ES2552668T3

ES2552668T3 - Una preparación de proteína ósea en una matriz de polietilenglicol/glicerol

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Publication number: ES2552668T3
Application number: ES11729961.0T
Authority: ES
Inventors: Hanna TÖLLI; Juha-Matti NÄRHI; Harri Lumme; Elli Birr; Oili Hietala; Mikko Viitanen; Merja Haikola; Pekka Jalovaara; Bo Kenneth SANDSTRÖM
Original assignee: BBS BIOACTIVE BONE SUBSTITUTES Oy; BBS - BIOACTIVE BONE SUBSTITUTES Oy
Current assignee: BBS BIOACTIVE BONE SUBSTITUTES Oy; BBS - BIOACTIVE BONE SUBSTITUTES Oy
Priority date: 2010-06-28
Filing date: 2011-06-27
Publication date: 2015-12-01
Anticipated expiration: 2031-06-27
Also published as: EP2585083B1; US20200289617A1; EA024470B1; US11219665B2; WO2012000930A1; EA201390030A1; US20220125881A1; CA2840546C; CA2840546A1; EP2585083A1; US10702584B2; US20150202265A1

Abstract

Una preparación de proteína ósea obtenida por un método que comprende: a) desmineralizar un hueso y extraer la matriz ósea con el disolvente hidrocloruro de guanidina para obtener un extracto de proteína ósea, b) filtrar el extracto con un microfiltro con un tamaño de corte en el intervalo de 0,1-10 μm (valor micrométrico nominal) suficiente para retirar grandes partículas y material no proteínico pero permitir que pasen las proteínas, c) filtrar la fracción no retenida con un ultrafiltro de cartucho que tiene un tamaño de corte de alrededor de 5-10 kDa para recuperar la preparación de proteína ósea, en la que la preparación de proteína ósea obtenida se incorpora en una matriz de polietilenglicol/glicerol (PEG-GLY).

Description

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DESCRIPCION

Una preparacion de protema osea en una matriz de polietilenglicol/glicerol Una matriz de polietilenglicol/glicerol de preparacion osea

Los ejemplos descritos aqu se refieren a metodos para preparar preparaciones de protema osea. Varias realizaciones de la presente invencion se refieren a preparaciones de protema osea obtenidas por estos metodos, y a composiciones que contienen una o mas de estas preparaciones, incluyendo dispositivos osteogenicos.

Antecedentes de la invencion

En los campos quirurgicos ortopedicos y periodontales es muy deseable encontrar sistemas eficientes para tratar pacientes con trastornos y deformaciones esqueleticas, que incluyen la reparacion de grandes defectos oseos que se originan de trauma, escision de tumores y malformaciones congenitas, la reconstruccion de masas oseas desgastadas por una endoprotesis implantada en operaciones de revision y fracturas sin unir o de curacion retrasada.

El injerto autologo (“autoinjerto”) es el enfoque tradicional para la reparacion osea, pero la cosecha de injertos oseos puede conducir a complicaciones, tales como sangrado, dolor e infeccion. Los autoinjertos tienen tambien disponibilidad limitada de este modo, como alternativa, se usan muchos materiales inorganicos. Los fosfatos de calcio tales como hidroxiapatito (HAP) y fosfatos de tricalcio (TCP) y sus variaciones son materiales substitutos del hueso comunmente conocidos. Estos materiales proporcionan una estructura osteoconductiva para la formacion de nuevo hueso.

La bioactividad de materiales inorganicos se puede incrementar anadiendo estfmulo osteogenico al extensor de injerto oseo. Se ha mostrado que los aloinjertos, matrices oseas desmineralizadas (DBM) y extractos oseos nativos aumentan la capacidad de curacion del hueso y mejoran la integracion en muchos estudios diferentes. Se ha demostrado que las combinaciones de factores de crecimiento derivados de hueso bovino en colageno y soportes de DBM y de HAP coralino son tan buenas como los autoinjertos de cresta ilfaca cuando se estudian como tasas de fusion en artrodesis espinal en conejos y monos.

Se han desarrollado biomateriales sintetizados comercialmente disponibles y se pueden usar como material de relleno o soporte incrustado asf como superpuesto. Por desgracia, estos materiales carecen de la actividad biologica necesaria para iniciar la regeneracion osea. Los soportes sinteticos preparados a partir de tales materiales que incluyen poli(acidos lacticos) y acidos hialuronicos se describen por ejemplo, en la patente de EE.UU. 5 366 508. La protema morfogenetica osea (BMP) se considera un factor importante en dispositivos osteogenicos y participa activamente en el proceso de implantacion.

El documento EP 0 883 410 B1 describe un metodo para producir el complejo de protema morfogenetica osea (BMP) modificada para un dispositivo osteogenico en el que el complejo de BMP modificada es obtenible por un metodo que comprende las etapas de (a) pulverizar material oseo desmineralizado; (b) extraer el material oseo en la etapa (a) con hidrocloruro de guanidinio (GuHCl); (c) realizar una filtracion usando un sistema de flujo tangencial; (d) realizar una filtracion en gel por la que es obtenible un complejo de BMP parcialmente purificada que muestra tres picos que comprenden tres fracciones de protema, que se caracterizan por tener diferentes pesos moleculares, siendo la Fraccion I una protema de alto peso molecular (100-700 kD) con la actividad de BMP osteoinductiva, siendo la Fraccion II una protema inmunogena de Pm medio (25-55 kDa) que carece de actividad de BMP y siendo la Fraccion III una protema de un Pm bajo (15-25 kDa) con actividad de bMp osteoinductiva; y (e) retirar de la BMP parcialmente purificada una fraccion de protema con propiedades inmunogenas e inflamatorias que tienen un Pm de 25-55 kD tal como se determina por filtracion en gel.

Ulmanen et al. (LIFE SCIENCES vol.77, no.19, p.2425-2437, 2005) describe la induccion de la formacion de hueso ectopico por medio de protemas morfogeneticas oseas en capsulas de gelatina.

La necesidad de mas materiales osteogenicos que son utiles para una variedad de aplicaciones de reparacion osea, especialmente, materiales que son compatibles con los materiales de soporte tfpicamente usados en las aplicaciones descritas anteriormente, es manifiesta.

Sumario de la invencion

Se descubrio sorprendentemente que un extracto de protema osea que contiene factores de crecimiento, entre otras protemas, proporciona propiedades osteogenicas unicas. El extracto de protema osea, por ejemplo, puede acelerar la desorcion de una estructura o soporte, en el que se incorpora el extracto.

Por consiguiente, varios ejemplos incluyen metodos para preparar una preparacion de protema osea, en los que los metodos se practican por:

a) desmineralizar el hueso y extraer la matriz osea con hidrocloruro de guanidina para obtener un extracto de protema osea,

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b) filtrar el extracto con un microfiltro con tamano de corte suficiente para retirar partmulas grandes y material no protemico pero permitir que pasen las protemas,

c) filtrar la fraccion no retenida con un ultrafiltro de cartucho que tiene un tamano de corte de alrededor de 5-10 kD para recuperar la preparacion de protema osea.

Varios ejemplos descritos aqm comprenden una preparacion de protema osea obtenida por uno mas de los metodos anteriormente mencionados.

La invencion proporciona una preparacion de protema osea obtenida por un metodo que comprende:

a) desmineralizar un hueso y extraer la matriz osea con hidrocloruro de guanidina como disolvente para obtener un extracto de protema osea,

b) filtrar el extracto con un microfiltro de tamano de corte en el intervalo de 0,1-10 pm (valor micrometrico nominal) suficiente para retirar grandes partmulas y material no protemico pero permitir que pasen las protemas,

c) filtrar la fraccion no retenida con un ultrafiltro de cartucho que tiene un tamano de corte de 5-10 kDa para recuperar la preparacion de protema osea.

en el que la preparacion de protema osea obtenida se incorpora en una matriz de polietilenglicol/glicerol (PEG/GLY).

Algunos ejemplos incluyen una preparacion de protema osea que contiene factores de crecimiento, factores de diferenciacion y moleculas de senalizacion que proporcionan, cuando se combinan, un efecto y/o actividad sinergica que puede ser util para propositos osteoinductivos, por ejemplo, promover ventajosas propiedades de induccion osea. Los factores de crecimiento, factores de diferenciacion y moleculas de senalizacion pueden incluir protemas definidas aqm, como la(s) protema(s) morfogenetica(s) osea(s) (BMP) y protemas que se encuentran en extractos oseos desmineralizados nativos. En un ejemplo se obtiene la preparacion de protema osea que contiene factores de crecimiento, factores de diferenciacion y moleculas de senalizacion con cualquier metodo descrito aqm.

Los aspectos de la presente invencion tambien incluyen una preparacion de protema osea que contiene una o mas de las protemas descritas aqm incorporadas en una matriz de polietilenglicol/glicerol (PEG-GLY), por ejemplo, algunas realizaciones comprenden o consisten esencialmente en una protema Gla de la matriz, SPP-24 (fosfoprotema secretada), bMp-2, BMP-7 y/o TGF-beta 1.

Los aspectos de la invencion tambien incluyen pastas o geles, tales como una pasta o gel inyectable, que comprende una o mas de las preparaciones de protema osea descritas aqm incorporada en una matriz de polietilenglicol/glicerol (PEG-Gly). La pasta o gel puede ser moldeable, forma que tambien se puede llamar masilla.

Por consiguiente, algunas realizaciones incluyen una masilla, un pelet, un disco, un bloque o un granulo que comprende una preparacion de protema osea que comprende una o mas de las protemas descritas aqm incorporada en una matriz de polietilenglicol/glicerol (PEG-Gly), por ejemplo, algunas realizaciones comprenden o consisten esencialmente en una protema Gla de la matriz, sPP-24 (fosfoprotema secretada), BMP-2, BMP-7 y/o TGF-beta 1.

Algunas realizaciones tambien incluyen un dispositivo osteogenico, tal como un implante oseo, que contiene una o mas de las preparaciones de protema osea descritas aqm incorporada en una matriz de polietilenglicol/glicerol (GLY- PEG), tal como una matriz porosa de polietilenglicol/glicerol (PEG-GLY). Es decir, algunas realizaciones son dispositivos osteogenicos que comprenden una o mas de las protemas descritas aqm en una matriz de polietilenglicol/glicerol (PEG-GLY), por ejemplo, algunas realizaciones comprenden o consisten esencialmente en una protema Gla de la matriz, SpP-24 (fosfoprotema secretada), BMP-2, BmP-7 y/o TGF-beta 1.

En algunos ejemplos, una o mas de las preparaciones de protema osea descritas aqm se pueden usar para tratar, mejorar, inhibir, o prevenir un trastorno o estado relacionado con defectos oseos, de cartflago, tendon o diente, en el que se desea su regeneracion, reparacion o crecimiento, tal como el cancer.

Algunos ejemplos descritos aqm incluyen una composicion farmaceutica que contiene una o mas de las preparaciones de protema osea descritas aqm. Estas composiciones farmaceuticas se pueden usar para tratar, mejorar, inhibir, o prevenir un trastorno o estado relacionado con defectos oseos, de cartflago, tendon o dientes, en el que se desea su regeneracion, reparacion o crecimiento, tal como el cancer.

En algunos ejemplos, se contemplan metodos para inducir la formacion de hueso, cartflago, tendon, o diente, in vitro o in vivo, y estos metodos se practican proporcionando o administrando una o mas de las preparaciones oseas descritas aqm (deseablemente, en un dispositivo osteogenico o matriz apropiada) a un sujeto que lo necesite, por ejemplo, un ser humano o animal (incluyendo animales domesticos y de compama). Opcionalmente, el sujeto se puede identificar o clasificar como un sujeto que necesita un agente que induce la formacion de hueso, cartflago, tendon, o diente y tal evaluacion puede ser realizada por el diagnostico clmico de un medico, dentista o cirujano. Opcionalmente, estos metodos tambien incluyen el analisis, observacion, medida o evaluacion clmica de la formacion de hueso, cartflago, tendon, o diente antes y/o despues de proporcionar o administrar una o mas de las preparaciones oseas descritas aqm (deseablemente, en un dispositivo osteogenico o matriz apropiada) para el

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sujeto que lo necesite.

En mas ejemplos, se contemplan metodos para tratar, mejorar, inhibir, o prevenir un trastorno o estado relacionado con los defectos oseos o de cartflago, tales como el cancer. Estos metodos se pueden practicar proporcionando o administrando una o mas de las preparaciones oseas descritas aqrn (deseablemente, en un dispositivo osteogenico o matriz apropiada) a un sujeto que lo necesite, por ejemplo, un ser humano o animal (incluyendo los animales domesticos y de comparMa). Opcionalmente, el sujeto se puede identificar o clasificar como un sujeto que necesita un agente que trata, mejora, inhibe, o previene un trastorno o estado relacionado con los defectos oseos o de cartflago, tal como cancer, y tal evaluacion se puede realizar por diagnostico clmico por un medico, dentista o cirujano. Opcionalmente, estos metodos tambien incluyen el analisis, observacion, medicion o evaluacion clmica de la formacion de hueso, cartflago, tendon, o dientes antes y/o despues de proporcionar o administrar una o mas de las preparaciones oseas descritas aqrn (deseablemente, en un dispositivo osteogenico o matriz apropiada) para el sujeto que lo necesite. Opcionalmente, estos metodos tambien incluyen el analisis, observacion, medicion, o evaluacion clmica de la progresion, inhibicion, mejora o tratamiento de la enfermedad, trastorno, o estado asociado a la misma y estos analisis, observaciones, o mediciones se pueden hacer por evaluacion clmica o enfoques de diagnostico.

En todavfa mas realizaciones, uno o mas de los extractos de protemas oseas descritos aqrn incorporados en una matriz de polietilenglicol/glicerol (PEG-GLY) se combinan con una estructura o soporte, tal como fosfato de tricalcio o sulfato de calcio, y la composicion resultante se usa para acelerar la desorcion de la estructura o soporte, mejorando por ello el proceso de curacion del hueso, en un sujeto que necesite curacion del hueso. Por consiguiente, se contemplan metodos para acelerar la formacion de hueso, cartflago, tendon, o dientes, in vitro o in vivo, y estos metodos se practican por proporcionar o administrar una composicion que comprende uno o mas de los extractos de protemas oseas descritos aqrn y fosfato de tricalcio o sulfato de calcio a un sujeto que lo necesite, por ejemplo, un ser humano o animal (incluyendo los animales domesticos y de comparna). Opcionalmente, el sujeto puede ser identificado o clasificado como un sujeto que necesita un agente que acelera la formacion de hueso, cartflago, tendon, o dientes y tal evaluacion se puede realizar por diagnostico clmico de un medico, dentista o cirujano. Opcionalmente, estos metodos tambien incluyen el analisis, observacion, medicion o evaluacion clmica de la, formacion del cartflago, tendon, o diente antes y/o despues de proporcionar o administrar una o mas de las preparaciones oseas descritas aqrn (deseablemente, en un dispositivo osteogenico o matriz apropiada) al sujeto que lo necesite.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 muestra los cambios en el flujo de filtrado durante la filtracion de 1000 kDa. El volumen total del lote era de 45 litros.

La Figura 2 muestra la concentracion de protema total (mg/ml) en las corrientes de filtrado y fraccion retenida durante la microfiltracion. El muestreo se realizo siempre cuando se acumularon cuatro litros de filtrado y en el punto final.

La Figura 3 muestra las velocidades de flujo durante la ultrafiltracion a traves de filtros de tipo V de 10 kDa. A representa un lote de 22 litros y B un lote de 23 litros.

La Figura 4 muestra un analisis de SDS-PAGE del filtrado final de la filtracion a traves del filtro de cartucho de tipo V de 10 kDa (lmea 2). La electroforesis se efectuo usando condiciones reducidas y voltaje constante de 200 V durante 50 minutos. Los tamanos de protemas de peso molecular estandar (lmea 1) comenzando desde arriba son de 250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 20, 15 y 10 kDa.

La Figura 5 muestra la determinacion del flujo cntico para microfiltracion. Flujo (arriba) y TMP (abajo) a caudales transversales iniciales de 1,15 l/min (A) y 1,66 l/min (B).

La Figura 6 muestra la determinacion del flujo cntico para microfiltracion a traves de un filtro de cartucho de 1000 kDa. Flujo (arriba) y TMP (abajo) a caudales transversales iniciales de 2,15 l/min (A) y 2,75 l/min (B).

La Figura 7 muestra las curvas de optimizacion de flujo vs. TMP en el caso de VCF 1 para el filtro de cartucho de ultrafiltracion de tipo V de 10 kDa. Los caudales transversales iniciales usados eran 1,15 l/ml (A), 1,66 l/min (B), 2,15 l/min (C) y 2,75 l/min (D).

La Figura 8 muestra la optimizacion del flujo vs. TMP en el caso de VCF 10 para el filtro de cartucho de ultrafiltracion del tipo V de 10 kDa. Los caudales transversales iniciales usados eran 1,66 l/min (A) y 2,75 l/min (B).

La Figura 9 muestra el resumen del modelo ajustado usando el metodo de mmimos cuadrados parcial (PLS) en MODDE. Las dos respuestas en el modelo eran tiempo y concentracion de protema (rendimiento).

La Figura 10 muestra el efecto de los parametros estudiados en la duracion de las ultrafiltraciones disenadas usando software MODDE. La abreviatura “pum” se refiere a velocidad de bombeo, “ret” a estrangulamiento de la fraccion retenida, “Temp” a temperatura de filtracion, “Mem(A)” a membrana A (Biomax tipo C, filtro de polietersulfona) y

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“(Mem(B)” a membrana B (Ultracel tipo C, filtro de celulosa regenerada).

La Figura 11 muestra perfiles de protema de cuatro filtrados de ultrafiltraciones disenadas usando software MODDE. El analisis SDS-PAGE se efectuo usando condiciones no reductoras y voltaje constante de 200 V durante 50 minutes. Lmea 1: peso molecular estandar, lmea 2: filtrado del experimento 1 (membrana B), lmea 3: filtrado del experimento 4 (membrana B), lmea 4: filtrado del experimento 7 (membrana A) y lmea 5: filtrado del experimento 10 (membrana A). Los tamanos de las protemas de peso molecular estandar (lmea 1) comenzando desde arriba son 250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 20, 15 y 10 kDa.

La Figura 12 muestra las curvas para la optimizacion de flujo versus TMP para cartucho de ultrafiltracion de tipo C Biomax. El VCF era 1 y los caudales transversales iniciales 0,945 l/min (A), 1,125 l/min (B) y 1,350 l/min (C).

La Figura 13 muestra las curvas para la optimizacion de flujo versus TMP para cartucho de ultrafiltracion de tipo C Biomax. El VCF era 5 y los caudales transversales iniciales 0,945 l/min (A) y 1,350 l/min (B).

La Figura 14 muestra las curvas para la optimizacion del flujo versus TMP para cartucho de ultrafiltracion de tipo C Ultracel. El VCF era 1 y los caudales transversales iniciales 0,730 l/min (A), 0,945 l/min (B) y 1,125 l/min (C).

La Figura 15 muestra las curvas para la optimizacion del flujo versus TMP para cartucho de ultrafiltracion de tipo C Ultracel. El VCF era 5 y los caudales transversales iniciales 0,945 l/min (A) y 1,125 l/min (B).

La Figura 16 muestra la recuperacion de filtros NWP de tipo C Biomax y Ultracel despues del ciclo de limpieza con NaOH 0,1 M a 37°C durante 30 minutos. Las filtraciones anteriores se realizaron usando un volumen de alimentacion de 3 l para VCF de 10.

La Figura 17 muestra un diagrama de una configuracion ejemplar en un procedimiento de fabricacion a pequena escala.

La Figura 18 muestra un diagrama de flujo de un procedimiento ejemplar para la obtencion del extracto de protema osea.

La Figura 19 muestra un SDS-PAGE de extracto nativo desmineralizado con acido formico. Las bandas de protemas se aislaron de SDS-PAGE y se analizaron con MS-MALDI-TOF

La figura 20 muestra un SDS-PAGE de extracto nativo desmineralizado con HCl. Las bandas de protemas se aislaron de SDS-PAGE y se analizaron con MS-MALDI-TOF

La Figura 21 muestra los volumenes oseos medidos a partir de imagenes micro-CT. En las comparaciones estadfsticas todos los otros grupos eran significativamente mejores que la matriz osea desmineralizada (DBM Grafton Plus®) grupo (ap <0,02). Todos los grupos de implante de extracto de protema osea, el grupo de autoinjerto y tambien otros grupos de control, excepto el grupo de DBM se habfan curado significativamente mejor que los defectos no tratados (bp <0,02). El grupo de autoinjerto era significativamente mejor en volumen oseo que el grupo de pasta 4 (cp <0,02). Los grupos de control se han marcado como dibujo de picaduras.

La Figura 22 muestra el examen histologico que muestra la bioactividad y la formacion de nuevo hueso para una dosis de 3 mg de extracto de protema osea de reno en una capsula de gelatina en el modelo de bolsa de raton. B = hueso. (Aumento original 10x).

La Figura 23 muestra el examen histologico que muestra la formacion de nuevo hueso y la respuesta del implante en el modelo de bolsa de raton usando diferentes soportes con el extracto de protema osea de reno: (a) HAP/TCP/CS 30:60:10 activo, (b) HAP/TCP/CS 30:60:10 control sin extracto de protema osea, (c) CS hemihidrato activo, (d) CS hemihidrato de control (e) CS dihidrato + acido estearico activo, y (f) CS dihidrato de control + acido estearico. C= celulas del cartflago calcificado, B = hueso, M = musculo, F = tejido fibrotico, e I = soporte de implante. (Aumento original 10x).

La figura 24 muestra la evaluacion radiografica de la formacion de nuevo hueso en el modelo de bolsa de raton usando diferentes soportes con el extracto de protema osea de reno. El control sin el extracto de protema osea estaba localizado en el lado derecho, y el implante activo estaba localizado en el lado izquierdo: (a) HAP/TCP/CS 30:60:10, (b) CS hemihidrato, y (c) CS dihidrato + acido estearico.

La figura 25 muestra ejemplos de pCT de CS activa (P2.1) y grupos de control de CS (P2.2) despues de 3 semanas de seguimiento. Los pellets se han reabsorbido y se ve alguna formacion de hueso.

La figura 26 muestra ejemplos de pCT de CS activa (P7.1) y grupos de control (P3U.3) despues de 8 semanas de seguimiento. Se ve mas formacion de hueso en el lado activo comparado con el lado de control.

La figura 27 muestra ejemplos de pCT de p-TCPId activo (P2.3) y grupos de control (P2.4) despues de 3 semanas de seguimiento. Se puede ver alguna formacion de hueso alrededor de los granulos. La resorcion de granulos es todavfa lenta.

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La figura 28 muestra ejemplos de |jCT de p-TCPId activo (P7.3) y grupos de control (P7.4) despues de 8 semanas de seguimiento. La mayor parte de los granulos de TCP se han reabsorbido en el lado activo y reemplazado por nuevo hueso. En el lado de control los granulos se han reabsorbido mas lentamente y la formacion de hueso se puede encontrar solamente alrededor de los granulos. Hay claramente mas formacion de hueso en el grupo activo que en el grupo control.

La figura 29 muestra un ejemplo de |jCT del grupo de p-TCPhd activo despues de 3 semanas de seguimiento. Los granulos todavfa no se reabsorbieron y se puede encontrar formacion de hueso alrededor de los granulos. No se encuentra ejemplo de control.

La figura 30 muestra ejemplos de |jCT de p-TCPhd activo (P9.1) y grupos de control (P10.3) despues de 8 semanas de seguimiento. La formacion de hueso es mas efectiva y la resorcion de granulos es mas rapida en el lado activo comparado con el lado de control.

La Figura 31 muestra un ejemplo de |jCT del grupo de defecto vado despues de 3 semanas de seguimiento. El sitio del defecto esta vado y no se ve formacion de hueso.

La figura 32 muestra ejemplos de |jCT del grupo de defecto vado despues de 8 semanas de seguimiento. Se ve formacion normal, muy minoritaria, de hueso en los bordes del defecto pero el defecto no se ha curado.

La Figura 33 muestra un corte histologico de CS activo, despues de 3 semanas de seguimiento (tincion de MG, aumento original 6,3x, BF = area de formacion de nuevo hueso). Se ve poca formacion de hueso.

La Figura 34 muestra cortes histologicos de CS activo, despues de 8 semanas de seguimiento (tincion de MG, aumento original 6.3x, BF = area de formacion de nuevo hueso). Se ve mucha formacion de hueso en el sitio del defecto.

La figura 35 muestra un corte histologico de CS de control, despues de 3 semanas de seguimiento (tincion de MG, aumento original 6,3x, PR = restos de pellets). Se ven restos de pelets en el sitio del defecto pero sin signos de formacion de nuevo hueso.

La figura 36 muestra un corte histologico de CS de control, despues de 8 semanas de seguimiento (tincion de MG, aumento original 6,3x, BF = formacion de nuevo hueso). Se puede ver alguna formacion de nuevo hueso en el sitio del defecto. Las secciones de los cortes no son axialmente paralelas al defecto.

La figura 37 muestra un corte histologico de p-TCPId activo, despues de 3 semanas de seguimiento (tincion de MG, aumento original 6,3x, BF = formacion de nuevo hueso, Gr = TCP-granulo). Se ve la resorcion de los granulos de partida y la formacion de nuevo hueso alrededor de los granulos

La Figura 38 muestra cortes histologicos de p-TCPId activo, despues de 8 semanas de seguimiento (tincion de MG, aumento original 6,3x, BF = formacion de nuevo hueso, Gr = TCP-granulo). El defecto esta bien lleno de nuevo hueso y se ve una marcada resorcion de los granulos.

La figura 39 muestra un corte histologico de control de p-TCPId, despues de 3 semanas de seguimiento (tincion de MG mancha, aumento original 6,3x, BF = formacion de nuevo hueso, Gr = TCP-granulo). Hay solo signos minoritarios de resorcion y formacion minoritaria de nuevo hueso alrededor de los granulos.

La figura 40 muestra cortes histologicos de control de p-TCPId, despues de 8 semanas de seguimiento (tincion de MG, aumento original 6,3x, BF = formacion de nuevo hueso, Gr = TCP-granulo). Se ven granulos y formacion de nuevo hueso alrededor de los granulos. Pero la cantidad de formacion de hueso es mucho menor y la resorcion de granulos mucho mas lenta que la correspondiente al grupo activo de p-TCPId (Fig. 38).

La figura 41 muestra un corte histologico de p-TCPhd activo, despues de 3 semanas de seguimiento (tincion de MG, aumento original 6,3x, BF = formacion de nuevo hueso, Gr = TCP-granulo). Se ve la resorcion de granulos de partida y la formacion de nuevo hueso alrededor de los granulos.

La Figura 42 muestra cortes histologicos de p-TCPhd activo, despues de 8 semanas de seguimiento (tincion de MG, aumento original 6,3x, BF = formacion de nuevo hueso, Gr = TCP-granulo). Se ven pequenos restos de granulos y excelente formacion de nuevo hueso. El defecto esta completamente lleno de nuevo hueso y la resorcion de los granulos es muy alta.

La figura 43 muestra un corte histologico de control de p-TCPhd, despues de 3 semanas de seguimiento (tincion de MG, aumento original 6,3x, BF = formacion de nuevo hueso, Gr = TCP-granulo). La resorcion de los granulos es lenta y se ve formacion minuscula de nuevo hueso alrededor de los granulos.

La figura 44 muestra cortes histologicos de control de p-TCPhd, despues de 8 semanas de seguimiento (tincion de MG, aumento original 6,3x, BF = formacion de nuevo hueso, Gr = TCP-granulo). Se ven granulos y formacion de nuevo hueso alrededor de los granulos. La formacion de hueso es mucho menor y la resorcion de los granulos es mas lenta que en el grupo activo (Fig. 42).

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La figura 45 muestra un corte histologico de defecto vacro, despues de 3 semanas de seguimiento (tincion de MG, aumento original 6,3x). El defecto vacm esta vacm.

La figura 46 muestra un corte histologico de defecto vacro, despues de 8 semanas de seguimiento (tincion de MG, aumento original 6,3x). El defecto vacro esta vacro (se ve alguna formacion normal de hueso en los bordes del defecto).

La figura 47 muestra la resorcion de granulos del control TCPId (a la izquierda) y granulos activos (a la derecha) (tincion de MG, aumento original 10x, Gr = granulo de TCP).

La figura 48 muestra la resorcion del control TCPhd (a la izquierda) y granulos activos (a la derecha) (tincion de MG, aumento original 10x, Gr = granulo de TCP).

Descripcion detallada de la invencion

Los ejemplos descritos aqrn se refieren a metodos para preparar una preparacion de protema osea, en los que los metodos se practican:

a) desmineralizando el hueso y extrayendo la matriz osea con un disolvente, tal como hidrocloruro de guanidina, para obtener un extracto de protema osea,

b) filtrando el extracto con un microfiltro con tamano de corte suficiente para retirar grandes partroulas y material no protemico pero permitiendo que pasen las protemas, y

c) filtrando la fraccion no retenida con un ultrafiltro de cartucho que tiene un tamano de corte de alrededor de 5-10 kDa para obtener la preparacion de protema osea.

En un ejemplo el tratamiento con disolucion de hidrocloruro de guanidina en la etapa a) se puede reemplazar con el tratamiento con disolucion de urea que es un equivalente conocido. Se puede usar generalmente una disolucion de hidrocloruro de guanidina 4 M.

El termino “microfiltro” en la etapa b se refiere a cualquier filtro apropiado que es suficiente para retirar dichas grandes partroulas y material no protemico pero permitir que pasen las protemas. Esto se puede llamar tambien “clarificacion” o “prefiltrado” que se realiza para retirar, por ejemplo, partroulas en suspension, coloides, macromoleculas, celulas y restos celulares de la disolucion. Las moleculas de interes pasaran el microfiltro. Los ejemplos de tales filtros o metodos de filtracion incluyen Normal Flow Filtration (NFF, Millipore) y Tangential Flow Filtration (TFF). Dicho tamano de corte en la etapa b) puede estar en el intervalo de 0,1-10 pm (valor micrometrico nominal), por ejemplo, alrededor de 0,22-0,1 pm, o alrededor de 1000 kDa.

En la etapa c) de ultrafiltracion puede ser util incluso el intervalo de corte de 1-500 kDa. El ultrafiltro puede ser un filtro de celulosa regenerada o filtro de polietersulfona.

En un ejemplo la preparacion de protema osea se dializa, por ejemplo, con agua, para concentrarla y purificarla adicionalmente.

En otro ejemplo la preparacion de protema osea se dializa adicionalmente con una disolucion de citrato para promover el plegamiento apropiado de las protemas.

En otra realizacion mas el hueso es hueso de mairnfero. En otra realizacion mas el hueso es hueso de reno. En otra realizacion mas el hueso es hueso de cuerno. En otra realizacion mas el hueso es hueso largo.

Los aspectos de la invencion tambien incluyen una preparacion de protema osea que contiene, por ejemplo, una o mas protemas que se encuentran en el extracto nativo desmineralizado con HCl, cuya preparacion se describe aqrn, que incluye biglicano, trombina, lamina A/C, vimentina, osteonectina, biglicano, lisil oxidasa, osteonectina, SPP-24 (fosfoprotema secretada), dermatopontina, condroadherina y/o protema Gla de la matriz. Se contempla que por lo menos las siguientes protemas promueven, inducen, o aceleran la osteoinducion: protema Gla de la matriz, SpP-24 (fosfoprotema secretada), BMP-2, BMP-7 y/o TGF-beta 1. Por consiguiente, la composicion de protema osea puede contener tambien por lo menos uno de los siguientes: biglicano, trombina, lamina A/C, vimentina, condroadherina, protema de matriz extracelular 22K, lisil oxidasa, osteonectina, colageno o dermatopontina en cantidades sustanciales.

En algunas realizaciones la composicion de protema osea contiene por lo menos protema Gla de matriz, biglicano, SPP-24 condroadherina, protema de matriz extracelular 22K, lisil oxidasa, osteonectina, colageno, BMP-2 , BMP-7 y/o TGF-beta 1 incorporado en una matriz de polietilenglicol/glicerol (PEG-GLY). Se puede incluir tambien una o mas de las otras protemas mencionadas aqrn. La preparacion de protema osea contiene dichas protemas en cantidades sustanciales, por ejemplo, una cantidad suficiente para proporcionar un efecto fisiologico, tal como efecto o actividad osteoinductiva. Tambien pueden estar presentes otras protemas en cantidades traza, una cantidad tal demasiado baja para ser vista en un SDS-PAGE tintado o para ser secuenciada, y tales protemas no son esenciales o requeridas para la actividad osteoinductiva o acelerante de la preparacion o una composicion que comprende dicha

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preparacion de protema. La Tabla 14, por ejemplo, ”Las protemas en extracto nativo desmineralizado con HCl” proporciona orientacion de como hacer una preparacion osea de la presente invencion. Estas preparaciones se pueden obtener con el metodo descrito anteriormente, pero se puede usar tambien cualquier otro metodo.

En mas ejemplos, la preparacion de protema osea se incorpora o impregna en matriz, tal como una matriz porosa. La matriz, soporte o estructura, palabras que se pueden usar intercambiablemente, mejora la actividad y potencial terapeutico del extracto de protema osea en el sitio de aplicacion (por ejemplo, la matriz, soporte o estructura cuando se anade a un extracto de protema osea permite un desprendimiento gradual de protemas activas y reduce la migracion de estos factores).

Deseablemente, una matriz soporte cumple ciertos criterios. La matriz es preferentemente biocompatible, bioabsorbible, maleable, y esterilizable. Los materiales deseados son estructuralmente fuertes, inmunologicamente inertes, altamente osteoconductivos y variablemente biodegradables. Los ejemplos de conocidas matrices organicas e inorganicas se describen por Kirker-Head, C.A: Potential applications and delivery strategies for bone morphogenic proeins. Advanced Drug Delivery Reviews 43 (2000) 65-92, and Moore et al., Synthetic bone graft substitutes, ANZ J. Surg. (2001) 71, 354-361.

En otra realizacion, una preparacion de protema osea incorporada en una matriz de polietilenglicol/glicerol (PEG- GLY) preparada como se describe aqrn se incorpora en granulos. En otra realizacion mas, los granulos son granulos de p-fosfato de tricalcio (TCP), o los granulos contienen p-fosfato de tricalcio. En otra realizacion mas, los granulos son granulos de sulfato de calcio, o los granulos contienen sulfato de calcio. En otra realizacion mas, los granulos son granulos de hidroxiapatito, o los granulos contienen hidroxiapatito. En otro ejemplo, la preparacion de protema osea preparada como se describe aqrn, se incorpora en una matriz. En otra realizacion mas, la preparacion de protema osea se incorpora en granulos en una matriz de polietilenglicol/glicerol (PEG-GLY). En una realizacion adicional, dicha preparacion contiene acido estearico. Todas dichas realizaciones se pueden aplicar a cualquiera de las aplicaciones, metodos o usos descritos aqrn.

En otra realizacion mas, la preparacion de protema osea incorporada en una matriz de polietilenglicol/glicerol (PEG- GLY) preparada como se describe aqrn esta en forma de un liofilizado.

Algunas realizaciones tambien incluyen una pasta, tal como una pasta o gel inyectable, que comprende una o mas de las preparaciones de protema osea descritas aqrn incorporadas en una matriz de polietilenglicol/glicerol (PEG/gLy). La pasta tambien puede ser moldeable, forma que tambien se puede llamar masilla. Por consiguiente, algunas realizaciones, incluyen una masilla que comprende una o mas de las preparaciones de protema osea, preparadas por un metodo descrito aqrn. Similarmente, algunas realizaciones incluyen un pelet, disco, bloque o granulo que comprende una o mas de las preparaciones de protema osea, preparado por un metodo descrito aqrn. En otro ejemplo, la preparacion de protema osea se proporciona en forma de un revestimiento sobre dicho pelet, disco, bloque o granulo.

Varias realizaciones tambien incluyen un dispositivo osteogenico, tal como un implante oseo, que comprende una o mas de las preparaciones de protema osea descritas aqrn, incorporadas en una matriz de polietilenglicol/glicerol (PEG-GLY).

Una realizacion proporciona la preparacion de protema osea preparada como se describe aqrn incorporada en una matriz de polietilenglicol/glicerol (PEG-GLY) para uso como medicamento, por ejemplo, para tratar trastornos relacionados con defectos oseos, de cartflago, tendon o diente en los que se desea su regeneracion, reparacion o crecimiento, u otras enfermedades.

Tambien se contemplan composiciones farmaceuticas que contienen dichas preparaciones de protema osea. Preferentemente dichas composiciones farmaceuticas contienen una cantidad terapeuticamente efectiva de una o mas de las preparaciones de protema osea preparadas como se describe aqrn y un vehmulo, soporte y/o excipiente farmaceuticamente aceptable. Dicha composicion farmaceutica se puede usar para tratar trastornos relacionados con defectos oseos, de cartflago, tendon o diente en los que se desea su regeneracion, reparacion o crecimiento, u otras enfermedades, tales como el cancer.

Algunos ejemplos proporcionan un metodo para inducir la formacion de hueso, cartflago, tendon, diente o similares, in vitro o in vivo, en los que dicho hueso, cartflago, tendon, diente o similares se trata con una o mas de la preparaciones de protema osea descritas aqrn, o con un dispositivo osteogenico u otra forma de aplicacion que los contiene.

Los ejemplos adicionales incluyen metodos para tratar trastornos relacionados con defectos oseos o de cartflago, en los que se desea su regeneracion, reparacion o crecimiento u otras enfermedades, tales como el cancer, administrando dicha preparacion de protema osea aislada a un paciente que padece dichos trastornos.

"Trastornos relacionados con defectos oseos, de cartflago, tendon o diente" tal como se usa aqrn, se refiere generalmente a cualquier trastorno conocido en el que se desea la curacion o reconstruccion, por ejemplo, regeneracion osea, de cartflago, tendon o periodontal. Los ejemplos no limitantes de tratamientos de trastornos relacionados con defectos oseos, de cartflago, tendon o periodontales o enfermedades o similares son la

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regeneracion, reparacion y crecimiento de tejido oseo y periodontal; la regeneracion, reparacion y crecimiento de hueso en mairnferos, tales como seres humanos o cualquier otro animal; tratamiento de las anomalfas de la formacion o regeneracion osea; cicatrizacion de heridas, la induccion de hueso ectopico y la curacion de defectos oseos segmentarios en los vertebrados; tratamiento de trastornos y deformaciones esqueleticas; reparacion de defectos oseos grandes originados por trauma, extirpacion de tumores o malformaciones congenitas, la reconstruccion de masas oseas desgastadas por una endoprotesis implantada en operaciones de revision y fracturas no unidas o de curacion retrasada; reparacion de defectos oseos y cartilaginosos como defectos de tamano cntico, defectos de tamano no cntico, no union segmentaria de fracturas; fracturas agudas, defectos condrales, defectos osteocondrales, defectos subcondrales; formacion local de cartflago y hueso; defectos resultantes de enfermedades degenerativas; aplicaciones dentales, tales como reparacion de tejidos periodontales, hueso alveolar, cemento dental, membrana de la rafz dental, llenado del canal de la rafz dental y la mejora o aumento de la fijacion del implante dental. Los ejemplos de tales trastornos se pueden encontrar en Ann Rheum Dis, Volume 62, 2003, 7378: Reddy AH: Cartilage morphogenetic proteins: role in joint development, homoeostasis and regeneration.

En una realizacion se proporciona un dispositivo osteogenico, tal como un implante, que contiene la preparacion de protema osea en una matriz de polietilenglicol/glicerol (PEG/GLY). El dispositivo osteogenico puede contener una matriz biocompatible, tal como un fosfato de calcio, carboximetilcelulosa o matriz de colageno o sus combinaciones. En una realizacion, dicha matriz de fosfato de calcio es una matriz de hidroxiapatito. Dicha matriz puede proporcionar la liberacion lenta de la preparacion de protema osea y/o el medio apropiado para la presentacion de la preparacion de protema osea. El dispositivo osteogenico tambien puede contener un implante metalico rodeado por dicha matriz biocompatible. Un ejemplo de dicho metal es titanio. Algunos ejemplos de tales dispositivos osteogenicos se describen en el documento WO 98/51354. Los ejemplos no limitantes de los diferentes materiales de enmarcado, soportes o marcos para formar, por ejemplo, diferentes tipos de dispositivos osteogenicos o similares con la protema de la presente invencion son un medio en forma de polvo, esponja, tira, pelmula, gel, banda o disolucion o suspension; vehmulo lfquido semisolido apropiado para inyeccion intramuscular, intravenosa, intramedular o intra-articular; celulas madre mesenquimales aisladas; cualquier vehmulo farmaceuticamente aceptable; auto- o alo-injerto encostrado; cualquier matriz farmaceuticamente aceptable; un material seleccionado del grupo que comprende hidroxiapatito, colageno, polfmeros (por ejemplo, poli(acido lactico), poli(acido glicolico), polfmeros sinteticos, acido hialuronico, a-BSM, fosfato de calcio, fosfato de tricalcio, biopolfmeros ceramicos aporosos, biopolfmeros reabsorbibles aporosos, coral, hueso desmineralizado, biovidrio, cualquier material biodegradable y sus combinaciones; agentes aglomerantes seleccionados del grupo que comprende manitol, dextranos, petrolato blanco, alquil- y metil-celulosas, agentes humectantes tales como sal de sodio, pegamento de fibrina, fibrinogeno y trombina de mamffero y sus combinaciones y mezclas. El dispositivo osteogenico puede ser, por ejemplo, un implante tridimensional estructuralmente estable en forma de cubo, cilindro o bloque o en la forma de una forma anatomica o una forma inyectable. Los ejemplos de dispositivos osteogenicos, materiales y tecnicas utiles se describen en el libro "Skeletal reconstruction and bioimplantation” (T. Sam Lindholm, 1.997, Springer- Verlag, Heidelberg, Germany).

Un ejemplo adicional proporciona un metodo para inducir la formacion de hueso, cartflago, tendon, diente o similares en el que dicho hueso, cartflago, tendon, diente o similares se trata con la preparacion de protema osea, in vitro o in vivo. Otro ejemplo mas proporciona un metodo para el tratamiento de los trastornos descritos en la memoria descriptiva que comprende administrar la preparacion de protema osea a un paciente que padece dichos trastornos. Dicha preparacion de protema osea se puede administrar en forma de una composicion farmaceutica o de un dispositivo osteogenico descrito anteriormente. Se pueden administrar protemas morfogeneticas u otros agentes utiles junto con dicha preparacion de protema osea, como se describe anteriormente, para mejorar el efecto terapeutico.

Ejemplos

Optimizacion y aumento a escala de filtracion de flujo tangencial de extracto de protema osea

El siguiente estudio esta basado la tesis de master “Optimization and scale-up of tangential flow filtration of bone protein extract”, Viitanen, M. University of Oulu, 2010.

El proposito de este estudio era investigar la micro- y ultra-filtracion de flujo tangencial de extracto de protema osea animal. Los procedimientos se optimizaron y basado en los resultados, se aumentaron a escala hasta la escala de produccion.

En aplicaciones biofarmaceuticas la disolucion que contiene los componentes deseados se somete a menudo a fraccionamiento y concentracion. Usualmente estas etapas se llevan a cabo usando filtracion. La filtracion de flujo tangencial es una excelente eleccion para la filtracion de grandes volumenes, dado que el filtro no se bloquea tan facilmente como en la tradicional filtracion en lmea. Esto es debido al flujo de alimentacion que es paralelo a la membrana, y de este modo arrastra las partmulas.

Durante este estudio los parametros del procedimiento de micro- y ultra-filtracion de extracto de protema osea se optimizaron para conseguir un procedimiento que fuera tan efectivo como fuese posible. Tambien se compararon dos membranas diferentes y tipos de canal de alimentacion para propositos de ultrafiltracion. Se uso un software

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para el diseno de los experimentos y optimizacion para estudiar el efecto de las variables de procedimiento.

Los resultados muestran que el extracto de protema osea animal se puede procesar efectivamente usando filtracion de flujo tangencial. El rendimiento de protema era bueno, tanto en microfiltracion como ultrafiltracion. Ninguno de los materiales de membrana ensayados posefa significativo ensuciamiento. Sin embargo, habfa diferencias en los flujos maximos de filtracion. Los procedimientos se podnan incluso optimizar adicionalmente. En base a los resultados obtenidos, se realizaron calculos para el aumento a escala del procedimiento de filtracion a la escala de produccion. Los calculos muestran que el procedimiento se puede llevar a cabo en el tiempo deseado y con costes razonables.

1 Introduccion

La filtracion de flujo tangencial se usa mucho en aplicaciones biofarmaceuticas y otras muchas otras aplicaciones industriales, por ejemplo, para concentrar o fraccionar protemas por ultrafiltracion o para retirar microorganismos y celulas por microfiltracion. En este estudio se evaluo la microfiltracion y ultrafiltracion de extracto de protema osea. La filtracion de flujo tangencial usando filtros de cartucho puede ser una tecnica ideal para el procesado a gran escala de un extracto preparado de este tipo de tejido.

El estudio comenzo con un estudio de la viabilidad de las etapas tanto de microfiltracion como de ultrafiltracion. Se compararon diferentes filtros de cartucho para ultrafiltracion. Se uso diseno sistematico y software de modelado (MODDE) para el diseno experimental. Se efectuo la optimizacion detallada de los parametros del procedimiento para todos los filtros ensayados. Finalmente, se realizaron los calculos para el aumento a escala del procedimiento en base a los resultados obtenidos.

No estan disponibles muchos datos publicados acerca de resultados de experimentos de optimizacion que correspondan directamente con este estudio. La mayona de ellos abarcan la ultrafiltracion de suero de leche. Tfpicamente, este tipo de informacion es generada por comparuas que tienen la filtracion como una etapa del procedimiento. Por lo tanto, no esta necesariamente publicada. Ademas, cada procedimiento de filtracion biologica es unico, con una solucion espedfica de cada caso que implica la eleccion de material de membrana y otras caractensticas. El comportamiento del sistema es diffcil de predecir y la optimizacion espedfica para cada caso es siempre necesaria.

2 Filtracion de flujo tangencial

2.1 Descripcion general de la filtracion de flujo tangencial

La filtracion en general se puede dividir en dos diferentes categonas operacionales. Son la filtracion de flujo normal (NFF) y la filtracion de flujo tangencial (TFF). En la NFF la disolucion fluye por medio de presion o incluso de la gravedad en direccion perpendicular a la membrana o filtro de profundidad. Las partmulas mayores de cierto tamano seran retenidas sobre la superficie de la membrana o dentro del entramado del filtro de profundidad. Sin embargo, la acumulacion de partmulas finalmente bloqueara el filtro. La NFF se usa comunmente para la filtracion esteril y prefiltracion antes de micro- o ultra-filtracion.

En contraste con la NFF, la TFF utiliza el flujo de alimentacion que es paralelo a la membrana. Esto crea un efecto de arrastre que previene el bloqueo de la membrana por partmulas. El flujo de filtrado, que quiere decir el flujo que pasa la membrana, es generado por presion. Las moleculas menores que los poros de la membrana iran con el filtrado y las mayores se concentraran en la corriente de la fraccion retenida. Generalmente, la TFF se usa para concentrar disoluciones y/o separar moleculas o partmulas en base a su diferencia de tamano. La separacion de moleculas a traves de una membrana generalmente sigue una distribucion gaussiana en el tamano medio de los poros (valor de corte). Ademas del tamano teorico de las moleculas, tambien la forma y carga tienen influencia en su paso a traves de los poros (Millipore Corporation 1992). La siguiente seccion se refiere a diferentes tipos de procedimientos de TFF, unidades de filtracion, membranas y factores que tienen influencia sobre ellas, con especial atencion dada a la ultrafiltracion.

2.2 Definicion de procedimientos de separacion de membrana.

Los procedimientos de separacion se pueden clasificar segun el intervalo de tamano de partmulas a dividir. Las definiciones comunmente usadas incluyen microfiltracion (MF), ultrafiltracion (UF), nanofiltracion (NF) y osmosis inversa (RO), a la que se ha denominado tambien hiperfiltracion en la bibliograffa antigua. La filtracion de partmulas se usa a menudo como una etapa de prefiltracion antes de la micro- o ultra-filtracion para retirar grandes partmulas solidas y materiales coloidales que pueden provocar el bloqueo de los canales de alimentacion de los filtros subsecuentes. Las fronteras entre las clases no son exactas.

2.2.1 Microfiltracion

El corte (valor micrometrico nominal) de tamano de poro de membrana usado en la mayona de las microfiltraciones vana entre 0,1 y 10 pm. La microfiltracion se usa para la separacion de partmulas suspendidas, coloides y macromoleculas de disoluciones. La microfiltracion se usa ampliamente, por ejemplo, en la industria qrnmica y de minerales, y en aplicaciones de clarificacion de agua. En la industria biotecnologica se usa a menudo para separar

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celulas y restos de celulas del medio despues del periodo de fermentacion. Los productos pueden ser protemas recombinantes, metabolites de los organismos, y las celulas mismas, como en el cultivo de la levadura de pan. La MF se puede usar tambien como un metodo para la filtracion esteril de disoluciones. En este caso, se usa comunmente un tamano de poro de corte de menos de 0,45 pm, o se puede escoger un corte de 0,2 pm si se desea la retencion completa.

2.2.2 Ultrafiltracion

La ultrafiltracion es una excelente eleccion para concentrar y fraccionar protemas. Este metodo es menos severo para protemas comparado con la evaporacion, y es mas economico comparado con la filtracion por permeacion de gel. En UF, el intervalo de separacion esta entre 1 kDa y 500 kDa. Muchos fabricantes de membranas proporcionan cartuchos de UF con un corte hasta de 1000 kDa, equivalente a alrededor de 0,1 pm. El intervalo de presion en UF es tipicamente de alrededor de 1,5-6,5 bar.

La UF se usa ampliamente en la industria biofarmaceutica en la purificacion aguas abajo de anticuerpos monoclonales y protemas recombinantes. La industria lactea fue una de las primeras en adoptar ampliamente esta tecnica. Las aplicaciones tfpicas se encuentran en la fabricacion de queso y en el fraccionamiento del suero de queso.

3 Metas del trabajo

Las metas de este trabajo eran examinar la idoneidad de filtros de cartucho de membrana para micro- y ultrafiltracion de extracto de protema osea y para optimizar los procedimientos a pequena escala. La seleccion del tipo de membrana era uno de los principales objetivos. El trabajo estaba mas centrado en la ultrafiltracion porque es mas cntica y compleja desde el punto de vista de la optimizacion. La microfiltracion sema principalmente como una etapa de purificacion para la retirada de partteulas y macromoleculas mayores que las protemas tfpicas. Aunque categorizada como microfiltracion en este trabajo, la etapa se ejecuto usando un filtro que tiene un tipo similar de membrana a los filtros usados para ultrafiltracion. Sin embargo, el filtro tiene un tamano de poro tan grande que la optimizacion se realiza como para microfiltros.

Primero, se realizaron experimentos de micro- y ultra-filtracion preliminares usando un tipo de filtro. En base a los resultados y experiencia ganada, se escogieron dos nuevos ultrafiltros ligeramente diferentes para estudios adicionales. Se uso un programa para diseno experimental (MODDE) para examinar diferentes parametros que tienen influencia en el procedimiento de ultrafiltracion. Ademas del tipo de filtro, los parametros estudiados fueron temperatura, presion y velocidad volumetrica de alimentacion. Los filtros se expusieron a varios protocolos de optimizacion para encontrar los mejores puntos de ajuste y de este modo hacer el procedimiento a gran escala tan economico como sea posible. Tambien se optimizo el procedimiento de microfiltracion con respecto al flujo cntico. En todo el estudio la palabra flujo sola se refiere al flujo de filtrado.

La regeneracion de las membranas despues de la etapa de limpieza subsecuente a la filtracion se estudio con metodos ffsicos y qmmicos. En base a los resultados, se evaluaron los metodos de limpieza. Finalmente, se realizaron calculos para el aumento a escala del procedimiento usando los datos obtenidos de los experimentos a pequena escala.

4 Equipo

Los experimentos de filtracion se llevaron a cabo en la Universidad de Oulu, Kajaani University Consortium's Laboratory of Biotechnology en Sotkamo.

4.1 El equipo de filtracion

4.1.1 Unidad BenchScale de Millipore

En este estudio, se uso exclusivamente la unidad Millipore BenchScale (Millipore Corp. USA) para propositos de prefiltracion y para medidas de integridad del filtro. La unidad tiene un recipiente de alimentacion de dos litros, que se considero demasiado pequeno para los volumenes del lote del ensayo de filtracion planeado. Se acoplo un filtro de capsula de prefiltracion a la manguera de la bomba.

4.1.2 Unidad ProScale de Millipore

Los experimentos de filtracion se llevaron a cabo usando la unidad ProScale de Millipore. Tiene un recipiente de alimentacion de vidrio de diez litros. Si se necesitaran mayores volumenes, la disolucion se extrajo con sifon de un recipiente extra. En este caso la corriente de la fraccion retenida se dirigio a este recipiente para asegurar la mezcla apropiada de la disolucion. El calentamiento y enfriamiento de la unidad ProScale se consiguio por medio de hacer circular agua de grifo caliente o fna en el intercambiador de calor.

4.2 Membranas

Todas las membranas usadas en este estudio se obtuvieron de Millipore Corp., USA. Segun la recomendacion del

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fabricante, la disolucion se prefiltro a traves de por lo menos un filtro de 100 pm antes de la filtracion MF y/o UF. Se uso siempre un filtro de capsula Opticap™ XL con medio Polygard® CR (Millipore Corp. USA) con un corte de 50 pm. Cada filtro de capsula se uso un maximo de dos veces. Entre las filtraciones, las capsulas se trataron en el autoclave a 121°C durante 20 minutos.

4.2.1 Membrana para microfiltracion

Para microfiltraciones, la disolucion de protema se filtro a traves de un cartucho Biomax® Pellicon® 2 que tiene un valor de corte de peso molecular (MWCO) de 1000 kDa. El area de filtracion era de 0,1 m2 y el tipo de tamiz era V. El material de la membrana era polietersulfona. Millipore clasifica los canales de alimentacion de la membrana como tipo V, C y A. El tipo V tiene la mas abierta geometna del canal de alimentacion mientras que el A tiene la mas cerrada.

4.2.2 Membranas para ultrafiltracion

Se ensayaron tres diferentes cartuchos de ultrafiltracion en este estudio y se listan en la Tabla 1. Los experimentos preliminares se efectuaron usando un tipo de cartucho malla V de Biomax. El tipo V se selecciono porque no se sabfa nada acerca del posible efecto de obturacion o formacion de agregados durante la filtracion en el caso de esta disolucion espedfica. Los canales de alimentacion del cartucho son los mas abiertos en los cartuchos de tipo V, lo que da cuenta de por que no se bloquean tan facilmente. Los cartuchos de tipo C que tienen un diametro mas estrecho del canal de alimentacion se seleccionaron para experimentos adicionales en base a los resultados positivos obtenidos.

Tabla 1. Cartuchos usados para experimentos de ultrafiltracion

Marca del filtro: Material del filtro MWCO kDa Area de filtracion, m2 Tipo de malla

Biomax: Polietersulfona 10 0,1 V

Biomax: Polietersulfona 10 0,1 C

Ultracel: Celulosa regenerada 10 0,1 C

5 Experimentos

Los experimentos se llevaron a cabo en Kajaani University Consortium's Laboratory of Biotechnology en cuatro fases. En la primera fase, se efectuaron estudios de viabilidad para descubrir como se comporta globalmente el sistema. La segunda fase de los experimentos inclrna las etapas de optimizacion de flujo y presion transmembrana (TMP) para los cartuchos tanto de 1000 kDa como de 10 kDa (tipo V).

La tercera fase empleaba un plan de diseno experimental creado usando el programa de modelado y diseno “MODDE”. El objetivo era determinar los factores que tienen el efecto mas fuerte en la ultrafiltracion, incluyendo el tipo de la membrana. Los cartuchos estudiados en este punto fueron Biomax y Ultracel de tipo C. En la fase final, ambos cartuchos de 10 kDa de tipo C (Biomax y Ultracel) se sometieron a ensayos de optimizacion de flujo versus TMP.

Antes de cada filtracion los cartuchos se lavaron con agua de osmosis inversa (RO) de modo que por lo menos se recogieron cinco litros del lado del filtrado. Despues de eso, el sistema se equilibro haciendo circular un litro de GuHCl pura cuatro molar (4 M) en el sistema durante diez minutos. El sistema se vacio a continuacion antes de que el extracto de protema se vertiera en el recipiente de alimentacion. Despues de cada filtracion el circuito de fraccion retenida se vacio y lavo con un volumen conocido de GuHCl 4 M antes de limpiar.

5.1 Fase uno: ensayos de viabilidad

Se estudio la filtrabilidad del extracto de protema prefiltrado a traves del cartucho de 1000 kDa primero filtrando un lote de 45 litros. Se uso una velocidad de la bomba de 5 Hz. El intervalo de TMP permanecio entre 0,65 y 0,73 bar. Las muestras para el analisis de protema se tomaron siempre de corrientes de filtrado y fraccion retenida cuando se habfan recogido 4 litros de filtrado. Cuando se recogieron 44 litros de filtrado, se anadio un litro de GuHCl 4 M al recipiente de alimentacion. Su uso este denominado desplazamiento para incrementar el rendimiento de protema en el filtrado. La filtracion continuo hasta que se habfa recogido mas de un litro de filtrado. Se tomaron muestras tambien al final de desplazamiento. El factor de concentracion volumetrica (VCF) de la filtracion era 45.

El filtrado de la filtracion de 1000 kDa precedente se sometio a ultrafiltracion. Se efectuaron dos filtraciones separadas usando volumenes de lote de 22 l y 23 l. Los VCFs aplicados eran 10,5 y 8,5 respectivamente. Se obtuvo una TMP de 0,75-0,78 usando la velocidad de la bomba de 12 Hz en ambos experimentos. Se tomaron muestras para analisis de la misma manera que se habfan aplicado despues de la microfiltracion.

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5.2 Fase dos: Optimizacion de flujo y TMP para cartuchos del tipo V

5.2.1 Optimizacion de flujo y TMP para cartucho de microfiltracion

Para membranas abiertas, como aquellas comunmente usadas en microfiltracion, el flujo cntico se determina en el modo de reciclado total. En este estudio, 5 litros de extracto de protema prefiltrado se hicieron circular en el sistema usando cuatro diferentes caudales de alimentacion. Se usaron velocidades de la bomba de 5, 7,5, 10 y 12,5 Hz para crear caudales de alimentacion de alrededor de 1,15, 1,66, 2,15 y 2,75 l/min, respectivamente. Debido a que el flujo de filtrado era tan insignificante al inicio del experimento, estos valores tambien corresponden a los caudales transversales iniciales. La expresion caudal transversal se refiere al caudal de la fraccion retenida y se usa comunmente en el contexto de las curvas de flujo versus TMP. Inicialmente la valvula de estrangulamiento del filtrado estaba cerrada. A un caudal dado se incremento el flujo ligeramente abriendo apenas la valvula. El sistema se dejo estabilizar durante 10-20 minutos. Se registraron el flujo y la TMP a intervalos de 5 minutos. Este procedimiento continuo hasta que la valvula estaba completamente abierta o la TMP ya no era lineal con el flujo. En el ultimo caso se ha alcanzado el valor cntico para el flujo (flujo de filtrado).

5.2.2 Optimizacion de flujo y TMP para el cartucho de ultrafiltracion de tipo V

La optimizacion de los parametros para cartucho de ultrafiltracion es diferente de para la microfiltracion. En este estudio se determinaron las curvas de flujo versus TMP para extracto microfiltrado a dos concentraciones (VCF 1 y 10) usando un par de diferentes caudales de alimentacion.

En el caso de VCF 1 los caudales de alimentacion (y los caudales transversales iniciales) fueron 1,15, 1,66, 2,15 y 2,75 l/min. Las velocidades de la bomba correspondientes fueron 5, 7,5, 10 y 12.5 Hz. En el caso de VCF 10 los caudales de alimentacion usados fueron 0,66 y 2,75 l/min, respectivamente.

Los experimentos se iniciaron haciendo circular 10 litros de extracto de protema en el modo de reciclado total. En cada caudal se elevo la TMP progresivamente a intervalos de 5-10 minutos cerrando la valvula de estrangulamiento de la fraccion retenida. Se registraron los cambios en el flujo. Si la pendiente de la curva de flujo versus TMP comenzo a disminuir, se habfa alcanzado el punto optimo de TMP. Despues de que el procedimiento se llevo a cabo con los cuatro caudales transversales, el extracto de protema se concentro a un VCF 10. El procedimiento descrito anteriormente se repitio a continuacion.

5.3 Fase tres: Diseno experimental usando MODDE

Se creo un diseno sistematico de experimentos usando el software de modelado y diseno MODDE (MODDE 8, Umetrics AB, Umea, Suecia). Todos los factores implicados en el procedimiento de ultrafiltracion se resumieron primero en el diagrama de Ishikawa, tambien conocido como el diagrama de espina de pescado. Los cuatro factores seleccionados para los experimentos se listan en la Tabla 2. Los factores pueden ser cualitativos o cuantitativos. El valor de un factor cuantitativo se puede ajustar. El tipo de membrana es un ejemplo tfpico de un factor cualitativo. Las respuestas medidas durante los ensayos fueron la duracion de cada filtracion y el rendimiento (concentracion de protema total en la disolucion concentrada).

Tabla 2. Factores seleccionados para los experimentos MODDE y sus propiedades.

Factor: Cuantitativo/cualitativo Controlable Intervalo

Velocidad de la bomba (caudal de alimentacion): Cuantitativo Si 3-6 Hz

Temperatura: Cuantitativo Si 15-30°C

Estrangulacion de la fraccion retenida: Cuantitativo Si 20-80%

Membrana: Cualitativo Si A o B

La organizacion total de los ensayos se presenta en la Tabla 3. Hubo en total 11 experimentos de ensayo. Durante el estudio, la membrana Biomax C se denomino membrana "A" y la membrana Ultracel C membrana "B". El intervalo de “estrangulacion de la fraccion retenida" (20-80%) se definio como el porcentaje de cierre de la valvula de estrangulamiento de la fraccion retenida. Las velocidades de la bomba de 3, 4,5 y 6 Hz crearon caudales de alimentacion de 730, 1.035 y 1.350 ml/min, respectivamente. La temperatura entre 15 y 30°C fue el cuarto factor seleccionado.

Fueron ignorados algunos factores, a saber, el volumen, la concentracion inicial, diferencias por lotes y el estrangulamiento de filtrado. Se ha encontrado que las diferencias entre lotes son insustanciales (resultados no mostrados). El volumen y la concentracion del extracto de protema seran constantes en el procedimiento de filtracion final. El uso de estrangulamiento del filtrado solo retrasana el procedimiento, de modo que no habfa razon para estudiar su impacto. El operador y el equipo, a excepcion de las membranas, se considero que tiene un efecto

5

10

15

20

25

insignificante sobre el resultado de la filtracion.

Se creo un conjunto de 11 filtraciones en orden aleatorio usando el software y seleccionado "Screening" como objetivo y "Fractional Factorial” lineal para el modelo de diseno. La resolucion era IV. A continuacion se ejecuto el diseno usando un volumen inicial de tres litros en cada filtracion. A continuacion se aplico el VCF de 10, que detuvo la filtracion cuando se recogieron 2,7 litros de filtrado. El tiempo requerido para la filtracion se registro (con una precision de 1 minuto) y se tomaron muestras del filtrado y concentrado para la determinacion de la concentracion de protema total. El perfil de protemas se analizo tambien para algunos de los experimented (vease el capftulo 5.6.2). Los resultados fueron evaluados con MODDE usando metodos de mmimos cuadrados parciales (PLS). Los experimentos de filtracion numeros 9, 10 y 11 fueron los denominados experimentos de punto central. El procedimiento se repitio tres veces usando los mismos puntos de ajuste de los factores. En los experimentos de punto central los valores de los factores estan siempre en el medio del intervalo de cada factor. Estos experimentos repetidos se usan para evaluar la variabilidad de los ensayos, incluyendo los metodos analfticos.

Tabla 3. Diseno de los ensayos de filtracion generados usando el software MODDE

Exp. No.: Nombre del Exp. Orden del exp. Incl/excl. Hz de la bomba % valvula de estrangulamiento de fraccion retenida Temp °C Membrana

1: N1 5 incl 3,0 20,0 15 A

2: N2 1 incl 6,0 20,0 15 B

3: N3 2 incl 3,0 80,0 15 B

4: N4 6 incl 6,0 80,0 15 A

5: N5 3 incl 3,0 20,0 30 B

6: N6 7 incl 6,0 20,0 30 A

7: N7 8 incl 3,0 80,0 30 A

8: N8 4 incl 6,0 80,0 30 B

9: N9 9 incl 4,5 50,0 22,5 A

10: N10 11 incl 4,5 50,0 22,5 A

11: M11 10 incl 4,5 50,0 22,5 A

5.4 Fase cuatro: Optimizacion de flujo y TMP para cartuchos de ultrafiltracion de tipo C

En comparacion con los cartuchos de tipo V los canales de alimentacion en los cartuchos de tipo C son mas cerrados. De este modo, se requiere un menor caudal de alimentacion para crear valores de TMP iguales a los cartuchos de tipo V. En este estudio, las curvas de flujo versus TMP se determinaron a dos concentraciones (VCF 1 y 5). Los valores de los caudales de alimentacion iniciales para ambos cartuchos y los VCFs se presentan en la Tabla 4. El cartucho Biomax se denomina membrana A y el cartucho Ultracel membrana B. Los experimentos se iniciaron con 5 litros de extracto de protema en el modo de reciclado total. De otro modo, el procedimiento es el mismo que se describe en el capftulo 5.2.3. Un punto adicional era la verificacion de la denominada histeresis: Cuando se llego al mas alto punto de TMP, se bajo gradualmente la TMP. Si el flujo retorno a su valor inicial la membrana no se habfa obturado.

Tabla 4. Caractensticas seleccionadas para la optimizacion de flujo versus TMP de cartuchos de 10 kDa de tipo C

: Bomba/caudal de alimentacion (Hz/ l/min)

Membrana/VCF: 3/0,730 4/0,945 5/1,125 6/1,350

A/VCF 1: X X X

A/VCF 5: x x

A/VCF 1: x x x

A/VCF 5: x x

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

5.5 Protocolo de limpieza de la membrana

Despues de cada ciclo de filtracion las membranas se sometieron a limpieza. El volumen de la disolucion de limpieza fue 1 l (10 l/m2 de area de la membrana). La disolucion se hizo circular en el sistema y se ajusto la temperature v^a un intercambiador de calor. Se uso un intervalo de temperatura de alrededor de 35 a 45°C. Se uso hidroxido de sodio (NaOH) como agente de limpieza en concentracion de 0,1 a 0,4 M. El intervalo de tiempo de contacto era de 30, 45 o 60 minutos, dependiendo del caso. El sistema se lavo con agua de RO de modo que se recogieron un total de 5 a 7 litros de la salida de filtrado. Despues de esto, se midio el valor para la permeabilidad de agua normalizada (NWP) como se describe en el capttulo 5.6.4. Si es necesario, se repitio la limpieza, posiblemente en condiciones mas severas.

5.6 Medidas efectuadas

Las muestras para la concentracion de protema y los analisis SDS-PAGE se efectuaron en una comparua finlandesa, Oulu. Las otras medidas se efectuaron en el Kajaani University Consortium's Laboratory of Biotechnology. Se debe advertir que no se realizaron necesariamente todas las medidas para cada muestra.

5.6.1 Concentracion de protema

Se analizaron las muestras de los ensayos de viabilidad (fase uno) para ver su concentracion de protemas usando el dispositivo NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, EE.UU.). El analisis se basa en espectrometna UV. La determinacion de la concentracion de protema total de todas las otras muestras se realizo usando el ensayo colorimetrico de Bradford (Bradford, 1976). El reactivo colorante usado se adquirio de Bio-Rad Laboratories, EE.UU. y seroalbumina bovina (BSA) de MP Biomedicals, EE.UU. La BSA se uso como el material protemico de referencia para preparar las curvas estandar de calibracion de concentracion de protema. Sin embargo, los resultados variaron dependiendo del metodo de ensayo usado. Por eso los resultados obtenidos de los ensayos preliminares usando NanoDrop se usaron solo para propositos de seleccion.

5.6.2 Analisis SDS-PAGE

La electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) es un metodo comun para la separacion de protemas segun su tamano. El perfil de protemas se puede visualizar sobre un gel usando un colorante espedfico de la protema. En procedimientos de filtracion la SDS-PAGE proporciona una excelente informacion de como ha tenido exito la filtracion. Por ejemplo, se puede ver claramente si el filtro esta funcionando de acuerdo a su valor nominal de corte de peso molecular. En este estudio, se realizo SDS-PAGE usando el dispositivo Bio-Rad Mini Protean II segun las instrucciones del fabricante (Bio-Rad Laboratories, USA). El metodo se basa en el sistema descrito por Laemmli (1970).

Debido a que el GuHCI interrumpe el analisis de SDS-PAGE, las muestras de los experimentos de filtracion primero tuvieron que ser dializadas contra agua. Durante la dialisis precipitaron la mayona de las protemas en el extracto. Por eso el precipitado y el sobrenadante se liofilizaron juntos despues de la dialisis. Una porcion del material protemico liofilizado se peso y se disolvio en urea 6 M. La concentracion de protemas se midio usando el metodo de Bradford (1976). Las muestras para SDS-PAGE se prepararon a continuacion segun las instrucciones del fabricante (Bio-Rad Laboratories, USA). En el caso del filtrado de filtracion la cantidad de material liofilizado era a veces tan minuscula que el pesaje no era posible. En su lugar, se disolvio al azar en urea 6 M y a continuacion se analizo la concentracion de protema.

Se cargaron tfpicamente quince microgramos de protema en pocillos de geles. En el caso de muestras de filtrado la cantidad podna ser menor. Se uso Precision Plus Dual Color Protein Standard (BioRad Laboratories, USA) como un estandar de peso molecular. La electroforesis se realizo usando un voltaje constante de 200 V y el tiempo promedio del experimento era de alrededor de 50 minutos.

5.6.3 Caudales y presion transmembrana

El sistema Millipore ProScale estaba equipado con un caudalfmetro digital. El caudal de la fraccion retenida, o caudal transversal se midio usando un cronometro y un cilindro de vidrio graduado de uno o dos litros. La unidad del caudal de filtrado era kg/min, pero se midio que era bastante cercano a l/min, tambien cuando se usan disoluciones 4 M de hidrocloruro de guanidina. El caudal de alimentacion podna calcularse sumando los caudales de la fraccion retenida y filtrado. La presion transmembrana (TMP) se muestra directamente en el sistema ProScale pero tambien se puede calcular usando la ecuacion (1):

en la que

Palimentacion es la presion de alimentacion (bar), Pfra. ret es la presion del fraccion retenida (bar) y

Pfiitrado es la presion de filtrado (bar).

5.6.4 Permeabilidad del agua normalizada

Cuando se usa un filtro por primera vez, se debe determinar su permeabilidad del agua normalizada inicial. Sera el valor con el que se comparan las medidas posteriores. Es aconsejable usar siempre los mismos parametros del 5 procedimiento para determinar la NWP. La ecuacion (2) se usa para el calculo de la NWP:

'7 = T (2)

TUP .X v '

en la que

Qfiltrado es el caudal de filtrado (l/h),

A es el area total de filtro (m2),

10 TMP es la presion transmembrana (bar) y

F es el factor de correccion de la temperatura del Apendice 1.

La medida de la NWP siempre se realizo despues de la limpieza y antes de las filtraciones. Medir la NWP es la mas directa demostracion de la eficiencia de la limpieza. Cuanto mas cerca se pueda restaurar a su valor original, mejor es la eficacia de la limpieza.

15 5.6.5. Integridad del filtro

Para confirmar la integridad de los filtros se debe realizar regularmente un ensayo de flujo de aire. El modulo de filtro se une al sistema Millipore BenchScale y el ensayo se realizo segun el procedimiento proporcionado por el fabricante (Millipore Corporation 1998). Brevemente, el modulo de filtro limpio y humedecido se unio a un suministro de gas (aire o nitrogeno) regulado. Se hizo pasar gas desde el lado de la alimentacion del filtro a una presion 20 espedfica de la membrana. Se conecto un tubo de plastico a una salida de filtrado. El otro extremo del tubo se condujo a un cilindro de vidrio graduado invertido lleno de agua. Este cilindro se coloco en un recipiente mayor lleno de agua. El caudal de aire se podna determinar a continuacion midiendo el volumen de aire desplazado dentro del cilindro de gas en un tiempo dado. Cada tipo y tamano de membrana tiene su propio lfmite maximo de flujo de aire para cumplir los requisitos de integridad.

25 5.6.6 Obturacion de la membrana

Tfpicamente, el grado de obturacion de la membrana se puede calcular usando la siguiente Ecuacion (3):

94i de obstruction=

riiijOi,

-FinjD/i

*1lliJ °|1U 'LlI

. 10094

(3)

en la que

Flujoinicial es el flujo de filtrado en el inicio de la filtracion y 30 Flujofinal es el flujo de filtrado el final de la filtracion.

Un modo de calcular la obturacion de la membrana es comparar los caudales de agua antes y despues de la filtracion antes de limpiar. En este estudio muchas de las protemas en el extracto precipitan cuando entran en contacto con agua. De este modo, los porcentajes de obturacion calculados no necesariamente indican la obturacion que ocurrio durante la filtracion. La obturacion total se puede monitorizar tambien durante la filtracion para observar 35 la disminucion del flujo. El efecto de obturacion se puede calcular de la disminucion del flujo durante este periodo usando la Ecuacion (3).

5.6.7 Balance de masa

Para entender como se distribuyen las protemas en el procedimiento, se realizan calculos de balance de masa. Una ecuacion util para este proposito es la Ecuacion (4):

-id: (4)

% Balance demasa--

| (l-V-a J + QWmCW** i +CFUiclaiO

L ^Lnl TLLlClnl d si .

en la que

Vret es el volumen de la fraccion retenida (l),

Cret es la concentracion de protema de la fraccion retenida (mg/ml o g/l),

Vperm es el volumen del filtrado (l),

Cperm es la concentracion del filtrado (mg/ml o g/l),

Vlav es el volumen de la disolucion usado para lavar el circuito (l),

Clav es la concentracion de protema en la disolucion usada para lavar el circuito (mg/ml o g/l),

5 Vinicial es el volumen de la disolucion inicial de alimentacion (l) y

Cinicial es la concentracion de protema de la disolucion de alimentacion inicial (mg/ml o g/l).

Debido a muchas razones, el porcentaje del balance de masa raramente es 100. Alguna porcion de protemas estara atascada dentro de la membrana. Siempre hay algun volumen de retencion en el cartucho y equipo. Ademas, los metodos de determinacion no son precisos.

10 6 Resultados

6.1 Integridades de los filtros

La integridad de todos los filtros de membrana analizados estaba en el nivel permitido. Los resultados de los ensayos no se muestran aqrn.

6.2 Viabilidad de la microfiltracion con cartucho

15 La viabilidad del filtro de cartucho de polietersulfona de 1000 kDa se estudio usando un volumen de lote de 45 litros y el VCF final de 45. La Figura 1 representa como evoluciono el flujo de filtrado en el curso de la filtracion. Se puede ver claramente que el flujo permanece entre 36 y 30 LMH la mayor parte del tiempo. La cafda al final es probablemente debida a la incrementada polarizacion de la concentracion. Hubo un pronunciado aumento de la concentracion de protema total en la corriente de la fraccion retenida al final de la filtracion (Figura 2). La 20 concentracion en el filtrado permaneda casi constante durante la filtracion.

6.2.1 Balance de masa en microfiltracion

Se determino el balance de masa de la microfiltracion. Los resultados se resumen en la Tabla 5. El porcentaje del balance de masa calculado usando la Ecuacion (4) era 94, lo que significa que el 6% de protema se habfa perdido en cierto modo despues de la filtracion. Siempre hay una cierta perdida debido al volumen de retencion del cartucho 25 de filtro, conducciones y bomba. Alguna de las perdidas probablemente se origina en la obturacion de la membrana. El volumen de retencion para cartuchos usados en este trabajo esta en el intervalo de 30 ml. Despues de la etapa de lavado la cantidad de protema en el volumen de retencion se considera por lo tanto que es despreciable.

Tabla 5. Calculos del balance de masa para filtracion de 1000 kDa

Fraccion: Volumen total (l) Cproteina (mg/ml) Protema total (g) Valor del porcentaje (%)

Alimentacion: 45 0,625 28,125 100

Filtrado: 45 0,513 23,085 82

Concentrado: 0,5 3,945 1,973 7

Lavado: 0,4 3,680 1,472 5

% de balance de masa: 94

30 6.3 Viabilidad de la ultrafiltracion de cartucho

Lotes microfiltrados de 22 y 23 litros se ultrafiltraron usando un filtro de 10 kDa de tipo V. Tardo 5 horas en llegar a VCFs de 10,5 y 8,5, respectivamente. Las dos filtraciones se comportaron en general bastante similarmente lo que se puede ver de las velocidades de flujo (Figuras 3A y 3B). En ambos casos la cafda de flujo durante los 10 primeros minutos era 6-7%. Esto es provocado usualmente por la polarizacion de la concentracion y posiblemente por la 35 obturacion. Cuando se habfa llegado a los VCFs finales los flujos eran el 72 y 73% (39 y 38,4 LMH) de los valores iniciales de 54 y 52,8 LMH, respectivamente.

6.3.1 Balances de masa en ultrafiltraciones

Las dos ultrafiltraciones dieron balances de masa muy proximos entre sf. Los porcentajes de perdida de balance de masa eran 3 y 5%. La mayor parte de la protema se podna encontrar en el concentrado (la fraccion retenida) como

5

10

15

20

25

30

35

se ve en la Tabla 6. Una diferencia chocante era la concentracion de protema (Cproteina) en las alimentaciones. Las concentraciones medidas eran 0,47 y 0,555 mg/ml aunque el material era el mismo. Esto podna ser debido a variaciones en el metodo de analisis.

Tabla 6. Calculos del balance de masa para dos filtraciones de 10 kDa (cartucho de tipo V)

Alimentacion: 22 0,47 10,43 100

: 23 0,555 12,77 100

Filtrado: 19,2 0,05 0,96 9

: 20 0,05 1,0 8

Concentrado: 2,1 4,1 8,61 83

: 2,75 3,88 10,67 84

Lavado: 0,4 1,535 0,61 6

: 0,4 1,225 0,49 4

Balance de masa total: 98




: 95

6.3.2 Analisis SDS-PAGE del filtrado en ultrafiltracion

El perfil protemico del filtrado muestra excelentemente lo bien que la membrana satisface sus especificaciones. El ensayo de integridad usualmente revela si la membrana ha perdido su selectividad pero el analisis SDS-PAGE muestra tambien los detalles para el cartucho intacto. La Figura 4 muestra el perfil protemico del filtrado de la ultrafiltracion de 23 litros. Se puede ver claramente que no hay protemas mayores de alrededor de 13 kDa. Este es un muy buen resultado para un cartucho de 10 kDa de corte.

6.4 Optimizacion de flujo y TMP para cartucho de microfiltracion

La optimizacion del rendimiento de flujo de microfiltracion se describe en el capttulo 5.2.2. El fin es determinar las condiciones en las que se consigue el mas alto flujo estable. Se usaron cuatro caudales transversales diferentes. Los resultados se presentan en las Figuras 4 y 5.

Una caractenstica comun de los cuatro casos era la cafda de flujo en el inicio de los experimentos. Esto es probablemente debido al efecto de obturacion o polarizacion de la concentracion. Despues de los primeros 15 minutos el flujo parecfa estabilizarse. De la Figura 5 no se puede concluir que se consiguiera el flujo cntico usando los caudales transversales de 1,15 o 1,66 l/min. Sin embargo, alrededor del punto de tiempo de 70 minutos hubo una disminucion de flujo a TMP constante en ambos casos. Cuando se abre totalmente la valvula de filtrado en la siguiente fase, los flujos paredan ser estables.

Cuando se usan caudales transversales de 2,15 y 2,75 l/min (Figura 6) sacar conclusiones es mas complicado. Hay una ligera disminucion del flujo durante los primeros 15 minutos de cada fase. Sin embargo, se podna ver una mas significativa disminucion durante la ultima fase en ambos casos. Se podna por lo tanto definir que los flujos cnticos son de alrededor de 60-66 LMH cuando el caudal transversal inicial es 2,15 l/min y alrededor de 72-78 lMh cuando el caudal transversal es 2,75 l/min.

6.5 Optimizacion de flujo y TMP para cartucho de ultrafiltracion de tipo V

Como se describe en el capttulo 5.2.2, se estudio el flujo versus TMP usando cuatro diferentes caudales transversales y dos valores de VCF (1 y 10). Las curvas obtenidas se presentan en las Figuras 7 (VCF 1) y 8 (VCF 10).

Cuando el VCF era 1, la pendiente de la curva comenzaba a descender solo a caudales transversales de 1,15 y 1,66 l/min (Figuras 7A y B). Esto sucedio en ambos casos a una TMP de alrededor de 2,5 bar y los flujos optimos correspondientes eran de alrededor de 84 y 96 LMH, respectivamente. A mas alta presion el lavado de la superficie de la membrana puede no ser suficiente a estos dos mas bajos caudales transversales. A mas altos caudales transversales (2,15 l/min y 2,75 l/min) el fenomeno no se observo (Figuras 7C y D). La TMP se podna haber elevado mas pero la presion de alimentacion era ya casi 3 bar cuando la TMP era 2,36 bar y 2,27 bar, respectivamente. Los flujos a estas presiones era 105 y 108 LMH y estan en el intervalo lineal.

Usando una concentracion mas alta de la disolucion de protema (VCF 10), el descenso de la pendiente se vefa mas

claramente. Como se muestra en la Figura 8A, la TMP optima es 1,8 bar dando el flujo de 60 LMH a el caudal transversal de 1,66 l/min. Cuando el caudal transversal era 2,75 l/min los valores comparables son 2 bar para TMP y alrededor de 78 LMH para el flujo (Figura 8B). Todos los resultados, incluyendo aquellos para el VCF 1 se resumen en la Tabla 7.

5 Tabla 7. TMPs optimas y valores correspondientes de flujo para diferentes caudales transversales iniciales y VCFs

VCF: Caudal transversal (l/min) TMP optima (bar) Flujo (LMH)

1: 1,15 2,5 85

1: 1,66 2,65 99

1: 2,15 >2,36 >105

1: 2,75 >2,27 >108

10: 1,66 1,8 60

10: 2,75 2 78

6.6 Diseno experimental usando MODDE

Se llevaron a cabo una serie de experimentos disenados usando el software MODDE. Consistian en 11 ultrafiltraciones con diferentes composiciones de parametros. Las respuestas medidas fueron la duracion de la 10 concentracion de 3 litros de extracto de protema a VCF 10 y la concentracion de protema total. Los resultados directos se presentan en la Tabla 8. Los valores de TMP variaban dependiendo de la velocidad de la bomba y la obstruccion de la fraccion retenida. El intervalo era 0,5-1,45 bar en el caso de la membrana A y 0,65-1,85 en el caso de la membrana B.

Tabla 8. Un resumen de parametros y respuestas obtenidas de experimentos de ultrafiltracion disenados usando el 15 software MODDE

Exp. No.: Nombre del Exp. Orden del exp. Incl/ excl Bomba Hz % de estrangulamiento de la fraccion retenida Temp. °C Membrana Tiempo min Conc. mg/ml

1: N1 5 Incl. 3,0 20,0 15 A 51 2,02

2: N2 1 Incl. 6,0 20,0 15 B 18 2,08

3: N3 2 Incl. 3,0 80,0 15 B 30 2,2

4: N4 6 Incl. 6,0 80,0 15 A 20 2,22

5: N5 3 Incl. 3,0 20,0 30 B 31 2,28

6: N6 7 Incl. 6,0 20,0 30 A 25 2,24

7: N7 8 Incl. 3,0 80,0 30 A 40 2,4

8: N8 4 Incl. 6,0 80,0 30 B 13 1,9

9: N9 9 Incl. 4,5 50,0 22,5 A 33 2,18

10: N10 11 Incl. 4,5 50,0 22,5 A 33 2,2

11: N11 10 Incl. 4,5 50,0 22,5 A 33 2,02

6.7.1 Ajuste del modelo

Los valores de las respuestas (tiempo y concentracion de protema, o rendimiento) se insertaron en MODDE. El modelo se ajusto usando el metodo de mmimos cuadrados parciales (PLS) y se sometio al analisis de la varianza 20 (ANOVA). La Figura 9 representa el grafico denominado Resumen del Ajuste. Para cada respuesta ajustada hay cuatro barras en el grafico. Segun el manual del software MODDE, los valores para R2 y Q2 proporcionan el mejor resumen del modelo. R2 describe lo bien que el modelo de regresion se puede hacer que ajuste los datos y se denomina “bondad del ajuste”. Q2 se refiere a la “bondad de la prediccion” y describe el poder predictivo del modelo. Generalmente R2 y Q2 deben ser altos y no estar separados mas de 0,2-0,3. La barra “MV” en la Figura 20 describe 25 la validez del modelo. Si el valor esta por debajo de 0,25, el error del modelo es notablemente mayor que la

5

10

15

20

25

reproducibilidad mostrada como barra “RE”. (Umetrics AB 2003). Para el valor Tiempo, todos los parametros evaluativos son buenos excepto la validez del modelo (Figura 9). La validez del modelo no se puede calcular porque los experimented repetidos de punto central dieron exactamente el mismo resultado (100% de reproducibilidad). Para el rendimiento (concentracion de protema) la bondad del modelo y la prediccion son bajas o cero, lo que significa que el sistema de filtracion es muy robusto con respecto al rendimiento: Los cambios dentro del intervalo de parametros seleccionados entonces no tienen una influencia sobre el rendimiento.

La tabla de ANOVA sobre el rendimiento (Tabla 9) muestra que la falta de ajuste no es significativa con un nivel de confianza del 95% dado que p>0,05. Como se ve tambien en la Figura 9, no hay error del modelo con respecto al rendimiento. El valor p de la regresion es 0,730, que esta muy por encima del valor cntico 0,05. La regresion por tanto no es significativa con un nivel de confianza del 95%, y el rendimiento no se puede predecir usando el modelo. Para el valor del tiempo, la tabla de ANOVA (Tabla 10) parece diferente. El valor p para la falta de ajuste (error del modelo) no se pudo determinar. Todos los experimentos de punto central espedficamente dieron como resultado los mismos valores de tiempo. Por lo tanto, no hay un error real en el modelo. Indicando el p=0,000 para la regresion muy buen modelo con respecto al tiempo de filtracion.

Tabla 9. Tabla ANOVA para el rendimiento. DF es grados de libertad, SS es la suma de cuadrados, MS es la media de los cuadrados y SD es la desviacion estandar.

Rendimiento: DS SS MS (varianza) F p SD

Total: 11 51,434 4,67582

Constante: 1 51,2352 51,2352

Total corregido: 10 0,198757 0,0198757 0,140981

Regresion: 4 0,0506643 0,0126661 0,513167 0,730 0,112544

Residual: 6 0,148093 0,0246822 0,157106

Falta de ajuste (error del modelo): 4 0,128626 0,0321566 3,30375 0,246 0,179322

Error puro (error de repeticion): 2 0,0194667 0,00973334 0,0986577

N=11 Q2=0,000 Cond. no.=1,049

DF=6 R2=0,255 Y-miss=0

Comp.=2 R2 Adj=-0,242 RSD=0,1571

Tabla 10. Tabla ANOVA para el tiempo. DF es grados de libertad, SS es la suma de cuadrados, MS es la media de los cuadrados y SD es la desviacion estandar.

Tiempo: DS SS MS (varianza) F p SD

Total: 11 10847 986,091

Constante: 1 9720,82 9720,82

Total corregido: 10 1126,18 112,618 10,6122

Regresion: 4 1079,47 269,867 34,6618 0,000 16,4276

Residual: 6 46,7143 7,78571 2,79029

Falta de ajuste (error del modelo): 4 46,7143 11,6786 - - 3,41739

Error puro (error de repeticion): 2 0 0 -

N=11 Q2=0,738 Cond. no.=1,049

DF=6 R2=0,959 Y-miss=0

Comp.=2 R2 Adj=-0,931 RSD=2,79

6.7.2 Evaluacion de los resultados

El tiempo era la unica respuesta que se podna afectar. La Figura 10 muestra como inflrna cada parametro en el tiempo de ultrafiltracion. Se puede ver claramente que la velocidad de la bomba (es decir, caudal de alimentacion)

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tiene el mayor efecto en la duracion de la filtracion. Una velocidad mas alta da como resultado una filtracion mas rapida. El estrangulamiento de la corriente de la fraccion retenida tiene una influencia minuscula. La temperatura no parece jugar ningun papel dado que su barra de error es incluso mayor que la barra real que describe el efecto. Cuando se comparan membranas, parece obvio que la membrana B es una mejor eleccion. Seleccionar la membrana B proporciona alrededor de 5 minutos de tiempo de filtracion mas corto comparado con el tiempo medio. Para la membrana A, el tiempo correspondiente es alrededor de 5 minutos mas largo.

La calidad de la filtracion es otro factor importante. Se estudio tomando muestras de los filtrados y midiendo su concentracion de protema. En todas la muestras la concentracion estaba por debajo de 0,05 mg/ml excepto en el filtrado del experimento 4 en el que la concentracion era 0,06 mg/ml. El perfil protemico de los cuatro filtrados se estudio usando analisis SDS-PAGE. Los perfiles se muestran en la Figura 1l. Los filtrados de los experimentos 1 y 4 (lmeas 2 y 3) se obtuvieron por ultrafiltraciones usando membrana B y los filtrados de los experimentos 7 y 10 (lmeas 4 y 5) usando membrana A. No hay protemas mayores de 13 kDa visibles en ninguna de las muestras. Esto significa que en todas las filtraciones estudiadas aqu la membrana funcionaba segun su valor de corte teorico. En el caso del experimento 1, apenas se ven protemas.

6.8 Optimizacion de flujo versus TMP para cartuchos de ultrafiltracion de tipo C

Los filtros de tipo C habfan demostrado ser una buena opcion para la ultrafiltracion del extracto de protema osea. Proporcionan una mejor turbulencia y menos resistencia de cizalladura que los filtros de tipo V que tienen canales de alimentacion mas abiertos. La cizalladura es menor con filtros de tipo C debido a que se obtiene la misma TMP que para el filtro de tipo V con un menor caudal de alimentacion. La optimizacion de flujo versus TMP se estudio segun el plan mostrado en la Tabla 4. En el caso del cartucho de filtro Biomax los resultados se presentan en la Figura 12 para VCF 1 y en la Figura 13 para VCF 5. Para el cartucho de filtro Ultracel las correspondientes figuras son la Figura 14 y la Figura 15. En este estudio la concentracion de VCF de 1 a VCF de 5 no se realizo usando los mas altos valores posibles. Los balances de masa se determinaron despues de los experimentos de optimizacion.

6.8.1 Filtro Biomax

En el caso de VCF 1 se observo la unica evidencia clara de un flujo decreciente a un caudal transversal inicial de 0.945 l/min (Figura 12A). Este y todos los demas valores, incluyendo la comprobacion de la histeresis se resumen en la Tabla 11. A TMP 2,3 bar el flujo era de alrededor de 108 LMH. A caudales horizontales mas altos no se observo disminucion del flujo a TMP alrededor de 2,8 bar. No se ensayaron valores mas altos porque la presion de alimentacion ya estaba en 3,6 bar debido al estrangulamiento de la fraccion retenida. De este modo, por lo menos se puede conseguir con seguridad un flujo de 138 LMH a un caudal transversal de 1,125 l/min y 132 LMH a 1.350 l/min, respectivamente.

Cuando se ensayo una concentracion mas alta (VCF 5) del extracto de protema a un caudal transversal inicial de 0.945 l/min hubo una ligera disminucion de flujo a valores altos de TMP (Figura 13). Esto puede indicar que el punto de flujo cntico estaba cerca. De nuevo, el experimento se detuvo debido a la alta presion de alimentacion. Al caudal transversal mas alto (1,350 l/min) se observo el punto rodilla cuando TMP era 2,5 bar con el flujo 108 LMH.

6.8.2 Filtro Ultracel

Los filtros Ultracel y Biomax difieren en material de la membrana. Esto provoca diferentes caractensticas de flujo. Como afecta esto a los eventos de filtracion es espedfico para cada caso. En este estudio usando extracto de protema osea, el mismo caudal de 0.945 l/min condujo a la TMP inicial de 1,04 bar y flujo de 57 LMH en el caso de filtro Ultracel en comparacion con la TMP inicial de 0,62 bar y el flujo de 30 LMH para el filtro Biomax (Figuras 14B y 12A). En comparacion, los valores correspondientes para el filtro Biomax de tipo V, incluso a un caudal transversal superior (1,15 l/min), eran tan pequenos como 0,17 bar y practicamente flujo cero (Figura 7A). Esto justificana el uso de cartuchos Ultracel de tipo C.

De las Figuras 14 y 15, se puede concluir que en ninguno de los caudales transversales usados en este estudio se alcanzo el lfmite superior de TMP y de este modo el flujo maximo. Este era el caso tanto para VCF 1 como para VCF 5. Esto era debido a las limitaciones de la presion de alimentacion, que excedfa de 3,6 bar. Parece que el filtro Ultracel no se obturaba facilmente incluso a altas presiones y flujos. La verificacion de la histeresis confirmo esto debido a que se consiguio el flujo inicial despues de los experimentos. La Tabla 16 resume todos los resultados.

6.8.3 Resumen de los resultados de la optimizacion de ultrafiltracion usando cartuchos de tipo C.

La Tabla 11 resume los resultados obtenidos durante las etapas de optimizacion para los filtros Biomax de tipo C y cartucho de Ultracel. Se ve claramente que se alcanzo el flujo optimo en pocos casos. Por lo tanto, ambos tipos de membrana muestran buen rendimiento. Como comparacion, el filtro Biomax de tipo V habfa mostrado un flujo cntico de 84 LMH a un caudal transversal de 1,15 l/min, mientras que el flujo cntico del filtro de tipo C es de mas de 138 LMH a un caudal transversal casi igual.

Los resultados de la verificacion de histeresis indican que la membrana Biomax se obtura mas facilmente que la membrana Ultracel. Los caudales del filtro Ultracel volvieron a los valores iniciales en todos menos uno de los casos.

Para el filtro Biomax, los caudales promedio fueron el 97% de los valores iniciales, que es un buen resultado. Sin embargo, se deben hacer ensayos adicionales antes de sacar las conclusiones finales.

Tabla 11. Resumen de los resultados de la optimizacion de flujo versus TMP para ultrafiltros de tipo C

Membrana/VCF: Caudal transversal (l/min) TMP optima (bar) Flujo (LMH) Histeresis (% del flujo inicial)

Biomax/1: 0,945 2,3 108 100

Biomax/1: 1,125 >2,95 >138 92

Biomax/1: 1,350 >2,8 >129 99

Biomax/5: 0,945 >2,85 >114 n.d.

Biomax/5: 1,350 2,5 108 96

Ultracel/1: 0,730 >2,7 >138 100

Ultracel/1: 0,945 >2,6 >144 100

Ultracel/1: 1,125 >2,4 >138 100

Ultracel/5: 0,945 >2,7 >129 100

Ultracel/5: 1,125 >2,4 >117 98

5 Los balances de masa de los experimentos mostrados anteriormente se calcularon y se presentaron los resultados en la Tabla 12. En ambos casos no se encontro cantidad detectable de protema en el filtrado. Las concentraciones de protema en las disoluciones de lavado y alimentacion eran las mismas. La unica diferencia se encontro en el concentrado que contema 87% de la protema total medida de la alimentacion en el caso del filtro Biomax. El valor correspondiente para el filtro Ultracel era 95%. Este alto valor dio como resultado un incremento del 6% en el 10 balance de masa final. Sin embargo, esta unica comparacion no indica de manera fidedigna que el filtro Ultracel proporciona un rendimiento mas alto. Cuando se calculan los rendimientos medios de siete filtraciones usando el filtro Biomax, y cuatro filtraciones usando el filtro Ultracel (Tabla 8), los resultados son 2,18 y 2,12 mg/ml, respectivamente. Como ya se evaluo usando el software MODDE, no hay notables discrepancias respecto al rendimiento.

15 Tabla 12. Calculos del balance de masa de ultrafiltraciones usando filtros Biomax tipo C y cartucho Ultracel.

Fraccion/membrana: Volumen total (l) Cproteina (mg/ml) Protema total (g) Valor del porcentaje (%)

Alimentacion/Biomax: 5 0,46 2,3 100

Alimentacion/Ultracel: 5 0,46 2,3 100

Filtrado/Biomax: 4 0(<0,05) 0 0

Filtrado/Ultracel: 4 0(<0,05) 0 0

Concentrado/Biomax: 1 2,01 2,01 87

Concentrado/Ultracel: 1 2,01 2,18 95

Lavado/Biomax: 0,5 0,5 0,25 11

Lavado/Ultracel: 0,5 0,52 0,26 11

Balance de masa /Biomax: 98

Balance de masa/Ultracel: 106

6.9 Eficiencia de la limpieza de membranas

El valor de NWP se midio despues de la etapa de limpieza, realizada despues de cada filtracion. Los resultados se resumen aqm. La membrana Biomax parecfa obturase mas facilmente que la membrana Ultracel. La Figura 16 20 muestra la eficacia de limpieza evaluada por los valores NWP. Se realizaron siete ciclos de filtracion usando la membrana Biomax y cuatro usando la membrana Ultracel. Las filtraciones se describen en el capttulo 5.3. Los experimentos de limpieza se llevaron a cabo usando NaOH 0,1 M durante 30 minutos a 37°C. En el caso del filtro Ultracel, la NWP casi volvio a su valor inicial en las cuatro limpiezas. El filtro Biomax mostro menor recuperacion

aunque era generalmente por encima de 90%, excepto despues de la filtracion numero 7. Despues de los experimentos de optimizacion de flujo vs. TMP (vease capftulo 6.8) usando estos mismos filtros la recuperacion de NWP era 99% para el filtro Ultracel y de 72% para el filtro Biomax cuando se llevo a cabo la limpieza usando NaOH 0,1 M durante 30 minutos a 37°C. Subsecuentemente, cuando se somete el filtro Biomax a limpieza mas severa con 5 NaOH 0,2 M durante 60 minutos a 45°C, la NWP volvio al 78% de su valor inicial. Incrementar la concentracion de NaOH a 0,3 M y haciendolo circular durante 45 minutos a 45°C proporciono un valor de NWP de 80%. Se encontro que se requena este mismo protocolo para restaurar la NWP del cartucho de ultrafiltracion Biomax de tipo V y de microfiltracion del tipo V a valores por encima de 80% (resultados no mostrados).

6.10 Aumento a escala del procedimiento de filtracion

10 Los filtros de cartucho son linealmente escalables. Por lo tanto, el area de membrana y el caudal de alimentacion requeridos en la escala de fabricacion final se pueden calcular en base a los resultados obtenidos a pequena escala. En este estudio los calculos para aumentar a escala el procedimiento de filtracion se realizaron para filtros Ultracel y Biomax de tipo C. Se usaron los valores obtenidos en los experimentos descritos en el capftulo 6.8. El valor de VCF era 5. No se llego al maximo absoluto para los flujos de filtrado para los filtros Biomax y Ultracel en esos 15 experimentos. Los mayores valores mostrados en la Tabla 11 se usan en los calculos de aumento a escala. El resumen de los resultados de aumento a escala se muestra en la Tabla 13.

6.10.1 Definiendo el flujo medio de filtrado

El flujo usualmente disminuye durante la filtracion. Con propositos de aumento a escala se necesita un valor medio. El flujo medio de filtrado Jf se puede calcular usando la Ecuacion (5):

20 Jf — 0,33 Jinicial + 0,67 Jfinal (5)

en la que

Jinicial es el flujo de filtrado inicial (l/m2/h, LMH) y Jfinal es el flujo de filtrado al final de la filtracion (LMH).

Por lo tanto Jinicial es el flujo cuando VCF es 1, y Jfinal en este caso es el flujo para VCF de 5. Los valores mas altos 25 de flujo de la Tabla 11 para ambos VCFs se usan en los calculos que usan la Ecuacion (5). Cuando VCF es 1, esos valores son 138 LMH para Biomax y 144 LMH para Ultracel. Cuando VCF es 5, los valores correspondientes son 114 LMH y 129 LHM, respectivamente. Substituyendo estos valores en la ecuacion (5) da Jf de 121 LHM para Biomax y 134 LHM para Ultracel. Si se desea un sistema muy robusto se puede usar meramente la Jfinal como Jf. Se debe advertir que, desgraciadamente, el flujo critico para Biomax en el caso de VCF de 5 no se ensayo para el 30 caudal de alimentacion de 1,125 l/ml. El uso de este caudal dio los mas altos flujos cuando VCF era 1. El valor de 114 LHM obtenido por el caudal de alimentacion de 0,945 l/min se usa en los calculos, lo que puede distorsionar los resultados hasta cierto punto.

6.10.2 Aumento a escala del area de la membrana

35

El area de membrana requerida para la filtracion (concentracion) de un cierto volumen de disolucion en un tiempo de proceso deseado se puede determinar de la Ecuacion (6):

A

■. ^"1! :+• j J ij-'V/.

r

(6)

en la que

Vfiltrado es el volumen del filtrado a procesar (l),

Jf es el flujo (LHM) medio de filtrado determinado a pequena escala y 40 t es el tiempo del procedimiento de filtracion deseado (h).

Si el volumen del filtrado en la escala de fabricacion es 800 l (VCF de 5 para un lote de 1000 l) y el tiempo deseado cuatro horas, el area A de membrana requerida se puede calcular usando la Ecuacion (6). Substituyendo los valores de Jf calculados anteriormente dara un area de membrana de 1,65 m2 para la membrana de Biomax y 1,49 m2 para la membrana de Ultracel. Se recomienda un factor de seguridad adicional de 20% para el area de la membrana (Millipore 2008). Por lo tanto, los valores son 1,98 m2 y 1,79 m2. En la practica esto significa el uso de cuatro membranas de 0,5 m2, dando un area de la membrana final de 2 m2. El area de la membrana aumentada a escala se puede calcular tambien usando la Ecuacion (7). El resultado final es el mismo que el obtenido via la Ecuacion (6).

a - j vticm

^sscill — n-exw ■ * t

(7)

en la que

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Aexp es el area de la membrana usada en el experimento (m2),

Vescai es el volumen del procedimiento a gran escala (l),

Vexp es el volumen usado en el experimento (l),

tescal es el tiempo de filtracion deseado en el procedimiento a gran escala (h), y texp es el tiempo de filtracion del experimento (h).

6.10.3 Calculo del caudal de alimentacion en el procedimiento aumentado a escala.

Para el procedimiento de filtracion a gran escala el caudal de alimentacion tambien se debe aumentar a escala. Se puede determinar de la Ecuacion (8):

imagen1

(8)

en la que

Qalim, exp es el caudal de alimentacion usado en el experimento (l/min),

Aexp es el area de la membrana usada en el experimento (m2) y Aescal es el area de la membrana en el procedimiento a gran escala (m2).

Los caudales de alimentacion usados en los experimentos a pequena escala se seleccionan de la Tabla 16. Para el mas alto flujo de filtrado usando el filtro Biomax era 1,125 l/min. Para el filtro Ultracel era 0,945 l/min. El area Aexp de membrana en los experimentos era 0,1 m2. Cuando se insertan los valores de las areas de membrana aumentadas a escala calculados en el capftulo 6.10.2 y se redondean al proximo mas alto valor posible (2 m2 para ambas membranas) la Ecuacion (8) da Qalim. exp de 22,5 l/min para Biomax y 18,9 l/min para Ultracel. En el equipo de filtracion a escala final, la capacidad de la bomba se debe dimensionar para cumplir estos requisitos. O si no se tiene que aceptar un incremento del tiempo de procedimiento.

6.10.4 Resumen de los resultados del aumento a escala

Se uso el ejemplo teorico del volumen de lote de 1000 l y VCF de 5 en los calculos para el procedimiento de aumento a escala. El tiempo del procedimiento a escala total se establecio en 4 horas. Comunmente se recomienda un periodo de tiempo de 3-4 horas (Millipore 2008). Los resultados se resumen en la Tabla 13. Los precios de la unidad de membrana son precios iniciales de la pagina web de Millipore Corporation (
www.millipore.com). La escalabilidad lineal de los filtros de cartucho permite ajustes rapidos de los calculos. Por ejemplo, si se dobla el volumen de filtracion y se mantiene constante el tiempo de filtracion, esto requerina doblar el area de la membrana. Como se puede ver en la Tabla 13 las diferencias entre las dos membranas no son grandes en este experimento. El filtro Ultracel es un poco mas caro que el filtro Biomax.

Tabla 13. Resumen de los factores del procedimiento de aumento a escala y coste de la membrana

: Membrana Biomax 10 C Membrana Ultracel 10 C

Volumen Valim (l): 1000 1000

Volumen Vfiltrado (l): 800 800

Tiempo de filtracion t (h): 4 4

Caudal de alimentacion Qalim (l/min): 22,5 18,9

Area de la membrana A (m2): 2(1,74) 2 (1,67)

Precio de la unidad de membrana (eur): 2227 2498

para filtro de 0,5 m2

Numero de unidades de membrana necesarias: 4 4

Coste total de la membrana (eur): 8908 9992

7 Discusion

Los procedimientos de filtracion de materiales biologicos complejos son siempre espedficos de cada caso. Cada material tiene su propia composicion de protemas y otros elementos, y sus efectos no se pueden predecir. Ademas,

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la disolucion y otras condiciones tambien afectan el resultado. En este estudio, el extracto de protema osea fue sometido a micro- y ultra-filtracion y una serie de experimented se usaron para optimizar el procedimiento tanto como sea posible. No se ha encontrado ningun otro estudio publicado que sea directamente comparable con este estudio. Este tipo de datos de la optimizacion se recogen tipicamente dentro de la industria y por lo tanto no necesariamente estan publicados.

Los primeros ensayos de viabilidad mostraron que los filtros de cartucho se pueden aplicar de manera eficiente para micro- y ultra-filtracion del extracto de protema. No se observo ninguna disminucion significativa en el flujo de filtrado, ya sea durante las etapas de micro- o ultra-filtracion, como se muestra en las Figuras 12 y 14. El factor de concentracion volumetrico fue tan alto como 45 para la microfiltracion, y 10 para la ultrafiltracion. Ademas, los porcentajes de balance de masa eran satisfactorios: 94% para microfiltracion y 95-98% para la ultrafiltracion. Si la recuperacion total de masa de producto es menor que la masa inicial de producto, es tfpicamente debido a las perdidas de adsorcion y/o solubilidad durante el proceso (Millipore Corporation 2007). Sin embargo, el metodo de analisis de protema usado en este estudio no es absolutamente preciso.

Un objetivo de este estudio era seleccionar el filtro de ultrafiltracion apropiado. En los ensayos de viabilidad, se usaron filtros que tienen geometna abierta del canal de alimentacion (tipo V). Para este tipo de filtros, era necesario un caudal relativamente alto de alimentacion para proporcionar suficiente flujo. Debido a este hecho y a los resultados positivos obtenidos en los ensayos de viabilidad, se identificaron dos ultrafiltros, el Biomax y Ultracel. Ambos filtros poseen mas estrechos canales de alimentacion (tipo C). El Biomax esta basado en una membrana de composite de polietersulfona mientras que el Ultracel es un composite de celulosa regenerada. La celulosa regenerada se selecciona a menudo para aplicaciones biofarmaceuticas debido a su propiedad de baja obturacion.

Ambas membranas de ultrafiltracion se compararon y se examinaron los otros parametros del procedimiento durante once experimentos de filtracion diferentes. Estos experimentos fueron disenados usando el software MODDE. En base a los resultados, el filtro Ultracel parece dar un tiempo de filtracion mas corto. El aumento del caudal de alimentacion tambien acorta el tiempo de filtracion. Sorprendentemente, el estrangulamiento de la corriente de la fraccion retenida no mostro un efecto significativo. Sin embargo, esto era debido probablemente al hecho de que la valvula de estrangulamiento no podfa bloquear la corriente lo suficiente, incluso cuando estaba cerrada al 80%. Este fue el valor maximo en estos experimentos. Es obvio que limitar la corriente de la fraccion retenida hace que se incremente el flujo de filtrado, hasta cierto punto. El experimento podna ser redisenado usando un valor n superior y dejando de lado los factores que no mostraron ninguna influencia (por ejemplo, temperatura) para obtener resultados mas exactos. Ambos filtros ensayados mostraron iguales rendimientos de protema, de modo que la posible alta obturacion de la membrana Biomax no es suficientemente significativa para provocar la perdida detectable de protemas.

Para el extracto de protema osea, el flujo cntico de 138 LMH se consiguio bajo TMP de 2,95 bar usando la membrana de polietersulfona de 10 kDA de corte de tipo C (Biomax, Millipore Corporation). En el caso de la membrana (Ultracel) de celulosa regenerada de tipo C de 10 kDa de corte de Millipore los valores correspondientes eran 144 LMH y 2,6 bar, respectivamente. En ambos casos no se alcanzo el valor cntico absoluto para el flujo debido a las limitaciones de la presion de alimentacion. Para la comparacion, la Biomax de tipo V dio un flujo cntico de 108 LMH a TMP de 2,5 bar.

Como se observo durante los estudios de optimizacion, los ultrafiltros de tipo C proporcionaron flujos mayores con caudales de alimentacion mas bajos en comparacion con los filtros de tipo V. Los filtros de tipo A tienen los canales de alimentacion mas estrechos y mas promotores de turbulencia. Por lo tanto, se podnan obtener con estos filtros flujos altos o incluso mas altos comparados con los filtros de tipo C (y tipo V). Esto significa que se puede lograr la misma eficiencia, pero con caudales de alimentacion mas bajos, o menores costes de operacion. Se necesita menos energfa para el bombeo y tambien disminuye la resistencia de cizalladura de la bomba hacia el producto. El mismo tipo de optimizacion adicional se debe aplicar para la microfiltracion. En este estudio se uso solo un tipo de microfiltro (Biomax de tipo V con 1000 kDa de corte).

El analisis de la idoneidad de los protocolos de limpieza de membrana por medio de la monitorizacion de los cambios en la NWP mostro algunas diferencias entre la membrana de polietersulfona (Biomax) y la membrana de celulosa regenerada (Ultracel). El protocolo de limpieza estandar usando un litro de hidroxido de sodio 0,1 M a + 37°C durante 30 minutos fue suficiente para restaurar la NWP original. El mismo protocolo se uso para la membrana Biomax y fue capaz de restaurar el 90% de la NWP original en la mayona de los casos (Figura 16). La NWP ± 20% del original tipicamente da como resultado la reproducibilidad del procedimiento (Millipore 2000). Sin embargo, en aquellos casos en los que no se alcanzo suficiente NWP, la limpieza con NaOH 0,3 M a 45°C durante 45 minutos era necesaria para restaurar el 80% de la NWP original. Esto sugiere la obturacion de la membrana. El filtro de Biomax puede necesitar limpieza con hipoclorito de vez en cuando.

Se ha estudiado la eficacia de limpiar los filtros Biomax y Ultracel despues de la filtracion de la disolucion que contiene 2-25% de seroalbumina humana (Millipore Corporation 2.000). Se mostro que la limpieza con NaOH 0,25 M a 40°C durante 60 minutos era suficiente para que la membrana Ultracel volviera a valores de NWP casi cercanos a los niveles iniciales. Un efecto similar se obtuvo para la membrana Biomax usando la misma disolucion fortificada con 250 ppm de hipoclorito de sodio. Se debe verificar la retirada del cloro de la membrana despues de la limpieza,

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lo que requiere una etapa de analisis adicional.

Los calculos para el aumento a escala del procedimiento de ultrafiltracion, a pesar de no ser definitivos, dan una idea de como se puede hacer el aumento a escala. El procedimiento de 1.000 litros sugerido se puede completar en cuatro horas. Esto es porque se obtuvieron razonablemente altos flujos con ambas membranas (Biomax y Ultracel) incluso en comparacion con los flujos presentados en la bibliograffa.

8 Conclusiones

Se encontro que los filtros de cartucho eran apropiados para la micro- y ultra-filtracion de flujo tangencial de extracto de protema osea. Solo un tipo de filtro se sometio a estudios de microfiltracion. El filtro usado era Biomax que utiliza polietersulfona como material de membrana. El valor de corte de peso molecular era de 1000 kDa y el tipo de canal de la malla era V. Se consiguio el flujo cntico de alrededor de 75 LMH. Los resultados se pueden mejorar introduciendo un filtro que posee canales de alimentacion mas cerrados, como el tipo C o A. Alternativamente, se pueden investigar para su uso en microfiltracion filtros basados en celulosa regenerada. Se encontro que la celulosa regenerada era menos susceptible a la obturacion que la polietersulfona en ultrafiltracion.

La ultrafiltracion se investigo usando tres filtros que tienen un valor de corte de peso molecular de 10 kDa. Eran Biomax que tiene un canal de malla de tipo V o C y Ultracel con canal de malla de tipo C. Los materiales de membrana eran polietersulfona y celulosa regenerada, respectivamente. Se encontro que el tipo C daba una mejor relacion de flujo de filtrado a caudal de alimentacion. Por lo tanto, los de filtros Biomax y Ultracel de tipo C se compararon adicionalmente. El flujo medio cntico obtenido era de 121 LMH para Biomax y 134 LMH para Ultracel. Los flujos obtenidos no eran los valores maximos para estos filtros debido a que el flujo se incrementaba linealmente con la presion transmembrana en ambos casos cuando se alcanzo el lfmite de presion de alimentacion del equipo. Esto sugiere ensayos adicionales de filtros de tipo A. No dan necesariamente flujos medios cnticos mas altos en comparacion con filtros de tipo C, pero los flujos se pueden conseguir usando mas bajos caudales de alimentacion

Se estudiaron sistematicamente diferentes parametros que tienen influencia en el procedimiento de ultrafiltracion usando un software (MODDE) para el diseno y analisis de experimentos. Los parametros estudiados en relacion con la duracion de cada filtracion y el rendimiento fueron la temperatura, caudal de alimentacion (velocidad de la bomba), estrangulamiento de la corriente de la fraccion retenida y la membrana. No se observaron diferencias significativas en el rendimiento. La membrana Ultracel dio una velocidad de filtracion mas rapida en comparacion con el filtro Biomax. El aumento de la velocidad de alimentacion tema un efecto similar, como se esperaba. El experimento fue disenado y evaluado con un metodo que no tiene en cuenta las interacciones entre los parametros. Sena necesario un conjunto mas amplio de experimentos para investigar a fondo las posibles interacciones.

Se observaron diferencias de limpieza entre las membranas de polietersulfona (Biomax) y de celulosa regenerada (Ultracel). Los resultados de limpieza se evaluaron mediante la comparacion de los valores de NWP. La membrana de Ultracel se limpio de manera eficiente usando NaOH 0,1 M durante 30 minutos a +37°C. En muchos casos, las membranas Biomax requirieron limpieza usando NaOH 0,3 M durante 45 minutos a 45°C. Basado en la bibliograffa, se sabe que la polietersulfona es mas susceptible a la suciedad que la celulosa regenerada. Este tema podna ser estudiado de forma sistematica usando MODDe. El uso de cloro como un aditivo para la limpieza de las membranas de polietersulfona es una manera de mejorar los resultados. Puede acortar la duracion de la limpieza y tambien sena posible usar mas bajas temperaturas. Estas mejoras afectan directamente a la econoirna del procedimiento. Se podna incluso ensayar la limpieza a temperatura ambiente.

En este estudio, se usaron filtros Pellicon-2® fabricados por Millipore Corporation. Sena posible usar y ensayar filtros de otros fabricantes si tuvieran identicas dimensiones exteriores. Sin embargo, ninguno de los datos obtenidos en este estudio sena aplicable a los otros filtros. La geometna interna de los filtros, la membrana y la clasificacion de los valores de peso molecular de corte difieren entre los fabricantes. Los resultados, recomendaciones y calculos para el procedimiento de aumento a escala son, por tanto, validos solo para los filtros espedficos evaluados en este estudio.

9 Resumen

El proposito de este trabajo era estudiar la filtracion de flujo tangencial con cartucho de extracto de protema osea. Cuando se procesan adicionalmente, las protemas se pueden usar en implantes ortopedicos para mejorar el crecimiento oseo. La filtracion de flujo tangencial se ha usado durante mucho tiempo en diversas aplicaciones industriales. En aplicaciones biofarmaceuticas, se prefieren a menudo filtros de cartucho debido a su escalabilidad lineal, alto rendimiento y la repetitividad de fabricacion de lote a lote.

La parte teorica de este estudio exploro los diferentes disenos de equipo de filtracion, diferentes tipos de membrana y sus propiedades. La ultrafiltracion con cartucho y su uso en aplicaciones biofarmaceuticas era el objetivo principal de este estudio. Tambien se trataron la obturacion, la limpieza y el saneamiento de las membranas.

La parte experimental del estudio consistio en varios experimentos de filtracion, la evaluacion de la eficacia de la limpieza y la realizacion de calculos de aumento a escala del procedimiento. El extracto se filtro primero a traves de un cartucho que tiene un valor de peso molecular de corte de 1000 kDa. La etapa se considero microfiltracion,

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aunque el formato de la membrana es el mismo que en un ultrafiltro. El tamano de poro muy abierto, sin embargo, equivale aproximadamente al extremo inferior del intervalo de microfiltracion (0,1 pm). El protocolo de optimizacion de parametros para la membrana abierta es el mismo que para microfiltros. El filtrado de microfiltracion se sometio a continuacion a ultrafiltracion a traves de un cartucho que tiene un valor de corte de 10 kDa. Los parametros que afectan a las filtraciones se estudiaron a fondo y se optimizaron.

Las dos marcas de filtros estudiadas para ultrafiltracion eran Biomax y Ultracel. Biomax consiste en un material de membrana de polietersulfona mientras que la membrana Ultracel consiste en celulosa regenerada. El Biomax exhibio una ligeramente mayor obturacion de lo que lo hizo el filtro Ultracel, sin embargo; tambien requirio condiciones de limpieza mas severas. Como resultado de la obturacion, el Ultracel produjo flujos ligeramente mas altos y por lo tanto sena una mejor eleccion de filtro para el procedimiento final. No se pudieron alcanzar los flujos de filtrado cnticos absolutos en ninguno de los dos casos. Son necesarios estudios adicionales usando filtros con canales de alimentacion mas cerrados tanto para microfiltracion como ultrafiltracion. Se podnan conseguir flujos de filtrado mas altos con presiones mas bajas, mejorando significativamente la econoirna del procedimiento.

Los calculos para el aumento a escala del procedimiento se basaron en un volumen de lote de 1000 litros y un VCF de 5. Para los ultrafiltros ensayados, el procedimiento se podna completar en cuatro horas usando dos metros cuadrados de area total de filtro con un coste de alrededor de 9.000 €. Los mismos filtros se pueden usar a menudo durante anos. Por lo tanto, el coste de la membrana por lote es moderado. La microfiltracion no se optimizo tan a fondo como la ultrafiltracion. Por lo tanto, no se realizaron calculos para el aumento a escala. Sin embargo, en base a los resultados obtenidos hasta el momento, el coste global de la etapa de microfiltracion debe estar dentro del mismo intervalo que los costes de ultrafiltracion.

El siguiente es un protocolo ejemplar para la extraccion de hueso de reno. Las diferentes etapas descritas se pueden aplicar a otros protocolos similares por separado. Se describen tambien ejemplos de tales protocolos en las figuras 17 y 18. Las Figuras 19 y 20 muestran SDS-PAGEs de extractos nativos desmineralizados usando acido formico o HCI.

1 Limpieza y molienda de hueso en bruto a granulos oseos (todas las etapas de lavado realizadas a <10°C).

1.1 Se pesaron huesos almacenados a -20°C y se cortaron y desecharon los extremos epifisiales del hueso. La superficie exterior se lava a alta presion con agua.

1.2 Se cortan los huesos con una sierra para hueso hasta aproximadamente longitudes de 10 cm y las superficies interiores se lavan con agua a alta presion. El lavado se efectua para retirar la medula osea y el tejido blando.

1.3 Despues de lavar, los huecos corticales limpios se congelan en nitrogeno lfquido durante aproximadamente 20 min, y a continuacion se muelen hasta un tamano de partfcula de 1,0 mm3 usando un Heavy-Duty Cutting Mill SM 2000 (Retsh GmbH, Haan, Germany).

1.4 Los granulos oseos se almacenan a -20°C

1.5 Se toma una muestra de cada lote molido para un recuento aerobico viable total subsecuente (TVAC).

2 Desmineralizacion de granulos oseos

2.1 Alrededor de 30 kg de granulos oseos se lavaron tres veces en agua fria de osmosis inversa (RO) (<10°C) con un tiempo de mezcla de alrededor de 5 minutos por lavado. A continuacion los granulos oseos se desmineralizan en tres etapas con HCl 0,6 M diluido.

2.3 En la primera etapa de desmineralizacion se anaden 120 kg de agua de RO y alrededor de 40 kg de acido clorfndrico (HCl) 2,4 M a los granulos oseos lavados para conseguir una concentracion de HCl de 0,6 M. El caudal de la alimentacion de HCl es de alrededor de 2,4 l por minuto. La mezcla se realiza en un recipiente hecho a medida con enfriamiento (BBS Oy, Bioengineering) y se agita continuamente. La temperatura para esta etapa y todas las etapas subsecuentes de adicion de HCl se mantiene a <10°C. El pH y la temperatura se monitorizan continuamente.

2.4 Despues de completar la alimentacion de HCl y despues de 15 minutos adicionales de mezcla, se detiene el mezclador y se deja que sedimenten los granulos oseos durante 20 minutos. La mezcla de agua desmineralizada se retira por medio de una bomba peristaltica y se descarga como desecho.

2.5 Se realiza la segunda desmineralizacion identica a la primera etapa de desmineralizacion.

2.6 La tercera etapa de desmineralizacion se realiza anadiendo 120 kg de agua a la mezcla de granulos oseos y anadiendo a continuacion alrededor de 20 kg de HCl 2,4 M durante un periodo de 1 h. Se continua la mezcla durante aproximadamente 16 h hasta que el pH permanece constante entre 2,8 y 3,0 durante por lo menos dos horas. La mezcla de agua desmineralizada se retira a continuacion por medio de una bomba peristaltica y se descarga como desecho.

2.7 El hueso desmineralizado se lava cinco veces con alrededor de 60 kg de agua de RO durante 15 minutos. El pH

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del agua en la ultima etapa de lavado debe estar entre 2,4 y 2,6.

3 Extraccion de la matriz osea con hidrocloruro de guanidina (GuHCl)

3.1 Se anaden alrededor de 100 kg de GuHCl 4 M (GuHCl, NIGU Chemie GmbH) al hueso desmineralizado y se mezcla durante 22 h para extraer la protema osea. Los granulos oseos desmineralizados y ex^dos se dejan reposar durante 20 minutos, despues de lo cual el extracto de GuHCl-protema se recoge como producto. El pH y temperature se miden continuamente.

3.2 Se realiza una segunda extraccion de la misma manera, anadiendo alrededor de 100 kg de GuHCl 4 M al hueso extrafdo y mezclando durante 22 h. El extracto de GuHCl-protema obtenido se junta con la primera extraccion. Se mide el pH y debe estar entre un pH de 3,9 a 4,5.

3.3 La concentracion de protema total del extracto de GuHCl-protema se determina por el metodo de Bradford despues de la primera y segunda extracciones y debe ser de alrededor de 0,56 mg/ml + 10%.

4 Centrifugacion para retirar fase solida y componentes de gel

4.1 El extracto de GuHCl-protema se mantiene a <10°C en mezcla continua durante 24 h antes de la clarificacion usando centrifugacion de flujo continuo (CEPA Zentrifuge Z41). El material separado se descarga como desecho.

5 Filtracion

5.1 El extracto de GuHCl-protema obtenido se filtra usando filtros de capsula de un solo uso (capsula STAX de 20 m2 con medio EKSP, Pall Life Science) o usando alternativamente MF-filtration de 0,2 pm (Pellicon, Millipore Corporation).

5.2 El extracto de GuHCl-protema filtrado se concentra por UF-filtration a <10°C, usando filtros de cartucho de 10 kDa (Pellicon, Millipore Corporation).

5.3 Al final de la etapa de ultrafiltracion se recogieron alrededor de 26 kg de concentrado de UF y se almacenaron a <10°C: El filtrado de UF se descarga como desecho.

6 Dialisis con agua

6.1 La dialisis con agua se realiza usando un equipo dializador hecho a medida (BBS Oy/Bioengineering) que contiene 10 membranas de dialisis tubulares. Las membranas de dialisis (Spectra/Por Dialysis Membrane, 34 ml/cm, MWCO: 12-14,000 Spectrum) se tratan con agua purificada durante 20 minutos antes de montar.

6.2 Las membranas de dialisis se cargan con el extracto de GuHCl-protema concentrado a traves de membranas asepticas, alrededor de 3 l por membrana.

6.3 Los parametros establecidos para dialisis con agua son: duracion 47 h, temperatura <10°C, cantidad de agua de RO bombeada 16 l/h. La conductividad del interior de la membrana se mide continuamente con la conductividad final de 2,2-3,5 mS/cm. El precipitado insoluble en agua se hunde al fondo de la membrana durante la dialisis.

6.4 El precipitado y la fase acuosa se centrifugan a <10°C (CEPA Zentrifuge GLE) y el precipitado se recoge en forma de extracto humedo. La cantidad de extracto humedo es de alrededor de 160 g.

7 Redisolucion y filtracion antes de la dialisis con citrato

7.1 El extracto humedo se redisuelve en GuHCl 4 M y se mezcla con un agitador magnetico durante 16-20 horas. Se mide el pH y la conductividad. La conductividad se ajusta a 230 mS/cm con GuHCl 6 M filtrado. La temperatura durante la mezcla es <10°C.

7.2 El extracto redisuelto se filtra a vacm a traves de filtros de disco de 0,45 pm (GN-6 esteril, PALL) y 0,2 pm (Supor 200 esteril, PALL).

8 Dialisis con citrato

8.1 Se realiza dialisis con citrato usando un dializador hecho a medida (BBS Oy/Bioengineering).

8.2 La membrana de dialisis (membrana de dialisis Spectra/Por 4, 18 ml/c, MWCO: 12-14,000, Spectrum) se trata con tampon de citrato 0,25 M (pH 3,1) durante 20 minutos antes del montaje.

8.3 Los parametros establecidos para dialisis son: 47 h, 9°C, 200 kg de tampon de citrato 0,25 M, capacidad de la bomba 16 l/h. La conductividad del interior de la membrana se mide continuamente. La conductividad final es usualmente 9,5-10 mS/cm.

8.4 El material insoluble en el tampon de citrato se centrifuga (rotor de tubo) a <10°C. El tampon de citrato

transparente se decanta a los desechos y se retiene el precipitado.

9 Lavado y liofilizacion de precipitado

9.1 El precipitado se lava tres veces con agua WFI. Entre lavados se retira el agua por centrifugacion

9.2 El precipitado lavado se pesa y se toman muestras para analisis. La cantidad de precipitado es de alrededor de

5 80 g con un contenido seco supuesto de 36%.

9.3 Se anaden excipientes (polisorbato 20, trehalosa, glicina, manitol) al precipitado como lioprotectores, y a continuacion se introduce en bandejas de liofilizacion (Lyoguard).

9.4 La liofilizacion se realiza a -20°C en un liofilizador (Christ EPSILON 2 - 10D LSC).

Tabla 14. Las protemas en extracto nativo desmineralizado con HCl

Las protemas secuenciadas en extracto nativo: Definicion Funcion

Trombina: Protema de coagulacion Estimulacion de la resorcion osea

Vimentina: Protema filamentosa de la celula Estabilizacion del citoesqueleto

Vitronectina: Glicoprotema en la matriz extracelular Promueve la adhesion y extension celular, inhibe los efectos del dano a la membrana

Fosfoprotema 2 secretada, 24 kDa(Spp24): Protema de la matriz osea, contiene el dominio de homologfa del receptor II TGFp (TRH1). Producto de degradacion osteoinductiva (18,5 kDa)

Osteonectina: Glicoprotema de union de calcio Inicia la mineralizacion, remodelacion osea

Trombospondina: Protemas de la matriz extracelular en hueso Se une/activa factores de crecimiento, regeneracion osea

Lisil oxidasa: Enzima de cobre extracelular Smtesis de colageno y elastina (reticulacion)

Condroadherina: Protema de la matriz de cartflago Media la adhesion de condrocitos, se une a colageno

Biglicano: Proteoglicano pequeno rico en leucina (SLRP) Remodelacion y mineralizacion osea, actua junto con TGF-P y BMP-4

Dermatopontina (protema de la matriz extracelular 22 K): Protema de la matriz extracelular con proteoglicano Regula la interaccion de TGF-beta y decorina, esta implicada en la organizacion de la matriz de colageno, promueve la mineralizacion osea e inhibe los efectos de BMP-2 en precursores de osteoblastos.

Protema Gla de la matriz: Protema de la matriz que se une a calcio extracelular Inhibe la calcificacion de la matriz extracelular en arterias y el crecimiento de placa epifisial, protema reguladora para BMP-2

Colageno de tipo I: Protema estructural fibrosa Repara tejido danado, proporciona resistencia, integridad y estructura

Factor de crecimiento transformante beta 1 (TFFp-1): Isoforma de TGFP; factor de crecimiento sintetizado por celulas esqueleticas Remodelacion osea, controla la proliferacion y diferenciacion celular

Lamina AC (LMNA): Protemas de lamina nuclear Forma lamina nuclear, factor requerido para la diferenciacion de osteoblastos

Vitrina: Protema de la matriz extracelular Estabiliza la matriz extracelular

PEDF, factor derivado del pigmento del epitelio: Glicoprotema extracelular Regulacion de la formacion de cartflago, hueso y angiogenesis

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Evaluacion de varias sales de calcio como estructuras para el extracto de protema osea en substitutos oseos.

1 Introduccion

El hueso nativo contiene factores de crecimiento y diferenciacion y moleculas de senalizacion, tales como protemas morfogeneticas oseas (BMPs) que son importantes para la regeneracion de hueso y cartflago. Se requieren estos factores y moleculas y sus concentraciones espedficas durante las diferentes fases de todo el proceso de curacion de la fractura. De este modo, como un tratamiento de fractura osea, el extracto de proteina osea anadido requiere un sistema de suministro o soporte apropiado para evitar la migracion desde el lugar de aplicacion con una liberacion gradual que da como resultado la formacion de nuevo hueso.

Una matriz de soporte optima debe cumplir varios criterios. La matriz debe ser biocompatible, bioabsorbible, maleable, y esterilizable. Los materiales inorganicos cumplen estos requisitos, porque la mayona de ellos son estructuralmente fuertes, inmunologicamente inertes, altamente osteoconductivos y variablemente biodegradables. Las sales de calcio, como materiales inorganicos, se han usado durante anos en diferentes variaciones debido a que la composicion de este material es cercana a la de la composicion de hueso natural.

Se ha mostrado que el fosfato de tricalcio (TCP) es un soporte util para BMPs humanas recombinantes (rhBMPs) y matriz osea desmineralizada (DBM). El TCP tiene muchas caractensticas positivas para el uso en implantes in vivo, tales como velocidades de resorcion que coinciden estrechamente con el curso de remodelacion de hueso esponjoso normal y se puede unir directamente al hueso y tiene una naturaleza principalmente osteoconductiva. El TCP es tambien mas soluble que el hidroxiapatito (HAP). El HAP es relativamente osteoconductivo y tiene alta capacidad de union a protemas. La estructura continua del diseno del HAP proporciona una flexibilidad para conseguir alta porosidad y alta superficie espedfica, lo que hace al HAP un buen candidato para estructuras. Sin embargo, el hAp se combina a menudo con TCP para formar un soporte mas resorbible y poroso con un mayor grado de formacion de hueso. Esta combinacion de fosfatos de calcio tambien se ha usado como soporte para rhBMPs y DBM. El sulfato de calcio se ha investigado como un relleno de huecos de huesos durante mas de cien anos y tiene muchas funciones como parte de un composite de injerto oseo. El sulfato de calcio actua como aglomerante para mejorar el contacto oseo total y el volumen que rodea al implante. El tamano de poro es importante para el crecimiento interno del hueso, e incrementar el tamano de poro mejora los efectos de curacion del hueso de materiales inorganicos, tales como sulfatos de calcio. El sulfato de calcio se ha usado como un soporte para DBM durante varios anos, y en estudios clmicos, ha mostrado excelente biocompatibilidad.

Una mezcla de protemas morfogeneticas oseas (BMP), factores de crecimiento y otras protemas oseas han sido extrafda de materiales oseos de varias especies animales, seres humanos y tumores oseos. Trabajos anteriores han demostrado que el extracto de protema osea de reno es un estimulante eficaz para la formacion de nuevo hueso en un modelo de bolsa muscular de raton. Ademas, la buena capacidad de curacion del extracto oseo de reno en un defecto oseo segmentario se demostro anteriormente en el conejo y la rata. La capacidad del extracto oseo de reno para curar diversos traumas oseos es mejor que la de otros extractos, por ejemplo, extracto bovino o de avestruz, que ha sido explicada por el hecho de que los renos renuevan sus cuernos anualmente. Ademas, se ha sugerido que mas del material protemico extrafdo del hueso de reno esta en forma de monocomponente en comparacion con otras especies, tales como bovino, ovino y porcino. El extracto de protema osea de reno es similar en composicion, modo de fabricacion, y uso deseado y aplicacion a otros extractos de tejido oseo de origen animal. Los productos comparables mas cercanos son Colloss® y Colloss® E, que son extractos oseos desmineralizados creados a partir de productos de matriz osea desmineralizada humana (DBM), tales como pelets de DBM Osteoset®.

Este estudio fue disenado para ser una evaluacion in vivo de los componentes inorganicos estructurales a combinar con extracto oseo de reno en un modelo de bolsa muscular de raton heterotopico de mineralizacion ectopica inducida. Se usaron evaluaciones histologicas y radiograficas para determinar las respuestas del implante y la potencial formacion de nuevo tejido oseo ectopico tres semanas despues de la implantacion.

2 Materiales y metodos

2.1 Extracto de protema osea

El extracto de protema osea se extrajo y purifico de hueso diafisario de reno (Jortikka L, Marttinen A, Lindholm TS.). La protema morfogenetica osea de reno (Rangifer Tarandus) parcialmente purificada tiene una alta actividad de formacion de hueso en comparacion con algun otro artiodactilo, Clin Orthop Relat Res 1993; 297: 33-7). El extracto de protema osea obtenida se liofilizo a -20°C grados usando excipientes (tensioactivo (polisorbato 20, Fluka, Sigma- Aldrich), lioprotector (D-(+)-trehalosa dihidrato, Fluka, Sigma-Aldrich), agente de carga (Glicina, Riedel-de Haen, Sigma-Aldrich) y tampon (D-manitol, Fluka, Sigma-Aldrich)).

El perfil protemico y la bioactividad del extracto de protema osea seco se evaluaron usando el SDS-PAGE y el estudio del modelo de bolsa muscular de raton (Fig. 22).

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2.2 Materiales estructurales y grupos de estudio

Los materiales estructurales y grupos de estudio usados fueron: a) discos porosos que eran de 5 mm x 3 mm (Berkeley Advanced Biomaterials Inc, USA) con una composicion de 30% de hidroxiapatito (HAP), 60% de fosfato de tricalcio (TCP), y 10% de sulfato de calcio (CS); b) discos porosos Cem-Ostetic (Berkeley Advanced Biomaterials Inc., USA), que eran de 5 mm x 3 mm con una composicion de 90% de TCP y 10% de CS; c) polvo Cem-Ostetic® (Berkeley Advanced Biomaterials Inc., USA.) para masilla; d) polvo de CS hemihidrato (97%, Sigma-Aldrich) para masilla; e) discos no porosos (Berkeley Advanced Biomaterials Inc, USA) con una composicion de 60% de HAP, 30% de TCP y 10% de CS; y f) granulos de CS dihidrato con acido estearico con una composicion de acido estearico 50, una mezcla de acidos grasos que consistfa principalmente en acido estearico y 40-60% de acido palmftico (Fluka, Sigma-Aldrich).

2.3 Preparacion de la muestra

El extracto oseo de reno liofilizado (3 mg, BBS-Bioactive Bone Substitutes Ltd, Finland) se reconstituyo en disolucion salina fisiologica al 0,9% (Natriumchlorid, Fagron, Tamro, Finland) y se impregno en los discos porosos (a, b) y el disco no poroso (e), o se mezclo con el polvo de Cem-Ostetic (c) y CS hemihidrato (d) para formar un disco moldeado, o se mezclo en seco con los granulos de CS dihidrato y acido estearico (f) para formar un disco comprimido.

La pata derecha se uso como un control que contiene el respectivo soporte y los excipientes pero excluye el extracto oseo.

2.4 Animales

Se uso un total de 48 ratones de la raza BALB/c. Los animales fueron suministrados por el Laboratory Animal Centre, University of Oulu. Los animales eran de 7-12 semanas de edad en el momento del procedimiento. El esquema de estudio inclrna 6 grupos con 8 animales por grupo.

Un raton del grupo b murio el dfa del procedimiento sin ninguna causa obvia. Un raton del grupo c murio el dfa del procedimiento debido a problemas respiratorios. Ademas, dos ratones del grupo d y un raton del grupo f se sometieron a eutanasia dos dfas despues del procedimiento porque teman problemas caminando. Por lo tanto, 43 ratones sobrevivieron hasta el final del estudio.

2.5 Procedimiento quirurgico

Se realizo cirugfa bajo anestesia general con una mezcla de citrato de fentanilo (80 pg/kg) - fluanisona (2,5 mg/kg) (Hypnorm®, Janssen Pharmaceutica, Inc., Beerse, Belgica) y midazolam (1,25 mg/kg) (Dormicum®, Roche, Basilea, Suiza). Ambas patas se limpiaron, y los ojos de los animales se trataron con gel de ojos para prevenir el secado. El raton se coloco sobre un colchon termico durante el procedimiento. Se hicieron incisiones en la piel transversales cerca de la columna vertebral en el sitio del femur. A continuacion, los implantes se introdujeron en ambas bolsas musculares del muslo en las patas traseras bilaterales. Despues de la implantacion, los musculos se cerraron con dos suturas, y la piel se cerro con una sutura.

La medicacion contra el dolor post-operacion consistfa en buprenorfina (Temgesic®, Reckitt & Colman Pharmaceuticals, Inc, Richmond, Inglaterra) con una dosis de 0,01-0,05 mg/kg subcutaneamente. A los animales se les permitio plena actividad en sus jaulas despues de la operacion. Todos los animales se sometieron a eutanasia 21 dfas despues del procedimiento, y se cosecharon las patas traseras.

El protocolo de estudio fue aprobado por el comite etico institucional de experimentos con animales.

2.6 Evaluacion radiografica de la formacion de hueso

Se uso la evaluacion radiografica (20 kV, 8,00 mAs, 0,32 s/exp, Mamex DC® ami, Orion Ltd., Soredex) para evaluar la formacion de nuevo hueso y la resorcion del implante. La formacion de nuevo hueso y la resorcion del implante se evaluaron midiendo el area opalescente en mm2 (Osiris 4,19 Unidad Digital Imaging, Ginebra, software).

2.7 Examen histologico

Se prepararon dos muestras de cada grupo para histologfa. Las muestras se fijaron en formalina al 10% tamponada neutra, se descalcificaron en disolucion de EDTA-formalina (pH de 7), se procesaron en un procesador de tejidos, y finalmente se incrustaron en parafina. A continuacion, se prepararon cortes de 4.5 pm de grosor usando un microtomo y se tineron con hematoxilina-eosina. La calidad del nuevo hueso y la respuesta inflamatoria en el sitio del defecto se evaluaron por analisis histologico usando microscopfa visible (Nikon Eclipse, E200, Japon).

2.8 Analisis estadfstico

El analisis estadfstico se realizo usando el paquete estadfstico para Windows SPSS (SPSS Inc., version 15.0). Se uso el test de Kruskal-Wallis no parametrico para evaluar las diferencias estadfsticas entre los grupos. Se uso el test

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de Mann-Whitney para la comparacion por pares entre los grupos activo y de control. Los valores de p<0,05 fueron considerados estad^sticamente significativos. Los resultados de la evaluacion radiografica se dan como la media y las desviaciones estandar. Las diferencias entre los implantes activos y los controles se muestran como valores porcentuales.

3 Resultados

Para el Grupo a, la evaluacion radiografica de los discos de hidroxiapatito-fosfato de tricalcio-sulfato de calcio (HAP: TCP:CS 30:60:10) demostro alguna formacion de hueso fuera del implante activo; sin embargo, los implantes de control permanecieron intactos (Tabla 15, Fig. 23A). El area de medida era significativamente mayor para los implantes activos en comparacion con los controles (p<0,01). El analisis de la cosecha indico que esta nueva formacion era similar al hueso. La evaluacion histologica demostro que se produjo formacion de hueso endocondral en la muestra activa y no en la muestra de control (Fig. 23A, 23B).

Para el grupo b (TCP:CS 90:10), la evaluacion de la radiograffa muestra alguna formacion de hueso fuera de los implantes activos; sin embargo, los implantes de control estaban casi intactos, y no hubo diferencias esiadfsticamente significativas entre los implantes activos y los controles (Tabla 15). La inspeccion visual durante la cosecha tambien indico formaciones de hueso similares. La evaluacion histologica mostro la formacion de hueso endocondral en la muestra activa y no en la muestra de control.

Para el grupo c (el Cem-Ostetic), el analisis de la radiograffa no muestra ninguna formacion de nuevo hueso visual; sin embargo, la zona de medicion era mayor en el grupo activo que en el grupo de control (p<0,01) (Tabla 15). La cosecha y el analisis histologico confirmaron que no se encontro nuevo hueso en las muestras.

Para el grupo d (discos de sulfato de calcio hemihidrato), el analisis de la radiograffa revelo alguna nueva formacion de hueso, y las diferencias significativas (p<0,01) eran evidentes entre los grupos activos y de control (el grupo de control se habfa resorbido visiblemente) (Tabla 15, Fig. 24B). Sin embargo, la cosecha y el analisis histologico mostro que no se encontro nuevo hueso en las muestras (Fig. 23C, 22D).

Para el grupo e (HAP/TCP/CS 60:30:10), la evaluacion de la radiograffa mostro alguna formacion de hueso fuera del implante en el lado activo y alguna en los implantes de control (Tabla 15). Ademas, el grupo activo tema un area de medida mayor que el grupo de control (p=0,001). El analisis de la cosecha indico que esta nueva formacion era similar al hueso. La evaluacion histologica revelo la formacion de hueso endocondral y celulas del carfflago maduro en la muestra activa; sin embargo, no se encontro ninguna en la muestra de control.

Para el grupo f (sulfato de calcio dihidrato - acido estearico), el analisis radiografico y el analisis de la cosecha revelaron la formacion de nuevo hueso en el grupo del implante activo (Tabla 15, Fig. 24c.). La diferencia entre los implantes activos y los controles era estadfsticamente significativa (p<0,01). Ademas, el analisis histologico revelo la clara formacion de hueso y celulas de carfflago maduras y calcificadas en la muestra activa (Fig. 24F). No era evidente visualmente la formacion de hueso en la muestra de control (Fig. 23E y 23F).

La comparacion entre todos los grupos activos revelo que el Grupo f tema el area de medida mas grande, segun lo determinado por el analisis radiografico (p<0,05). Ademas, los grupos c y d teman areas significativamente mayores que los grupos a, by e (p<0,01). Tambien habfa una diferencia estadfsticamente significativa entre los grupos activos a y e (p<0,05).

4 Discusion

El objetivo principal de este estudio era encontrar un candidato a vetffculo inorganico apropiado para extracto de protema osea de reno. Seis candidatos diferentes, incluyendo cuatro materias primas diferentes, fueron elegidos para evaluar la formacion de hueso y la resorcion de implante en el modelo de bolsa de raton con una evaluacion de seguimiento de tres semanas. En particular, el acido estearico - sulfato de calcio era un candidato de soporte alentador para el extracto de protema osea de reno.

El extracto de protema osea de reno tiene alta actividad de formacion de hueso, como se ve en la bioactividad y los ensayos anteriores (Fig. 22.); sin embargo, en una situacion de curacion del hueso real, el extracto puede no funcionar sin un sistema estructural. Se establecen limitaciones de la seleccion del soporte por las caracteffsticas del extracto de protema osea de reno. La limitacion principal es que el extracto no es soluble en agua. De este modo, hay por lo menos tres posibilidades diferentes para la preparacion de implante. La primera es que la suspension de extracto oseo formulada se puede impregnar en una matriz porosa. El segundo metodo consiste en moldear el extracto y el soporte juntos para formar masilla o comprimirlos en forma de discos, y en el tercer metodo, los discos o granulos de soporte estan revestidos superficialmente con el extracto oseo. Se ha ensayado como soporte colageno puro en algunos de nuestros estudios anteriores. Se mezclo extracto liofilizado en agua y despues se pipeteo sobre la esponja de colageno; alternativamente, la esponja de colageno se empapo en agua y a continuacion, con el extracto, se envolvio para formar un implante. Los resultados de este metodo mostraron una buena formacion de hueso en el modelo de bolsa de raton y en el modelo de defecto segmentario; sin embargo, parece que el colageno no soporta la funcionalidad de las protemas de formacion de hueso en el tiempo requerido. Por lo tanto, una alternativa inorganica proporcionaffa un marco mejor para el soporte del efecto de curacion de

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hueso del extracto. Previamente, hemos probado combinaciones de TCP, HAP y coral junto con el extracto y la esponja de colageno en el modelo de raton. Ademas, se encontro que el biovidrio era un soporte alternativo aceptable segun se ensayo en el modelo de defecto de rata.

Este estudio se diseno para encontrar alternativas para la seleccion del soporte, considerando la absorcion de extracto oseo y las caractensticas de tamano de poro del soporte. Con excipientes, el extracto liofilizado fue absorbido en los poros del grupo TCP:CS 90:10, parcialmente revestido en superficie y parcialmente absorbido en el grupo HAP:TCP:Cs 30:60:10. Ademas, se uso el revestimiento de superficie en el grupo de HAP/TCP/CS 60:30:10. El extracto de protema osea de reno liofilizado se mezcla en el material de soporte de los grupos CSH y Cem-Ostetic y se mezclo en seco, sin resuspender el extracto liofilizado, para el grupo CSD-acido estearico. Debido a que la combinacion de la formulacion liofilizada y el soporte era diferente para cada grupo de estudio, la distribucion y disponibilidad del extracto tambien era diferente para cada grupo; Por lo tanto, las comparaciones estadfsticas entre los grupos de soporte no son validas. Se uso el metodo roentgenografico nativo para determinar la actividad de los implantes en este estudio; sin embargo, este metodo no puede mostrar la formacion de hueso en el interior de los restos del implante. El metodo de obtencion de imagenes por microtomograffa puede dar informacion mas detallada sobre el crecimiento oseo y la resorcion de soporte en estudios futuros. Sin embargo, la formacion de nuevo hueso se ve claramente en el analisis histologico completado para este estudio.

Todos los grupos con extracto funcionaron mejor que los grupos de control sin extracto oseo. La mayor cantidad de formacion de hueso se encontro en los grupos que teman el extracto oseo facilmente disponible, lo que indica que se requieren factores de formacion de hueso en concentraciones suficientes durante la etapa anterior. Esto se vio particularmente en los grupos HAP/TCP/CS 60:30:10 y CSD-acido estearico. En los grupos TCP/CS 90:10, masilla Cem-Ostetic y CSH, se observaron diferencias entre los implantes activos y los controles, y los implantes funcionaron como un implante con un revestimiento de mezcla de protema osea. La cantidad minima de formacion de hueso se encontro en el grupo HAP/TCP/CS 30:60:10, lo que indica que el extracto oseo se absorbio profundamente en la estructura durante la preparacion del implante, y la cantidad liberada de protemas oseas era demasiado baja para inducir la formacion de hueso. Estos resultados apoyan los de los estudios anteriores que mostraron que la formacion de nuevo hueso depende de un contenido ceramico con una alta relacion HAP/TCP y una alta dosis de protemas oseas. Ademas, este estudio confirma que la presencia de componentes bioactivos redujo la formacion de tejido fibroso e incremento la formacion de hueso que rodea las estructuras inorganicas. Sin embargo, la cantidad y disponibilidad de protemas oseas deben estar equilibradas con la curacion del hueso y la formacion en cascada.

Los productos de DBM son productos comparables para extracto de protema osea de reno. La cantidad comparable del producto de DBM disponible comercialmente se habfa ensayado tambien en el modelo de bolsa muscular, pero no se vio ningun signo de formacion de hueso roentgenograficamente o histologicamente en 21 dfas (datos no mostrados). Esto indica que las protemas en el extracto oseo de reno son mas espedficas para la induccion de nuevo hueso, y la capacidad de formacion de hueso de protemas oseas de reno extrafdas es mucho mejor en comparacion con la DBM.

Se sabe que la presencia de celulas oseas es esencial para la degradacion de material de sulfato de calcio. Idealmente, la formacion de hueso y la degradacion de la estructura van una detras de otra hasta que el area defectuosa ha sido substituida completamente por nuevo hueso. Si la formacion de hueso no es suficiente para suministrar resistencia mecanica, entonces el material estructural se debe degradar lentamente para evitar la exposicion de las caractensticas de soporte. Este estudio tambien revelo que el acido estearico habfa afectado positivamente a la mejora de crecimiento oseo interno y a la formacion en el medio del soporte de sulfato de calcio. El acido estearico se ha usado ampliamente como un excipiente en la fabricacion de comprimidos debido a que la adicion de acido estearico disminuye la viscosidad de la suspension ceramica incrementando la uniformidad microestructural del empaquetamiento de partmulas. El acido estearico tambien se usa como parte de moldes de yeso. Se pulveriza acido sobre la superficie del molde que se separa despues del moldeado. A continuacion, el acido estearico reacciona con el calcio en el yeso para formar una delgada capa de estearato de calcio, que funciona como un agente de liberacion. Wright Medical Technology Inc. ha usado acido estearico como una ayuda de comprimido en sus productos de sulfato de calcio como Osteoset® y registro una buena capacidad de curacion del hueso, como se encuentra en el trabajo previo de los autores. De este modo, la conclusion es que el estearato de calcio no solo tiene propiedades de ayuda al comprimido, sino que tambien apoya la formacion de hueso, de modo similar a la carboximetilcelulosa.

En conclusion, la mayor cantidad de formacion de hueso se produjo en los grupos que teman extracto oseo facilmente disponible cerca de la superficie del implante. La combinacion de TCP o CS y acido estearico pareda ser la alternativa de soporte mas ideal para el extracto oseo de reno. Tambien se sugirio que la formulacion de materiales de soporte en forma de granulos o en una forma inyectable incremental la eficacia de la formacion de hueso. Esta hipotesis se ensayara en estudios adicionales.

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Tabla 15. Analisis radiografico de implante activo que contiene el extracto oseo y el control despues de 21 dfas de seguimiento (area opalescente en mm2). Se muestra el porcentaje de incremento en comparacion con el control.

Grupo: n Activo, mm2 (SD) Control, mm2 (SD) % de incremento

a) HAP/TCP/CS 30:60:30: 8 34 (6,08)a 25 (3,14) 36

b)TCP:CS 90:10: 7 41 (12,22) 27 (1,41) 52

c) Cem-Ostetic: 7 76 (6,49)a,c 50 (6,04) 52

d) CS hemihidrato: 6 78 (13,47)a,c 44 (8,33) 77

e) HAP/TCP/CS 60:30:10: 8 46 (12,87)a,d 25 (2,77) 84

f) CS dihidrato + acido estearico: 7 97 (13,48)a,b 49 (13,88) 98

ap<0,01 vs. control, bp<0,05 vs. otros grupos activos, cp<0,01 vs. (a), (b) y (e), dp<0,01 vs. (a)

Evaluacion de sulfato de calcio y p-TCP como soportes para extracto de protema osea derivada de reno en ovejas

Implantacion y evaluacion por metodos anaffticos

Introduccion

Se formaron defectos oseos como resultado de trauma o relacionados con cirugfa de reconstruccion en los que se retiran partes de hueso debido a cambios destructivos de tejido. Los defectos oseos de tamano cntico son aquellos en los que el hueso solo no es capaz de regeneracion espontanea del hueco formado y necesita ayuda ffsica para recobrar el hueco entre las partes de hueso.

Los presentes inventores han desarrollado un extracto de protema osea para su uso en cirugfa osea. Este extracto oseo de reno induce efectivamente la formacion de nuevo hueso ectopico in vivo. El extracto de protema osea de reno se ha preparado a partir del hueso diafisario dando como resultado una mezcla de varias protemas oseas.

El extracto de protema osea necesita una matriz de soporte para guiar la formacion de hueso y para proteger las protemas oseas de la lisis no espedfica. La matriz ideal debe ser biocompatible, bioabsorbible, maleable, y esterilizable. La matriz de soporte se debe unir al hueso huesped sin la formacion de tejido de cicatrizacion, y reabsorberse a la misma velocidad que se regenera el hueso.

Estan disponibles diferentes metodos de implantacion y analisis. El primer producto estaba destinado para la fusion del tobillo. Se supuso que el modelo de defecto de agujero puede afinar lo suficiente para modelar la situacion real. El modelo de defecto de agujero de oveja se ha usado ampliamente pero no se podna definir un claro modelo de defecto de tamano cntico segun la bibliograffa. El tamano del modelo mas ffpico era un agujero de 9 mm x 6 mm, de este modo nosotros escogemos un tamano de 10 mm x 6 mm.

Segun la bibliograffa diferentes metodos de obtencion de imagenes e histologicos son los mas usados y los mas practicos para mostrar la curacion del hueso y las reacciones en un area de trauma oseo. El principal objetivo de este estudio era ensayar el sistema de funcionamiento del modelo de defecto de agujero de oveja y diferentes metodos de analisis.

Objetivos

Este estudio se diseno para la evaluacion del rendimiento in vivo de tres diferentes candidatos de soporte inorganico combinados con extracto de protema osea de reno en un modelo de defecto de agujero de femur de oveja. Otro objetivo de este estudio era proporcionar informacion metodologica para la planificacion de futuros estudios de rendimiento. Estos incluyen el ensayo de los problemas tecnicos del estudio de implantacion (tamano del defecto de tamano cntico comparado con el tamano del defecto que se encuentra en la bibliograffa, metodos de operacion con anestesia y analgesicos, observaciones clmicas, tolerancia local y recuperacion del implante, manejo del material de ensayo, tiempo de seguimiento, y metodos anaffticos) e informacion del procedimiento de curacion del hueso con tres candidatos de soporte diferentes.

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Materiales y metodos Diseno del estudio

El estudio ha sido aprobado por el Animal Care and Use Committee del Southern Finland Provincial Government, numero de aprobacion ESLH-2009-0568/Ym-23.

En este estudio se indujeron dos defectos de agujero con un diametro de 6 mm y una profundidad de 10 mm en los condilos mediales femorales de las patas traseras de oveja con un taladro con anestesia general. La localizacion de los defectos se marco con pequenos alambres K de titanio. Los agujeros taladrados del femur izquierdo y derecho se llenaron con material de soporte y el extracto de protema osea de reno, o con el material de soporte solo, o se dejaron vados (controles sin tratar). La formacion de nuevo hueso se determino con fluorocromo en vivo. Despues de un tiempo predeterminado los animales se sometieron a eutanasia y se cosecharon femures para investigaciones de laboratorio adicionales ex vivo. El tiempo de seguimiento era de tres (n=5) y ocho semanas (n=5).

Los artfculos de ensayo fueron (Tabla 16):

1. BSS001 F001: 30 mg/g de pelets de sulfato de calcio revestido en superficie

2. BBS001 F002: pelets de control de CS

3. BBS001 F003: granulos de beta fosfato de tricalcio (p-TCP, alta porosidad, baja densidad) y gel -> pasta de polietilenglicol/glicerol (PEG/GLY).

4. BBS001 F004: granulos de p-TCP (alta porosidad, baja densidad) con control de PEG-GLY

5. BBS001 F005: granulos de beta fosfato de tricalcio (p-TCP, baja porosidad, alta densidad), y gel -> pasta de polietilenglicol/glicerol (PEG/GLY).

6. BBS001 F006: granulos de p-TCP (baja porosidad, alta densidad) con control de PEG/GLY Tabla 16: Artmulos de ensayo

Codigo de grupo: Implante Abreviatura

BBS001 F001: Sulfato de calcio, activo CS activo

BBS001 F002: Sulfato de calcio, control CS control

BBS001 F003: TCP de baja densidad, activo TCPld activo

BBS001 F004: TCP de baja densidad, control TCPld control

BBS001 F005: TCP de alta densidad, activo TCPhd activo

BBS001 F006: TCP de alta densidad, control TCPhd control

Vado: Sin implante
Vado

La composicion objetivo del producto BBS001 F001 contema alrededor de 30 mg de extracto de protema seca para 1 g de producto, en el que el soporte estaba en la forma de pelets ligeramente conicos de 3 mm x 3 mm. El volumen del defecto de 6 mm x 10 mm era de 0,238 ml, y podna incluir 6 pelets dando como resultado 4 mg de extracto por defecto.

El pelet de sulfato de calcio se fabrico por moldeo de beta sulfato de calcio hemihidrato (Sigma-Aldrich, 97%, codigo 12090) e inclrna alrededor de 5% en peso de acido estearico (Meck PARTECK LUB STA (acido estearico de grado vegetal), PH EUR, lote K39557661). El extracto de protema humedo se revistio sobre los pelets con Tween 20 (Ph.Eur., codigo: 44112, Fluka, Sigma-Aldrich), CMC (Carmellos, Natr. Ph.Eur. Tamro) y PeG 400 (Macrogol 400, 0784710, Tamro). La composicion final contema 2,4% de extracto de protema seco, 1,12% de CMC, 0,19% de PEG400, 0,036% de Tween 20, 91,4% de sulfato de calcio y 4,8% de acido estearico.

Las composiciones objetivo de los productos BBS001 F003 y BBS001 F005 conteman en volumen la misma cantidad de extracto seco que en BBS001 F001.

La fase PEG/GLY en los productos de BBS001 F003 y BBS001 F005 contema 1,62% de extracto de protema liofilizado, 38,1% de PEG 2K (Clariant, Kemi Intressen, codigo: 107903) y 60,3% de Glicerina (Croda, Kemi Intressen, codigo: pricerina 9095). El p-TCP en BBS001 F003 y BBS001 F005 era del tamano de 300-500 pm (Cambioceramics, lote GR090819B, alta porosidad, baja densidad y Cambioceramics, lote GR090819A, baja porosidad, alta densidad).

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El extracto de protema humeda se liofilizo antes de mezclar con la mezcla de PEG/GLY. El extracto de protema liofilizada seca contema 0,35% de Tween 20 (Ph.Eur., codigo 44112, Fluka, Sigma-Aldrich), 0,79% de trehalosa dihidrato (para microbiolog^a, Fluka, Sigma-Aldrich, codigo 90210), 4,1% de glicina (puriss, Ph.Eur., codigo; 32226, Riedel-de Haen, Sigma-Aldrich) y 10,9% de manitol (Ph.Eur., codigo: 17311, Fluka, Sigma-Aldrich).

La composicion final del BBS001 F003 (alta porosidad, baja densidad) contema 1,14% de extracto liofilizado, 29,7% de TCP, 42,4% de glicerina y 26,8% de PEG 2K.

La composicion final del BBS001 F005 (baja porosidad, alta densidad) contema 1,00% de extracto liofilizado, 37,8% de TCP, 37,5% de glicerina y 23,7% de PEG 2K.

Sistema de ensayo

Especie, raza, origen, cualidad, numero de animales, edad

Se usaron corderas (oveja hembra) de la raza Soumeniammas (oveja finlandesa)

Los animales originarios de los rebanos de oveja reproductora finlandesa para la produccion de carne y lana. Las corderas eran todas reproductoras varias veces. Los animales se habfan adquirido para uso como animales de laboratorio.

Se usaron 11 animales en total en este estudio de investigacion. Su edad media era 7 anos y 7 meses.

Implante

La operacion se realizo con anestesia general por inhalacion, inducida por una inyeccion intravenosa de Propofol (57 mg/kg i.v., Propofol- ®Lipuro, B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany) y se mantuvo con isoflurano en una mezcla de oxfgeno-aire 1-1,5% (Isoba Vet, Schering-Plough A/S, Farum, Denmark). Antes de la anestesia las ovejas se premedicaron con Medetomidina-Ketamina (0.015 ml/kg i.m., Domitor® Vet (1 mg/ml), Orion Oyj, Espoo, Finland and Ketalar (50 mg/ml), Pfizer Oy, Helsinki, Finland) y se intubaron. Las ovejas se controlaron con un monitor cardfaco durante la operacion.

Se les dio preoperatoriamente un parche de fentanilo (2 pg/kg/hora, Fentanyl ratiopharm, Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany) para 72 h de alivio del dolor. Adicionalmente, se inyectaron 2 ml de fentanilo (50 pg/ml i.m., Fentanyl- Hameln, Hameln Pharmaceuticals GmbH, Hameln, Germany) dos veces al dfa intramuscularmente durante las primeras 72 horas despues de la operacion.

Se inyecto amoxicilina (15 mg/kg i.m., Betamox® Vet, 150 mg/ml, Norbrook Laboratories Ltd, Newry, Nord-Ireland) como profilaxis antibiotica, subcutaneamente 24 h preoperatoriamente y una vez al dfa dos dfas postoperatoriamente.

Los implantes se colocaron bilateralmente dentro del defecto de agujero circular. Por lo tanto, los animales se inmovilizaron sobre su espalda y se afeitaron ambas patas y se desinfectaron con etanol. Se hizo una incision longitudinal sobre la superficie medial del femur y se expuso el condilo mediante diseccion roma. Los pequenos vasos sangumeos abiertos se cerraron por diatermia. Se perforaron dos agujeros con un diametro de 6 mm y una profundidad de 10 mm (taladro inalambrico, Bosch PSR12-2). La distancia entre los defectos es por lo menos 1,5 cm. Primero se perforo un agujero piloto de 2 mm. Subsecuentemente, este defecto se amplio gradualmente usando brocas de tamano creciente (3,5 mm y 4,5 mm) hasta un diametro final de 6 mm (herramientas de calidad Magnum, HSSart 76035, 76045 y HSSart HSSart 76060). Los agujeros perforados se lavaron con disolucion salina para eliminar restos oseos y se tamponaron con gasas para detener el sangrado. Mientras tanto, la situacion de los defectos se marco, usando pequenos alambres K de titanio en la parte frontal de los agujeros de perforacion. Los agujeros se llenaron con artmulo de ensayo, o se dejaron vacms.

Finalmente, los tejidos subcutaneos se cerraron en capas con suturas Vicryl 2-0 resorbibles continuas, y la piel con suturas Mohosof 2-0. La piel alrededor del sitio del defecto se anestesio localmente con bupivacama clortndrica (5 mg/ml de Bicain, Orion Oyj, Espoo, Finland) y se desinfecto con povidona yodada.

Seguimiento

El tiempo de seguimiento fue de 3 semanas (n = 5 ovejas) o 8 semanas (n = 5 ovejas) despues de la cirugfa. Una oveja (P3) se sometio a eutanasia inmediatamente despues de la operacion debido a la extensa hemorragia.

Eutanasia y necropsia

Despues de periodos de tiempo predeterminados, los animales se transportaron al Laboratory Animal Centre, donde se sometieron a eutanasia. La eutanasia se realizo con pentobarbital (60 mg/kg iv Mebunat® Vet, Orion Oyj, Espoo, Finland). Antes de esto, las ovejas fueron anestesiadas por una inyeccion intramuscular de ketamina-medetomidina (0,015 ml/kg i.m., Domitor® Vet (1 mg/ml), Orion Oyj, Espoo, Finland y Ketalar (50 mg/ml), Pfizer Oy, Helsinki, Finland).

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Muestreo

Despues de la eutanasia los femures se extirparon y conservaron en hielo antes de la tomograffa computarizada (CT). A continuacion, los bloques de hueso que se van a tomar para analisis histologicos se conservaron en formalina tamponada al 10%. Antes de los analisis histologicos se obtuvo una imagen con micro-CT de una muestra de cada grupo.

Analisis de los datos

micro-CT

Una muestra de cada grupo de estudio y puntos de seguimiento se escanearon usando micro-CT (SkyScan, microtomograffa de rayos X, Universidad de Turku). Se analizaron dos muestras escaneadas analizados usando software CTAn (SkyScan).

Histologfa

Despues de la obtencion de imagenes de |jCT los huesos se fijan en disolucion de formaldetndo tamponado con fosfato (pH = 7,4), se deshidratan en concentraciones crecientes de etanol (70-100%) y se incrustan en metacrilato de metilo (MMA) para su procesamiento histologico.

Despues de la polimerizacion, se preparan secciones delgadas en una direccion transversal al eje del implante usando una tecnica de microtomo de corte modificado. Se cortaron secciones de cuatro micrometros, y una seccion se tino con tincion de Masson-Goldner Trichrome (MG) y una seccion con tincion de hematoxilina eosina (HE).

El lugar de implantacion se examinara para la evaluacion de la formacion de hueso, la resorcion del material de soporte y tolerancia local.

Histomorfometna

Se examinaron secciones de cada implante por microscopfa optica. Todas las secciones tenidas con HE se fotografiaron (imagen de super alta calidad) por estereomicroscopfa (Olympus SZX9, Europa, camara: U-CMAD3, Japon, Universidad de Oulu, Laboratory of Process Metallurgy) por aumento 6,3x. Una imagen de una sola seccion tintada se transfirio a la pantalla del ordenador y se escogio el sitio del defecto como region de interes (ROI). Se calculo el area de nuevo hueso en el sitio del defecto mediante software de procesamiento de imagenes y analisis (Fiji-win-32).

Metodos estadfsticos

Debido al pequeno numero de muestras (n = 3 en cada grupo), no se usaron metodos estadfsticos.

Resultados

Micro-CT

Se presenta un corte de muestra axial de la mitad de cada muestra (Fig. 25-30)

Cortes de TCP activo de baja densidad (3 semanas P2.3 y 8 semanas P7.3) se analizaron para mostrar como el resto de materiales de soporte se puede diferenciar de la formacion de nuevo hueso. El principal resultado de esto era que la matriz de nuevo hueso que incluye granulos era 25% en volumen despues de 3 semanas de seguimiento y 46% en volumen despues de un seguimiento de 8 semanas. El volumen de partfculas sin unirse al nuevo hueso u otras partfculas era 1,4% en volumen despues de 3 semanas y solo 0,10% en volumen despues de 8 semanas. Este metodo es apropiado para mostrar volumen de llenado y resorcion de material de soporte en el defecto.

Analisis histologico e histomorfometrico

Resumen de comentarios sobre el analisis histologico:

1. BBS001 F001: Pelets de sulfato de calcio (CS activo),

. 3 semanas de seguimiento (Fig. 33)

- Se puede encontrar restos de pelets

- Formacion de nuevo hueso en el lado defecto, no en el medio del defecto . 8 semanas de seguimiento (Fig. 34)

- Restos de pellets (partfculas muy pequenas)

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- Formacion de hueso alrededor de las partfculas

2. BBS001 F002: pelets de CS de control . 3 semanas de seguimiento (Fig. 35)

- Lote de matriz fibrotica en todo el area del defecto

- Se puede encontrar pequenos restos de pellets . 8 semanas de seguimiento (Fig. 36)

- Los pellets se han resorbido

- El Tejido fibrotico llenaba el defecto

- Se puede encontrar algo de formacion de hueso

3. BBS001 F003: pasta activa de p-TCPld . 3 semanas de seguimiento (Fig. 37)

- Se puede encontrar restos de granulos, pero no reaccion de resorcion

- Formacion de hueso tambien en la mitad del defecto, alrededor de granulos . 8 semanas de seguimiento (Fig. 38)

- Los osteoclastos resorben granulos

- Buena formacion de nuevo hueso en el area del defecto

- Union osea clara

4. BBS001 F004: Control de p-TCPld . 3 semanas de seguimiento (Fig. 39)

- Muchos restos de granulos

- Mucha matriz fibrotica en el area del cortex

- Algunos granulos alrededor del nuevo hueso . 8 semanas de seguimiento (Fig. 40)

- Muchos restos de granulos

- Granulos no tan resorbidos como en el caso activo

- Formacion de nuevo hueso alrededor de los granulos

5. BBS001 F005: pasta activa de p-TCPhd . 3 semanas de seguimiento (Fig. 41)

- Matriz fibrotica en la superficie del agujero del defecto

- Muchos restos de granulos, pero tambien buena formacion de nuevo hueso . 8 semanas de seguimiento (Fig. 42)

- se puede ver una clara resorcion de los granulos

- Formacion de nuevo hueso alrededor de los granulos en todo el sitio del defecto

- Union osea clara

6. BBS001 F006: Pasta de control p-TCPhd . 3 semanas de seguimiento (Fig. 43)

- Restos de granulos

- Mucha matriz fibrotica en el area del cortex

- Algunos granulos alrededor del nuevo hueso . 8 semanas de seguimiento (Fig. 44)

- Capa de tejido fibrotico muy gruesa

5 - Sin union osea

- Formacion de hueso solo alrededor de los granulos

- Algunos restos de los granulos pero solo en el borde del defecto

7. defecto vado

. 3 semanas de seguimiento (Fig. 45)

10 -Solo matriz fibrotica

. 8 semanas de seguimiento (Fig. 46)

- Mucho tejido fibrotico en el area del cortex

- Sin la formacion de hueso en la mitad del defecto

La resorcion de granulos era mas rapida en los grupos activos que en los grupos de control. Usamos dos tamanos 15 de porosidad diferentes de granulos de p-TOP. No se puede definir una clara diferencia entre los tamanos, aunque la resorcion mas rapida y mejor crecimiento oseo interno se observaron en el grupo de baja porosidad (grupo de TCPhd activo). La diferencia de resorcion entre los grupos de TCPld y TCPhd despues de 8 semanas de seguimiento se puede ver en las figuras 47 y 48.

Discusion

20 El objetivo principal de este estudio de investigacion era encontrar un soporte candidato inorganico apropiado para extracto de protema osea de reno y ensayar el funcionamiento y el metodo de analisis del modelo de defecto de agujero en ovejas. Se escogieron tres candidatos diferentes, incluyendo dos materias primas diferentes, para estudiar la formacion de hueso y la resorcion de implante en este estudio piloto con tres semanas y ocho semanas de seguimiento. Los metodos de operacion y observacion usados funcionaron bien y son utilizables en los estudios 25 futuros. La mejor formacion de hueso y curacion del defecto se observo en los grupos de pasta que inclrna p-TCP y extracto oseo de reno liofilizado junto con polietilenglicol y glicerol.

BBS Ltd ha enfocado su primer producto en la fusion de tobillo. Se supoma que el modelo de defecto de agujero puede afinar lo suficiente para modelar la situacion real. El tamano mas tfpico del modelo era un agujero de 9 mm x 6 mm de este modo hemos escogido un tamano de 10 mm x 6 mm. Este era suficientemente grande porque no se 30 vefa ninguna cicatrizacion osea en el defecto vacro despues de 8 semanas. Ahora se uso el femur pero si se piensa en el enfoque de este producto, un hueso metatarsiano de oveja es tambien un modelo de funcionamiento de hueso apropiado. Usamos alambres K para senalar el sitio del defecto. Esta era una idea buena y funcional. Especialmente, despues de 8 semanas en algunos casos no estaba claro encontrar el defecto sin usar la ayuda de los alambres K. Ademas, se usaron alambres K para ayudar en la formacion de imagenes de pQCT y en la 35 preparacion de cortes histologicos (para encontrar el punto medio del defecto).

Se investigaron en este estudio tres alternativas de formulacion diferentes con dos matrices diferentes. Ambos materiales inorganicos usados son biocompatibles y osteoconductivos.

Pelets de sulfato de calcio con acido estearico se moldearon y secaron y a continuacion se revistieron con extracto oseo de reno. Los pellets puros funcionaron como control. Una dosis inclrna seis pelets que eran faciles de 40 configurar para el defecto. Los pellets mostraron una clara formacion de hueso en Bioensayo (modelo de ratones). En este estudio de ovejas la resorcion de los pelets era tan rapida que solo se encontro en este grupo poca formacion de hueso. Sin embargo, se puede encontrar el comienzo de union osea despues de 8 semanas de seguimiento. Los pellets sin extracto no teman el efecto de la formacion de hueso. Se necesita optimizar la velocidad de resorcion de pelets antes del estudio final. Tal vez, el tamano de un pelet podna ser menor que el defecto 45 llenado, estana disponible mejor y mas area de protema revestida. Esto podna mejorar el crecimiento interno de hueso en el defecto.

Otras dos formulaciones ensayadas estaban en forma de pasta. Se anadieron granulos de beta fosfato de tricalcio (p-TCP) (dos tamanos de porosidad) y extracto oseo de reno liofilizado a pasta formada de polietilenglicol y glicerol. A continuacion, la pasta se dosifico en jeringas. Sobre todo, era facil inyectar la dosis de pasta dentro del defecto, 50 pero en algunos casos la pasta no se despegaba del piston de la jeringa y una parte minuscula de pasta salfa del

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defecto. Esta puede ser una razon por la que no se ha visto crecimiento interno de hueso en el cortex del hueso, solo en el mitad del defecto. La pasta no mostro clara formacion de hueso en Bioensayo (TONA002.003) pero en este estudio de ovejas se encontro resorcion de granulos y formacion de hueso, especialmente despues de 8 semanas de seguimiento. El p-TCP es un material que solo es osteoconductivo, de este modo encontramos formacion de nuevo hueso tambien en los grupos de control. Pero la formacion de hueso era alrededor de los granulos y no se vefa crecimiento interno de hueso. Ademas, la resorcion de los granulos era mas rapida en los grupos activos que en los grupos de control. Usamos dos tamanos de porosidad diferentes de granulos de p-TCP. No se puede definir una clara diferencia entre tamanos, aunque la resorcion mas rapida y el mejor crecimiento oseo se observaron en el grupo de baja porosidad (grupo de TCPhd activo). Se necesita optimizacion de la velocidad de resorcion de la pasta antes del estudio final. La pasta (PEG y GLY) con granulos se debe mantener en el defecto mas tiempo para que sea tambien posible el crecimiento interno de hueso en la parte del cortex del hueso.

En los estudios de investigacion de material inorganico los puntos de seguimiento ampliamente usados son de 3 a 12 semanas, dependiendo del material y modelo de defecto usados. En este estudio usamos seguimientos de tres semanas y ocho semanas. El primer punto de tiempo solo mostro el comienzo de la formacion y la resorcion de material. El area operada (herida, musculos) ya se habfa curado en tres semanas. El segundo punto de tiempo mostro una clara diferencia entre los grupos activo y de control, y ninguna formacion de hueso en defectos vados. Pero no se observo crecimiento oseo completo en los grupos activos despues de ocho semanas. Especialmente, los grupos de TCP implicados necesitan mas tiempo de seguimiento para que la resorcion de granulos se pudiese definir claramente. En el siguiente estudio el seguimiento podna ser de entre 8 a 16 semanas.

Los mejores y mas informativos resultados de la obtencion de imagenes se obtuvieron de |jCT. Esta da imagenes de mayor resolucion y de este modo informacion mas detallada de la formacion de nuevo hueso y la resorcion de soporte que la TC normal. En este estudio se analizaron solo dos muestras del ejemplo por |jCT pero es muy alentador usar el metodo como principal metodo de analisis en el futuro. Tambien es recomendable obtener algunas imagenes justo despues de la implantacion. De este modo, se tiene informacion, de como se ha conseguido su implantacion y de como los valores del analisis de obtencion de imagenes estan en el llamado punto nulo.

Despues de la obtencion de imagenes las muestras se enviaron a histologfa. Se usaron dos metodos de tincion. Especialmente, la tincion de Masson Goldner Trichrome mostro la formacion de nuevo hueso y la resorcion de soporte, porque esta tincion es espedfica para el hueso. Se midio el area de nuevo hueso en el sitio del defecto histomorfometricamente tomando fotograffas con microscopio estereoscopico. Pero solo un corte de cada grupo era tan bueno que la medida era aceptable. La mayona de los cortes se rompieron o hubo algunos otros problemas que hicieron imposible el analisis cuantitativo. Aunque fue posible ver en histologfa la formacion de hueso y la curacion de defectos, tenemos que tener mas en cuenta la calidad del corte en el futuro para que fuese posible que la medida cuantitativa mostrara diferencias entre los grupos.

Conclusion

El defecto de agujero de este tamano es un defecto de tamano cntico y por lo tanto es apropiado para la evaluacion de los efectos de curacion de hueso de los dispositivos medicos de investigacion. La operacion, anestesia y metodos de analisis usados son utilizables tambien en los futuros estudios de esta raza de ovejas. Tanto el sulfato de calcio como el fosfato de tricalcio son materiales de soporte apropiados, pero se necesita la optimizacion de la formulacion. Parece que una forma de formulacion que llena todo el defecto en el inicio de la cascada de curacion del hueso es la mejor alternativa. El efecto de curacion del hueso era realmente mejor y excelente en el defecto tratado con implantes activos en comparacion con los defectos de control.

Rendimiento de la formacion de hueso de formulaciones de extracto de proteina osea de reno, autoinjerto y matriz osea desmineralizada en modelo de defecto de agujero de oveja

1 Introduccion

El autoinjerto es el metodo tradicional de mejora de la reparacion osea, pero la cosecha de injertos oseos puede conducir a complicaciones, tales como sangrado, dolor e infeccion. Los autoinjertos tienen tambien limitada disponibilidad de este modo, como una alternativa, se usan muchos materiales inorganicos. Los fosfatos de calcio, tales como hidroxiapatito (HAP) y fosfatos de tricalcio (TCP) y sus variaciones son comunmente conocidos materiales de substitucion osea. Estos materiales proporcionan una estructura osteoconductiva para la formacion de nuevo hueso.

La bioactividad de materiales inorganicos se puede aumentar mediante la adicion de estfmulo osteogenico al extensor de injerto oseo. Los aloinjertos, matrices oseas desmineralizadas (DBM) y extractos oseos nativos se ha demostrado que aumentan la capacidad de curacion del hueso y mejoran la integracion en muchos estudios diferentes. Se ha mostrado que las combinaciones de factores de crecimiento derivados de hueso de bovino en colageno y soportes de DMB o HAP coralino son tan buenas como los autoinjertos de cresta ilfaca cuando se estudian como velocidades de fusion en artrodesis espinal en conejos y monos y seres humanos.

El extracto de hueso de reno es una mezcla de colageno y factor de crecimiento extrafda de la matriz extracelular del hueso diafisario cortical. Los extractos de proteina osea de reno son similares a los extractos de tejido oseo de

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origen animal en la composicion, modo de fabricacion, y el uso y la aplicacion deseada. Los productos comparables mas parecidos son Colloss® y Colloss® E, que son extractos oseos desmineralizados creados de productos oseos ovinos y equinos, y matriz (DBM) osea desmineralizada humana, tales como pelets de DBM osteoset®.

Para el estudio actual, se lanza la hipotesis de que los implantes de extracto oseo de reno tienen la capacidad de formacion de hueso equivalente o mejor que el autoinjerto oseo o matriz osea desmineralizada usando el modelo de defecto de agujero de oveja. Para ensayar la hipotesis, se comparo la capacidad de diferentes formulaciones de extractos oseos de reno para estimular la formacion y reparacion de hueso en el modelo de defecto de agujero de Nuss et al. 2008. Los resultados se compararon con los defectos no tratados, y los defectos llenos con ceramica de beta fosfato de tricalcio (p-TCP), matriz osea desmineralizada disponible comercialmente (Grafton® DBM), y autoinjerto.

2 Materiales y metodos

2.1 Extracto de protema osea

El extracto de protema osea se extrajo y se purifico del hueso diafisario de reno como se describe previamente (Jortikka et al. 1993). El extracto de protema osea obtenido se liofilizo a -20°C usando excipientes (tensioactivo (polisorbato 20, Fluka, Sigma-Aldrich), lioprotector (D-(+)-trehalosa dihidrato, Fluka, Sigma-Aldrich), agente de carga (Glicina, Riedel-de Haen, Sigma-Aldrich) y tampon (D-Manitol, Fluka, Sigma-Aldrich))

2.2 Los artmulos de ensayo y grupos de estudio

Los artmulos de ensayo y grupos de estudio se muestran en la tabla 17.

2.3 Preparacion de la muestra

Polietilenglicol 2000 (PEG), glicerol y acido estearico se calentaron hasta que se formo una mezcla transparente. La mezcla se enfrio con agitacion continua para formar una pasta opalescente, despues de lo cual se anadieron las cantidades requeridas del extracto oseo liofilizado y granulos de TCP. La pasta formulada se envaso en jeringas y se cerro en bolsas de lamina de aluminio. Todas las muestras se fabricaron en una cabina de flujo laminar para reducir la biocarga, y a continuacion se esterilizo con rayos gamma terminalmente (15 kGy).

En el grupo de autoinjerto el material oseo se retiro de los sitios de agujero de ensayo de la misma oveja usando cincel y taladro de trepanacion.

2.4 Animales

Se uso un total de 10 corderas sanas de la raza de oveja del archipielago finlandes. Los animales eran de tres anos de edad y sus pesos corporales eran de 52 a 59 kg.

Los sitios de implante fueron la parte esponjosa proxima de la diafisis y epffisis distal de humero y femur. Esto proporciono un total de 8 sitios de implante diferentes por animal. El protocolo de estudio se llevo a cabo segun las leyes finlandesas de bienestar animal y fue aprobado por el comite etico institucional de experimentos con animales. Todos los animales sobrevivieron durante las 8 semanas de seguimiento.

2.5 Procedimiento quirurgico

La operacion se realizo bajo anestesia general por inhalacion, inducida por una inyeccion intravenosa de propofol (57 mg/kg, i.v.,®Lipuro, B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany) y se mantuvo con isoflurano en una mezcla oxfgeno-aire 1-1,5% (Isoba Vet, Schering-Plough A/S, Farum, Denmark). Antes de la anestesia las ovejas se premedicaron con Medetomidina (0,015 ml/kg i.m., Domitor®Vet, Orion Oyj, Espoo, Finland) y se intubaron. Las ovejas se controlaron con un monitor cardfaco durante la operacion.

Se les dio antes de la operacion un parche de fentanilo (2 pg/kg/hora, Durogesic®, fentanilo ratiopharm, Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany) antes de la operacion durante 72 horas para el alivio del dolor. Adicionalmente, se inyecto intramuscularmente durante las primeras 72 horas despues de la operacion 2 ml de fentanilo (50 pg/ml i.m., Fentanyl-Hameln, Hameln Pharmaceuticals GmbH, Hameln, Germany). A continuacion se inyecto buprenorfina (0,3 mg/dosis i.m., Temgesic®, Schering-Plough Europe, Bruselas, Belgica) dos veces al dfa de forma continua durante dos dfas o mas despues de la operacion cuando se retiro el parche.

Se inyecto amoxicilina (15 mg/kg i.m., Betamox® Vet, 150 mg/ml, Norbrook Laboratories Ltd, Newry, Nord-lreland) como profilaxis antibiotica, por via intramuscular en la mitad anterior del cuello 24 h antes de la operacion y una vez por dfa durante dos dfas despues de la operacion.

Se indujeron defectos de agujero en los condilos distales y proximales del femur y humero de las patas trasera y delantera de la oveja con un taladro como se describe por Nuss et al. (2006). Se taladro un agujero con un diametro de 6 mm y una profundidad de 10 mm (taladro inalambrico, Bosch PSR12-2). El taladro se lavo con disolucion salina para eliminar restos de hueso y se tampono con gasas durante varios minutos para detener el sangrado. Mientras

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tanto, la localizacion del defecto se marco usando postes dentales de endodoncia de fibra de vidrio radiopacos de 1,0 mm (Snowpost refill, Plandent Oy, Helsinki, Finland). Los postes se cortaron a la longitud apropiada con un disco de diamante. Los agujeros perforados se llenaron segun la tabla de asignacion al azar con los materiales de ensayo o se dejaron vacms (controles no tratados). Finalmente, los tejidos subcutaneos se cerraron en capas con suturas resorbibles continuas Polysorb 3-0 y piel con suturas no resorbibles Monosof 2-0.

Despues del penodo de tiempo predeterminado de 8 semanas, los animales se sometieron a eutanasia y se tomaron muestras de hueso para su analisis. Las eutanasias se realizaron con pentobarbital (60 mg/kg i.v. Mebunat® Vet, Orion Oyj, Espoo, Finland). Antes de esto, las ovejas se anestesiaron por via intramuscular con medetomidina (0,015 ml/kg de Vet Domitor®, Orion Oyj, Espoo, Finland y 0,04 ml/kg de Ketalar®, Pfizer Oy, Helsinki, Finland).

Despues de la eutanasia los huesos se extirparon y conservaron en hielo. A continuacion, los bloques de hueso se conservaron en formalina al 4% tamponada los primeros siete dfas y a continuacion en etanol al 70%. Algunas muestras se rompieron en la fase de extirpacion y se han eliminado del analisis.

2.6 Evaluacion de micro-CT de la formacion de hueso

Las muestras se escanearon usando microtomograffa computarizada (|-iCT) (SkyScan, microtomografo de rayos X, Universidad de Turku). Las muestras escaneadas se analizaron usando software CTAn (SkyScan). Ademas, se llevo a cabo el analisis de radiograffa de imagenes de micro-CT para mostrar la formacion de nuevo hueso y la resorcion de la estructura.

2.7 Analisis estadfstico

El analisis estadfstico se realizo usando el programa SPSS para Windows. Se uso el ensayo de Kruskall-Wallis no parametrico para evaluar las diferencias estadfsticas entre los grupos. El ensayo U de Mann-Whitney se uso para las comparaciones por pares entre los grupos de tratamiento de extracto de protema osea, grupo de autoinjerto y los grupos de control. Los valores de p<0,05 se consideraron estadfsticamente significativos.

3 Resultados

Para los grupos de pasta 1 y pasta 2 (el extracto de protema osea y Cambioceramics TCP en matriz de PEG-GLY con acido estearico) las evaluaciones de micro-CT mostraron una buena formacion de hueso en el area del defecto con ambas cantidades de extracto de protema osea aunque habfa areas corticales sin nuevo hueso o restos de granulos de TCP. Casi todos los granulos de TCP se habfan resorbido durante el seguimiento. En el grupo de control, la pasta 3 (Cambioceramics en matriz de PEG-GLY con acido estearico, sin el extracto de protema osea), las evaluaciones de micro-CT mostraron que los granulos de TCP aun no se habfan resorbido y se habfan empaquetado en forma de una masa gruesa en el fondo del defecto. Sin embargo, habfa formacion de nuevo hueso en esta masa de granulos alrededor de los granulos. Para el otro grupo de control, granulo (TCP Cambioceramics puro), las evaluaciones de micro-CT mostraron que los granulos implantados habfan llenado todo el area del defecto. Los granulos no se habfan absorbido durante el seguimiento, pero se habfa visto alguna formacion de nuevo hueso alrededor de los granulos.

Para los grupos de pasta 4 (el extracto de protema osea y TCP Cerasorb® M en matriz de PEG-GLY con acido estearico) las evaluaciones de micro-CT mostraron la formacion de hueso en el area del defecto aunque habfa areas corticales sin nuevo hueso o restos de granulos de TCP. Casi todos los granulos de TCP se habfan resorbido durante el seguimiento. Para el grupo de control, la pasta 6 (TCP Cerasorb® M en matriz de PEG-GLY con acido estearico, sin el extracto de protema osea), las evaluaciones de micro-CT mostraron que la mayona de granulos de TCP aun no se habfan resorbido y se habfan empaquetado en forma de una masa espesa en el fondo del defecto. La formacion clara de nuevo hueso era difmil de ver.

Para la pasta del grupo 5 (el extracto de protema osea y TCP Cerasorb® en la matriz de PEG-GLY con acido estearico) las evaluaciones de micro-CT mostraron una clara y muy buena formacion de nuevo hueso en el area del defecto. Casi todos los granulos de TCP se habfan absorbido durante el seguimiento. Aun habfa el mismo problema que en los otros grupos que inclman matriz de PEG-GLY y acido estearico que el implante (granulos) no habfa llenado todo el defecto y habfa algunas zonas vacfas, especialmente en el sitio cortical.

Para el grupo de autoinjerto las evaluaciones de radiograffa mostraron la clara formacion de hueso y remodelacion del hueso en el area del defecto. No se vefan areas vacfas en los sitios corticales, excepto un par de defectos.

Para el grupo de matriz osea desmineralizada grafton (DBM Grafton Plus®) y en el grupo de evaluaciones de micro- CT no tratado las evaluaciones no mostraron formacion de nuevo hueso en los sitios de defecto durante el seguimiento.

El valor del volumen oseo se midio a partir de micro-CTs por analisis de imagenes (Fig. 21). El volumen oseo mas alto se observo en los grupos de la pasta 5 y el autoinjerto, mientras que el volumen oseo mas bajo estaba en los grupos de la matriz osea desmineralizada y de defectos vacms. En las comparaciones estadfsticas todos los demas grupos fueron significativamente mejores que el grupo de la matriz osea desmineralizada (DBM Grafton Plus®)

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(p<0,02). Todos los grupos de implante de protema osea, el grupo de autoinjerto y tambien otros grupos de control excepto el grupo de DBM se hadan curado significativamente mejor que los defectos no tratados (p<0,02). El grupo de autoinjerto era significativamente mejor en volumen oseo que el grupo de pasta 4 (p<0,02) y casi significativamente mejor que el grupo de pasta de 6 (p<0,06). El grupo de pasta 5 era casi significativamente mejor en volumen oseo en comparacion con el grupo de pasta 4 (p = 0,064).

4 Discusion

Los objetivos de este estudio eran comparar tres desarrollos de formulaciones de extracto de protema de reno con autoinjerto, y rellenos oseos comercialmente disponibles (partmulas de matriz osea desmineralizada y fosfato de tricalcio) por su capacidad para formar nuevo hueso usando un modelo de defecto de agujero de hueso esponjoso de oveja. Ademas, el proposito era proporcionar informacion sobre el efecto potencial de la concentracion de protemas en la formulacion sobre la capacidad de curacion del hueso y para proporcionar informacion preliminar sobre la biocompatibilidad de las formulaciones. Se encontro que el planeado y probado dispositivo medico que incluye el extracto de protema osea de reno y la formulacion de p-TCP en forma pasta inyectable es una alternativa apropiada para el tratamiento oseo de autoinjerto usado hoy en dfa.

El extracto de protema osea de reno tiene actividad de formacion de hueso elevada, como se ve en la bioactividad y los ensayos anteriores; sin embargo, en una situacion real de curacion de hueso, el extracto puede no funcionar sin un sistema estructural. Las limitaciones de la seleccion del soporte estan establecidas por las caractensticas del extracto de protema osea de reno. La limitacion principal es que el extracto no es soluble en agua. De este modo, hay por lo menos tres posibilidades diferentes para la preparacion de implante. La primera es que la suspension de extracto oseo formulada se puede impregnar en una matriz porosa. El segundo metodo consiste en moldear el extracto y el soporte juntos para formar masilla o comprimirlos en forma de discos, y en el tercer metodo, los discos de soporte o granulos estan revestidos en superficie con el extracto oseo. El colageno puro ha sido probado como un soporte en estudios previos. El extracto liofilizado se mezclo en agua y despues se pipeteo sobre la esponja de colageno; Alternativamente, la esponja de colageno se empapo en agua y a continuacion, con el extracto, se enrollo para formar un implante. Los resultados de este metodo mostraron una buena formacion de hueso en el modelo de bolsa de raton y en el modelo de defecto segmentario; sin embargo, parece que el colageno no soporta la funcionalidad de las protemas de formacion de hueso en el tiempo requerido. Por lo tanto, una alternativa inorganica proporcionana un mejor marco para el soporte del efecto curativo del hueso del extracto. Previamente, hemos ensayado combinaciones de TCP, HAP y coral junto con el extracto y la esponja de colageno en el modelo de raton. Ademas, se encontro que el biovidrio era un soporte alternativo aceptable segun lo ensayado en el modelo de defecto de rata.

Varias alternativas de sal de calcio tambien se ensayaron en un modelo de raton. Este estudio mostro que un sistema estructural inorganico es un soporte muy apropiado para el extracto de protema osea de reno. Los resultados del presente estudio apoyaron estudios previos de que la formacion de nuevo hueso depende del contenido ceramico con una alta proporcion de HAP/TCP y alta dosis de protemas oseas. Ademas, este estudio confirma que la presencia de componentes bioactivos redujo la formacion de tejido fibroso y el aumento de la formacion de hueso alrededor de estructuras inorganicas. Sin embargo, la cantidad y disponibilidad de protemas oseas debe estar en equilibrio con la cascada de formacion y curacion del hueso. En nuestro estudio piloto preliminar en ovejas (datos no mostrados) encontramos que los granulos de p-TCP pueden ser mejor material estructural que el sulfato de calcio porque el TCP tiene menor velocidad de resorcion. Sin embargo, sin extracto oseo la resorcion de TCP es tambien demasiado lenta. Por otra parte, nuestro estudio de modelo de raton mostro que el acido estearico puede anadir capacidad de formacion de hueso del extracto de protema osea de reno con estructura de calcio.

Segun esta informacion previa preparamos implantes que incluyen el extracto de protema osea de reno formulado junto con granulos de p-TCP disponibles comercialmente en matriz de PEG-GLY con acido estearico. La forma de dosificacion era una pasta inyectable que era posible cuando se uso matriz de PEG-GLY. El PEG se usa ampliamente como precipitado en la fabricacion de medicinas y, por ejemplo, se usa en varias pastas de dientes como dispersante porque tiene una baja toxicidad, se une al agua y ayuda a mantener la goma uniforme en toda la pasta de dientes. Tambien el glicerol (GLY) se usa ampliamente en formulaciones farmaceuticas para mejorar la suavidad y proporcionar lubricacion. El implante era facil de hacer y no se necesitaba ninguna mezcla adicional de producto en la mesa de operaciones. Sin embargo, el analisis mostro que la cantidad usada de granulos no era suficiente para cubrir toda el area del defecto despues de que se disolvio la matriz, lo que provoco que el sitio cortical del defecto estuviera usualmente vado y sin nuevo hueso o resto de granulos. Esto se comparo con el grupo de TCP puro en el que la cantidad de granulos era el doble y toda el area del defecto estaba llena de los granulos tambien despues del seguimiento. De este modo, el efecto de curacion del hueso no se puede comparar solo por la diferencia en la formacion de hueso entre los grupos de estudio, y se necesita la optimizacion de la matriz de PEG- GLY junto con el acido estearico y granulos. Idealmente, la formacion de hueso y la degradacion de la estructura se suceden hasta que el area del defecto ha sido remplazada completamente por nuevo hueso. Con tal de que la formacion de hueso no sea lo suficientemente extensa para suministrar resistencia mecanica, el material estructural se debe degradar tan lentamente que no se exponga la caractenstica del soporte. El analisis de las radiograffas mostro que la resorcion de los granulos era mas rapida en el grupo que incluye el extracto de protema osea, pero se vio tambien una buena formacion de nuevo hueso y estaba en marcha la remodelacion osea. En el grupo que inclrna

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solo granulos o granulos con matriz de PEG-GLY y acido estearico no se observo la resorcion de granulos. Se vio formacion de hueso pero usualmente solo alrededor de los granulos. En nuestro estudio piloto preliminar (datos no mostrados) esta formacion de hueso era como una capa de fosfato apatito alrededor de los granulos y no se vio una union osea real entre granulos. Esto confirma los resultados de que el extracto de protema osea aumento la bioactividad de materiales inorganicos. La obtencion de imagenes de histolog^a y microscop^a electronica de barrido (SEM) pudo confirmar nuestra conclusion del resultado de micro-CT. El mas alto volumen oseo y formacion de hueso se observo en el grupo que inclrna una forma mas pequena y esferica de granulo de TCP. Se ha encontrado que la forma, figura y micro- y nano-estructuras de la estructura afectan tanto a las propiedades de resorcion osea como de formacion de estructuras. Posiblemente, la forma de granulo mejoraba la fijacion de protemas oseas, factores de crecimiento y moleculas de senalizacion a la superficie de los granulos y la estructura funcionaba lo mas optimamente en este grupo.

La DBM Grafton Plus® ha sido autorizada por la Food and Drug Administration (FDA) de Estados Unidos (510k) como substituto de injerto oseo, extensor de injerto oseo y relleno de huecos de huesos en huecos oseos o espacios del sistema esqueletico. Los productos DBM Grafton han sido ampliamente usados y se han publicado buenos resultados de curacion en varios modelos animales, especialmente con ratas y conejos. Tambien tiene buenos resultados clmicos como tratamiento de problemas de la columna vertebral. De este modo, era sorprendente que la matriz osea desmineralizada no funcionara en el presente estudio. Hay algunos estudios en la bibliograffa en los que se encontraron diferencias de curacion osea entre diferentes productos de DBM comercialmente disponibles. Ademas, la DBM tiene mucho menor efecto de formacion de hueso en comparacion con el producto recombinante. En este estudio se uso el modelo de oveja. Podna ser que la oveja como modelo no sea apropiada para Grafton u otros productos de DBM humana en comparacion con otro producto de DBM como Collos que ha dado resultados de curacion superiores en modelos de oveja y perro.

En este estudio un objetivo era comparar implante ceramico, que contiene el extracto de protema osea de reno, con autoinjerto. Los resultados mostraron que el autoinjerto no era mejor en la formacion de hueso o la curacion de defectos que el extracto de protema osea en estructura de TCP. Este era un resultado alentador al encontrar un metodo substitutivo para el tratamiento de autoinjerto que tiene limitaciones debido a que la cosecha de los injertos oseos puede llevar a complicaciones, tales como sangrado, dolor e infeccion. Los resultados previos con materiales de DBM apoyan nuestros resultados.

En conclusion, los granulos de p-TCP en la matriz de PEG-GLY con acido estearico es un sistema estructural viable para el extracto de protema osea de reno pero aun se debe optimizar la cantidad proporcional de granulos en la matriz. El planeado y ensayado dispositivo medico que incluye el extracto de protema osea de reno y la formulacion de p-TCP en forma inyectable es la alternativa apropiada para el tratamiento de autoinjerto usado hoy en dfa.

Tabla 17. Los artmulos de ensayo y grupos de estudio

Grupo: N Extracto de protema osea Estructura

Pasta 1: 8 60 mg de extracto de protema osea de reno (BBS-Bioactive Bone Substitutes Ltd, Oulu, Finland) / jeringa de 3 cm3 p-TCP cambioceramics a medida (Cambioceramics, Cam Bioceramics, Leiden, The Netherlands), granulos esfericos de 300-500 pm de 1,24 g/cm3 de densidad combinados con matriz de polietilenglicol/glicerol (PEG/GLY) (Clariant, Kemi Intressen, y Croda, Kemi Intressen) con acido estearico (Acido estearico 50, mezcla de acidos grasos, que consiste principalmente en acido estearico y 40-60% de acido palmrtico, Fluka, Sigma-Aldrich)

Pasta 2: 8 30 mg de extracto de protema osea de reno/ jeringa de 3 cm3 p-TCP Cambioceramics, 300-500 pm de 1,24 g/cm3 de densidad combinado con matriz de PEG/GLY modificada con acido estearico.

Pasta 3: 8 p-TCP Cambioceramics, 300-500 pm de 1,24 g/cm3 de densidad combinado con matriz de PEG/GLY modificada con acido estearico.

Pasta 4: 7 60 mg de extracto de protema osea de reno/ jeringa de 3 cm3 p-TCP Cerasorb M de Curasan (Cerasob® M Ortho, Curasan AG, Frankfurt, Germany), trozos de 500-1000 pm de 0,61 g/cm3 de densidad combinado con matriz de PEG/GLY modificada con acido estearico.

Pasta 5: 8 60 mg de extracto de protema osea de reno/ jeringa de 3 cm3 p-TCP Cerasorb de Curasan (Cerasob®, Curasan AG, Frankfurt, Germany), granulos de 500-1000 pm de 1,211,24 g/cm3 de densidad combinado con matriz de PEG/GLY modificada con acido estearico.

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Pasta 6: 8 p-TCP Cerasorb M de Curasan, trozos de 500-1000 pm de 0,61-0,64 g/cm3 de densidad combinado con matriz de PEG/GLY modificada con acido estearico.

Granulo: 7 p-TCP Cambioceramics, 300-500 pm de 1,24 g/cm3 de densidad. La cantidad de granulos era el doble comparado con la cantidad de granulos en los grupos de pasta.

Autoinjerto: 8 - -

Grafton: 7 DBM (pasta de matriz osea desmineralizada Grafton Plus®, 1 cm3, Osteotech Inc., Eatontown, New Jersey, USA)

Defecto vacfo: 8

Formulaciones segun continua de la etapa de dialisis con citrato:

Se prepara un liofilizado liofilizando el precipitado obtenido de la etapa de dialisis con citrato usando lioprotectores apropiados:

Se prepara una disolucion de excipientes en exceso que contiene tensioactivo (Polysorbat 20), lioprotector (Trehalosa), agente espesante (Glicina) y tampon (Manitol) en agua WFI. La disolucion se esteriliza en autoclave. El contenido seco de protema de la etapa de dialisis con citrato se analiza pesando y se anade una cantidad apropiada de la disolucion de excipientes esterilizada. La mezcla se mezcla con un mezclador apropiado hasta que se forma una suspension homogenea. La suspension homogenea protema-excipientes se dispensa en bandejas para liofilizacion o viales de dosis unitaria y se liofiliza subsecuentemente. El extracto de protema liofilizada contiene entonces 0,35% en peso de Polysorbat, 0,97% de trehalosa, 4,1% de glicina, 10,9% de manitol y 83,7% de extracto de protema.

La disolucion de excipientes se ensayo y selecciono usando un enfoque de Diseno de Experimented (DoE) con los siguientes niveles de factor:

Tensioactivo: Polysorbat 20 o Polysorbat 80 (0,01-1,06%)

Lioprotector: trehalosa o sacarosa (0,2-2,3%)

Agente espesante: glicina o CMC (1,0-10%)

Tampon: manitol o histidina (3,2-23%)

Se han ensayado por lo menos cinco diferentes formulaciones con la composicion de liofilizado seleccionada.

La Formulacion 1 comprende el liofilizado anteriormente mencionado liofilizado en viales de dosis unitaria. El liofilizado se reconstituye con disolucion salina despues de lo cual se puede inyectar a traves de una aguja.

La Formulacion 2 comprende el liofilizado anteriormente mencionado liofilizado en viales de dosis unitaria. El liofilizado se reconstituye con disolucion salina despues de lo cual se puede impregnar en varias estructuras. Los ejemplos de estructuras apropiadas son discos de tCp o TCP/HAP porosos o composites polimericos porosos.

La Formulacion 3 comprende el liofilizado anteriormente mencionado liofilizado en viales de dosis unitaria. El liofilizado se mezcla con sal de calcio (sulfato de calcio, fosfato de calcio) para formar una pasta/masilla moldeable. La pasta/masilla se puede dar forma a mano o moldear en forma de discos o pelets apropiados.

Material para dosis de 60 mg.

1. Vial [1] - 60 mg de liofilizado

2. Vial [2] - 1 g de disolucion salina

3. Vial [3] - sulfato de calcio hemihidrato

4. Vial [4] - bol de mezcla

5. Disco moldeado

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6. Espatula

Instrucciones para uso:

1. abrir el vial [1] de 60 mg de formulacion liofilizada y anadir 1 g de disolucion [2] salina. Mezclar hasta que se forma una suspension homogenea.

2. Dispensar los 2 g de vial [1] de CS hemihidrato en el bol [4] de mezcla y anadir la suspension del vial [2]

3. Mezclar durante 60 segundos usando la espatula [6]

4. Se puede formar una pasta en 5 minutos, y se endurece en 5-10 minutos.

5. Llena el molde [5] de disco con la pasta y deja endurecer

6. Las estructuras estan listas para implantar cuando se retiran del molde despues de 60 min

La Formulacion 4 comprende el liofilizado anteriormente mencionado liofilizado en bandejas (lyoguards). El liofilizado se mezcla con sulfato de calcio y acido estearico y se comprime en forma de pelets apropiados.

Fabricacion de pelets de sulfato de calcio-acido estearico

Los pelets de CS/acido estearico se fabrican en la habitacion limpia

Primero se mezcla un exceso de sulfato de calcio hemihidrato con agua WFI y se extruye de modo que se forme una tira de sulfato de calcio dihidrato (yeso). Despues de 60 minutos cuando se endurece, la(s) tira(s) se corta(n) en forma de pelets, y a continuacion se granula en forma de pequenos granulos el dfa siguiente.

Una cantidad en exceso de acido estearico se criba a traves de un tamiz de 1 mm para retirar las partfculas mas grandes.

El contenido de un vial liofilizado se mezcla con 1,5 g de sulfato de calcio y 0,5 g de acido estearico en un pequeno bol.

Se forman pelets de 5 mm de diametro pesando 100 mg de la mezcla de polvo en la prensa de hacer comprimidos, y a continuacion se prensa durante 10-15 segundos. Los pelets se introducen en un vial de vidrio y se etiquetan.

La formulacion 5 comprende una pasta inyectable que contiene el liofilizado anteriormente mencionado, y suministrado en un sistema de jeringa apropiado. La pasta se compone de polietilenglicol (PEG 2000), glicerol y acido estearico, junto con granulos esfericos de fosfato de tricalcio (TCP).

Se prepara una pasta pesando 37% de PEG 2000, 59% de glicerina y 3,5% de acido estearico en un mezclador de pasta. La mezcla se calienta por encima del punto de fusion del PEG y acido estearico (60-70°C). La mezcla se deja enfriar lentamente durante la mezcla continua hasta que se ha formado una pasta a temperatura ambiente. La cantidad apropiada del anteriormente mencionado liofilizado y granulos de TCP se anaden y mezclan hasta que es homogeneo. La pasta se introduce en las jeringas y se envasa en lamina de aluminio. El producto final contiene 1,27% de extracto de protema, 0,01% de Tween, 0,01% de trehalosa, 0,06% de glicina, 0,16% de manitol, 28,9% de TCP, 41,2% de glicerol, 26,0% de PEG 2000 y 2,43% de acido estearico.

La formulacion 6 comprende pelets o granulos de superficie revestida. El extracto de tejido animal se mezcla con agentes formadores de pelfcula y a continuacion se reviste por pulverizacion sobre los pelets.

Formacion de pelets de yeso

Material (por molde):

10 g de sulfato de calcio hemihidrato (beta): Sigma-Aldrich 0,5 g (5%) de acido estearico: Merck, Parteck 5 ml de agua WFI. Fresenius Kabi (One-Med)

Preparacion (6 moldes)

Se mezcla sulfato de calcio (61 g) y acido estearico (3,0 g) como sigue: se presiona materia prima a traves de un tamiz de 1 mm por turnos en pequenas cantidades para mezclarlo por capas. Despues de esto se mezclan con una cuchara hasta una mezcla homogenea.

Se anade sulfato de calcio-acido estearico (10,5 g) a agua WFI (5 ml) y se mezcla hasta que se obtiene una mezcla uniforme (alrededor de 30 segundos). La mezcla se moldea en un molde de silicona y se deja endurecer bajo una membrana de plastico. La mezcla es moldeable durante alrededor de 5 minutos y los pelets moldeados se pueden

retirar del molde despues de alrededor de 60 minutes.

El polvo y los restos mas grandes de moldeo formados durante el procedimiento de moldeo se retiran cribando. El endurecimiento final ocurre durante 24 horas (bajo una lamina protectora).

Los pelets secos se envasan en bolsas Minigrip en forma de parche (2 x 67 g) y se almacenan en una habitacion fna 5 al secar el material.

Revestimiento de pelets de yeso

Los materiales usados en el revestimiento se listan en las Tablas 18-20 Tabla 18: Composicion

Material: Por dosis (2 g)

Extracto de protema: 60 mg

Tween 20: 0,44 mg

CMC: 13,2 mg

PEG 400: 2,20 mg

Pelet de yeso: 1921 mg

10 Tabla 19: Disolucion de revestimiento (contenido seco de la suspension pulverizada: 3%)

Material: Cantidad

CMC: 1,63 g

PEG 400: 0,27 g

TWEEN 20: 0,5 g

Agua WFI: 100 g

TWEEN-20/agua: 10 g

Agua WFI: 290 g

Tabla 20: Disolucion de revestimiento y la cantidad de pelets por lote:

Material: Cantidad Proveedor/calidad

Pelet de yeso: 67 g BBS Oy

Extracto de protema: 7 g BBS OY, YHD 200809

Disolucion de revestimiento: 146 g BBS OY

Se pesan 7 g de extracto de protema para el recipiente de mezcla y se anaden 146 g de disolucion de excipiente. La 15 mezcla se mezcla hasta que es visualmente homogenea. La suspension se mantiene homogenea con agitador magnetico todo el tiempo durante el revestimiento.

Se carga un granulador de lecho fluidizado con 67 g de pelets de sulfato de calcio (3x3 mm). Los pelets se fluidizan primero durante 30 segundos para retirar el polvo de yeso extra. El revestimiento comienza arrancando la bomba de alimentacion de la disolucion de revestimiento. Durante el revestimiento se monitoriza la alimentacion de la 20 disolucion de revestimiento, la posicion de la cabeza del inyector, la flotacion de los pelets y su adhesion a las paredes de la camara.

La adhesion de los pelets a las paredes de la camara se previene pulsando la alimentacion para dejar secar los pelets (por ejemplo, en ciclos de 15 segundos)

El revestimiento se detiene cuando toda la disolucion de revestimiento se ha pulverizado y la humedad extra se ha 25 evaporado de la superficie de los pelets, es decir, la humedad y la temperatura del aire saliente se han vuelto estables. No se recomienda demasiada fluidizacion porque los pelets comenzaran a triturarse y se puede erosionar la protema de la superficie.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

REIVINDICACIONES

1. Una preparacion de protema osea obtenida por un metodo que comprende:

a) desmineralizar un hueso y extraer la matriz osea con el disolvente hidrocloruro de guanidina para obtener un extracto de protema osea,

b) filtrar el extracto con un microfiltro con un tamano de corte en el intervalo de 0,1-10 pm (valor micrometrico nominal) suficiente para retirar grandes partmulas y material no protemico pero permitir que pasen las protemas,

c) filtrar la fraccion no retenida con un ultrafiltro de cartucho que tiene un tamano de corte de alrededor de 5-10 kDa para recuperar la preparacion de protema osea,

en la que la preparacion de protema osea obtenida se incorpora en una matriz de polietilenglicol/glicerol (PEG-GLY).
2. La preparacion de protema osea de la reivindicacion 1, caracterizada por el hecho de que el tamano de corte de la etapa b) es de alrededor de 0,1-0,22 pm o de alrededor de 1000 kDa.
3. La preparacion de protema osea de la reivindicacion 1 o 2, caracterizada por el hecho de que la preparacion de protema osea se dializa para concentrarla y purificarla adicionalmente, tal como dializada con agua o con disolucion de citrato.
4. La preparacion de protema osea de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por el hecho de que el hueso es hueso de mairnfero, tal como hueso de reno.
5. La preparacion de protema osea de la reivindicacion 4, caracterizada por el hecho de que el hueso es hueso de asta o hueso largo.
6. Una preparacion de protema osea que contiene protema Gla de la matriz, SPP-24 (fosfoprotema secretada), BMP-2, BMP-7 y TGF-beta 1 en cantidades sustanciales suficientes para proporcionar un efecto fisiologico, caracterizada por el hecho de que se incorpora en una matriz de polietilenglicol/glicerol (PEG-GLY).
7. La preparacion de protema osea de la reivindicacion 6, caracterizada por el hecho de que contiene por lo menos uno de los siguientes: biglicano, trombina, lamina A/C, vimentina, condroadherina, protema de matriz extracelular 22 K, lisil oxidasa, osteonectina, colageno o dermatopontina en cantidades sustanciales para proporcionar un efecto fisiologico.
8. La preparacion de protema osea de la reivindicacion 6 o 7, caracterizada por el hecho de que es la preparacion de protema osea de cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
9. La preparacion de protema osea de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por el hecho de que la preparacion de protema osea esta en una forma de un liofilizado.
10. Un granulo, pelet, disco, o bloque que comprende una preparacion de protema osea de cualquiera de las reivindicaciones 1-8.
11. El granulo, pelet, disco o bloque de la reivindicacion 10, caracterizado por el hecho de que la preparacion de protema osea es un revestimiento sobre dicho pelet, disco, bloque o granulo.
12. El granulo de la reivindicacion 10 u 11, caracterizado por el hecho de que el granulo es un granulo de p- fosfato de tricalcio (TCP).
13. El granulo de la reivindicacion 10, caracterizado por el hecho de que el granulo es un granulo de sulfato de calcio (CS).
14. El granulo de la reivindicacion 10, caracterizado por el hecho de que el granulo es un granulo de hidroxiapatito (HAP).
15. El granulo de la reivindicacion 10, caracterizado por el hecho de que el granulo es un granulo de HAP/TCP/CS, preferentemente en una relacion de alrededor de 60:30:10 (en peso).
16. El granulo de cualquiera de las reivindicaciones 10-15, caracterizado por el hecho de que el granulo contiene acido estearico.
17. El granulo de la reivindicacion 10, caracterizado por el hecho de que la preparacion de protema osea de reno esta en una matriz de polietilenglicol/glicerol (PEG/GLY) que contiene acido estearico comprendido en granulos de p-fosfato de tricalcio (TCP).
18. Una pasta o una masilla que comprende la preparacion de protema osea de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o el granulo de cualquiera de las reivindicaciones 10-17.
19. Un dispositivo osteogenico, tal como implante oseo, que contiene la preparacion de protema osea de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o el granulo de cualquiera de las reivindicaciones 10-17.
20. La preparacion de protema osea de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o el granulo de cualquiera de las reivindicaciones 10-17 para uso como medicamento.

5 21. La preparacion de protema osea de la reivindicacion 20 para uso como medicamento para tratar trastornos

relacionados con defectos oseos o de cartflago en la que se desea su regeneracion, reparacion o crecimiento.