомбинантных ВМР (гЬВМР) человека и деминерализованного костного матрикса (ЭВМ). ТКФ обладает многими положительными признаками для применения в имплантатах ίη νίνο, такими как скорости резорбции, близко соответствующие нормальному ремоделированию губчатой кости, и может связываться непосредственно с костью и обладает, прежде всего, остеокондуктивной природой. ТКФ также обладает большей растворимостью, чем гидроксиапатит (ГАП). ГАП является относительно остеокондуктивным и обладает высокой способностью к связыванию белка. Непрерывная структура строения ГАП обеспечивает гибкость для достижения высокой пористости и высокой площади поверхности, что делает ГАП хорошим кандидатом для каркасов. Однако ГАП часто комбинируют с ТКФ с образованием более резорбируемого и пористого носителя с большей степенью костеобразования. Данная комбинация фосфатов кальция также использована в качестве носителя для гЬВМР и ЭВМ. Кальция сульфат исследовался в качестве заполнителя пустот кости в течение более ста лет, и обладает множеством функций как часть композитного ма- 28 024470 териала костного трансплантата. Кальция сульфат действует в качестве связующего вещества для улучшения общего контакта с костью и объемом, окружающим имплантат. Размер пор важен для прорастания внутрь кости, и увеличение размера пор улучшает воздействие на заживление кости неорганических материалов, таких как сульфаты кальция. Кальция сульфат использовался в качестве носителя для ΌΒΜ в течение ряда лет, и в клинических исследованиях показана его отличная биосовместимость.
Смесь костных морфогенетических белков (ΒΜΡ), факторов роста и других костных белков экстрагирована из костных материалов различных видов животных, людей и костных опухолей. В предшествующих работах продемонстрировано, что экстракт костного белка северного оленя является эффективным стимулятором образования новой кости в мышиной модели мышечного кармана. Кроме того, хорошая заживляющая способность костного экстракта северного оленя в сегментарном дефекте кости ранее продемонстрирована у кролика и крысы. Способность костного экстракта северного оленя к заживлению различных травм кости является лучшей, чем для других экстрактов, например бычьего экстракта или экстракта страуса, что объясняется тем фактом, что северные олени обновляют рога ежегодно. Кроме того, предположили, что большее количество белкового материала, экстрагированного из кости северного оленя, находится в однокомпонентной форме по сравнению с другими видами, такими как крупный рогатый скот, овцы и свиньи. Экстракт костного белка северного оленя подобен по составу, способу изготовления и предназначенному использованию и применению другим экстрактам костной ткани животного происхождения. Близко сравнимыми препаратами являются Со11окк® и Со11окк® Ε, которые представляют собой деминерализованные костные экстракты, полученные из костей крупного рогатого скота и лошадей, и препараты деминерализованного костного матрикса (ΌΒΜ), такие как Ок1еоке1® ΌΒΜ Ре11е1к.
Данное исследование спланировано как оценка ίη У1уо неорганических компонентов каркаса, которые объединяют с костным экстрактом северного оленя в гетеротопической мышиной модели индуцированной эктопической минерализации мышечного кармана мыши. Для того чтобы определить ответы имплантата и потенциальное образование эктопической новой костной ткани через три недели после имплантации, использовали гистологические и радиографические оценки.
2. Материалы и методы.
2.1. Экстракт костного белка.
Экстракт костного белка был экстрагирован и очищен из диафизарной кости северного оленя (Логйкка Ь., Μ;·ιΠΐίη;η А., Ыпй1ю1т Τ.δ. Рагйа11у рштйей гешйеег (КапдГег Тагапйик) Ьопе тогрйодепейс рго1е1п Бак а ЫдЬ Ьопе-Гогттд асйуйу сотрагей χνίΐΗ коте оШег агйойасй'Пк. С1ш ОйЬор Ке1а! Кек. 1993; 297: 33-7). Полученный экстракт костного белка был лиофилизирован при -20° с использованием наполнителей (сурфактанта (полисорбата 20, Ρ1ιιΙ<;ι, Ендта-АИпсБ). лиопротектора (О-(+)-трегалозы дигидрата, Ника. 81дта-А1йпсЬ), объемообразующего агента (агента-наполнителя) (глицина, К|ейе1-йе Наёп, 5ндта-А1йпс11) и буфера (Ό-маннита, Ρ1ιιΙ<;ι, 5ндта-А1йпс1й).
Профиль белков и биологическую активность экстракта костного белка оценивали, используя электрофорез в δΌδ-ΡΑΟΕ и исследования модели мышечного кармана мыши (фиг. 22).
2.2. Материалы каркаса и группы исследования.
Используемые материалы каркаса и группы исследования представляли собой а) пористые диски размером 5x3 мм (Вегке1еу Айуапсей ВютакпаК 1пс, И8А) композиции 30% гидроксиапатита (ГАП), 60% трикальцийфосфата (ТКФ) и 10% кальция сульфата (КС); Ь) пористые диски Сет-Ок1ейс (Вегке1еу Айуапсей В1ота1епа1 1пс., И8А) размером 5x3 мм композиции 90% ТКФ и 10% КС; с) порошок для мастики Сет-Ок1ейс® (Вегке1еу Айуапсей В1ота1епа1 1пс., И8А); ά) порошок для мастики КС полугидрат (97%, 81дта-А1йпсЬ); е) непористые диски (Вегке1еу Айуапсей В1ота1епа1к 1пс, И8А) композиции 60% ГАП, 30% ТКФ и 10% КС; и Г) гранулы КС дигидрата со стеариновой кислотой композиции: стеариновая кислота 50, смесь жирных кислот, которая состояла в основном из стеариновой кислоты и 40-60% пальмитиновой кислоты (Лика, Ендта-АИпсБ).
2.3. Образец препарата.
Лиофилизированный костный экстракт северного оленя (3 мг, ВВ8-Вюасйуе Вопе ЗиЬкййЛек Ый, Нпктй) восстанавливали в 0,9% физиологическом растворе (КайтитсЫопй, Бадгоп, Татго, Нп1апй) и пропитывали им пористые диски (а, Ь) и непористый диск (е) или смешивали с порошком Сет-Ок1ейс (с) и КС полугидратом (й) с образованием формованного диска, либо смешивали в сухом виде с гранулами КС дигидрата и стеариновой кислоты (Г) с образованием прессованного диска.
Правую лапу использовали в качестве контроля с содержанием соответствующего носителя и наполнителей, но исключая костный экстракт.
2.4. Животные.
Использовали суммарно 48 мышей линии ВАЬВ/с. Животные были получены из Центра лабораторных животных университета Оулу. Возраст животных составлял 7-12 недель в момент операции. План исследования включал 6 групп по 8 животных на группу.
Одна мышь из группы Ь погибла в течение суток операции без какой-либо видимой причины. Одна мышь из группы с погибла в течение суток операции в связи с проблемами дыхания. Кроме того, две
- 29 024470 мыши из группы 6 и одна мышь из группы £ были умерщвлены через двое суток после операции, поскольку испытывали затруднения при ходьбе. Таким образом, 43 мыши выжили до конца исследования.
2.5. Хирургическая операция.
Операцию проводили под общей анестезией смесью фентанилцитрата (80 мкг/кг) - флуанизона (2,5 мг/кг) (Нуриогт®, 1апк5еп РНагтасеибса, 1пс., Веегке, Ве1дшт) и мидазолама (1,25 мг/кг) (Όοηηίαιιη®. КосНе, Ваке1, 3\уЦ/ег1ап6). Обе лапы очищали и глаза животных обрабатывали глазным гелем для предотвращения высыхания. Мышь помещали на термический матрац на время операции. Поперечные кожные разрезы делали вблизи спины на стороне бедра. Затем имплантаты вводили в оба кармана бедренных мышц в билатеральные задние лапы. После имплантации мышцы закрывали двумя швами и кожу закрывали одним швом.
Обезболивающее лекарственное средство после операции состояло из бупренорфина (Тетдекю®, КескШ & Со1тап РНагтасеиНса1к, 1пс, КгсНтопб, Епд1ап6) в дозе 0,01-0,05 мг/кг подкожно. Животным предоставляли возможность полной активности в их клетках после операции. Всех животных подвергали эвтаназии через 21 суток после операции, и собирали задние лапы.
Протокол исследования был одобрен Институциональным комитетом по экспериментам на животных и этическим комитетом.
2.6. Радиографическая оценка костеобразования.
Для оценки образования новой кости и резорбции имплантата использовали радиографическую оценку (20 кВ, 8,00 мАс, 0,32 с/эксп., Матех 6с® ат1, Опоп Ы6., Зогебех). Образование новой кости и резорбцию имплантата оценивали путем измерения опалесцентной площади в мм2 (программное обеспечение Окшк 4.19 01дИа1 1тадшд ИпН, Сепеуа).
2.7. Гистологическое исследование.
Для гистологии готовили два образца из каждой группы. Образцы фиксировали в 10% нейтрально забуференном формалине, декальцинировали в растворе ЭДТА-формалин (рН 7), обрабатывали в гистопроцессоре и, наконец, заключали в парафин. Затем получали срезы толщиной 4,5 мкм, используя микротом, и окрашивали гематоксилином-эозином. Качество новой кости и воспалительный ответ в сайте дефекта оценивали с помощью гистологического анализа, используя световую микроскопию (№коп ЕсНрке, Е200, 1арап).
2.8. Статистический анализ.
Статистический анализ проводили, используя статистический пакет программ 3Р33 для \Ут6о\У5 (3Р33 1пс., уегкюп 15.0). Непараметрический критерий Крускала-Уоллиса использовали для оценки статистических различий между группами. Критерий Манна-Уитни использовали для попарного сравнения между активной и контрольной группами. Значения р менее 0,05 считали статистически значимыми. Результаты радиографической оценки приведены в виде средних и стандартных отклонений. Различия между активными имплантатами и контролями представлены в виде процентных значений.
3. Результаты.
Для группы а радиографическая оценка дисков гидроксиапатит -трикальцийфосфат - кальция сульфат (ГАП:ТКФ:КС 30:60:10) показала некоторое костеобразование снаружи активных имплантатов; однако контрольные имплантаты оставались интактными (табл. 15, фиг. 23А). Площадь измерения была значимо выше для активных имплантатов по сравнению с контролями (р менее 0,01). Анализ отобранных образцов показал, что данное новообразование было подобно кости. Гистологическая оценка продемонстрировала, что эндохондриальное костеобразование происходит в активном образце и отсутствует в контрольном образце (фиг. 23А, 23В).
Для группы Ь (ТКФ:КС 90:10) радиографическая оценка выявила некоторое костеобразование снаружи активных имплантатов; однако контрольные имплантаты были почти интактными и отсутствовали статистически значимые различия между активными имплантатами и контролями (табл. 15). Визуальный осмотр во время отбора образцов также показал костеподобные образования. Гистологическая оценка показала эндохондриальное костеобразование в активном образце и его отсутствие в контрольном образце.
Для группы с (Сет-Ок1еНс) радиографический анализ не выявил нового видимого костеобразования; однако площадь измерения была больше в активной группе, чем в контрольной группе (р менее 0,01) (табл. 15). Отбор образцов и гистологический анализ подтвердил, что новая кость в образцах не обнаружена.
Для группы 6 (диски сульфата кальция полугидрата) радиографический анализ выявил некоторое новое костеобразование, и между активной и контрольной группами были очевидны значимые различия (р менее 0,01) (контрольная группа видимо резорбирована) (табл. 15, фиг. 24В). Однако отбор образцов и гистологический анализ подтвердил, что новая кость в образцах не обнаружена (фиг. 23С, 22Ό).
Для группы е (ГАП/ТКФ/КС 60:30:10) радиографическая оценка показала некоторое костеобразование снаружи имплантата на активной стороне и некоторое в контрольных имплантатах (табл. 15). Кроме того, активная группа имела большую площадь измерения, чем контрольная группа (р=0,001). Анализ отобранных образцов показал, что это новообразование было подобно кости. Гистологическая оценка
- 30 024470 выявила эндохондриальное костеобразование и зрелые хрящевые клетки в активном образце; однако ни одно из этого не было обнаружено в контрольном образце.
Для группы ί (кальция сульфат дигидрат - стеариновая кислота) радиографический анализ и анализ образцов выявил новое костеобразование в группе активного имплантата (табл. 15, фиг. 24С). Различие между активными имплантатами и контролями было статистически значимым (р менее 0,01). Гистологический анализ также выявил явное костеобразование и зрелые и кальцинированные хрящевые клетки в активном образце (фиг. 24Р). В контрольном образце визуально костеобразования не было видно (фиг. 23Е и 23Р).
Сравнение между всеми активными группами выявило, что группа ί имела самую большую площадь измерения, как определено с помощью радиологического анализа (р менее 0,05). Кроме того, группы с и й имели значимо большие площади, чем группы а, Ь и е (р менее 0,01). Также было статистически значимое различие между активными группами а и е (р менее 0,05).
4. Обсуждение.
Основная задача данного исследования состояла в том, чтобы найти подходящий неорганический носитель-кандидат для экстракта костного белка северного оленя. Шесть различных кандидатов, включая четыре различных сырьевых материала, было выбрано для оценки костеобразования и резорбции имплантата в мышиной модели кармана с оценкой через три недели наблюдения. В частности, смесь сульфат кальция - стеариновая кислота была обнадеживающим носителем-кандидатом для экстракта костного белка северного оленя.
Экстракт костного белка северного оленя обладает высокой костеобразующей активностью, как видно из тестов биологической активности и вышеописанных тестов (фиг. 22); однако в реальной ситуации заживления кости этот экстракт не может действовать без каркасной системы. Ограничения выбора носителя устанавливаются характеристиками экстракта костного белка северного оленя. Основное ограничение состоит в том, что этот экстракт не является водорастворимым. Следовательно, существует по меньшей мере три различные возможности для получения имплантата. Первая состоит в том, что препаратом в виде суспензии костного экстракта можно пропитывать пористую матрицу. Вторым способом является совместное плавление экстракта и носителя с образованием мастики или прессование их в диски, и при третьем способе поверхность дисков или гранул носителя покрывают костным экстрактом. Чистый коллаген протестирован в качестве носителя в некоторых из предшествующих исследований авторов изобретения. Лиофилизированный экстракт перемешивали в воде, а затем переносили пипеткой на коллагеновую губку; альтернативно, коллагеновую губку замачивали в воде, а затем заворачивали с экстрактом с формированием имплантата. Результаты этого способа показали хорошее костеобразование в мышиной модели кармана и в модели сегментарного дефекта; однако, оказалось, что коллаген не поддерживает функциональность костеобразующих свойств в течение необходимого времени. Поэтому неорганическая альтернатива обеспечила бы лучший каркас для поддержания действия экстракта при заживлении кости. Ранее авторы изобретения тестировали комбинации ТКФ, ГАП и коралла вместе с экстрактом и коллагеновой губкой в мышиной модели. Кроме того, было обнаружено, что биокерамика является приемлемой альтернативой носителя, что протестировано в модели дефекта крысы.
Данное исследование было предназначено для того, чтобы найти альтернативы для выбора носителя, учитывая при этом абсорбцию костного экстракта и характеристики размера пор носителя. С наполнителями лиофилизированный экстракт был абсорбирован в порах группы ТКФ:КС 90:10, частично покрывал поверхность и частично был абсорбирован в группе ГАП:ТКФ:КС 30:60:10. Кроме того, поверхностное покрытие использовали в группе ГАП/ТКФ/КС 60:30:10. Лиофилизированный экстракт костного белка северного оленя смешивали в материале носителя групп КСП (кальция сульфат полугидрат) и ί',οιη-Οδ^Ιχ и перемешивали в сухом виде без ресуспендирования лиофилизированного экстракта в группе КСД (кальция сульфат дигидрат) - стеариновая кислота. Поскольку комбинация лиофилизированного препарата и носителя отличалась для каждой группы исследования, распределение и доступность экстракта также были различными для каждой группы; следовательно, статистические сравнения между группами носителя некорректны. Для определения активности имплантатов в данном исследовании использовали нативный рентгенографический метод; однако данный метод не может показать костеобразование внутри остатков имплантата. Метод микротомографической визуализации может дать более подробную информацию о росте кости и резорбции носителя в будущих исследованиях. Однако новое костеобразование было четко видно при гистологическом анализе, выполненном для данного исследования.
Все группы с экстрактом выглядели лучше, чем контрольные группы без костного экстракта. Самое большое количество костеобразования было обнаружено в группах, в которых костный экстракт был легко доступен, что указывает на то, что костеобразующие факторы требуются в достаточных концентрациях на ранней стадии. Это было видно, в частности, в группах ГАП/ТКФ/КС 60:30:10 и КСД - стеариновая кислота. В группах ТКФ/КС 90:10, мастики Сет-Ο8ΐеΐ^с и КСП наблюдали различия между активными имплантатами и контролями, и имплантаты функционировали в качестве имплантата с покрытием смесью костных белков. Самое малое количество костеобразования было обнаружено в группе ГАП/ТКФ/КС 30:60:10, что указывает на то, что костный экстракт глубоко абсорбировался в каркасе в
- 31 024470 процессе получения имплантата, и высвобождающееся количество костных белков было слишком низким, чтобы индуцировать костеобразование. Эти результаты подтверждают результаты предшествующих исследований, которые показали, что образование новой кости зависит от соотношения содержания в керамике ГАП/ТКФ и высокой дозы костных белков. Кроме того, данное исследование подтверждает, что присутствие биоактивных компонентов уменьшает образование фиброзной ткани и увеличенное костеобразование вокруг неорганических каркасов. Однако количество и доступность костных белков должны находиться в равновесии с каскадом заживления и образования кости.
Препараты ΌΒΜ являются сравнимыми с экстрактом костного белка северного оленя. Сравнимое количество имеющегося в продаже препарата ΌΒΜ также протестировано в модели мышечного кармана, но никаких признаков костеобразования не было видно ни рентгенографическим, ни гистологическим путем в течение 21 суток (данные не представлены). Это указывает на то, что белки в костном экстракте северного оленя являются более специфичными для стимулирования роста (индукции) новой кости и костеобразующая способность экстрагированных белков костей северного оленя является значительно лучшей по сравнению с ΌΒΜ.
Известно, что присутствие костных клеток является существенным для распада материала сульфата кальция. В идеале костеобразование и разложение каркаса следуют друг за другом до тех пор, пока область дефекта полностью не замещается новой костью. Если костеобразование является недостаточным для придания механической прочности, каркасный материал должен разлагаться медленно, чтобы предотвратить воздействие характеристик каркаса. В данном исследовании также выявлено, что стеариновая кислота оказала положительное влияние на усиление врастания и образования кости в окружении носителя кальция сульфата. Стеариновую кислоту широко применяют в качестве наполнителя при изготовлении таблеток, поскольку добавление стеариновой кислоты уменьшает вязкость керамической суспензии, при этом увеличивая микроструктурную однородность упаковки частиц. Стеариновую кислоту также используют как часть гипсовых моделей. Кислоту распыляют на поверхность формы для отливки, которую отделяют после отливки. Затем стеариновая кислота взаимодействует с кальцием в гипсовом слепке с образованием тонкого слоя стеарата кальция, который функционирует в качестве высвобождающего агента. Фирма ХУгфЫ МеФса1 ТесЬпо1о§у 1пс. использовала стеариновую кислоту в качестве добавки для таблеток в своих изделиях из кальция сульфата, таких как О51ео5е1®. и зарегистрирована хорошая способность к заживлению кости, как обнаружено в предшествующей работе авторов изобретения. Таким образом, вывод состоит в том, что стеарат кальция не только обладает вспомогательными свойствами для таблеток, но также поддерживает костеобразование, подобно карбоксиметилцеллюлозе.
В заключение, самое большое количество костеобразования встречалось в группах, в которых костный экстракт был легко доступен вблизи поверхности имплантата. Комбинация ТКФ или КС и стеариновой кислоты оказалась самой идеальной альтернативой носителя для костного экстракта северного оленя. Также предположили, что препарат материалов носителя в виде гранул или в инъекционной форме должен увеличить костеобразующую эффективность. Данная гипотеза будет проверена в дальнейших исследованиях.
Таблица 15
Радиографический анализ активного имплантата, содержащего костный экстракт и контроль, после 21 суток наблюдения (площадь опалесценции в мм2). Показан процент увеличения по сравнению с контролем
Группа η Активный, мм2 (80) Контроль, мм2 (50) Увеличение %
а) ГАП/ТКФ/КС 30:60:10 8 34 (6,08)а 25(3,14) 36
Ь) ТКФ/КС 90:10 7 41 (12,22) 27(1,41) 52
с) Сет-Оз1е11с 7 76 (6,49)а,с 50 (6,04) 52
ά) КС полугидрат 6 78 (13,47)30 44 (8,33) 77
е) ГАП/ТКФ/КС 60:30:10 8 46 (12,87)3 а 25 (2,77) 84
0 КС дигидрат + стеариновая кислота 7 97 (13,48)а* 49(13,38) 98
ар < 0,01 по сравнению с контролем, ьр < 0,05 по сравнению с другими активными группами, ср< 0,01 по сравнению с (а), (Ь) и (е), р < 0,01 по сравнению с (а)
Оценка кальция сульфата и β-ТКФ в качестве носителя экстракта костного белка, полученного из северного оленя, у овец.
- 32 024470
Имплантация и аналитические методы оценки.
Введение.
Дефекты кости образуются в результате травмы или в связи с реконструктивной хирургией, где части кости удаляют вследствие деструктивных изменений ткани. Дефектами кости критического размера являются те, где одна кость неспособна к спонтанной регенерации образовавшегося пробела, и необходима физическая помощь при восполнении пробела между частями кости.
Авторы настоящего изобретения разработали экстракт костного белка для применения в костной хирургии. Данный экстракт костей северного оленя эффективно индуцирует эктопическое новое костеобразование ίη νί\Ό. Экстракт костного белка северного оленя получен из диафизарной кости с получением в результате смеси различных костных белков.
Для экстракта костного белка необходима матрица-носитель, чтобы направлять костеобразование и защищать костные белки от неспецифического лизиса. Идеальная матрица должна быть биосовместимой, биорассасываемой, пластичной и стерилизуемой. Матрица-носитель должна связываться с костью хозяина без образования рубцовой ткани и резорбироваться с такой же скоростью, с которой происходит регенерация кости.
Доступны различные способы имплантации и анализа. Первое изделие было направлено на артродез голеностопного сустава. Предположили, что модель дефекта в виде отверстия может быть достаточно хорошей для моделирования реальной ситуации. Модель дефекта в виде отверстия у овец широко применяется, но четкую модель критического размера дефекта невозможно определить на основании литературных данных. Наиболее характерный размер модели представлял собой отверстие 9 мм х 6 мм, поэтому авторами изобретения был выбран размер 10х6 мм.
Согласно литературе различные способы визуализации и гистологические методы являются чаще всего используемыми и наиболее практичными, чтобы показать заживление кости и взаимодействия в области травмы кости. Основная цель данного исследования состояла в тестировании системы операции в модели дефекта в виде отверстия у овец и различных способов анализа.
Цели.
Данное исследование было предназначено для оценки качества ίη νί\Ό трех различных неорганических носителей-кандидатов, объединенных с экстрактом костного белка северного оленя, в модели дефекта в виде отверстия бедренной кости овец. Другой целью данного исследования было предоставление методологической информации для планирования будущих исследований качества. Они включают тестирование технических аспектов исследований имплантации (величины критического размера дефекта в сравнении с размером дефекта, найденным из литературы, способов операции с анестезией и устранением боли, клинических наблюдений, местной переносимости и выздоровления после имплантации, обращения с тестируемым материалом, времени наблюдения и аналитических методов) и информацию о процессе заживления кости с тремя различными носителями-кандидатами.
Материалы и методы.
План исследования.
Исследование одобрено Комитетом по содержанию и использованию лабораторных животных органов местного самоуправления Южной Финляндии, регистрационный номер Е8ЬН-2009-0568/Ут-23.
В данном исследовании с помощью костной дрели под общей анестезией были индуцированы два дефекта в виде отверстия диаметром 6 мм и глубиной 10 мм во внутренних мыщелках бедренной кости задних ног овцы. Локализация дефектов была отмечена небольшими титановыми спицами Киршнера. Просверленные отверстия левой и правой бедренной кости были заполнены материалом носителя и экстрактом костного белка северного оленя или одним материалом носителя, или оставлены пустыми (необработанные контроли). Новое костеобразование определяли с помощью флуорохрома ίη νί\Ό. После предопределенного времени животных подвергали эвтаназии, и бедренные кости собирали для дальнейших лабораторных исследований ех νί\Ό. Время наблюдения составляло три (п=5) и восемь недель (п=5).
Исследуемые препараты представляли собой (табл. 16):
1. ВВ8001 Р001: Пеллеты кальция сульфата (КС) с поверхностным покрытием 30 мг/г.
2. ВВ8001 Р002: Контрольные пеллеты КС.
3. ВВ8001 Р003: Гранулы бета-трикальцийфосфата (β-ТКФ, высокая пористость, низкая плотность) и гель паста полиэтиленгликоль/глицерин (РЕС/СЬУ).
4. ВВ8001 Р004: Гранулы β-ТКФ (высокая пористость, низкая плотность) с контролем РЕС/СЬУ
5. ВВ8001 Р005: Гранулы бета-трикальцийфосфата (β-ТКФ, низкая пористость, высокая плотность) и гель паста полиэтиленгликоль/глицерин (РЕС/СЬУ).
6. ВВ8001 Р006: Гранулы β-ТКФ (низкая пористость, высокая плотность) с контролем РЕС/СЬУ.
- 33 024470
Таблица 16
Исследуемые препараты
Код группы Имплантат Сокращение
ВВ3001 Р001 Кальция сульфат, активное вещество КС активный
ВВ3001 Р002 Кальция сульфат, контроль КС контроль
ВВ3001 РООЗ ТКФ низкой плотности, активное вещество ТКФНП активный
ВВ3001 Р004 ТКФ низкой плотности, контроль ТКФНП контроль
ВВ3001 Р005 ТКФ высокой плотности, активное вещество ТКФВП активный
ВВ3001 РООб ТКФ высокой плотности, контроль ТКФВП контроль
Пустой Нет имплантата Пустой
Целевая композиция препарата ΒΒδ001 Р001 содержала примерно 30 мг сухого экстракта белка на 1 г препарата, где носитель находился в форме слегка конических пеллет 3x3 мм. Объем дефекта 6x10 мм составлял 0,283 мл, и он может включать 6 пеллет с получением в результате примерно 4 мг экстракта на дефект.
Пеллет кальция сульфата был изготовлен путем формования из бета-кальция сульфата полугидрата (Ыдта-А1бпсЬ 97%, код 12090), и он включал примерно 5% (мас./мас.) стеариновой кислоты (Мегск РАРТЕСК ЬиВ δΤΑ (Стеариновая кислота растительного сорта), РН ЕиР, партия К39557661). Пеллеты покрывали влажным экстрактом белка с Твином 20 (РЬЕцг., код: 44112, Р1ика, δ^дта-Α1б^^ск). КМЦ (карбоксиметилцеллюлозой) (Сагте11о8. Жа1г. РЬ. Еиг, Татго) и ПЭГ 400 (Макрогол 400, 0784710, Татго). Конечная композиция содержала 2,4% сухого экстракта белка, 1,12% КМЦ, 0,19% ПЭГ 400, 0,036% Твин 20, 91,4% кальция сульфата и 4,8% стеариновой кислоты.
Целевые композиции препаратов ΒΒδ001 Р003 и ΒΒδ001 Р005 содержали по объему такое же количество сухого экстракта, как ΒΒδ001 Р001.
Фаза РЕС/СЬУ в препаратах ΒΒδ001 Р003 и ΒΒδ001 Р005 содержала 1,62% лиофилизированного экстракта белка, 38,1% ПЭГ 2К (С1апап1, Кет1 1п1ге55еп, код: 107903) и 60,3% глицерина (Сгоба, Кет1 ЬИге^еп, код: рпсеппе 9095). β-ТКФ в ΒΒδ001 Р003 и ΒΒδ001 Р005 составлял по размеру 300-500 мкм (СатЪюсегаткк, партия СР090819В, высокой пористости, низкой плотности, и СатЪюсегатюк, партия СР090819А, низкой пористости, высокой плотности).
Влажный экстракт белка лиофилизировали перед смешиванием со смесью РЕС/СЬУ. Сухой лиофилизированный экстракт белка содержал 0,35% Твин 20 (РЬ. Еиг., код: 44112, Р1ика, δ^дта-Α1б^^сЬ), 0,97% трегалозы дигидрата (для микробиологии, Р1ика, δ^дта-Α1б^^сЬ код 90210), 4,1% глицина (рцп88, РЬ. Еиг., код: 33226, Ыебе1-бе Наёп, δ^дта-Α1б^^сЬ) и 10,9% маннита (РЬ. Еиг., код: 17311, Р1ика, δ^дта-Α1б^^сЬ).
Конечная композиция ΒΒδ001 Р003 (высокая пористость, низкая плотность) содержала 1,14% лиофилизированного экстракта, 29,7% ТКФ, 42,4% глицерина и 26,8% ПЭГ2К.
Конечная композиция ΒΒδ001 Р005 (низкая пористость, высокая плотность) содержала 1,00% лиофилизированного экстракта, 37,8% ТКФ, 37,5% глицерина и 23,7% ПЭГ2К.
Система теста.
Вид, линия, происхождение, качество, число животных, возраст.
Использовали овец (самок овцы) линии δиοтеη1аттаδ (финские овцы).
Животные имели происхождение из племенных стад финских овец для производства мяса и шерсти. Все овцы были производителями несколько раз. Животные были приобретены для использования в качестве лабораторных животных.
В данном научном исследовании использовали 11 животных. Их средний возраст составлял 7 лет и 7 месяцев.
Имплантация.
Операцию проводили под общей ингаляционной анестезией, индуцированной внутривенной инъекцией пропофола (5-7 мг/кг внутривенно, Ргоро£о1© Ыриго, В. Вгаип Мекипдеп АС, МеЬипдеп, Сегтапу) и поддерживали изофлураном в 1-1,5% кислородно-воздушной смеси (ЬоЬа Уе1, δсЬе^^ηд-Р1οидЬ А/δ, Рагит, Эептагк). Перед анестезией овец подвергали премедикации медетомидином - кетамином (0,015 мл/кг внутримышечно, ЭотЦог® Уе1 (1 мг/мл), Опоп Оу), Езроо, Р1п1апб) и кеталаром (50 мг/мл), РП/ег Оу, НеЫпкг Р1п1апб и интубировали. Овец контролировали кардиомонитором во время операции.
Депо-пластырь с фентанилом (2 пг/кг/ч, Рейапу1 гаЬорЬагт, РаЬорЬагт СтЪН, и1т, Сегтапу) накладывали после операции для облегчения боли на 72 ч. Дополнительно 2 мл фентанила (50 мкг/мл внутримышечно, Реп)апу1-Нате1п, Нате1п РЬагтасеиЬсак СтЪН, Нате1п, Сегтапу) инъецировали дважды в сутки внутримышечно в течение первых 72 ч после операции.
Амоксициклин (15 мг/кг внутримышечно, Ве1ато\® Уе1, 150 мг/мл, ЖогЪгоок ЬаЪога1опе8 Ыб, Жетогу, Жогб-1ге1апб) инъецировали в качестве профилактики антибиотиком, подкожно за 24 ч до операции и один раз в сутки двое суток после операции.
- 34 024470
Имплантаты помещали билатерально в круговой дефект в виде отверстия. Затем животных иммобилизовали на спине, и обе ноги выбривали и дезинфицировали этанолом. На медиальной поверхности бедра делали продольный разрез, и с помощью тупого отделения обнажали мыщелок. Небольшие кровеносные сосуды закрывали диатермией. Просверливали два отверстия диаметром 6 мм и глубиной 10 мм (аккумуляторная дрель, Воксй Ρ8Κ12-2). Расстояние между дефектами составляет по меньшей мере 1,5 см. Сначала просверливали 2 мм пробное отверстие. Затем этот дефект постепенно расширяли, используя сверла возрастающих размеров (3,5 и 4,5 мм) до конечного диаметра 6 мм (Мадиит циайГу 1оо1з, Н§§ай 76035, Н§§ай 76045 и Н§§ай 76060). Просверленные отверстия промывали физиологическим раствором для удаления обломков кости и тампонировали марлей, чтобы остановить кровотечение. В это время отмечали локализацию дефектов, используя небольшие титановые спицы Киршнера, на передней стороне просверленных отверстий. Отверстия заполняли исследуемым препаратом или оставляли пустыми.
Наконец, подкожные ткани закрывали послойно рассасываемыми непрерывными швами Викрил 2-0 и кожу закрывали швами МоНоюГ 2-0. Кожу вокруг сайта дефекта место анестезировали бупивакаином гидрохлоридом (5 мг/мл Вюат, Опои Оу), Екроо, Р1и1аиб) и дезинфицировали повидоном - йодом.
Наблюдение.
Время наблюдения составляло 3 недели (и=5 овец) или 8 недель (и=5 овец) после операции. Одну овцу (Р3) подвергли эвтаназии сразу после операции в связи с обширным кровотечением.
Эвтаназия и некропсия.
После предопределенных периодов времени животных перевозили в Центр лабораторных животных, где их подвергали эвтаназии. Эвтаназию осуществляли пентобарбиталом (60 мг/кг внутривенно, МеЬииа!® Уе!, Опои Оу), Екроо, Р1и1аиб). Перед этим овец анестезировали внутримышечной инъекцией медетомидина -кетамина (0,015 мг/кг внутримышечно, Иотйог® Уе! (1 мг/мл), Опои Оу), Екроо, Рш1аиб) и кеталаром (50 мг/мл), ΡΠ/ег Оу, НеШикц Р1и1аиб.
Взятие образцов.
После эвтаназии бедренные кости вырезали и сохраняли во льду до компьютерной томографии (КТ). Затем костные блоки для взятия на гистологические анализы консервировали в 10% забуференном формалине. Перед гистологическим анализом один образец из каждой группы визуализировали с помощью микроКТ.
Анализ данных микроКТ.
Один образец из каждой группы исследования и точек наблюдения сканировали с использованием микроКТ (§ку§саи, рентгеновский микротомограф, ИтуегаГу оГ Тигки). Два сканированных образца анализировали, используя программное обеспечение СТАи (§ку§саи).
Г истология.
После визуализации с помощью мкКТ кости фиксировали в растворе формальдегида, забуференном фосфатом (рН 7,4), дегидратировали при возрастающих концентрациях этанола (70-100%) и заключали в метилметакрилат (ММА) для гистологической обработки.
После полимеризации готовили тонкие срезы в поперечном направлении к оси имплантата, используя модифицированный метод распиливания на микротоме. Резали срезы 4 мкм, один срез окрашивали красителем трихромом по Массону-Голднеру (МС) и один срез - красителем гематоксилин-эозин (НЕ).
Для оценки костеобразования, резорбции материала носителя и локальной переносимости будет исследован сайт имплантации.
Гистоморфометрия.
Срезы каждого имплантата исследовали с помощью световой микроскопии. Все1 НЕ-окрашенные срезы фотографировали (изображение высшего качества) с помощью стереомикроскопии (О1утри8 8ΖΧ9, Еигоре, камера: и-СМАЭ3, .Гараи, Итуегейу оГ Ои1и, ЬаЬога!огу оГ Ргосе88 Ме!а11игду) под 6,3х увеличением. Отдельное изображение окрашенного среза передавали на экран компьютера, и в качестве области, представляющей интерес (гедюи оГ ш!еге8!, КО1) был выбран сайт дефекта. Площадь новой кости в сайте дефекта вычисляли путем обработки изображения и анализа с помощью программного обеспечения (Г(р-\ут-32).
Статистические методы.
В связи с малым числом образцов (и=3 в каждой группе) статистические методы не использовали.
Результаты.
МикроКТ.
Представлен один осевой примерный срез из середины каждого образца (фиг. 25-30).
Микроскопические препараты с активным ТКФ низкой плотности (3 недели Р2.3 и 8 недель Р7.3) анализировали, чтобы показать, как остатки материалов носителя могут отличаться от нового костеобразования. Основной результат состоял в том, что новый костный матрикс, включающий гранулы, составлял 25% (об./об.) после 3 недель наблюдения и 46% (об./об.) после 8 недель наблюдения. Объем частиц без соединения с новой костью или других частиц составлял 1,4% (об./обю) после 3 недель и только 0,10% (об./об.) после 8 недель. Данный метод является подходящим, чтобы показать заполнение объема
- 35 024470 и резорбцию материала носителя в дефекте.
Г истологический и гистоморфометрический анализ.
Краткое изложение комментариев к гистологическому анализу:
1. ВВδ001 Р001: Пеллеты кальция сульфата (КС активный):
недели наблюдения (фиг. 33):
могут быть обнаружены остатки пеллет, новое костеобразование на стороне дефекта, отсутствует в середине дефекта;
недель наблюдения (фиг. 34):
остатки пеллет (очень маленькие частицы), костеобразование вокруг частиц.
2. ВВδ001 Р002: контрольные пеллеты КС:
недели наблюдения (фиг. 35):
множество фиброзного матрикса на всей площади дефекта, могут быть обнаружены маленькие остатки пеллетов;
недель наблюдения (фиг. 36):
пеллеты резорбированы, фиброзная ткань заполнила дефект, может быть обнаружено некоторое костеобразование.
3. ВВδ001 Р003: активная паста β-ТКФНП:
недели наблюдения (фиг. 37):
остатки гранул могут быть обнаружены, но отсутствует реакция резорбции, костеобразование также в центре дефекта, вокруг гранул;
недель наблюдения (фиг. 38):
остеокласты резорбируют гранулы, хорошее новое костеобразование на площади дефекта, четкое соединение кости.
4. ВВδ001 Р004: β-ТКФНП контроль:
недели наблюдения (фиг. 39): множество остатков гранул, множество фиброзного матрикса в области кортекса, некоторые гранулы окружены новой костью;
недель наблюдения (фиг. 40):
множество остатков гранул, гранулы резорбированы не настолько, как в случае активного вещества, новое костеобразование вокруг гранул.
5. ВВδ001 Р005: β-ТКФВП активная паста:
недели наблюдения (фиг. 41):
фиброзный матрикс на поверхности дефекта в виде отверстия, множество остатков гранул, но также хорошее новое костеобразование;
недель наблюдения (фиг. 42):
видна четкая резорбция гранул, новое костеобразование вокруг гранул на всем сайте дефекта, четкое соединение кости.
6. ВВδ001 Р006: β-ТКФВП контрольная паста:
недели наблюдения (фиг. 43):
остатки гранул, множество фиброзного матрикса в области кортекса, некоторые гранулы окружены новой костью;
недель наблюдения (фиг. 44):
очень толстый слой фиброзной ткани, нет соединения кости, костеобразование только вокруг гранул, некоторые остатки гранул, но только по краям дефекта 7.
Пустой дефект:
недели наблюдения (фиг. 45): только фиброзный матрикс;
недель наблюдения (фиг. 46):
множество фиброзной ткани в области кортекса, отсутствует костеобразование в центре дефекта.
- 36 024470
Резорбция гранул была более быстрой в активных группах, чем в контрольных группах. Авторы изобретения использовали два различных размера пористости гранул (3-ТКФ. Четкое различие между размерами невозможно определить, хотя более быстрая резорбция и лучшее врастание кости было видно в группе низкой пористости (группе ТКФВП активное вещество). Различие в резорбции между группами ТКФНП и ТКФ ВП после 8 недель наблюдения видно на фиг. 47 и 48.
Обсуждение.
Основная цель данного научного исследования состояла в том, чтобы найти подходящий неорганический носитель-кандидат для экстракта костного белка северного оленя, а также в тестировании системы операции в модели дефекта в виде отверстия у овец и способа анализа модели дефекта в виде отверстия у овец. Три различных кандидата, включая два различных сырьевых материала, было выбрано для исследования костеобразования и резорбции имплантата в данном пилотном исследовании с тремя неделями и восемью неделями наблюдения. Использованные способы операции и наблюдения действовали хорошо и полезны в будущих исследованиях. Самое лучшее костеобразование и заживление дефекта наблюдалось в группах пасты, которая включала β-ТКФ и лиофилизированный костный экстракт северного оленя вместе с полиэтиленгликолем и глицерином.
Фирма ВВ§ ЬЙ нацелила свой первый продукт на артродез голеностопного сустава. Предположили, что модель дефекта в виде отверстия может быть достаточно хороша, чтобы моделировать реальную ситуацию. Самый характерный размер модели представлял собой отверстие 9x6 мм, поэтому авторами изобретения был выбран размер 10x6 мм. Этот размер был достаточно велик, поскольку в пустом дефекте после 8 недель заживления кости не наблюдалось. В данном случае использовали бедренную кость, но, если подразумевать цель данного продукта, метатарзальная кость овцы также является подходящей действующей костной моделью. Авторы изобретения использовали спицы Киршнера, чтобы обозначить сайт дефекта. Эта идея была хорошей и работоспособной. В частности, после 8 недель в некоторых случаях было неясно нахождение дефекта без использования помощи спиц Киршнера. Кроме того, спицы Киршнера использовали при помощи визуализации рЦСТ и при приготовлении гистологических препаратов (чтобы найти срединную точку дефекта).
В данном исследовании были изучены три различных альтернативы препарата с двумя различными матрицами. Оба используемых неорганических материала являются биосовместимыми и остеокондуктивными.
Гранулы кальция сульфата со стеариновой кислотой формовали и высушивали, а затем покрывали костным экстрактом северного оленя. Чистые пеллеты действовали в качестве контроля. Одна доза, которую можно было легко установить для дефекта, включала шесть пеллет. Эти пеллеты проявляли чистое костеобразование в биологическом анализе (мышиная модель). В данном исследовании на овцах резорбция пеллет была настолько быстрой, что в этой группе наблюдалось только небольшое костеобразование. Однако можно было обнаружить начало соединения кости после 8 недель наблюдения. Гранулы без экстракта не обладали эффектом костеобразования. Оптимизация скорости резорбции пеллет необходима перед конечным исследованием. Возможно, размер одной пеллеты может быть меньшим, чтобы дефект заполнялся лучше, и была бы доступна большая площадь, покрытая белком. Это может усилить врастание кости в дефект.
Два других тестируемых препарата находились в форме пасты. Гранулы бета-трикальцийфосфата (β-ТКФ) (два размера пористости) и лиофилизированный костный экстракт северного оленя добавляли в пасту, сформованную из полиэтиленгликоля и глицерина. Затем эту пасту дозировали в шприцы. В основном, было легко инъецировать дозу пасты в дефект, но в некоторых случаях паста не высвобождалась из поршня шприца, и небольшая часть пасты выходила из дефекта. Это может быть одной из причин того, что врастание кости не наблюдали в кортексе кости, только в центре дефекта. Паста не проявляла чистого костеобразования в биологическом анализе (Τ0ΝΑ002.003), но в данном исследовании на овцах была обнаружена резорбция гранул и костеобразование, в частности, после 8 недель наблюдения. β-ТКФ представляет собой материал, который сам по себе является остеокондуктивным, поэтому авторы изобретения также обнаружили новое костеобразование в контрольных группах. Но костеобразование находилось вокруг гранул, и врастание кости не наблюдалось. Кроме того, резорбция гранул была более быстрой в активных группах, чем в контрольных группах. Авторы изобретения использовали два различных размера пористости гранул β-ТКФ. Четкое различие между гранулами невозможно определить, хотя более быструю резорбцию и лучшее врастание кости наблюдали в группе низкой пористости (группа ТКФВП активная). Перед конечным исследованием необходима оптимизация скорости резорбции пасты. Пасту (ΡΕΟ и ОЬУ) с гранулами необходимо выдерживать в дефекте дольше, чтобы было также возможно врастание кости в кортексной части кости.
В научных исследованиях неорганического материала широко используемыми точками наблюдения являются точки от 3 до 12 недель в зависимости от используемого материала и модели дефекта. В данном исследовании авторы изобретения использовали три недели и восемь недель наблюдения. Первая временная точка показала только начало костеобразования и резорбцию материала. Оперированная зона (рана, мышцы) уже зажила за три недели. Вторая временная точка показала четкое различие между ак- 37 024470 тивной и контрольной группами и отсутствие костеобразования в пустых дефектах. Но полное врастание кости не наблюдали в активных группах после восьми недель. В частности, группам, включающим ТКФ, необходимо более длительное наблюдение, чем может быть четко определена резорбция гранул. При дальнейшем исследовании наблюдение может составлять от 8 до 16 недель.
Лучшие и наиболее информативные результаты визуализации были получены в результате микроКТ. Этот метод дает изображения более высокого разрешения и, следовательно, более подробную информацию о новом костеобразовании и резорбции носителя, чем нормальная КТ. В данном исследовании авторы изобретения анализировали только два иллюстративных образца с помощью микроКТ, но этот способ является весьма обнадеживающим для использования в качестве основного метода анализа в будущем. Он также рекомендуется для получения некоторых изображений непосредственно после имплантации. Следовательно, можно получить информацию о том, насколько успешна имплантация, и какие анализируемые значения визуализации находятся в так называемой нулевой точке.
После визуализации образцы посылали на гистологию. Использовали два метода окрашивания. В частности, окрашивание трихромом по Массону-Голднеру показало новое костеобразование и резорбцию носителя, поскольку данное окрашивание является специфичным для кости. Площадь новой кости в сайте дефекта измеряли с помощью гистоморфометрии с фотографии, снятой с помощью стереомикроскопа. Но только один препарат из каждой группы был настолько хорошим, что измерение было приемлемым. Большинство микроскопических препаратов было разбито, или встречались некоторые другие проблемы, в связи с чем количественный анализ был невозможен. Хотя костеобразование и заживление дефекта можно было увидеть на гистологии, в будущем следует уделять больше внимания качеству микроскопического препарата, чтобы количественное измерение было способно показать различие между группами.
Вывод.
Дефект в виде отверстия данного размера представляет собой критический размер дефекта и поэтому пригоден для оценки эффектов заживления кости исследовательских медицинских устройств. Использованные методы операции, анестезии и анализа применимы также в будущих исследованиях для данной линии овец. Как кальция сульфат, так и трикальцийфосфат являются подходящим материалом носителя, но необходима оптимизация препарата. По-видимому, та форма препарата, которая целиком заполняет дефект в начале каскада заживления кости, является лучшей альтернативой. Эффект заживления кости был действительно лучшим и отличным при дефекте, который обрабатывали активными имплантатами, по сравнению с контрольными дефектами.
Качество костеобразования препаратов экстракта костного белка северного оленя, аутотрансплантата и деминерализованного костного матрикса в модели дефекта в виде отверстия у овец.
1. Введение.
Аутотрансплантат является традиционным способом усиления репарации кости, но сбор костных трансплантатов может привести к осложнениям, таким как кровотечение, боль и инфекция. Аутотрансплантаты также обладают ограниченной доступностью, поэтому в качестве альтернативы используют многие неорганические материалы. Фосфаты кальция, такие как гидроксиапатит (ГАП) и трикальцийфосфаты (ТКФ) и их вариации, являются общеизвестными материалами заменителей костной ткани. Эти материалы обеспечивают остеокондуктивный каркас для формирования новой кости.
Биологическую активность неорганических материалов можно повысить путем добавления остеогенного стимула в наполнитель костного трансплантата. Во многих различных исследованиях показано, что аллотрансплантаты, ИВМ и нативные костные экстракты повышают способность к заживлению кости и усиливают интеграцию. Показано, что комбинации бычьих факторов роста костной ткани в носителях на основе коллагена и ИВМ или кораллового Г АП обладают настолько же хорошим эффектом, что и аутогребни подвздошной кости, при исследовании скоростей сращения в позвоночном артродезе у кроликов и обезьян, а также у людей.
Костный экстракт северного оленя представляет собой смесь коллагена и факторов роста, экстрагированных из внеклеточного матрикса кортикальной диафизарной кости. Экстракт костных белков северного оленя подобен экстрактам костной ткани животного происхождения по композиции, способу получения и предназначенному использованию и применению. Самыми близкими сравнимыми препаратами являются Со11о88® и Со11о88® Е, которые представляют собой деминерализованные костные экстракты, полученные из бычьих и лошадиных костей, и препараты деминерализованного костного матрикса (ИВМ) человека, такие как пеллеты ИВМ О81ео8е1®.
Для настоящего исследования авторы изобретения выдвинули гипотезу, что имплантаты костного экстракта северного оленя обладают эквивалентной или лучшей костеобразующей способностью по сравнению с костным аутотрансплантатом или деминерализованным костным матриксом при использовании модели дефекта в виде отверстия у овец. Для проверки данной гипотезы авторы изобретения сравнивали способность различных препаратов костного экстракта северного оленя к стимуляции костеобразования и репарации в модели дефекта в виде отверстия авторов N1188 е1 а1. 2006. Результаты сравнивали с необработанными дефектами и с дефектами, заполненными керамическим бета-трикальцийфосфатом
- 38 024470 ((3-ТКФ), имеющимся в продаже деминерализованным костным матриксом (Огайоп® ИВМ) и аутотрансплантатом.
2. Материалы и методы.
2.1. Экстракт костного белка.
Экстракт костного белка был экстрагирован и очищен из диафизарной кости северного оленя, как описано ранее (ЗогПкка е) а1., 1993). Полученный экстракт костного белка был лиофилизирован при -20° с использованием наполнителей (сурфактанта (полисорбата 20, Р1ика, Еадта-АИпсН), лиопротектора (Э-(+)-трегалозы дигидрата, Р1ика, Еадта-АИпсН), объемообразующего агента (глицина, Ктейе1-йе Наёп, Еадта-АИпсН) и буфера (Ό-маннита, Р1ика, Еадта-АИпсП)).
2.2. Исследуемые препараты и группы исследования.
Исследуемые препараты и группы исследования представлены в табл. 17.
2.3. Приготовление образца препарата.
Полиэтиленгликоль 2000 (ПЭГ), глицерин и стеариновую кислоту нагревали до образования прозрачной смеси. Эту смесь охлаждали при постоянном перемешивании с образованием опалесцентной пасты, после чего добавляли необходимые количества лиофилизированного костного экстракта и гранул ТКФ. Приготовленную пасту упаковывали в шприцы и закрывали в пакеты из алюминиевой фольги. Все образцы были получены в ламинарном шкафу для уменьшения биологической нагрузки, а затем подвергали конечной стерилизации гамма-облучением (15 кГр).
В группе аутотрансплантата костный материал извлекали из сайтов тестируемого отверстия той же овцы, используя медицинское долото и электротрепан.
2.4. Животные.
Суммарно использовали 10 здоровых овец линии овец Финского архипелага. Животные были трехлетнего возраста, и их масса тела составляла от 52 до 59 кг.
Сайты имплантации представляли собой проксимальную, губчатую часть диафиза и дистальный эпифиз плечевой и бедренной кости. Всего было представлено 8 различных сайтов имплантации на животное. Протокол исследования осуществляли в соответствии с финским законодательством о защите прав животных, и он был одобрен Институциональным комитетом по экспериментам на животных и этическим комитетом. Все животные выжили в течение всех 8 недель наблюдения.
2.5. Хирургическая операция.
Операцию проводили под общей ингаляционной анестезией, индуцированной внутривенной инъекцией пропофола (5-7 мг/кг внутривенно, РгороРо1© Ыриго, В. Вгаип Мекипдеп АО, МеПипдеп, Оегтапу) и поддерживали изофлураном в 1-1,5% кислородно-воздушной смеси (1коЪа Уе), 8сНег1пд-Р1оидП А/8, Рагит, Эептагк). Перед анестезией овец подвергали премедикации медетомидином (0,015 мл/кг внутримышечно, ЭотЬот® Уе) (1 мг/мл), Опоп Оу), Екроо, Рт1апЬ) и интубировали. Овец контролировали кардиомонитором во время операции.
После операции для облегчения боли на 72 ч накладывали депо-пластырь с фентанилом (2 пг/кг/ч, Реп)апу1 гайорйатт, Кайорйатт ОтЪН, И1т, Оегтапу). Дополнительно в течение первых 72 ч после операции инъецировали внутримышечно 2 мл фентанила (50 мкг/мл внутримышечно, Реп)апу1-Нате1п, Нате1п РйаттасеийсаН ОтЪН, Нате1п, Оегтапу). Затем, когда депо-пластырь удаляли, дважды в сутки постоянно в течение двух суток или более после операции инъецировали бупренорфин (0,3 мг/доза внутримышечно, Тетдекю®, 8сНег1пд-Р1опдН Еигоре, Вти88е18, Ве1дшт).
В качестве профилактики антибиотиком внутримышечно в переднюю половину шеи за 24 ч до операции и один раз в сутки в течение двух суток после операции инъецировали амоксициклин (15 мг/кг внутримышечно, Ве)атох® УеР 150 мг/мл, ЫогЬтоок ЕаЪотаййек ЬЙ, Ые^ту, Ыой-йекий).
В дистальном и проксимальном мыщелке бедренной и плечевой кости задних и передних ног овцы медицинской дрелью, как описано N1155 е) а1. (2006), индуцировали дефекты в виде отверстия. Просверливали отверстие диаметром 6 мм и глубиной 10 мм (аккумуляторная дрель, Вокск Р8К12-2). Просверленное отверстие промывали физиологическим раствором для удаления обломков кости и тампонировали марлей на несколько минут, чтобы остановить кровотечение. В это время отмечали локализацию дефекта, используя 1,0 мм зубные рентгеноконтрастные стекловолоконные штифты для корневого канала (Зпо^рок! тей11, Р1апЬеп) Оу, НеЫпкР Рш1апй). Штифты отрезали до соответствующей длины диском с алмазной режущей кромкой. Просверленные отверстия заполняли тестируемыми материалами в соответствии с таблицей рандомизации или оставляли пустыми (необработанные контроли). Наконец, подкожные ткани закрывали послойно резорбируемыми непрерывными швами 3-0 Ро1укогЪ, а кожу нерезорбируемыми швами 2-0 МопокоР
После заранее определенного периода времени 8 недель животных подвергали эвтаназии, и образцы кости отбирали для анализа. Эвтаназию осуществляли пентобарбиталом (60 мг/кг внутривенно, МеЬппа)® Уе), Опоп Оу), Екроо, Рткнй). Перед этим овец анестезировали внутримышечно медетомидином (0,015 мл/кг ЭотЬот® Уе), Опоп Оу), Екроо, Рткнй) и 0,04 мл/кг кеталара®, РП/ег Оу, НеШпку Рткнй
- 39 024470
После эвтаназии кости вырезали и сохраняли во льду. Затем костные блоки консервировали в 4% забуференном формалине первые семь суток, а затем в 70% этаноле. Некоторые образцы были разрушены в фазе вырезания, и их удаляли из анализа.
2.6. Оценка костеобразования с помощью микроКТ.
Образцы сканировали путем использования устройства для микрокомпьютерной томографии (мкКТ) (§ку§сап, рентгеновский микротомограф, университет Турку). Сканированные образцы анализировали, используя программное обеспечение СТАп (§ку§сап). Кроме того, проводили радиографический анализ микроКТ изображений, чтобы показать новое костеобразование и резорбцию каркаса.
2.7. Статистический анализ.
Статистический анализ проводили, используя программу §Р§§ для \Утбо\У5. Непараметрический критерий Крускала-Уоллиса (Ктиккай-УаШк) использовали для оценки статистических различий между группами. Критерий Манна-Уитни (Мапи-УЬйпеу) использовали для попарного сравнения между группами обработки экстрактом костного белка, группой аутотрансплантата и контрольными группами. Значения р менее 0,05 считали статистически значимыми.
3. Результаты.
Для групп пасты 1 и пасты 2 (экстракт костного белка и ТКФ СатЫосетаткк в матрице РЕС-СЬУ со стеариновой кислотой) оценки микроКТ показали хорошее костеобразование в области дефекта с обоими количествами экстракта костного белка, хотя были кортикальные области без новой кости или остатков гранул ТКФ. Почти все гранулы ТКФ резорбированы за период наблюдения. В контрольной группе пасты 3 (СатЬюсетаткк в матрице РЕС-СЬУ со стеариновой кислотой, без экстракта костного белка) оценки микроКТ показали, что гранулы ТКФ еще не резорбированы и упакованы в виде плотной массы на дне дефекта. Однако в этой массе гранул было новое костеобразование вокруг гранул. Для другой контрольной группы гранул (чистый СатЫосеташкк ТКФ), оценки микроКТ показали, что имплантированные гранулы заполнили всю область дефекта. Гранулы не абсорбированы за период наблюдения, но было видно некоторое новое костеобразование вокруг гранул.
Для групп пасты 4 (экстракт костного белка и СегакогЬ® М ТКФ в матрице РЕС-СЬУ со стеариновой кислотой) оценки микроКТ показали костеобразование в области дефекта, хотя были кортикальные области без новой кости или остатков гранул ТКФ. Почти все гранулы ТКФ резорбированы за период наблюдения. Для контрольной группы пасты 6 (СегакогЬ® М ТКФ в матрице РЕС-СЬУ со стеариновой кислотой, без экстракта костного белка) оценки микроКТ показали, что большинство гранул ТКФ еще не резорбировано и не упаковано в виде плотной массы на дне дефекта. Четкое новое костеобразование было трудно увидеть.
Для группы пасты 5 (экстракт костного белка и СегакогЬ® ТКФ в матрице РЕС-СЬУ со стеариновой кислотой) оценки микроКТ показали четкое и очень хорошее новое костеобразование в области дефекта. Почти все гранулы ТКФ абсорбированы за период наблюдения. Как и в других группах, включавших матрицу РЕС-СЬУ и стеариновую кислоту, еще существовала такая же проблема в том, что имплантат (гранулы) не заполнили дефект полностью, и были некоторые пустые области, особенно в кортикальном сайте.
Для группы аутотрансплантата радиографические оценки показали четкое костеобразование и ремоделирование кости в области дефекта. Пустые области в кортикальных сайтах были не видны, за исключением нескольких дефектов.
Для группы деминерализованного костного матрикса Стайоп (Стайоп Р1ик® ЭВМ) и в необработанной группе оценки микроКТ показали отсутствие нового костеобразования в сайтах дефекта за период наблюдения.
Значение объема костной ткани измеряли на основании микроКТ путем анализа изображений (фиг. 21). Самое высокое значение объема костной ткани наблюдали в группах пасты 5 и аутотрансплантата, тогда как самое низкое значение объема костной ткани было в группах деминерализованного костного матрикса и пустого дефекта. При статистических сравнениях все остальные группы были значимо лучше, чем группа деминерализованного костного матрикса (Стайоп Р1ик® ЭВМ) (р менее 0,02). Все группы имплантата с экстрактом костного белка, группа аутотрансплантата, а также другие контрольные группы за исключением группы ОВМ были заживлены значимо лучше, чем необработанные дефекты (р менее 0,02). Группа аутотрансплантата была значимо лучше по объему костной ткани, чем группа пасты 4 (р менее 0,02) и почти значимо лучше, чем группа пасты 6 (р менее 0,06). Группа пасты 5 была почти значимо лучше по объему костной ткани по сравнению с группой пасты 4 (р=0,064).
4. Обсуждение.
Цели данного исследования состояли в сравнении трех разрабатываемых препаратов экстракта белка северного оленя с аутотрансплантатом и имеющимися в продаже заполнителями кости (деминерализованным костным матриксом и частицами трикальцийфосфата) по их способности к образованию новой кости, при использовании модели дефекта в виде отверстия губчатой кости овцы. Кроме того, цель состояла в предоставлении информации о потенциальном влиянии концентрации белка в препарате на способность к заживлению кости и в предоставлении предварительной информации о биосовместимости
- 40 024470 препаратов. Было обнаружено, что спланированное и протестированное медицинское устройство, включающее экстракт костного белка северного оленя и препарат (β-ТКФ в форме инъекционной пасты, является подходящей альтернативой используемому в настоящее время лечению аутотрансплантатом кости.
Экстракт костного белка северного оленя обладает высокой костеобразующей активностью, как видно в тестах биоактивности и в вышеописанных тестах; однако в реальной ситуации заживления кости этот экстракт не может действовать без каркасной системы. Ограничения выбора носителя устанавливаются характеристиками экстракта костного белка северного оленя. Основное ограничение состоит в том, что этот экстракт не является водорастворимым. Следовательно, существует по меньшей мере три различные возможности для получения имплантата. Первая состоит в том, что препаратом в виде суспензии костного экстракта можно пропитывать пористую матрицу. Вторым способом является совместное плавление экстракта и носителя с образованием мастики или прессование их в диски, и при третьем способе поверхность дисков или гранул носителя покрывают костным экстрактом. В предшествующих исследованиях в качестве носителя протестирован чистый коллаген. Лиофилизированный экстракт перемешивали в воде, а затем переносили пипеткой на коллагеновую губку; альтернативно, коллагеновую губку замачивали в воде, а затем заворачивали с экстрактом с формированием имплантата. Результаты этого способа показали хорошее костеобразование в мышиной модели кармана и в модели сегментарного дефекта; однако, оказалось, что коллаген не поддерживает функциональность костеобразующих свойств в течение необходимого времени. Поэтому неорганическая альтернатива обеспечила бы лучший каркас для поддержания воздействия экстракта при заживлении кости. Ранее авторы изобретения тестировали комбинации ТКФ, ГАП и коралла вместе с экстрактом и коллагеновой губкой в мышиной модели. Кроме того, было обнаружено, что биокерамика является приемлемой альтернативой носителя, что протестировано в модели дефекта крысы.
Различные альтернативы солей кальция были также протестированы в мышиной модели. Это исследование показало, что неорганическая каркасная система является весьма подходящим носителем для экстракта костного белка северного оленя. Результаты настоящего исследования подтвердили предшествующие исследования, что образование новой кости зависит от содержания отношения ГАП/ТКФ в керамике и высокой дозы костных белков. Кроме того, это исследование подтверждает, что присутствие биоактивных компонентов уменьшает образование фиброзной ткани и увеличенное костеобразование вокруг неорганических каркасов. Однако количество и доступность костных белков должно находиться в равновесии с каскадом заживления и образования кости. В предварительном пилотном исследовании авторов изобретения на овцах (данные не представлены) обнаружено, что гранулы β-ТКФ могут представлять собой лучший каркасный материал, чем кальция сульфат, поскольку ТКФ обладает более медленной скоростью резорбции. Однако без костного экстракта резорбция ТКФ также является слишком медленной. Кроме того, исследование авторов изобретения на мышиной модели показало, что стеариновая кислота может добавлять костеобразующую способность экстракта костного белка северного оленя с кальциевым каркасом.
В соответствии с данной предшествующей информацией авторы изобретения получили имплантаты, включающие препарат экстракта костного белка северного оленя вместе с имеющимися в продаже гранулами β-ТКФ в матрице РЕС-СЬУ со стеариновой кислотой. Форма дозирования представляла собой инъекционную пасту, которая была возможна при использовании матрицы РЕС-СЬУ. Полиэтиленгликоль (РЕС) широко применяют в качестве преципитата в медицинском производстве и, например, применяют в ряде зубных паст в качестве диспергирующего агента, поскольку он обладает низкой токсичностью, связывает воду и способствует поддержанию однородной смолы во всей зубной пасте. Глицерин (СЬУ) также широко применяют в фармацевтических препаратах как улучшающий мягкость и обеспечивающий смазывание. Имплантацию было легко осуществлять, и дополнительного перемешивания препарата на операционном столе не требовалось. Однако анализ показал, что используемое количество гранул было недостаточным для заполнения всей площади дефекта после того, как матрица полностью растворилась, и это являлось причиной того, что кортикальный сайт дефекта был обычно пустым без новой кости или остатков гранул. Данный препарат сравнивали с группой чистого ТКФ, в которой количество гранул было удвоено, и вся площадь дефекта была заполнена гранулами также после периода наблюдения. Следовательно, эффект заживления кости невозможно сравнивать только по различию в костеобразовании между исследуемыми группами, и необходима оптимизация матрицы РЕС-СЬУ вместе со стеариновой кислотой и гранулами. В идеале костеобразование и разложение каркаса следует одно за другим до тех пор, пока площадь дефекта не будет полностью замещена новой костью. Если костеобразование не является достаточно интенсивным, чтобы обеспечить механическую прочность, материал каркаса должен разлагаться настолько медленно, чтобы не проявлялись характеристики каркаса. Анализ радиограмм показал, что резорбция гранул была самой быстрой в группе, включающей экстракт костного белка, но также наблюдали хорошее новое костеобразование, и ремоделирование кости продолжалось. В группе, которая включала только гранулы или гранулы с матрицей РЕС-СЬУ и стеариновой кислотой, резорбцию гранул не наблюдали. Костеобразование наблюдали, но обычно только вокруг гранул. В предварительном пилотном исследовании авторов изобретения (данные не представлены) это костеобра- 41 024470 зование было подобно слою фосфата апатита вокруг гранул, а реального соединения кости между гранулами не наблюдали. Это подтверждает результаты, демонстрирующие, что экстракт костного белка повышает биоактивность неорганических материалов. Гистология и визуализация с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) могли бы подтвердить вывод авторов изобретения на основании результата микроКТ. Самый высокий объем костной ткани и костеобразование наблюдали в группе, которая включала более мелкую и сферическую форму гранул ТКФ. Обнаружено, что форма, вид и микрои наноструктуры каркаса влияют как на свойства костеобразования, так и на свойства резорбции каркаса. Возможно, форма гранулы улучшала прикрепление костных белков, факторов роста и сигнальных молекул к поверхности гранул, и в этой группе каркас действовал наиболее оптимально.
Сгайоп Р1и5® ЭВМ авторизован Управлением США по надзору за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств ШпПей δίаΐе5 Роой апй Эгид Айт1П1в1гаРоп, ΡΌΑ) (510к) в качестве заместителя костного трансплантата, удлинителя костного трансплантата и заполнителя пустот кости в костных пустотах или пробелах скелетной системы. Препараты Сгайоп® ОВМ широко применяют, и хорошие результаты заживления кости описаны в различных животных моделях, в частности на крысах и кроликах. Он также имел хорошие клинические результаты в качестве терапии проблем позвоночника. Поэтому было неожиданным, что деминерализованный костный матрикс не действовал в настоящем исследовании. В литературе имеется несколько исследований, в которых обнаружены различия заживления кости между различными имеющимися в продаже препаратами ОВМ. Кроме того, ЭВМ обладает значительно более низким костеобразующим эффектом по сравнению с рекомбинантным препаратом. В данном исследовании была использована модель на овцах. Возможно, овца в качестве модели непригодна для Сгайоп или других препаратов ОВМ человека по сравнению с другим препаратом ОВМ. таким как Со11ов, который дает лучшие результаты заживления в моделях овец и собак.
В данном исследовании одна из задач состояла в сравнении керамического имплантата, содержащего экстракт костного белка северного оленя, с аутотрансплантатом. Результаты показали, что аутотрансплантат был не лучше по костеобразованию и заживлению дефекта, чем экстракт костного белка в ТКФ каркасе. Этот результат был обнадеживающим при нахождении заменяющего способа для терапии аутотрансплантатом, который имеет ограничения, поскольку сбор костных трансплантатов может приводить к осложнениям, таким как кровотечение, боль и инфекция. Предшествующие результаты с материалами ОВМ подтверждают эти результаты авторов изобретения.
В заключение, гранулы β-ТКФ в матрице РЕС-СЬУ со стеариновой кислотой представляют собой действующую каркасную систему для экстракта костного белка северного оленя, но пропорциональное количество гранул в матрице должно быть еще оптимизировано. Спланированное и протестированное медицинское устройство, включающее экстракт костного белка северного оленя и препарат β-ТКФ в инъекционной форме, является подходящей альтернативой для применяемой в настоящее время терапии аутотрансплантатом.
- 42 024470
Таблица 17
Исследуемые препараты и группы исследования
Группа N Экстракт костного белка Каркас
Паста 1 8 60 мг экстракта костного белка северного оленя (ВВЗВюасйуе Воле ЗиЬзй1и1ез ЬМ, Ои1и, Р|п1апб) / шприц 3 см3 Изготовленный на заказ СаппЬ|осегат1С5 β-ΤΚΦ (СатЬ|0сегат1С5, САМ Вюсегапгнсз, 1_екеп, ТИе Ме1бег1апбз), сферические гранулы 300-500 мкм; объемная плотность 1,24 г/см3, объединенные с матрицей полиэтиленгликоль/глицерин (ΡΕΟ/ΟίΥ) (С1апап1, Κβιηί 1п1геззеп, и Сгоба, Кет11п1геззеп), модифицированным стеариновой кислотой (Стеариновая кислота 50, смесь жирных кислот, состоящая, в основном, из стеариновой кислоты и 40-60% пальмитиновой кислоты, Пика, 3|дта-А1бпсИ)
Паста 2 8 30 мг экстракта костного белка/ шприц 3 см3 Сатбюсегаткз β-ΤΚΦ, 300-500 мкм; объемная плотность 1,24 г/см3, объединенные с матрицей ΡΕΘ-ΘΙ-Υ, модифицированной стеариновой кислотой
Паста 3 8 Сатбюсегат1С5 β-ΤΚΦ, 300-500 мкм; объемная плотность 1,24 г/см3, объединенные с матрицей РЕС-СЬТ, модифицированной стеариновой кислотой
Паста 4 7 60 мг экстракта костного белка/ шприц 3 см3 Сигазап β-ΤΚΦ СегаэогЬ М (СегазогЬ® Μ ΟγΙΓιο, Сигазап АС, ЕгапкГиб, Сегтапу), кусочки 500-1000 мкм объемной плотности 0,61 г/см3, объединенные с матрицей РЕС-СЬТ, модифицированной стеариновой кислотой
Паста 5 8 60 мг экстракта костного белка/ шприц 3 см3 Сигазап β-ΤΚΦ СегазогЬ (СегазогЬ®, Сигазап АС, РгапкГиб, Сегтапу), сферические гранулы 500-1000 мкм объемной плотности 1,21-1,24 г/см3, объединенные с матрицей РЕС-ОЬУ, модифицированной стеариновой кислотой
Паста 6 8 Сигазап β-ΤΚΦ СегазогЬ М (СегазогЬ® Μ ΟγΙΙιο, Сигазап АО, ГгапкТиг!, Сегтапу), кусочки 500-1000 мкм объемной плотности 0,61-0,64 г/см3, объединенные с матрицей ΡΕΟ-ΟίΥ, модифицированной стеариновой кислотой
Гранула 7 СатЫосегатюз β-ΤΚΦ, 300-500 мкм объемной плотности 1,24 г/см3. Количество гранул было двойным по сравнению с количеством гранул в группах пасты.
Аутотранс- плантат 8 - -
Сгайоп 7 овм (Деминерализованный костный матрикс Сгайоп ΡΙιιε® 1 см3 (ϋΒΜ) Паста, Оз1ео1есИ 1пс., Еа(оп(о\уп. Иехлгбегзеу, и8А)
Пустой дефект 8 - -
Приготовление препаратов, продолженное после стадии цитратного диализа.
Лиофилизат получают путем сушки вымораживанием преципитата, полученного со стадии цитратного диализа с использованием подходящих лиопротекторов:
Раствор наполнителей готовят в избытке, содержащем сурфактант (полисорбат 20), лиопротектор (трегалозу), объемообразующий агент (глицин) и буфер (маннит) в воде ВДИ (воде для инъекций). Этот
- 43 024470 раствор стерилизуют в автоклаве. Сухое содержание белка со стадии цитратного диализа анализируют путем взвешивания и добавляют соответствующее количество стерилизованного раствора наполнителей. Смесь перемешивают подходящей мешалкой до образования гомогенной суспензии. Гомогенную суспензию белка и наполнителей распределяют в лотки для сушки вымораживанием (лиофилизации) или флаконы стандартной дозы, а затем высушивают вымораживанием. Лиофилизированный экстракт белка, таким образом, содержит по массе 0,35% полисорбата, 0,97% трегалозы, 4,1% глицина, 10,9% маннита и 83,7% экстракта белка.
Раствор наполнителей тестируют и отбирают, используя метод Программы экспериментов (Эекщп оГ Εxре^^теηΐ5, ЭоБ) с приведенными ниже уровнями факторов.
Сурфактант: полисорбат 20 или полисорбат 80 (0,01-1,06%).
Лиопротектор: трегалоза или сахароза (0,2-2,3%).
Объемообразующий агент: глицин или КМЦ (1,0-10%).
Буфер: маннит или гистидин (3,2-23%).
С выбранной композицией лиофилизата было протестировано по меньшей мере пять различных препаратов.
Препарат 1 содержит вышеупомянутый лиофилизат, высушенный вымораживанием во флаконах стандартной дозы. Лиофилизат восстанавливают физиологическим раствором, после чего его можно инъецировать через иглу.
Препарат 2 содержит вышеупомянутый лиофилизат, высушенный вымораживанием во флаконах стандартной дозы. Лиофилизат восстанавливают физиологическим раствором, после чего им можно пропитывать различные каркасы. Примерами подходящих каркасов являются пористый ТКФ, либо диски ТКФ/ГАП, либо пористые полимерные композитные материалы.
Препарат 3 содержит вышеупомянутый лиофилизат, высушенный вымораживанием во флаконах стандартной дозы. Лиофилизат смешивают с солью кальция (кальция сульфатом, кальция фосфатом) с образованием формуемой пасты/мастики. Эту пасту/мастику можно формовать вручную, либо формовать в подходящие диски или пеллеты.
Материал для дозы 60 мг:
1. Флакон [1] - 60 мг лиофилизата.
2. Флакон [2] - 1 г физиологического раствора.
3. Флакон [3] - кальция сульфат полугидрат.
4. Флакон [4] - миска для смешивания.
5. Форма для диска.
6. Шпатель
Инструкция по применению.
1. Открыть флакон [1] с 60 мг лиофилизированного препарата и добавить 1 г физиологического раствора [2]. Перемешивать до образования гомогенной суспензии.
2. Распределить 2 г КС полугидрата из флакона [3] в сосуд для смешивания [4] и добавить суспензию из флакона [2].
3. Смешивать в течение 60 с, используя шпатель [6].
4. Пасту можно формовать в пределах 5 мин, и она затвердевает в течение 5-10 мин.
5. Заполнить форму для диска [5] пастой и оставить для отвердевания.
6. Каркасы готовы к имплантации после извлечения из формы после 60 мин.
Препарат 4 содержит вышеупомянутый лиофилизат, высушенный вымораживанием в лотках (Ьуодиагф. Лиофилизат смешивают с кальция сульфатом и стеариновой кислотой и прессуют в подходящие пеллеты.
Получение пеллет кальция сульфата и стеариновой кислоты.
Пеллеты КС/стеариновая кислота готовят в стерильной комнате.
Сначала избыток кальция сульфата полугидрата смешивают с водой ВДИ и экструдируют таким образом, чтобы сформовать полоску кальция сульфата дигидрата (гипса). Через 60 мин после затвердевания эту полоску (полоски) режут на пеллеты, а затем измельчают до мелких гранул на следующие сутки.
Избыточное количество стеариновой кислоты просеивают через сито 1 мм, чтобы удалить более крупные частицы.
Содержимое одного лиофилизированного флакона смешивали с 1,5 г кальция сульфата и 0,5 г стеариновой кислоты в небольшой миске.
Пеллеты диаметром 5 мм формуют путем взвешивания 100 мг порошкообразной смеси в таблеточном прессе, а затем прессуют в течение 10-15 с. Пеллетами заполняют стеклянный флакон и маркируют его.
Препарат 5 включает инъекционную пасту, содержащую вышеупомянутый лиофилизат, и доставляют через шприц подходящей системы. Паста состоит из полиэтиленгликоля (ΡΕΟ 2000), глицерина и стеариновой кислоты вместе со сферическими гранулами трикальцийфосфата (ТКФ).
- 44 024470
Пасту готовят путем взвешивания 37% ПЭГ 2000, 59% глицерина и 3,5% стеариновой кислоты в смесителе для пасты. Смесь нагревают выше точки плавления ПЭГ и стеариновой кислоты (60-70°С). Смеси дают возможность медленно охладиться при непрерывном перемешивании до тех пор, пока не сформируется паста, при комнатной температуре. Добавляют соответствующее количество вышеупомянутого лиофилизата и гранул ТКФ и перемешивают до гомогенности. Пастой заполняют шприцы и упаковывают их в алюминиевую фольгу. Конечный продукт содержит 1,27% экстракта белка, 0,01% Твина, 0,01% трегалозы, 0,06% глицина, 0,16% маннита, 28,9% ТКФ, 41,2% глицерина, 26,0% ПЭГ 2000 и 2,43% стеариновой кислоты.
Препарат 6 содержит пеллеты или гранулы с поверхностным покрытием. Экстракт ткани животных смешивают с пленкообразующими агентами, а затем распыляют в качестве покрытия на гранулы.
Получение гипсовых гранул.
Материал (на форму):
г кальция сульфата полугидрата (бета): δίβίικι-ΑΜΓκΙι.
г (5%) стеариновой кислоты: Уегск, ГаПеск, мл воды ВДИ: Ргезетик КаЫ, (Οηе-Μей).
Получение (6 форм).
Кальция сульфат (61 г) и стеариновую кислоту (3,0 г) смешивают, как описано ниже: сырьевой материал пропускают через сито 1 мм поочередно в малых количествах, чтобы смешивать их послойно. После этого их смешивают ложкой до гомогенной смеси.
Кальция сульфат со стеариновой кислотой (10,5 г) добавляют в воду ВДИ (5 мл) и перемешивают до получения однородной смеси (примерно 30 с). Смесь формуют в силиконовой форме и дают затвердеть под полимерной мембраной. Смесь является формуемой в течение примерно 5 мин, и формованные пеллеты могут быть извлечены из формы примерно через 60 мин.
Мелкие и более крупные остатки формования, образовавшиеся в процессе формования, удаляют путем просеивания. Конечное отвердевание происходит в течение 24 ч (под защитным слоем).
Сухие пеллеты упаковывают в лоскутные пакеты Μίηί^τίρ (2x67 г) и хранят в холодной комнате на высушивающем материале.
Покрытие гипсовых гранул.
Материалы, используемые при покрытии, перечислены в табл. 18-20.
Таблица 18
Композиция
Материал На дозу (2 г)
Экстракт белка 60 мг
Твин 20 0,44 мг
кмц 13,2 мг
ПЭГ 400 2,20 мг
Гипсовая пеллета 1921 мг
Таблица 19
Раствор покрытия (содержание сухого вещества распыляемой суспензии: 3%)
Материал Количество
КМЦ 1,63 г
ПЭГ400 0,27 г
Твин 20 0,5 г
Вода ВДИ 100 г
Твин 20/вода 10 г
Вода ВДИ 290 г
Таблица 20
Раствор покрытия и количество пеллет на партию
Г ипсовая пеллета 67 г ВВЗОу
Экстракт белка 7г ВВЗ ΟΥ, ΥΗϋ 200809
Раствор покрытия 146 г ΒΒ3ΟΥ
г экстракта белка взвешивают в контейнер для смешивания и добавляют 146 г раствора наполнителей. Смесь перемешивают до тех пор, пока она не станет визуально гомогенной. Суспензию поддерживают гомогенной с помощью магнитной мешалки все время в течение нанесения покрытия.
В гранулятор с псевдоожиженным слоем загружают 67 г пеллет кальция сульфата (3x3 мм). Пеллеты подвергают псевдоожижению сначала в течение 30 с, чтобы удалить избыточную гипсовую пыль. Покрытие начинают путем запуска подающего насоса раствора покрытия. Во время покрытия проводят
- 45 024470 мониторинг подачи раствора покрытия, положения распылительного устройства, флотацию пеллет и прилипания их к стенкам камеры.
Прилипание пеллет к стенкам камеры предотвращают путем пульсирующей подачи, чтобы оставить пеллеты сухими (например, в течение 15-секундных циклов).
Нанесение покрытия останавливают, когда весь раствор покрытия распылен, и избыточную влагу выпаривают с поверхности пеллет, т.е. влажность и температура выходящего воздуха становятся стабильными. Слишком длительное псевдоожижение не рекомендовано, поскольку пеллеты начнут измельчаться, и белок может быть унесен с поверхности.

Claims (22)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Препарат костного белка, включенный в матрицу полиэтиленгликоль/глицерин (РЕС-СЬУ), для обеспечения остеоиндуктивного эффекта, полученный способом, включающим:
    a) деминерализацию кости и экстракцию костного матрикса растворителем гуанидингидрохлоридом с получением экстракта костного белка;
    b) фильтрование экстракта микрофильтром с отсекаемым размером частиц в диапазоне 0,1-10 мкм (номинальное значение в микронах), достаточным для удаления крупных частиц и небелкового материала, но обеспечивающим прохождение белков;
    c) фильтрование фильтрата кассетным ультрафильтром, имеющим отсекаемый размер частиц примерно 5-10 кДа, с выделением препарата костного белка;
    6) включение препарата костного белка, полученного на стадии с), в матрицу полиэтиленгликоль/глицерин (РЕС-СЬУ).
  2. 2. Препарат костного белка по п.1, отличающийся тем, что отсекаемый размер стадии Ь) составляет примерно 0,22-0,1 мкм или примерно 1000 кДа.
  3. 3. Препарат костного белка по п.1 или 2, отличающийся тем, что препарат костного белка, полученный на стадии с), подвергнут диализу для его концентрирования и дополнительной очистки, такому как диализ водой или раствором цитрата.
  4. 4. Препарат костного белка по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что кость представляет собой кость млекопитающего, такую как кость северного оленя.
  5. 5. Препарат костного белка по п.4, отличающийся тем, что кость представляет собой губчатую или трубчатую кость.
  6. 6. Препарат костного белка, содержащий матриксный С1а-белок, 8РР-24 (секретируемый фосфопротеин), ВМР-2, ВМР-7 и ТСР-в1 в количествах, достаточных, чтобы обеспечить остеоиндуктивный эффект при ведении, отличающийся тем, что он включен в матрицу полиэтиленгликоль/глицерин (РЕССЬУ).
  7. 7. Препарат костного белка по п.6, отличающийся тем, что он содержит по меньшей мере одно из следующего: бигликан, тромбин, ламин А/С, виментин, хондроадгерин, 22К внеклеточный матриксный белок, лизилоксидазу, остеонектин, коллаген или дерматопонтин в количествах, достаточных, чтобы обеспечить остеоиндуктивный эффект.
  8. 8. Препарат костного белка по п.6 или 7, отличающийся тем, что он представляет собой препарат костного белка по любому из пп.1-5.
  9. 9. Препарат костного белка по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что препарат костного белка находится в форме лиофилизата.
  10. 10. Гранула, содержащая препарат костного белка по любому из пп.1-8.
  11. 11. Гранула по п.10, отличающаяся тем, что препарат костного белка находится на грануле в виде покрытия.
  12. 12. Гранула по п.10 или 11, отличающаяся тем, что представляет собой гранулу βтрикальцийфосфата (ТКФ).
  13. 13. Гранула по п.10, отличающаяся тем, что представляет собой гранулу кальция сульфата (КС).
  14. 14. Гранула по п.10, отличающаяся тем, что представляет собой гранулу гидроксиапатита (ГАП).
  15. 15. Гранула по п.10, отличающаяся тем, что представляет собой гранулу гидроксиапатит/βтрикальцийфосфат/кальция сульфат (ГАП/ТКФ/КС) предпочтительно в соотношении примерно 60:30:10 (мас./мас.).
  16. 16. Гранула по любому из пп.10-15, отличающаяся тем, что содержит стеариновую кислоту.
  17. 17. Гранула по п.10, отличающаяся тем, что препарат костного белка представляет собой препарат костного белка северного оленя, который находится в матрице полиэтиленгликоль/глицерин (РЕС-СЬУ), содержащей стеариновую кислоту, содержащуюся в гранулах β-трикальцийфосфата (ТКФ).
  18. 18. Пеллета, содержащая препарат костного белка по любому из пп.1-8.
  19. 19. Пеллета по п.18, отличающаяся тем, что препарат костного белка находится на пеллете в виде покрытия.
  20. 20. Паста, содержащая препарат костного белка по любому из пп.1-8 или гранулу по любому из пп.10-17.
    - 46 024470
  21. 21. Остеогенное устройство, представляющее собой имплантат кости, содержащий препарат костного белка по любому из пп.1-8 или гранулу по любому из пп.10-17.
  22. 22. Способ лечения расстройств, относящихся к дефектам кости, хряща или зуба, где желательна их регенерация, репарация или рост, включающий введение препарата костного белка по любому из пп.1-8 или гранулы по любому из пп.10-17.
EA201390030A 2010-06-28 2011-06-27 Способ получения препарата костного белка и препарат костного белка EA024470B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10167448 2010-06-28
EP11160828 2011-04-01
PCT/EP2011/060702 WO2012000930A1 (en) 2010-06-28 2011-06-27 A method for preparing a bone protein preparation and a bone protein preparation

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201390030A1 EA201390030A1 (ru) 2013-11-29
EA024470B1 true EA024470B1 (ru) 2016-09-30

Family

ID=44628070

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201390030A EA024470B1 (ru) 2010-06-28 2011-06-27 Способ получения препарата костного белка и препарат костного белка

Country Status (6)

Country Link
US (3) US10702584B2 (ru)
EP (1) EP2585083B1 (ru)
CA (1) CA2840546C (ru)
EA (1) EA024470B1 (ru)
ES (1) ES2552668T3 (ru)
WO (1) WO2012000930A1 (ru)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107236775A (zh) * 2017-06-05 2017-10-10 深圳知本康业有限公司 一种鹿骨蛋白多肽及应用
US10702584B2 (en) 2010-06-28 2020-07-07 Bbs-Bioactive Bone Substitutes Oyj Method for preparing a bone protein preparation and a bone protein preparation
RU2819906C2 (ru) * 2017-07-31 2024-05-28 Лети Фарма, С.Л. Ветеринарный продукт

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6417596B2 (ja) * 2013-06-05 2018-11-07 株式会社サンギ 粉体噴射用ハンドピース
US20160022379A1 (en) * 2014-07-23 2016-01-28 Duane C. Keller Assemblies For Improved Periodontal Surgery And Recovery Therefrom
WO2016120341A2 (en) * 2015-01-27 2016-08-04 Vitak B.V. Epidermal skin health
AU2016304809B2 (en) * 2015-08-07 2020-09-24 Allosource Rapid allograft treatment systems and methods
DK3359318T3 (da) 2015-10-09 2020-07-20 Particle3D ApS Fremgangsmåde til 3d-printning under anvendelse af en suspension
CN106789313A (zh) * 2016-12-30 2017-05-31 成都康赛信息技术有限公司 基于JFinal架构的路由管理优化方法
WO2024086171A1 (en) * 2022-10-17 2024-04-25 Lifenet Health Bone grafts

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002047713A2 (en) * 2000-12-15 2002-06-20 Sulzer Biologics Inc. Composition containing a mixture of growth factor for the treatment of renal injury
US6511958B1 (en) * 1997-08-14 2003-01-28 Sulzer Biologics, Inc. Compositions for regeneration and repair of cartilage lesions
US20040072322A1 (en) * 2002-06-26 2004-04-15 Kevin Thorne Rapid isolation of osteoinductive protein mixtures from mammalian bone tissue
US20050098915A1 (en) * 2003-11-07 2005-05-12 Smith & Nephew Inc. Manufacture of bone graft substitutes
US20060093640A1 (en) * 2002-06-20 2006-05-04 Nicolaas Duneas Osteoinductive biomaterials
WO2007053850A2 (en) * 2005-11-01 2007-05-10 Osteotech, Inc. Bone matrix compositions and methods

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5133755A (en) 1986-01-28 1992-07-28 Thm Biomedical, Inc. Method and apparatus for diodegradable, osteogenic, bone graft substitute device
ES2225870T3 (es) 1996-02-29 2005-03-16 Bioactive Bone Substitute Oy, Ab Dispositivo osteogenico y su procedimiento de preparacion.
US20030032586A1 (en) 1997-05-15 2003-02-13 David C. Rueger Compositions for morphogen-induced osteogenesis
US7622562B2 (en) * 2002-06-26 2009-11-24 Zimmer Orthobiologics, Inc. Rapid isolation of osteoinductive protein mixtures from mammalian bone tissue
EP1960008A2 (en) * 2005-12-14 2008-08-27 Scil Technology GmbH A moldable biomaterial for bone regeneration
KR101512863B1 (ko) * 2007-03-26 2015-04-16 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 주입 가능한 연조직 증강용 공극 충전제
ITFI20080058A1 (it) * 2008-03-27 2009-09-28 Tissuelab S P A Pasta d'osso umano, sua preparazione ed uso.
US9320761B2 (en) * 2008-12-18 2016-04-26 Vivex Biomedical, Inc. Bone induction system and methods
US10702584B2 (en) 2010-06-28 2020-07-07 Bbs-Bioactive Bone Substitutes Oyj Method for preparing a bone protein preparation and a bone protein preparation

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6511958B1 (en) * 1997-08-14 2003-01-28 Sulzer Biologics, Inc. Compositions for regeneration and repair of cartilage lesions
WO2002047713A2 (en) * 2000-12-15 2002-06-20 Sulzer Biologics Inc. Composition containing a mixture of growth factor for the treatment of renal injury
US20060093640A1 (en) * 2002-06-20 2006-05-04 Nicolaas Duneas Osteoinductive biomaterials
US20040072322A1 (en) * 2002-06-26 2004-04-15 Kevin Thorne Rapid isolation of osteoinductive protein mixtures from mammalian bone tissue
US20050098915A1 (en) * 2003-11-07 2005-05-12 Smith & Nephew Inc. Manufacture of bone graft substitutes
WO2007053850A2 (en) * 2005-11-01 2007-05-10 Osteotech, Inc. Bone matrix compositions and methods

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ULMANEN, M.S. PEKKARINEN, T. HIETALA, O.A. BIRR, E.A. JALOVAARA, P.: "Osteoinductivity of partially purified native ostrich (Struthio camelus) bone morphogenetic protein: Comparison with mammalian species", LIFE SCIENCES., PERGAMON PRESS, OXFORD, GB, vol. 77, no. 19, 23 September 2005 (2005-09-23), GB, pages 2425 - 2437, XP005044547, ISSN: 0024-3205 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10702584B2 (en) 2010-06-28 2020-07-07 Bbs-Bioactive Bone Substitutes Oyj Method for preparing a bone protein preparation and a bone protein preparation
US11219665B2 (en) 2010-06-28 2022-01-11 Bbs-Bioactive Bone Substitutes Oyj Method for preparing a bone protein preparation and a bone protein preparation
CN107236775A (zh) * 2017-06-05 2017-10-10 深圳知本康业有限公司 一种鹿骨蛋白多肽及应用
RU2819906C2 (ru) * 2017-07-31 2024-05-28 Лети Фарма, С.Л. Ветеринарный продукт

Also Published As

Publication number Publication date
EP2585083B1 (en) 2015-09-09
US10702584B2 (en) 2020-07-07
CA2840546C (en) 2020-05-05
EP2585083A1 (en) 2013-05-01
WO2012000930A1 (en) 2012-01-05
US20200289617A1 (en) 2020-09-17
US20150202265A1 (en) 2015-07-23
ES2552668T3 (es) 2015-12-01
CA2840546A1 (en) 2012-01-05
US20220125881A1 (en) 2022-04-28
US11219665B2 (en) 2022-01-11
EA201390030A1 (ru) 2013-11-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11219665B2 (en) Method for preparing a bone protein preparation and a bone protein preparation
Grgurevic et al. Recombinant human bone morphogenetic protein 6 delivered within autologous blood coagulum restores critical size segmental defects of ulna in rabbits
Waselau et al. Effects of a magnesium adhesive cement on bone stability and healing following a metatarsal osteotomy in horses
EP3697459B1 (en) Autologous bone graft substitute
Parizi et al. Effectiveness of synthetic hydroxyapatite versus Persian Gulf coral in an animal model of long bone defect reconstruction
Alluri et al. Regional gene therapy with 3D printed scaffolds to heal critical sized bone defects in a rat model
AU2014331971B2 (en) Processed bone particle compositions and related methods
Bolaños et al. Long-term in vivo performance of low-temperature 3D-printed bioceramics in an equine model
Kanjilal et al. Bone morphogenetic proteins (BMPs) and bone regeneration
Ding et al. Efficacy of a small cell‐binding peptide coated hydroxyapatite substitute on bone formation and implant fixation in sheep
Jeong et al. Acceleration of bone formation by octacalcium phosphate composite in a rat tibia critical-sized defect
US11596712B2 (en) Autologous bone graft substitute composition
Iwai et al. Bone regeneration by freeze‐dried composite of octacalcium phosphate collagen and teriparatide
SHAFIEI Histological, biomechanical and radiological evaluation of bone repair with human platelet rich plasma in rabbit model
Liu et al. Bone morphogenetic Protein-2 derived peptide loaded calcium sulfate hemihydrate scaffold for enhanced bone tissue regeneration
Stogov et al. Preclinical evaluation of the efficacy and safety of a new osteoplastic material of xenogenic origin containing vancomycin or meropenem
Lee et al. Bone Regenerative Effects of Biphasic Calcium Phosphate Collagen, Bone Morphogenetic Protein 2, Mesenchymal Stem Cells, and Platelet-Rich Plasma in an Equine Bone Defect Model
Suddaby et al. Osteoimmunological Principles Adapted to Achieve Mechanically Superior Posterolateral Fusion in a New Zealand White Rabbit Model Using Antigen-Coated, Electrospun Beta-Tricalcium Phosphate
Ali et al. Repairing an A unilateral Critical-Sized Mandibular Defect in Rabbits Using Hydroxyapatite Matrix, Polylactic-Polyglycolic Acid (HA/PLGA) Scaffold, and Platelet Rich Plasma [PRP]
Plachokova Biologically active additives-Relevance for bone regeneration.
Lee A Pilot Study to Compare the Activity of Different Bone Morphogenetic Protein Bioimplants In Vivo

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KG MD TJ TM