PL224458B1 - Test diagnostyczny do detekcji białka Efb(145-162) - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest test diagnostyczny do detekcji białka Efb(145-162) znajdujący zastosowanie w wykrywaniu białka Efb wydzielanego przez bakterie Staphylococcus aureus. Test diagnostyczny do detekcji białka Efb(145-162) zawiera jako czynnik detekcyjny przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec epitopu białka Efb(145-162) izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci koniugatu fragmentu epitopowego białka Efb(145-162) o sekwencji CKVKKMVLQERIDNVLKQG z białkiem nośnikowym - hemocyjnaniną.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest test diagnostyczny do detekcji fragmentu białka Efb(145-162) znajdujący zastosowanie w wykrywaniu białka Efb wydzielanego przez bakterie Staphylococcus aureus.

Białko Efb jest jednym z wielu zewnątrzkomórkowych czynników wirulencji wydzielanych przez bakterie Staphylococcus aureus, które zwiększają szanse patogenu na kolonizację tkanek gospodarza, jak i zaburzają prawidłowe funkcjonowanie jego mechanizmów obronnościowych. Jednym ze sposobów ucieczki komórek S.aureus przed rozpoznaniem przez układ immunologiczny gospodarza jest blokowanie aktywności systemu dopełniacza - bakteryjne białko Efb wiążąc się proteiną C3b hamuje efektywną lizę komórek bakterii na drodze aktywacji komplementu. Ponadto wykazuje zdolność dwubiegunowego wiązania - z jednej strony wiąże się z ludzkim fibrynogenem, a drugiej ze strukturami obecnymi na powierzchni komórki bakteryjnej, co ułatwia adhezję bakterii i w konsekwencji sk uteczną kolonizację tkanek [Lee L.Y.L., Liang X., Hook, Brown E.L, Journal of Biological Chemistry, 2004, 279, 50710; Haviland D.L., Wetsel R.A., Encyclopedia of Molecular Biology, Wiley, 1999; Lambris J.D., Immunol Taday, 1988, 9, 387]. Podstawowe metody diagnozowania infekcji bakteryjnych, w tym infekcji gronkowcem złocistym, wykorzystują klasyczne techniki mikrobiologiczne, jak hodowla pobranego materiału na podłożach różnicujących, barwienie komórek czy analiza mikroskopowa. Niestety, wymienione metody charakteryzują się wieloma ograniczeniami jak długi czas wykonania analizy, niejednoznaczne wyniki w przypadku osób po antybiotykoterapii [Colque-Navarro P, Soderquist B, Holmberg H, Blomqvist L, Olcen P, Mollby R. J. Med. Microbiol, 47, 1998, 217-25] czy konieczność dysponowania specjalistycznym zapleczem laboratoryjnym. Dodatkowo, klasyczne metody diagnostyki wymagają pobranie materiału do analizy, co w przypadku infekcji organów wewnętrznych (np. ro pnie narządów wewnętrznych) jest praktycznie niemożliwe. Metody serologiczne opierają się na poszukiwaniu specyficznych dla bakterii Staphylococcus aureus białek markerowych, które wydzielane są przez bakterie do płynów ustrojowych. Z uwagi na fakt, iż białko Efb jest wydzielane wyłącznie przez bakterie Staphylococcus aureus, stanowi ono istotny element, którego detekcja oraz analiza ilościowa w surowicy pacjenta pozwala na diagnozę infekcji bakteryjnej gronkowcem złocistym.

Epitop białka Efb obejmujący reszty 145-162 (zgodnie z numeracją sekwencji gi: 21282769 zdeponowanej w bazie GenBank) został wybrany ze względu na swoją potencjalnie wysoką immunogenność, α-helikalną strukturę drugorzędową oraz dostępność dla wiązania się z receptorami limfocytów B, którego sekwencja przedstawia się CKVKKMVLQERIDNVLKQG.

Przeciwciała klasy IgY obecne są w organizmach płazów, gadów, ptaków oraz ryb prapłaźcokształtnych. Uznaje się, że są one ewolucyjnym przodkiem ssaczych przeciwciał klas IgG oraz IgE. Z uwagi na funkcje efektorowe, przeciwciała IgY odpowiadają przeciwciałom IgG ssaków, natomiast strukturalnie zbliżone są do przeciwciał klasy IgE. Przeciwciała IgY obecne są we krwi ptaków, jednakże ich duże ilości transportowane są do żółtka jaja, gdzie zapewniają ochronę piskląt przez pat ogenami. Obecność dużych ilości przeciwciał IgY w żółtku jaj stanowi ogromną zaletę, gdyż po immunizacji określonym antygenem powstające specyficzne wobec niego przeciwciała mogą być wyizolow ane w nieinwazyjny sposób, bez konieczności skrwawiania zwierząt. Ponadto przeciwciała IgY pozb awione są zdolności wiązania z ludzkim czynnikiem reumatoidalnym, aktywacji systemu dopełniacza czy interakcji z przeciwciałami HAMA, co, w przeciwieństwie do ssaczych przeciwciał, ogranicza liczbę fałszywie pozytywnych wyników w serologicznych testach diagnostycznych.

Test diagnostyczny na bazie immunoglobulin Y specyficznych wobec epitopu białka Efb(145-162) umożliwiające detekcję antygenu specyficznego dla bakterii Staphylococcus aureus nie został dotychczas opisany w literaturze oraz nie jest dostępny handlowo. W literaturze naukowej opisane zostało wykorzystanie ssaczych przeciwciał IgG specyficznych wobec białka Efb, najczęściej w postaci ant ysurowicy, pochodzących z organizmów takich jak mysz, królik czy owca. [Shannon O, Uekotter A, Flock JI., Stand J Immunol., 2006, 63, 184; Scarpa M, Piccinini R, Brun P, Grillo A, Palu G, Mengoli C, Dapra V, Castagliuolo I, Zecconi A., J Dairy Res., 2010, 77, 159; Palma M, Wade D, Flock M, Flock JI., J Biol Chem., 1998, 273, 13177].

Istotą wynalazku jest test diagnostyczny do detekcji białka Efb(145-162) który zawiera jako czynnik detekcyjny przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec epitopu białka Efb(145-162) izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci koniugatu fragmentu epitopowego białka Efb(145-162) o sekwencji CKVKKMVLQERIDNVLKQG z białkiem nośnikowym - hemocyjnaniną.

PL 224 458 B1

Korzystnie przeciwciała mają masę cząsteczkową od 175000 do 200000 daltonów.

Po etapie izolacji, przeciwciała poddaje się analizie biochemicznej, której celem jest określenie czystości przeciwciał, stężenia, awidności, mianowanie przeciwciał oraz określenie limitu detekcji epitopu białka Efb(145-162). W trakcie procesu immunizacji analizę biochemiczną przeciwciał przeprowadzono dla każdego zebranego jaja w trakcie 20 tygodni. Odpowiedź organizmu kurcząt w postaci produkcji specyficznych przeciwciał pojawiła się około 4-5 tygodnia od momentu pierwszej immunizacji.

Sposób otrzymywania przeciwciał cechuje duża ilości izolowanych przeciwciał oraz niska inwazyjność, ponieważ nie wymaga skrwawiania zwierząt w określonych odstępach czasu w celu izolacji przeciwciał.

Test diagnostyczny według wynalazku znajduje zastosowanie w diagnostyce infekcji wywołanych przez bakterie Staphylococcus aureus, które prowadzić mogą do poważnych stanów chorobowych, do których zaliczyć można zakażenia skóry i tkanek podskórnych (np. zakażenia ran pooperacyjnych), zakażenia układowe (np. zapalenie tchawicy, mięśnia sercowego, żył) jak również zakażenia wywołane przez toksyny produkowane przez S. aureus np. zespół wstrząsu toksycznego. Zastosowanie przeciwciał specyficznych wobec epitopu białka Efb(145-162) w teście diagnostycznym polega na ich zdolności do specyficznego wiązania z antygenem, którym może być pełne białko Efb lub epitop białka Efb(145-162). Dzięki związaniu przeciwciał IgY do antygenu możliwa jest pośrednia detekcja białka Efb przy użyciu handlowo dostępnych drugorzędowych przeciwciał anty-IgY (np. królicze przeciwciała IgG anty-IgY) zawierających dowolny znacznik (peroksydaza chrzanowa, fosfataza alkaliczna, biotyna, fluoresceina).

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładach oraz na rysunku na którym na:

Fig. 1 przedstawiono analizę elektroforetyczną (SDS-PAGE, 4-12%) w warunkach nieredukujących otrzymanych przeciwciał IgY specyficznych wobec epitopu białka Efb(145-162). Barwienie wykonano przy użyciu barwnika Coomassie R 250.

Fig. 2 przedstawiono wykres przedstawiający odpowiedź w postaci produkcji specyficznych wobec epitopu III białka Efb(145-162) przeciwciał IgY. Strzałkami oznaczono czas immunizacji. Abs* - przedstawione wartości absorbancji po odjęciu wartości absorbancji otrzymanych dla kontrolnych przeciwciał IgY.

Fig. 3 przedstawiono detekcję epitopu białka Efb(145-162) przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY (western blotting).

Fig. 4 przedstawiono wykres mianowania przeciwciał IgY do detekcji epitopu białka Efb(145-162).

Fig. 5 przedstawiono zdolność detekcji epitopu białka Efb(145-162) przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY.

Fig. 6 przedstawiono miano przeciwciał IgY specyficznych wobec epitopu białka Efb(145-162).

Fig. 7 przedstawiono zdolność krzyżowej detekcji białka Efb przez otrzymane przeciwciała IgY specyficzne wobec epitopu białka Efb(145-162).

Fig. 8 przedstawiono detekcję białka Efb przez przeciwciała specyficzne wobec epitopu białka Efb(145-162).

P r z y k ł a d 1

1.1 Synteza peptydu.

Peptyd o sekwencji CKVKKMVLQERIDNVLKQG otrzymano wykorzystując technikę syntezy na podłożu stałym z użyciem żywicy H-_L-Gly-2-Cl-Trt (0,75 mmol/g). Etapy sprzęgania kolejnych aminokwasów prowadzono z wykorzystaniem strategii Fmoc/Boc z użyciem HBTU jako czynnika sprzęgającego w obecności DIPEA. Do usunięcia grupy ochronnej Fmoc stosowano 20% roztwór piperydyny w DMF. W celu odłączenia peptydu od żywicy zastosowano mieszaninę TFA/TIPS/EDT/fenol w stosunku 92,5:2,5:2,5:2,5 (v/v). Produkt oczyszczono z wykorzystaniem techniki HPLC, a masę cząsteczkową potwierdzono przy pomocy wysokorozdzielczej spektrometrii mas.

1.2 Synteza koniugatu Efb(145-162)-KLH

Do roztworu białka KLH w 10 mM buforze fosforanowym (PB, pH 7,0) dodano roztwór GMBS w DMSO. Reakcję prowadzono 2 h w temperaturze pokojowej a następnie zaktywowane białko KLH-MB oczyszczono z wykorzystaniem chromatografii żelowej. Frakcje zawierające białko połączono i rozcieńczono acetonitrylem, aż jego końcowe stężenie wyniosło 25%. Do roztworu KLH-MB dodano roztwór peptydu w 50% acetonitrylu w wodzie delikatnie mieszając. Wartość pH mieszaniny utrzymywano w granicach 7,2-7,4 przy pomocy 1M wodnego roztworu NaOH. Postęp reakcji monitorowano przy użyciu chromatografii HPLC.

PL 224 458 B1

1.3 Synteza koniugatu Efb(145-162)-BSA

Do roztworu albuminy wołowej (BSA) w buforze PB dodano roztwór GMBS w DMSO. Reakcję prowadzono 30 min w temperaturze pokojowej po czym zaktywowane białko BSA-MB oczyszczono z wykorzystaniem chromatografii żelowej. Frakcje zawierające białko połączono a następnie rozcieńczono acetonitrylem, aż jego końcowe stężenie wyniosło 25%. Do roztworu BSA-MB dodano powoli roztwór peptydu w 50% acetonitrylu w wodzie delikatnie mieszając. Wartość pH mieszaniny utrzym ywano w granicach 7,0-7,4 przy pomocy 1M wodnego roztworu NaOH. Postęp reakcji monitorowano przy użyciu chromatografii HPLC.

P r z y k ł a d 2.

2.1 Przygotowanie antygenu do immunizacji

Koniugat Efb(145-162)-KLH (o sekwencji przedstawionej wzorem 1) rozpuszcza się tuż przed wykonaniem iniekcji w mieszaninie sterylnego roztworu soli fizjologicznej i pełnego Adiuwantu Freund'a (przy pierwszej immunizacji) oraz niepełnego adiuwantu Freund'a (przy dawkach prz ypominających) w stosunku 1:1 (v/).

2.2 Immunizacja kurcząt

Kury hodowlane rasy White Leghorn immunizuje się poprzez podanie domięśniowe antygenu w ilości 100 pg/zwierzę (300 pl). Immunizację powtarza się po 4 i 8 tygodniach stosując antygen w dawce 50 pg/zwierzę. Grupę kontrolną stanowią kury otrzymujące iniekcję roztworu pełnego adiuwantu Freund'a w soli fizjologicznej w stosunku 1:1 (v/).

2.3 Pobieranie i przechowywanie materiału biologicznego

Jaja kolekcjonuje się codziennie od następnego dnia po immunizacji przez 20 tygodni. Jaja przechowywane są w temperaturze 4°C do momentu izolacji przeciwciał.

2.4 Izolacja przeciwciał IgY

Jaja przemywa się 50% roztworem izopropanolu. Rozdziela się żółtko od białka, a następnie usuwa się błonę białkową otaczającą worek żółtkowy. Płynną zawartość żółtka rozcieńcza się czterokrotnie buforem fosforanowym (PBS, 10 mM, pH 7,4) z 4,75% dodatkiem glikolu polietylenowego 6000 (PEG 6000). Po dokładnym wymieszaniu, całość wiruje się przez 15 min przy 11 000 rpm w 4°C. Otrzymany supernatant filtruje się przez sączek bibułowy, a następnie do przesączu dodaje się PEG 6000 do końcowego stężenia wynoszącego 12%. Po dokładnym wymieszaniu wytrącony osad odwirowuje się przy 11 000 rmp przez 15 min w 4°C. Supernatant odrzuca się, pozostały osad rozpuszcza się w 10 ml buforu fosforanowego (pH 7,4). Do mieszaniny dodaje się glikol polietylenowy do końc owego stężenia 12%. Po dokładnym wymieszaniu, całość wiruje się przy 11 000 rpm przez 15 min w 4°C. Supernatant odrzuca się, a osad zawierający przeciwciała klasy IgY rozpuszcza się w 5 ml buforu fosforanowego. Po wykonaniu analiz biochemicznych przeciwciała przechowuje się w temperaturze -20°C.

2.5 Analiza czystości i stężenia przeciwciał

Stężenie otrzymanych białek oznacza się spektrofotometrycznie (A₂₈₀). Czystość otrzymanych przeciwciał sprawdza się poprzez wykonanie analizy elektroforetycznej SDS-PAGE (4-12%) w warunkach nieredukujących (Fig. 1). Czystość otrzymanych przeciwciał zawiera się w zakresie 85-95%.

P r z y k ł a d 3. Analiza odpowiedzi immunologicznej na podany antygen oraz awidność przeciwciał anty-Efb(145-162) w czasie procesu immunizacji (ELISA).

W celu wykonania analizy odpowiedzi immunologicznej immunizowanych zwierząt na podany antygen zastosowano test ELISA. W tym celu 96-cio dołkowe płytki mikrotitracyjne pokryto koniugatem Efb(145-162)-BSA (50 ng peptydu na 100 pl) rozpuszczonym w buforze węglanowym (50mM, pH 9,6) i inkubowano przez 12 godzin w temperaturze 4°C. Wolne miejsca zablokowano przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym (pH 7,4) zawierającym 0,05% Tween-20 (PBST, v/v) w temperaturze 37°C (60 min). Po odmyciu czynnika blokującego na płytkę mikrotitracyjną naniesiono przeciwciała specyficzne lub kontrolne, w rozcieńczeniu 1:1 00 przygotowane w 0,5% roztworze odtłuszczonego mleka w PBS-T i inkubowano przez 60 min w temperaturze 37°C. W celu oznaczenia awidności przeciwciał część próbek inkubowano z 6M roztworem mocznika w PBS-T. Detekcję kompleksów Efb(145-162)-IgY prowadzono z wykorzystaniem króliczych przeciwciał detekcyjnych anty-IgY sprzężonych z peroksydazą chrzanową. Jako chromogenicznego substratu użyto O-fenylenodiaminy. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (Fig. 2).

P r z y k ł a d 4. Analiza specyficzności przeciwciał IgY anty-Efb(145-162) w eksperymencie w czasie immunizacji (western blotting).

PL 224 458 B1

W celu potwierdzenia specyficzności otrzymanych przeciwciał IgY wobec Efb(145-162) wykonano analizę western blotting. Po rozdziale elektroforetycznym koniugatu Efb(145-162)-BSA (50 ng peptydu na studzienkę) w warunkach redukujących (SDS-PAGE, 4%-12%) przeprowadzono elektrotransfer na membranę nitrocelulozową. Blokowanie wolnych miejsc wiążących na membranie nitrocelulozowej wykonano przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w PBS-T (12 h, 4°C). Membranę inkubowano z roztworem przeciwciał specyficznych wobec Efb(145-162) lub roztworem przeciwciał kontrolnych, rozcieńczonych w stosunku 1:100 (0,5% roztwór mleka odtłuszczonego w PBS-T, 1 h, 37°C). Detekcję związanych z antygenem przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY sprzężonego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (Fig. 3).

P r z y k ł a d 5. Miano przeciwciał - test ELISA.

Miano przeciwciał specyficznych wobec epitopu białka Efb(145-162) określono przy użyciu testu ELISA, Płytkę mikrotitracyjną opłaszczono koniugatem Efb(145-162)-BSA w ilości 100 ng peptydu na studzienkę. Po inkubacji z antygenem (12h, 4°C) i zablokowaniu wolnych miejsc (5% odtłuszczone mleko w buforze PBST) przygotowano serię rozcieńczeń specyficznych oraz kontrolnych przeciwciał IgY w zakresie od 1:100 do 1:100000 i inkubowano z opłaszczoną antygenem płytką. Detekcję kompleksów koniugatów z przeciwciałami IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego antyIgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylenodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (Fig. 4).

P r z y k ł a d 6. Określenie limitu detekcji epitopu białka Efb(145-162) - western blotting.

W celu określenia limitu detekcji fragmentu białka Efb(145-162) w technice western blotting w pierwszym etapie wykonano rozdział elektroforetyczny (SDS PAGE, 4%-12%) koniugatu Efb(145-162)-BSA w warunkach redukujących w zakresie od 200 ng do 62,5 pg peptydu na studzienkę. Następnie wykonano transfer białek na membranę nitrocelulozową. Po zablokowaniu wolnych miejsc wiążących przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w PBST membranę inkubowano z roztworem specyficznego przeciwciała IgY w rozcieńczeniu 1:100 (0,5% odtłuszczone mleko w PBST). Detekcję kompleksów Efb(145-162)-IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu.

Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (Fig. 5).

P r z y k ł a d 7. Miano przeciwciał specyficznych wobec epitopu białka Efb(145-162).

W celu określenia zakresu rozcieńczeń otrzymanych przeciwciał klasy IgY niezbędnych do detekcji epitopu białka Efb(145-162) wykonano analizę western blotting (50 ng peptydu Efb(145-162) na studzienkę). Po transferze białek na membranę nitrocelulozową i blokowaniu wolnych miejsc paski membrany inkubowano z roztworami specyficznych przeciwciał IgY w zakresie rozcieńczeń od 1:100 do 1:25000 (0,5% mleko odtłuszczone w PBS-T). Detekcję związanych z antygenem specyficznych przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (Fig. 6).

P r z y k ł a d 8. Zdolność przeciwciał IgY specyficznych wobec epitopu białka Efb(145-162) do detekcji pełnego białka Efb.

Zdolność przeciwciał specyficznych wobec epitopu białka Efb(145-162) do rozpoznawania pełnego białka Efb potwierdzono testem western blotting. W tym celu przeprowadzono rozdział elektroforetyczny (SDS-PAGE, 4%-12%) białka Efb w warunkach redukujących (200 ng/studzienkę) a następnie elektrotransfer na membranę nitrocelulozową. Po zablokowaniu wolnych miejsc membranę inkubowano z roztworem przeciwciał IgY specyficznych wobec epitopu białka Efb(145-162) lub przeciwciał IgY specyficznych wobec natywnego białka Efb lub przeciwciał kontrolnych, w rozcieńczeniu 1:100 (0,5% mleko odtłuszczone w PBS-T). Detekcję kompleksów białka Efb z przeciwciałami IgY prowadzono z wykorzystaniem przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (Fig. 7).

P r z y k ł a d 9. Detekcja natywnego białka Efb przez przeciwciał IgY specyficzne wobec epit opu Efb(145-162) - test ELISA.

PL 224 458 B1

W celu określenia zdolności detekcji natywnego białka Efb przez otrzymane przeciwciała IgY specyficzne wobec epitopu Efb(145-162) płytkę mikrotitracyjną opłaszczono natywnym białkiem Efb w ilości 100 ng na studzienkę. Następnie inkubowano z roztworem przeciwciał specyficznych wobec epitopu Efb(145-162) lub przeciwciał kontrolnych, w rozcieńczeniu 1:100 (0,5% mleko odtłuszczone w buforze PBS-T). Detekcję kompleksów Efb-IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylenodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek (Fig. 8).

P r z y k ł a d 10. Test diagnostyczny do wykrywania białka Efb w teście ELISA. Surowicę pacjenta rozcieńcza się 100-krotnie buforem PBS i nanosi na płytkę mikrotitracyjną w dwóch powtórzeniach. Równocześnie przygotowuje się roztwór białka Elb(145-162)-BSA w zakresie stężeń peptydu od 1 pg/ml do 0,03125 pg/ml i nanosi na płytkę w dwóch powtórzeniach. Płytkę inkubuje się następnie w temperaturze 37°C przez 1 h po czym płucze, blokuje wolne miejsca wiążące przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze PBS-T. Po 2 godzinnej inkubacji w 37°C płytkę płucze się i inkubuje z roztworem specyficznych przeciwciał IgY otrzymanych po immunizacji koniugatem Efb(145-162)-KLH. Płytkę inkubuje się w 37°C przez 1 h, płucze a następnie inkubuje z dowolnym przeciwciałem specyficznym wobec IgY zawierającym dowolny enzym znacznikowy (peroksydazą chrzanowa, fosfataza alkaliczna) lub znacznik fluorescencyjny (fluoresceina). Po 1 h inkubacji w temperaturze 37°C płytkę płucze się i dodaje dowolny substrat enzymatyczny lub, w przypadku zastos owania znacznika fluorescencyjnego, analizę wykonuje się spektrofluorymetrycznie. Wynik uzyskany dla badanej próbki porównuje się z wynikami krzywej standardowej i na tej podstawie potwierdza się obecność białka Efb oraz określa jego ilość.

P r z y k ł a d 11. Test diagnostyczny do wykrywania białka Efb w teście western blotting.

Próbkę badanej surowicy rozcieńcza się 100-krotnie, a następnie poddaje się rozdziałowi elektroforentycznemu (SDS PAGE) w warunkach redukujących. Równolegle rozdziałowi poddaje się białko Efb (50 ng/studzienkę) oraz białko Efb(145-162)-BSA (50 ng peptydu/studzienkę). Po wykonaniu elektroforezy białka przenosi się na membranę nitrocelulozową, blokuje wolne miejsca wiążące 5% roztworem mleka odtłuszczonego w buforze PBS-T (2 h, 37°C) a następnie membranę płucze się buforem PBS-T. Wypłukaną membranę inkubuje się następnie z roztworem przeciwciał IgY otrzymanych po immunizacji koniugatem Efb(145-162)-KLH (1 h, 37°C). Detekcję kompleksów białka Efb lub jego fragmentu z przeciwciałami IgY prowadza się z wykorzystaniem dowolnych przeciwciał zawierających dowolny enzym znacznikowy (peroksydaza chrzanowa, fosfataza alkaliczna) lub znacznik fluorescencyjny (fluoresceina) przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego lub chromogennego substratu, lub światła o odpowiedniej długości fali wzbudzenia dla znaczników fluorescencyjn ych. Na podstawie uzyskanych wyników określa się, czy analizowana próbka zawiera białko Efb lub fragmenty jego degradacji.

Claims (2)

1. Test diagnostyczny do detekcji białka Efb(145-162), znamienny tym, że zawiera jako czynnik detekcyjny przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec epitopu białka Efb(145-162) izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci koniugatu fragmentu epitopowego białka Efb(145-162) o sekwencji CKVKKMVLQERIDNVLKQG z białkiem nośnikowym - hemocyjnaniną.

2. Test według zastrz. 1, znamienny tym, że przeciwciała mają masę cząsteczkową od 175000 do 200000 daltonów.