BRPI0822760B1 - Immunogens for the control of bovine carraps - Google Patents

Description

“IMUNÓGENOS PARA O CONTROLE DO CARRAPATO BOVINO” CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção está relacionada ao campo de biotecnologia de vacinas, ou seja, ao desenvolvimento de peptídeos vacinais (mimetopos) para o controle do carrapato bovino. A vacina apresenta aplicação potencial em função de as proteínas de carrapatos serem reconhecidas pelo soro de camundongos inoculados com os fagos que expressam peptídeos de fusão e também, em função de as teleóginas apresentarem uma coloração escurecida sugerindo lesões hemorragias em ensaios de desafio. Considerando a grande necessidade de novos métodos de controle do B. microplus, uma vacina potencial pode ser desenvolvida a partir da utilização de peptídeos isolados, em conjunto ou em associação com os antígenos existentes para um controle eficaz de carrapatos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Extensivos estudos relacionados ao desenvolvimento de um método de controle do carrapato Boophilus microplus são baseados no desenvolvimento de vacinas, pois este é um dos mais importantes ectoparasitas de bovinos, causando grandes prejuízos à pecuária mundial pelos seus efeitos diretos e indiretos. A aplicação de produtos químicos é atualmente o principal método de controle, mas em função das desvantagens desta prática, o uso de vacinas é uma alternativa de melhor viabilidade, por serem livres de resíduos, específicas e apresentarem menor possibilidade de desenvolver resistência. O principal hospedeiro do B. microplus é o bovino, mas outros animais podem ser parasitados, entre eles búfalos, burros, ovinos, caprinos, cão, gato, porco, veado, onça, preguiça, canguru, coelho e cervídeos. Nestes animais, com exceção do bovino, os carrapatos não conseguem atingir o estágio adulto, em função de diversos fatores, entre eles o fator imunológico, que promovem alta mortalidade, principalmente das larvas (Riek RF. Austral. J. Agric. Res. 10: 614-619,1959).

Boophilus microplus está entre os parasitas mais importantes dos bovinos. Esse pa-rasitismo causa grandes perdas econômicas na pecuária mundial afetando principalmente os países tropicais e subtropicais. No Brasil, o carrapato B. microplus é encontrado nos 26 estados, em 95,6% dos municípios (Teixeira Leite N et ai. Ecosystem, 16:137-141,1991) e em 66,04% destes municípios, durante os doze meses do ano. Em função das condições climáticas, as regiões de maior incidência do carrapato são sul, sudeste e centro-oeste (HORN SC. Boi. Def. San. Ani. Brasília·. Ministério da Agricultura, 1983).

De acordo com as informações fornecidas pelas Secretarias de Agricultura dos estados brasileiros que calcularam os prejuízos econômicos causados por B. microplus, os quais chegavam a um total de US$ 968 milhões (HORN SC et al. Boi. Def. San. Ani. Brasília: Ministério da Agricultura, 1984), em função do crescimento do rebanho bovino de 76 milhões de cabeças em 1983 para 169 milhões de cabeças em 2000, estas perdas poderiam ultrapassar os dois bilhões de dólares (Grisi L et al. A Hora Veterinária, 21(125):8-10, 2002). Os prejuízos, considerando apenas o setor de couros, são de mais de R$ 500 milhões por ano.

As perdas são decorrentes dos efeitos diretos e também indiretos. Como efeito direto, pode se mencionar a ação hematófaga que influencia negativamente no ganho de peso e no estado nutricional trazendo conseqüências na produção de leite e carne, e podendo levar à morte do animal (Horn SC et al. Boi. Def. San. Ani. Brasília, Ministério da Agricultura, 1984). A lesão causada na pele dos animais pode favorecer o aparecimento de patologias secundárias, acarretando prejuízos no mercado de couro. Como efeito indireto, o carrapato B. microplus também causa prejuízos por ser um importante transmissor de hemoparasito-ses tais como Anaplasma sp. (Rickettsia) e Babesia spp. (Protozoário) formando o complexo da tristeza parasitária bovina. O carrapato B. microplus é um parasita monoxeno, ou seja, realiza suas mudas ou metamorfoses em um único hospedeiro. Seu ciclo de vida pode ser subdividido em duas fases: fase parasitária e fase não parasitária (Gonzáles JC. Porto Alegre, Sulina, 103,1975). O gado Bos indicus (zebu) é mais resistente aos carrapatos do que o Bos taurus (europeu), sendo que o gado europeu apresenta em média 10,5 vezes mais carrapatos que os de cruzamentos com zebuínos (Francis J et al. Aust. Vet. J. 40:247-53,1964). Por outro lado, existem dentre as raças européias, aquelas com maior resistência aos carrapatos, como é o caso da raça Jersey (Utech KBW et al. Austral. J. Agric. Res. 29:885-895,1978). Foi observado que a variação individual em relação à resistência aos carrapatos também acontece dentro de uma mesma raça (Gomes A. Tese, Rio de Janeiro: Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, 1995). Além disso, outras variáveis influenciam a relação parasita-hospedeiro podem ser mencionadas, como sexo (Stear MJ et al. Aust. J. Exp. Biol. Med. Sei. 62:47-52, 1984), idade (Sutherst RW et al. Aust. J. Agric. Res., 30:353-68,1979), época do ano (Gomes et al. Trop. Anim. Health. Prod. 21:20-24, 1989), estado nutricional (Sutherst RW et al. Austral. J. Agric. Res., 343:329-339,1983), a coloração da pele e do pelo (Oliveira GP et al. Pesq. Agrop. Bras., 22(4):433-439,1987).

Em um animal altamente resistente, a proporção de larvas que consegue ter sucesso e completar o ciclo é menor que 1% e para um animal susceptível, a proporção sobe para cerca de 20% ou mais (Willadsen et al. 1977, citado por Veríssimo CJ. Tese (mestrado), FCAV, Campus de Jaboticabal, UNESP, 163, 1990). Durante a fase parasitária do B. microplus ocorrem mais perdas nos animais resistentes, tanto de larvas como de ninfas, principalmente nos períodos que antecedem as mudas (Bennett GF. Acarologia, 16:643-650, 1975).

Os zebuínos apresentaram mais que o dobro de mastócitos dérmicos por unidade de volume na região da virilha que os taurinos em animais naturalmente infestados (Moraes FR. Tese (doutorado), FCAV, Unesp, Jaboticabal, SP, p. 106,1988). As alterações dérmicas prejudicam a ingestão de sangue, fazendo com que o peso das fêmeas ingurgitadas seja menor em zebuínos do que em taurinos, e conseqüentemente, estas teleóginas produzem um menor número de ovos e larvas. A maior resistência dos bovinos zebus não afetou a oviposição, a embriogênese e a eclosão das larvas.

No estudo das alterações teciduais ocorridas durante o parasitismo dos bovinos pelo Boophilus microplus, foi verificado que o grau de degranulação de eosinófilos é maior no local da fixação da larva nos animais resistentes (Schleger AV et al. Austral. J. Biol. Sei., 29:499-512, 1976). De acordo com Schleger et al., a formação do complexo antígeno-anticorpo, fixação de complemento e linfocinas recrutam os eosinófilos. Ocorre também um grande afluxo de basófilos e mastócitos (Willadsen, 1977 citado por Veríssimo J. Tese (mestrado), FCAV, Campus de Jaboticabal, UNESP, p. 163, 1990). Estas células liberam hista-mina, que é o principal mediador da resposta inflamatória, aumentando, assim, a permeabilidade capilar dos vasos sanguíneos e a passagem de elementos de defesa do hospedeiro. As enzimas liberadas pelos eosinófilos atraídos e degranulados causam lesão tecidual, evidenciada pela vesícula epidérmica observada nos hospedeiros e irritação local. Estes produtos também são tóxicos para a larva, impedindo sua alimentação ou forçando a migração para outro local. A irritação também estimula a autolimpeza e a vesícula epidérmica que se forma sob o local da fixação facilitando a remoção das larvas. Nas fases finais do ciclo parasitário ocorre intensa infiltração de neutrófilos, atraídos pelos fatores produzidos pela fixação de complemento.

Os artrópodes ao parasitar os animais injetam saliva que contém antígenos indutores de resposta imune. Estes antígenos estimulam três tipos diferentes de resposta imune: resposta do tipo Th1; resposta do tipo Th1 associada com a produção de anticorpos IgG e infiltrado de basófilos; resposta Th2 com produção de IgE e hipersensibilidade do tipo 1. Cada um destes três tipos de respostas pode modificar a pele do animal e prejudicar a alimentação do parasita. A saliva do carrapato reduz a função do macrófago e é imunossu-pressiva (Tizard IR. Veterinary immunology. Saunders Company, 6:482p, 2000). O controle químico é a principal forma de controle dos carrapatos no rebanho bovino, principalmente por meio de aspersão ou banho de solução aquosa. Os sistemas dorsal, injetável e por bolos gástricos têm sido incrementados nos últimos a nos facilitando o manejo. Novas formas de administração dos produtos vêm sendo desenvolvidas com o objetivo de facilitar o manejo e aumentar a eficiência dos produtos químicos no controle do carrapato. O extensivo uso de acaricidas tem levado a um número elevado de problemas como o custo do manejo, custo da dose e período curto de proteção. Além disso, seu uso promove a seleção de linhagens de carrapatos acaricida-resistentes, diminuindo o período de proteção dos produtos e aumentando o custo de tratamento. No controle químico, são utilizados os derivados arsenicais, organoclorados, organofosforados, carbamatos, amidinas e piretróides sintéticos. Em média, os diferentes princípios ativos utilizados para controlar o carrapato apresentaram uma vida útil de pouco mais de uma década, quando quase a totalidade das populações de carrapatos presentes no campo apresentava resistência à droga utilizada (Graf JF et al. Parasitology 129:427-S442,2004).

Atualmente, as drogas mais utilizadas são os derivados de piretróides, ivermectinas e benzoil fenil ureia (Da Silva Vaz JR I. Tese. Porto Alegre: Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 1997). Em adição, esta metodologia de controle é extremamente desvantajosa em função dos agentes químicos e apresentarem os efeitos nocivos ao próprio animal durante o tratamento e também à saúde humana pelo extensivo efeito residual.

Formas de controles alternativos têm sido estudadas, principalmente, com a finalidade de se evitar a presença de resíduos químicos em produtos de origem animal destinados ao consumo humano e animal. O controle alternativo do carrapato vem sendo estimulado, apesar de sua eficácia discutível. Os métodos são os mais variados podendo ser associados ou não. São exemplos destes métodos: seleção de bovinos resistentes aos carrapatos (Davis GP. Aust. J. Agric. Res., 44:179, 1993), cultivo de pastagens que dificultam a sobrevivência das larvas (Sutherst RW et al. Nature, 295:320-321, 1982), rotação de pastagens (Elder JK et al. Aust. Vet. J., 56:219-231, 1980), manejo de predadores naturais, tais como a Egretta íbis (Alves-Branco FPJ et al. Comunicado técnico EMBRAPA. 1:1-4,1983) e formigas (Gonzales JC. 2a Ed. Porto Alegre: Edição do Autor, 1995), uso de patógenos tal como o fungo Beauveria bassiana (Cordovés CO. 2a Ed.. Rio Grande do Sul: Agropecuária. 176, 1997) e bactérias tal como a Erwinea sp (Brum JGW. International Journal of Systema-tic Bacteriology, 31:317-326, 1981).

As vacinas apresentam uma atrativa alternativa à metodologia química tradicional para o controle do B. microplus, pois apresentam controle profilático e terapêutico dos agentes causadores de diversas doenças em humanos e animais, não são agentes químicos, apresentando menor custo e maior tempo para o desenvolvimento da resistência (Willadsen P. Veterinary Parasitology. 71:209-222,1997).

Três vacinas comerciais foram desenvolvidas apresentando eficácia moderada. A primeira vacina comercial foi produzida em larga escala na Austrália com o nome comercial de TickGard® (AU8700401), composta pelo antígeno Bm86 ee desenvolvida por engenharia genética em E. coli associado a um adjuvante oleoso. A segunda vacina contra carrapatos comercialmente disponível, denominada de Gavac® (BR PI9300625-0), foi baseada no antígeno Bm86, clonada em Pichia pastoris e associada também a um adjuvante oleoso. A terceira vacina, contendo o antígeno Bm86 e um novo adjuvante denominado Vaximax, foi comercialmente registrada com o nome de TickGard Plus®.

Os testes de campo realizados no Brasil com as vacinas comercialmente disponí- veis, TickGardplus e Gavac®, apresentaram uma eficácia moderada e a necessidade da aplicação concomitante de produtos químicos. Para se obter certa eficácia destas vacinas é fundamental sua associação a práticas de manejo que favoreçam a descontaminação das pastagens. O desenvolvimento de vacinas contra o carrapato, processo cogitado anteriormente apenas para vírus, protozoários e bactérias, viabilizou-se após as primeiras infestações de bovino em condições naturais ao desenvolver expressiva resposta imune contra tecido do carrapato. Esta observação levou diversos pesquisadores à procura de antígenos de carra-patos capazes de conferir proteção ao bovino. A maior parte dos esforços para a procura de antígenos foi concentrada no aparelho digestivo e na glândula salivar dos carrapatos, sendo que as proteínas isoladas até o momento são originadas principalmente do aparelho digestivo. No entanto, foi constatado que os anticorpos presentes no sangue do hospedeiro vertebrado passam pelo aparelho digestivo e são encontrados ainda ativos na hemolinfa do carrapato. Desta forma foi proposto também o emprego como antígenos na elaboração de uma vacina, proteínas do carrapato com funções fisiologicamente essenciais a sua sobrevivência e com as quais o sistema imune do bovino normalmente não entraria em contato. No entanto, a procura de bons alvos internos do animal esbarra na falta de conhecimento bioquímico mais detalhado da sua fisiologia. Várias moléculas envolvidas na fisiologia dos carrapatos e sua interação com o hospedeiro têm sido descritas por diversos grupos de pesquisa. O estudo dessas proteínas possibilita a identificação de novos antígenos para o desenvolvimento de vacinas. Uma vez que elas tenham sido caracterizadas, os respectivos genes poderão ser clonados de modo que estas proteínas possam ser produzidas nas quantidades necessárias para testes de imunoproteção. O fato de que anticorpos bovinos funcionais são encontrados em vários tecidos do carrapato expandiu o leque de moléculas-alvo para além daquelas presentes no intestino, de forma que moléculas presentes em praticamente qualquer tecido do carrapato passaram a ser alvo potencial (Da Silva Vaz Junior et al. Vet. Parasito!., 62:155-160,1996). São exploradas, atualmente, três abordagens distintas no desenvolvimento de vacinas para o controle dos carrapatos: exploração dos antígenos expostos, exploração dos antígenos ocultos e por último, a combinação de ambas as abordagens. A primeira delas, a exploração de antígenos expostos, é baseada na observação da ocorrência de resistência natural do bovino adquirida depois de repetidas infestações com o ectoparasita e propiciou a identificação de antígenos por imunidade naturalmente adquirida (Roberts JA. Journal Parasitol. 54(4):657-62, 1968; Wagland BM. Aust. J. Agric. Res. 26:1073-1080, 1975.; Willadsen P et al. J. Immunology., 143:1346-1351, 1989; J Parasitol. 79(5):710-715, 1993). Em uma recente revisão, os principais antígenos recombinan-tes testados e classificados como antígenos expostos foram: calreticulina, proteína ligante de imunoglobulinas, proteína ligante de histamina, P29, HL34, RIM36 e 64TRPs (Nuttall PA et al. Parasite Immunology, 28:155-163, 2006). A segunda metodologia foi baseada na identificação dos antígenos ocultos, os quais não são apresentados naturalmente ao sistema imune do hospedeiro, necessitando de inoculações sucessivas para a geração de resposta imune (Willadsen P et al. Parasito-logy Today. 4:196-198, 1988). Os antígenos desenvolvidos como vacinas recombinantes anti-carrapato, incluindo antígenos constituints das vacinas comerciais são: Bm86, Bm91, Bm95, Vitelina, BmPRM (paramiosina), HLS1 (serpina), Voraxina, HLS2, P27/P30 (proteína semelhante à troponina 1 e 4D8) (Nuttall PA et al. Parasite Immunology, 28:155-163,2006).

Atualmente, um novo conceito é a identificação de antígenos que, quando usados como vacinas, alvejam epítopos antigênicos secretados e também ocultos. Possivelmente, o antigeno 64P é o único exemplo de antígeno 64P isolado de R. appendiculatus. Embora o 64P seja um antígeno oculto, ele apresenta reação cruzada com antígenos do intestino, he-molinfa e glândulas salivares de carrapatos adultos e extratos totais de ninfas e larvas de R. appendiculatus (Trimnell AR etal. Vaccine, 23:4329-4341,2005; Trimnell AR et al. Vaccine, 20:3560-3568, 2002). A ação dupla existente neste mecanismo, representada pela atuação dos mecanismos de defesa do hospedeiro no local de alimentação e no intestino, oferece uma estratégia de auto-sustentação para o controle do ectoparasita mantida por infestações naturais.

Além do antígeno Bm86, outras proteínas de B. microplus foram caracterizadas como imunógenos, partes potencialmente constituintes de vacinas, mas nenhuma delas está sendo presentemente utilizada como vacina comercial. Os antígenos mais importantes são: as proteínas Bm91 (Riding GA et al. J. Immunology, 153:5158-5166,1994) e BMA7 (Mcken-na RV et al. Parasite Immunol., 20:325-336,1998), um grupo de proteínas (massas moleculares variando entre 30 kDa a 200 kDa) que usa um anticorpo monoclonal QU13 (Lee RP et al. Immunol., 72:121-126, 1991). Outro anticorpo monoclonal, o BrBm2, reconhece uma proteína de 27 kDa de intestino, (Toro-Ortiz RD et al. Vet. Parasito!., 69:297-306,1997).

Antígenos relacionados à ovogênese e ao desenvolvimento embrionário são os seguintes: a Vitelina (Logullo C et al. Insect. Biochem. Mol. Biol., 32:1805-1811, 2002), a BYC (Boophilus Yolk Catepsin) (Logullo C et al. Parasitol. 116:525-532, 1998), uma cisteíno-endopeptidase degradatora de vitelina (VTDCE) (Seixas A et al. Parasitol. 126:155-1563, 2003).

Antígenos relacionados à digestão, estresse oxidativo e sistema imune são os seguintes: proteínas ligadoras de heme (HeLp), uma lipoproteína capaz de transportar heme para os diferentes tecidos (Maya-Monteiro CM et al. J Biol Chem., 275:36584-36589, 2000) a THAP, uma protease ligadora de heme, relacionada à degradação de VT (Sorgine MH et al. J Biol Chem., 275: 28659-28665, 2000) e a própria VT, que é uma proteína ligadora de heme com papel antioxidante (Logullo et al. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 32(12):1805-1811, 2002), uma cisteíno-endopeptidase denominada BmCL1 (Renard G et al. Insect Biochem Mol Biol. 30:1017-1026, 2000).

Poucos antígenos foram testados em ensaios de vacinação como antígenos re-combinantes eficazes. Embora diversas proteínas de carrapato tenham sido propostas como antígenos protetores específicos, há ainda a necessidade da identificação e a caracterização de novos antígenos para o controle de carrapatos (De Ia Fuente J et al. Expert Rev Vaccines, 2:583-593, 2003; Willadsen P. Parasitology, 129:S1-S2, 2004).

Para o Rhipicephalus appendiculatus, a proteína de cemento 64P quando utilizada para imunizar o hospedeiro, representou um avanço significativo por apresentar ação sistêmica contra parasita (Trimnell AR et al. Vaccine, 20:3560-3582, 2002), e porque ela está relacionada às proteínas ligantes de imunoglobulinas (Wang H et al. Cell Mol Life Sei., 56:286-295, 1999). A proteína da matriz da glândula salivar p29 de Haemaphysalis longicornis (Mulen-ga A et al. Infect Immun., 67:1652-1681, 1999), a proteína HL34 de função desconhecida (Tsuda A et al. Vaccine, 19:4287-4296, 2001), a proteína serpina 2 inibidora de serina pro-tease (Imamura S et al. Vaccine, 23:1301-1311, 2005), a proteina P27/p30 semelhante à troponina (You MJ. J Vet Sei, 6:47-51,2005), representam avanços importantes para o controle do Haemaphysalis longicornis.

As proteínas de Ixodes scapularis 4D8 e 4E6, de funções desconhecidas, e a nu-cleotidase 4F8 são alguns antígenos com funções importantes (Almazan C et al. Vaccine, 23:4403-4416, 2005), além do fator de engorgitamento AhEF do Amblyomma hebraeum (Weiss BL et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 101:5874-5892, 2004), que tem afetado significativamente as infestações de carrapato em diversos experimentos.

As proteínas intestinais recombinantes Bm86 e Bm95, de funções desconhecidas, foram um marco no desenvolvimento de antígenos protetores contra o B. microplus (Willadsen P et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86:9657-9661, 1989; Rodriguez M et al. J. Biotech-no/., 33:135-146, 1994; Garcia-Garcia JC et al. Vaccine, 18:2275-2287, 2000), a peptidase (proteína Bm91) (Willadsen P etal. Parasite immunoi, 18:241-246,1996).

Outros antígenos recombinates não alcançaram o sucesso desejado, tais como a calreticulina (CRT) de B. microplus (Ferreira CA et al. Experim. Parasito!., 101:25-34, 2002) e a paramiosina, no qual a proteína recombinante é ligante de IgG e colágeno (Ferreira CAS et al. Parasitology, 125:265-274,2002).

Os resultados destes estudos experimentais têm demonstrado a viabilidade do controle das infestações pelo uso de múltiplos produtos gênicos que alvejam diversos mecanismos fisiológicos de carrapatos.

Como conseqüência destes e dos demais estudos, as vacinas e os componentes antigênicos foram patenteados, tais como, por exemplo, a galectina (NZ 535468, BR PI 0303322-8), os genes de RhcA e RhcB para moléculas de cisteína proteinase (CN 1657617), proteína de cemento (US 2003170257, NZ 504532, BR PI 0110278-8), triptase TdPI (NZ 516809), a proteína recombinante peroxirredoxina (JP 2002010785), Bm95 (ZA 9901320), polipeptídeo correspondente à neurotoxina HT-1 (W09747649), glicoproteína de membrana celular (US 6235283, EP 0290565, CA 1339466), antígenos diversos (JP 62084029, IL 84574), singânglio (AU 5970786), carboxipeptidase (WO 9504827), formulações de antígenos particulados (ZA 9302352), inibidor de proteases do tipo Kunitz (BR PI 0406057-1), quitinase de carrapato (JP 0302335), antígeno inibidor de serina protease (BR PI 0004655-8 ), protease aspártica (PI9903530-8), vacinas anti-carrapatos (BR PI 8707549-0).

Diversos produtos vacinais, além das vacinas comerciais disponíveis para B. micro-plus, foram elaborados a partir de metodologias diversas, que não a forma recombinante, e merecem atenção especial a descrição dos seus resultados. A Patente US 5.281.836 (2005) descreve três peptídeos sintetizados quimicamente (SBm4912, SBm7462 e SBm19733) derivados da glicoproteína Bm86 foram construídos e utilizados para a imunização de animais. Os peptídeos, tendo saponina como adjuvante, foram inoculados nos animais. Os melhores resultados de eficácia, 81,05%, foram obtidos com o peptídeo sintético SBm7462. Posteriormente, foi verificado a viabilidade da utilização do imunógeno SBm7462 em micro-esferas de látex para o prolongamento da resposta imune (Sales-Junior PA et al. Veterinary Immunology and Immunopathology, 107:281-290, 2005).

As vacinas de DNA, contendo vetores que codificam o gene Bm86, apresentaram resultados encorajadores, embora ainda insuficientes para proteção adequada (De Rose R et al. Vet. Immunol. Immunopathol., 1:151-160,1999; Ruiz LM et al. Veterinary Parasitology, 144:138-145, 2007).

No Pedido de Patente BR PI 0004655-8, foi utilizada uma proteína inibidora de serina roteases (BMTI), que apresentou um efeito protetor de 72,8%, após a administração de três doses aos animais (Andreotti R et al. International Immuno Pharmacology, 2:557-563, 2002). Em um trabalho posterior, foi reportado um estudo conduzido para a evolução de um fragmento sintético de BmTI N-terminal como antígeno contra carrapatos em bovinos apresentando um nível de eficácia de 18,4%, quando comparado com o grupo de controle (Andreotti R. Experimental Parasitology, 116:166-70, 2007). O Pedido de Prioridade US 10425563 descreve o uso de ELI (Expression Library Imunization) e análises de seqüências de cDNA protetoras contra infestações experimentais com /. scapularis (Almazan C et al. Vaccine 21(13-14):1492-1501, 2003. Este trabalho foi o primeiro exemplo de aplicação de ELI em artrópodes e, particularmente, em carrapatos. Nestes experimentos, foi possível a caracterização e a utilização dos antígenos 4F8, 4D8 e 4Ε6 em formulações de vacinas anti-carrapato de amplo espectro (Almazan C et al. Vacci-ne, 23(35):4403-4416, 2005; Almazan C et al. Vaccine, 23(46-47):5294-5298, 2005). Os pedidos WO 03093416, US 20040022795 foram requeridos inicialmente para antígenos protetores contra as espécies de Ixodides ssp. Posteiormente, US 20060040361, EP 1655306 US 7214784 e EP 1749835 foram requeridos para Ixodides ssp e demais espécies de carrapa-tos. O uso de RNA de interferência (RNAi) para a determinação da função gênica foi demonstrada em várias espécies de carrapato incluindo o B. microplus, sendo para este último, silenciados os antigenos Bm86, Bm91 e subolesina. Os ovos gerados por fêmeas ingurgitadas, injetadas com dsRNA para subolesin, foi anormal sugerindo que a subolesina poderia apresentar um papel no desenvolvimento embrionário. Os resultados apresentados por esta linha de pesquisa levaram a novas possibilidades para a descoberta de novos antígenos (Nijhof AM et al. International Journal for Parasitology, 37(6):653-662, 2007; Kocan KM et al. Parasitology Research, 100(6):1411-1415, 2007).

No Brasil, até o momento foram depositados os seguintes pedidos de patente referentes ao desenvolvimento de antígenos vacinais para o controle do carrapato bovino: BR PI 0110278, BR PI0604365, BR PI 9704150, BR PI 0004655, BR PI 0406057, BR PI 9903530, BR PI 0303322, BR PI 0303321, BR PI 0504346, BR PI 0501904.

Em função do que foi apresentado referente às formas de controle dos carrapatos por meio de vacinas, para se obter uma vacina ideal, as características necessárias seriam as seguintes: a atividade contra todas as espécies de carrapatos, atividade contra todos os estágios, a imunidade duradoura, o impedimento de fixação dos carrapatos, a redução da incidência de doenças, a ausência de resistência e uma boa relação de custo-benefício (Nuttall PA et al. Parasite Immunology, 28:155-163, 2006; Tellam RL et al. Veterinary Parasitology, 103:141-156,2002).

Na pesquisa de vacinas recombinantes para o controle de carrapatos tem sido demonstrado que os protótipos contendo mais de um antígeno são mais eficazes do que aqueles com apenas um antígeno (Willadsen P et al. Parasite Immunology, 18:241-246, 1996). Em vista disso, torna-se evidente a necessidade de identificação de novos antígenos, a i-dentificação de epítopos importantes de antígenos conhecidos ou mesmo melhorar as vacinas existentes para o controle do carrapato bovino. Assim, a tendência, hoje em dia, é a utilização concomitante de diversos antígenos a fim de melhorar a resposta imune protetora.

Os problemas referentes ao desenvolvimento e produção de vacinas convencionais para o controle de carrapato são desafiadores, pois ainda não se chegou a uma solução satisfatória através da utilização das metodologias tradicionais de cultivo. Os métodos de purificação e obtenção de imunógenos para carrapatos in natura requerem um procedimento complexo para se tornarem viáveis comercialmente. Por outro lado, proteínas recombinan- tes são normalmente baseadas em apenas um antígeno e podem não produzir o mesmo efeito protetor da proteína similar original. Vacinas baseadas em antígenos sintetizados quimicamente apresentam custo acima das vacinas anteriores e em alguns casos também podem não funcionar como a proteína original.

Uma vacina com reais possibilidades de substituir o uso de acaricidas ainda não está disponível. Seria importante o estudo das capacidades dos antígenos imunogênicos já disponíveis e a associação de novos antígenos a serem descobertos. A identificação de diversas proteínas com potencial para serem utilizadas em vacinas contra o carrapato permitirá estimar que as duas vacinas atuais, com eficácia parcial, tornem-se mais eficientes com o acréscimo de novos imunógenos, adjuvantes específicos e citocinas, levando a alterações na forma de inoculação e apresentação dos imunógenos ao sistema imunológico do bovino (Vaz Junior IS et al. XIII Congresso Brasileiro de Parasitologia Veterinária & I Simpósio Latino-Americano de Ricketisioses, Ouro Preto, MG, 2004).

Neste contexto, a biotecnicas moleculares ocupam um espaço central para o fornecimento de informações no campo de parasitologia e é um caminho extremamente promissor para se chegar a vacinas eficazes. Com os estudos científicos e o desenvolvimento tecnológico, no campo da proteômica e da genômica de parasitas, ocorre a possibilidade da identificação e correlação de dados para o desenvolvimento e comercialização de novos medicamentos, minimizando custos e tempo gasto no desenho de novos produtos (Dalton JP et al. Veterinary Parasitology, 98:149-167, 2001). Segundo os autores, torna-se necessário o mapeamento e a identificação dos principais epítopos que conferem proteção. Este mapeamento podería identificar os principais epítopos responsáveis por conferirem resposta imune eficaz e eliminar os epítopos relacionados ao desenvolvimento dos mecanismos de evasão da resposta imune do parasita frente ao hospedeiro.

De forma geral, podemos concluir que os estudos realizados até o momento justificam a confiança sobre a viabilidade do desenvolvimento de uma vacina baseada nas proteínas já descritas e a pesquisa de novas proteínas a serem descobertas consideradas de extrema importância. Pelo exposto, uma vacina baseada na seleção específica de epítopos do carrapato abrangendo diferentes antígenos de diferentes fases e órgãos, representa uma possibilidade extremamente viável na constituição de uma vacina poliimunogênica, comparada às demais metodologias existentes. A identificação e caracterização dos epítopos capazes de gerar resposta imune contra o carrapato possibilitam a utilização de peptídeos re-combinantes ou mesmo sintetizados quimicamente objetivando fins vacinais, em escala industrial. Dessa forma, trabalha-se apenas a região imunogênica, sendo desnecessária a utilização da proteína completa. Além disso, estas vacinas apresentam algumas características desejáveis tais como, por exemplo, alto grau de pureza, caracterização química conhecida, ausência de contaminantes, produção em larga escala, fácil armazenagem devido à alta estabilidade, ausência de enzimas proteolíticas, baixo custo e produção em escala industrial (Patarroyo JH etal. Veterinary Immunology and Immunopathology, 88(3-4):163-172, 2002).

Desta forma, a presente invenção se refere ao uso de novos peptídeos recombinan-tes ou sintetizados quimicamente, que funcionam como epítopos antigênicos e que são alvos potenciais para geração de resposta imune contra proteínas de carrapatos, compreendendo seqüências que reconhecem motivos protéicos comuns da poliproteína existente nas diversas fases de desenvolvimento, diferentes órgãos e tecidos, além de estruturas não pro-téicas. A presente invenção baseia-se no uso da técnica de Phage Display para a identificação e seleção de seqüências de peptídeos específicos miméticos do B. microplus, determinando epítopos funcionais, através de anticorpos policlonais obtidos de galinhas imunizadas com extrato total do B. microplus. Neste trabalho ocorreu a primeira utilização da seleção de bibliotecas de peptídeos para o desenvolvimento de mimetopos específicos de artrópodes e, particularmente, em carrapatos.

DESCRICÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Técnicas aplicadas à biologia molecular apresentam grande potencial na elucidação de novos antígenos para o desenvolvimento de uma vacina eficiente. Dentre estas técnicas, a tecnologia do Phage Display (“expressão de biomoléculas em fagos”) é uma metodologia capaz de selecionar peptídeos com diversas finalidades, tais como mapeamento e identificação de epítopos reconhecidos por anticorpos. O processo consiste em sucessivos ciclos de seleção, lavagem, eluição e amplificação de fagos filamentosos que expressam seqüências randômicas de peptídeos que se ligam, por afinidade, a diversas moléculas, incluindo imunoglobulinas. Bibliotecas comerciais de peptídeos podem ser utilizadas para a seleção de peptídeos sintéticos que mimetlzam epítopos naturais. Estes clones são seqüenciados e as seqüências traduzidas e, posteriormente, são realizados testes imunológicos para demonstrar a reatividade contra o alvo de interesse (Barbas CFIII et al. Plain View, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). O fago M13 tem sido amplamente utilizado para o uso em bibliotecas de Phage Display. O peptídeo ou proteína expresso na superfície do fago possibilita a seleção de seqüências baseadas na afinidade de ligação para uma molécula alvo (anticorpos, peptídeos, enzimas, receptores de superfície celular etc.). Neste sistema, o gene codificador do peptídeo ou proteína de interesse é geralmente fusionado a um dos genes destas duas proteínas da capa protéica do fago. Assim, o peptídeo é expresso na extremidade N-terminal das proteínas virais plll ou pVIII. O processo de Phage Display, ou apresentação de biomoléculas em fagos, foi inicialmente desenvolvido por Smith (Smith GP. Science, 228:1315-1317,1985). O dito processo envolve enzima de restrição EcoRI através da fusão com a proteína três (plll) do capsídeo do fago. O Phage display permite a seleção de peptídeos e proteínas, incluindo anticorpos com alta afinidade e especificidade para vários alvos. A vantagem crucial dessa tecnologia está na ligação direta que existe entre o fenótipo experimental e o genótipo encapsulado, mostrando, assim, a evolução dos ligantes selecionados até moléculas otimizadas (Azzazy HM et al. Clinicai biochemistry, 35:425-445,2002). O Phage display tem provado ser uma técnica muito poderosa na obtenção de bibliotecas contendo milhões ou até mesmo bilhões de diferentes peptídeos ou proteínas. A metodologia de bibliotecas mais amplamente utilizada é baseada no uso de fagos filamento-sos (Smith GP. Science, 228:1315-1317,1985). A partícula do fago filamentoso é formada por uma fita simples de DNA envolta por uma capa protéica constituída por cinco proteínas (plll, pVI, pVII, pVIII e pIX). Destas cinco proteínas, existem aproximadamente 2800 cópias da pVIII e cinco cópias da plll. Neste sistema, o gene codificador do peptídeo ou proteína de interesse é geralmente fusionado a um dos genes destas duas proteínas da capa protéica do fago (Brigido MM et al. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, 26:44-51, 2002). Assim, geralmente o peptídeo é expresso na extremidade N-terminal da plll ou pVIII. A plll está relacionada com a infectividade do fago pela ligação ao pilus F da célula bacteriana. Ela apresenta três domínios (D1, D2 e D3) separados uns dos outros por resíduos de glicina. Devido à baixa representatividade da plll em relação à pVIII as bibliotecas de peptídeos sintéticos fusionados na plll são mais indicadas para descoberta de ligantes com alta afinidade, quando comparadas com as bibliotecas pVI-II ligadas.

Apesar da técnica de Phage Display ter sido primeiramente introduzida há aproximadamente 15 anos, as aplicações e desenvolvimento desta tecnologia estão apenas começando a ser exploradas. Essa exploração da tecnologia de Phage Display irá levar à produção de uma enorme gama de ligantes, incluindo anticorpos recombinantes e peptídeos, com especificidades pré-definidas. Além disso, tecnologias emergentes baseadas em Phage Display irão beneficiar métodos de diagnóstico através da produção de moléculas impossíveis de se obter por métodos tradicionais. Especificamente, anticorpos recombinantes contra antígenos tóxicos ou seqüências conservadas e carboidratos podem ser isolados, entre outros (Soderlind E et al. Nature Biotechnology, 18:852-856, 2000). A Patente US 7.083.945, Pedido de Patente US 2006068421, Pedido de Patente US2005202512, Patente GB 2408332, Pedido de Patente US 2003104604, Patente EP 1452599, Pedido de Patente US 2006035223 utilizam a técnica de Phage Display com o intuito de expressar polipeptídios recombinantes com afinidade para o ligante, além de propor metodologias que tornam a técnica mais eficiente. A seleção de bibliotecas fusionadas em fagos apresenta uma grande versatilidade para a obtenção de peptídeos específicos para anticorpos monoclonais e policlonais, reco- nhecedores de epítopos lineares, tanto quanto mimetopos, peptídeos que imitam epítopos lineares, descontínuos, conformacionais e até mesmo epítopos não protéicos de antígenos. Os antígenos expressos em fagos têm importantes vantagens comparadas com vacinas de peptídeos sintéticos (Huerta M et al. Vaccine, 20:262-266, 2001; Sciutto E et al. Microbes Infect., 2:1875-1890, 2000). Eles podem ser produzidos em larga escala a um custo baixo, pois são secretados por bactérias. A densidade da superfície do fago é de 200-400 m2/g e a fusão com peptídeos expressos na PVIII compreendem mais de 25% do seu peso e estende-se por 50% da sua área de superfície. Os fagos também são resistentes à temperatura e a muitos solventes orgânicos e químicos, assim como a outros tipos de estresses. O mais importante é que proteínas do próprio fago são altamente imunogênicas, e na maioria das vezes, não requerem adjuvante para sua aplicação com imunógenos (Petrenko VA et al. Protein Eng., 13:589-592, 2000).

Fagos são comumente utilizados como partículas imunogênicas para a geração de anticorpos contra os peptídeos recombinantes expressos nas regiões amino-terminais de proteínas de superfícies, e reagem cruzadamente com o alvo original, indicando que mimetopos expressos podem ser utilizados como candidatos a subunidades vacinais (Willis AE et al. Gene, 128:79-83, 1993; Meola A et al. J. Immunol., 154:3162-3172, 1995; Demangel C et al. Mol Immunol., 33:909-916, 1996; Yang WJ et al. Journal of Immunological Methods, 276:175-183,2003). O Phage Display tem sido recentemente utilizado por pesquisadores para o desenvolvimento de vacinas contra muitas doenças: HIV-1 (Scala G et al. J Immunol., 192:6155-6161,1999; De Berardinis PD et al. Nat. Biotech., 18:873-876, 2000), hepatite viral do tipo C (Puntoriero G et al. Embo J., 17:3521-3533, 1998), doença de Alzheimer (Frenkel D et al. Proc. Nati Acad. Sei, U.S.A. 16: 5675-5679, 2002). Em WO 2006/005943, WO 2006/071896, Pedido de Patente US 2006094017, Pedido de Patente US 2003082524, Patente DE 10041342, Patente US 6.939.948, representam alguns exemplos da aplicação desta metodologia no campo de vacinas.

Uma aplicação especial desta tecnologia para animais de médio porte foi realizada por Manoutcharian et al., Veterinary Immunology and Immunopathology, 99(1-2):11-24, 2004). Manoutcharian et al. utilizaram pela primeira vez fagos recombinantes como vacinas em suínos, e observaram a capacidade de indução de resposta imune por fagos contendo peptídeos recombinantes da Taenia solium, agente causador da cisticercose em humanos.

Estes trabalhos demonstram que o perfil antigênico completo de um organismo pode ser obtido através de seleções de bibliotecas de peptídeos expressos em fagos e revelam o potencial da utilização de fagos que expressam epítopos como vacinas.

Outra inovação nesta invenção, foi a utilização de imunoglobulina de galinha (IgY) para pesquisas proteômicas do B. microplus. Essa metodologia foi denominada por Zhang de tecnologia IgY (Zhang WW. Drug Discovery Today, 8:364-371, 2003), tendo como fontes dos anticorpos o soro e os ovos (Gassmann M et al. FASEB J., 4:2528-2532, 1990). Como ensiando por Lemamy (Lemamy GJ. International Journal of Câncer, 80:896-902, 1999), aves têm capacidade de produzir anticorpos com alto título e grande persistência da resposta imune às proteínas de bactérias e mamíferos. Além disso, os anticorpos produzidos em galinhas possuem vantagens bioquímicas como resistência a pH extremo (Lee et al. J Bio-chem Mol Biol, 35:488-493, 2002), resistência à temperatura elevada (Jensenius et al. J. Immunol Methods, 46:63-68, 1988), alta afinidade (Ikemori et al. Poult Sei, 72:2361-2365, 1993) e avidez (Stuart et al. Anal Biochem, 173:142-150, 1988). Por essa razão, têm sido usados eficientemente em imunoensaios (Schade et al. ALTEX, 13:5-9,1996).

Desta forma, o grande potencial da metodologia para uma vacina específica de epí-topos miméticos de antígenos, representativos de diferentes fases e órgãos , parece ser um processo extremamente poderoso na constituição de uma nova vacina poliimunogênica, quando comparada às demais metodologias existentes. A identificação e caracterização dos epítopos capazes de gerar resposta imune importantes contra o carrapato possibilitam a utilização de peptídeos recombinantes ou mesmo sintetizados quimicamente para fins vacinais. Assim, trabalha-se apenas a região imunogênica do antígeno, sendo desnecessária a utilização da proteína completa. Além disso, estas vacinas apresentam algumas características desejáveis tais como alto grau de pureza, caracterização química conhecida, ausência de contaminantes, produção em larga escala, fácil armazenagem devido à alta estabilidade, ausência de enzimas proteolíticas, baixo custo e produção em escala industrial (Patarroyo JH et al. Veterinary Immunology and Immunopathology, 88:163-172,2002).

Pela utilização de uma metodologia rápida, eficiente e capaz de fornecer novos antígenos protetores, desenvolveu-se a presente invenção que proporciona por meio da obtenção de peptídeos epítopos específicos do carrapato B. microplus, um avanço significativo no campo de vacinas com potencial aplicação para o controle efetivo deste parasita. O aperfeiçoamento da presente invenção consiste na obtenção de seqüências de mimetopos de estruturas presentes no extrato total de diferentes fases do carrapato, e a sua utilização como imunógenos através de metodologias de expressão recombinante ou síntese química e a sua composição associada a estes imunógenos como vacina.

Em função destes aspectos, a presente invenção refere-se ao uso de cento e dez diversos mimetopos peptídicos lineares ou conformacionais, possuindo diversos tamanhos e formas, de maneira que sua utilização como imunógeno expresso no capsídeo viral, outros vetores, isolados, em conjunto ou mesmo sintetizados quimicamente e conjugado com o veículo hapteno, ou demais apresentações, é capaz de gerar resposta imune cruzada contra o carrapato no momento da ingestão de sangue de forma que proporcione o controle imu-noprofilático da carrapatose. A presente invenção propõe o uso de novos peptídeos recombinantes, que funcionam como epítopos antigênicos e que são alvos potenciais para geração de resposta imune para diversas espécies de carrapato, em que os peptídeos compreendem seqüências que reconhecem motivos protéicos comuns da poliproteína do parasita existentes em todas as fases de desenvolvimento.

Ainda, evidenciamos a potencialidade da invenção obtida em estudos com camun-dongos e bovinos. Os peptídeos foram testados em ensaios de imunização e desafio e a-presentaram a capacidade de produção de reatividade do soro destes animais pelo reconhecimento de proteínas de tecidos e órgãos do parasita. A presente invenção poderá ser mais bem compreendida através da seguinte descrição detalhada mediante que mostra os resultados experimentais listados nas Tabelas 1 a 12 e as figuras em anexo. Os procedimentos experimentais realizados estão detalhados no final desse relatório descritivo. A metodologia empregada para a seleção, caracterização e utilização de peptídeos recombinantes e motivos protéicos que mimetizam regiões antigêni-cas foi aplicada às proteínas de B. microplus, podendo também ser aplicada a outras espécies de maneira eficiente.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Produção e caracterização de soro hiperimune em galinhas que reconhecem antígenos totais do carrapato bovino (Boophilus microplus). O presente exemplo teve como objetivo extrair as proteínas totais, analisar a resposta imune de galinhas imunizadas com estes inóculos, purificar as imunoglobulinas específicas do soro e ovos e verificar o reconhecimento dos anticorpos de galinhas imunizadas com este extrato protéico total de larvas e adultos do carrapato bovino Boophilus microplus.

Para a produção de soro policlonal, as galinhas foram imunizadas com proteínas totais, extraídas de larvas e teleóginas do carrapato bovino Boophilus microplus. A qualidade da extração foi avaliada através do perfil protéico por SDS-PAGE -10% (Figura 1). As linhas A e B representam as proteínas totais extraídas de larvas e adultos, respectivamente. O resultado foi condizente com o perfil protéico desejado e mostra diversas bandas protéicas de intensidades e pesos moleculares variados.

Foram utilizadas para a imunização, galinhas de três semanas de idade, da raça White-Leghorn. Todos os animais imunizados desenvolveram anticorpos reativos ao extrato protéico de B. microplus, em contraste com os animais de controle negativo (Figura 2). O gráfico foi representado pela disposição dos valores de ELISA (OD 492nm) em função da diluição serial (3 vezes) dos soros testados. Os resultados foram expressos como títulos (Titulo = Diluição do soro baseado no valor do cut off). A legenda foi representada da seguinte forma: galinhas imunizadas com antígenos de larvas (GL1, GL2), galinhas imunizadas com proteínas de adultos (GT1 e GT2), soros pré-imunes (SPIL1, SPIL2, SPIT1 e SPIT2) e os controles negativos de reação (BL1 e BL2). Os títulos foram acima de 1:145.800 para larvas (seta A) e acima de 1:16.200 para adultos (seta B). Estes resultados refletem a capacidade das aves produzirem anticorpos com alta afinidade, alto título e grande persistência da resposta imune para proteínas de bactérias e mamíferos. Isto provavelmente se deve ao fato do B. microplus não ser um ectoparasita natural de galinhas. A grande distância evolucionária existente entre aves e artrópodes é um fator contribuinte, assim como o fato de que em aves o mecanismo de produção de anticorpos se faz por conversão gênica, diferentemente dos mamíferos, sendo por mutação somática, embora com a mesma taxa de variabilidade de anticorpos.

Após obtenção de título satisfatório, as imunoglobulinas de galinha (IgY) presentes no soro foram precipitadas por sulfato de amônio e cromatografadas em colunas de troca iônica. As imunoglobulinas purificadas foram caracterizadas parcialmente quanto à pureza por SDS-PAGE (Figura 3). O Processo de purificação de imunoglobulinas a partir do soro de galinhas mostrou ser eficiente. A Figura 3 mostra um padrão de eletroforese das preparações de IgYS purificadas (A) comparadas com soro total (B) e também com um padrão de purificação rotineiro para IgGs de coelhos em nosso laboratório (C) em condições não redu-toras. Foram utilizadas condições redutoras por dithiothreitol-DTT (linhas D e E) para a determinação das cadeias leves e pesadas, respectivamente. Foi verificada a presença de uma banda forte de aproximadamente 180 kDa no soro correspondente ao peso molecular da IgY (linha F). Sob condições redutoras com DTT, ocorreu a formação de uma banda com peso molecular de aproximadamente 66 kDa (cadeia pesada de anticorpo) e duas bandas menores correspondentes a aproximadamente 28 kDa (cadeia leve de anticorpo). Foi possível demonstrar a boa seletividade na purificação dos anticorpos por sulfato de amônio associada a uma eficiente cromatografia de troca iônica.

Foi também realizado um método alternativo para a purificação dos anticorpos por afinidade. O extrato protéico de carrapato foi adsorvido em uma membrana de nitrocelulose. A membrana contendo as proteínas foi incubada com a fração parcialmente purificada de IgY e posteriormente lavadas com PBST e então monitoradas por leitura no espectrofotôme-tro no final da lavagem para averiguação do desprendimento de proteínas da membrana. Os anticorpos foram então eluídos, neutralizados e a concentração do eluído foi estimada por espectrofotometria (OD 280) e a qualidade verificada por SDS-PAGE 10% (Figura 4). Neste experimento foi verificada a presença de banda de menor intensidade para anticorpos elui-dos de proteínas totais de larvas e adultos (Linhas C e D, respectivamente) em comparação com as bandas da fração parcialmente purificada de anticorpos IgY anti-larva e adultos no experimento anterior (Linhas A e B, respectivamente).

Por fim, para determinar a funcionabilidade dos anticorpos policlonais purificados, foi realizado Western blotting (Figura 5). Os resultados mostraram reatividade das IgYs con- tra os principais estádios de larvas (A) e adultos (B) do B. microplus frente dos anticorpos IgY purificados (1:180, 1:360, 1:540, 1:1420). Foram identificadas bandas fracas para as proteínas de menor peso molecular e bandas fortes com pesos moleculares mais altos.

Em conclusão, pela análise da resposta imune em galinhas imunizadas com extrato protéico de B. microplus foi possível demonstrar a capacidade de utilizar galinhas como fonte produtora de anticorpos policlonais específicos e funcionalmente reativos contra B. microplus. Os anticorpos de galinhas foram purificados para eliminar a interferência em experimentos posteriores. As análises de Western blotting demonstraram que as IgY purificadas reconheceram diversas proteínas e que a atividade da IgY purificada não foi perdidada durante o processo de purificação. Em função destes resultados, foi possível a continuidade dos trabalhos para a utilização das bibliotecas de Phage Display.

Exemplo 2: Obtenção de peptídeos miméticos de proteínas de B. microplus por processo Phage Display.

Este exemplo se refere à seleção e a caracterização dos peptídeos recombinantes miméticos e motivos protéicos, às quais a presente invenção se refere. Diversos parâmetros podem ser utilizados para indicar se houve ou não o sucesso da seleção de cada peptídeo, como pode ser visualizado na Tabela 1. Esses mesmos parâmetros foram anteriormente utilizados por Rodi e colaboradores (Rodi DJ et al. Journal of Molecular Biology, 322:1039-1052, 2002). A Tabela 1 apresenta o enriquecimento das seleções pelos títulos obtidos durante as etapas de seleção biológica. As seleções estão indicadas pela letra S, sendo realizadas no total sete seleções distintas. Na segunda coluna, foram mostradas as bibliotecas utilizadas para as seleções. Na terceira coluna, foi representado o alvo utilizado para a seleção de clones. A quarta coluna mostra os ciclos de seleção para cada seleção. Posteriormente, foi determinada a entrada e a saída de fagos em cada etapa de seleção. Os títulos estão indicados pela contagem de unidades formadoras de colônias (UFC) ou Unidades Tradutoras (TU) para as bibliotecas do tipo Ph.D. e Fd-tet, respectivamente. A taxa efetiva de enriquecimento em cada seleção S foi apresentada. Quanto maior for o coeficiente de enriquecimento ao longo dos ciclos de seleção maior é o enriquecimento. Todas as etapas são representadas por valores de enriquecimento que podem ser confirmados pela divisão do título da saída pelo título da entrada multiplicado por 100. Por fim, foi determinada a taxa efetiva de enriquecimento que é a divisão da taxa de enriquecimento do último ciclo pela taxa do primeiro ciclo, perfazendo, assim, o número de vezes que a seleção enriqueceu.

De forma geral, todas as seleções apresentaram enriquecimento nas etapas iniciais comparadas com as etapas finais de seleção, com exceção da seleção S1 (0,6), demonstrando que a seleção dos clones foi direcionada ao alvo. Para as seleções S3, S5 e S7 foram obtidas taxas de enriquecimento em todas as etapas de seleção. Nas seleções S1, S2, S4 e S6, ocorreu o empobrecimento do primeiro para o segundo ciclo. Isto pode ser explica- do pelo aumento da estringência, a qual foi alterada pela diminuição do número de partículas na entrada do segundo ciclo e aumento do detergente Tween 20 nas lavagens. Posteriormente, ocorreu o enriquecimento do segundo para o terceiro ciclo em todas as etapas. Também, foi observado que o título na saída do terceiro ciclo foi superior a saída após o primeiro ciclo de lavagem. Isso mostra a ocorrência de seleção positiva dos clones, os quais representam em cada seleção, uma subpopulação específica de peptídeos para o alvo. E-xemplificamos isto através da seleção S6 a qual enriqueceu 1,091 vez a partir do conjunto de clones da biblioteca inicial representando a maior taxa entre estas seleções. Na seleção S1, ocorreu empobrecimento (0,6 vez) demonstrando, assim, pouca eficácia na seleção.

Concluindo, este exemplo possibilitou a seleção de subpopulações de clones de fa-gos contendo peptídeos recombinantes que se ligam ao alvo biológico representado por IgY Policlonais anti-Pts totais de B. microplus. O próximo passo (Exemplo 3) é a caracterização das seqüências destes peptídeos ligantes ao alvo biológico utilizado para seleção. â- UFC/pL: Unidade formadora de colônia por pL (Ph.D.- 12mer, Ph.D.-C7C), T.U./pL: Unidade tradutora por pL(F88-15mer, Cys3, Cys6 e Fuse 6mer). - - Após cada ciclo de seleção, foi determinado o título dos fagos selecionados pelos anticorpos policlonais e foi calculada a taxa de eluição pela divisão do valor de saída de fagos divididos pelo valor da entrada para cada ciclo. - - O enriquecimento foi determinado pela divisão da taxa obtida no terceiro ciclo dividido pela taxa do primeiro ciclo para cada seleção.

Exemplo 3: Análises da seqüência dos peptídeos selecionados.

Após o processo de seleção biológica, os clones selecionados foram caracterizados por sequenciamento de DNA da região correspondente ao inserto dos peptídeos recombi-nantes (Tabela 2). A Tabela 2 lista em ordem numérica todas as seqüências peptídicas obtidas pelo sequênciamento de DNA da região correspondente inserto fusionado no fago constituinte da biblioteca. A representação está de acordo com a biblioteca utilizada (Seq. ID No. 1 a Seq. ID No. 46 biblioteca Ph.D.-12mer, Seq. ID No. 47 a Seq. ID No. 74 biblioteca Ph.D.-C7C, Seq. ID No. 75 a Seq. ID No. 79 para a biblioteca F88-15mer, Seq. ID No. 80 a Seq. ID No. 90 para a biblioteca Cys3, Seq. ID No. 91 a Seq. ID No. 93 para a biblioteca Cys6, Seq. ID No. 94 a Seq. ID No. 107 para a biblioteca Fuse-6mer e por último a Seq. ID No. 108 a Seq. ID No. 110 referente à biblioteca Ph.D.-C7C. À esquerda da seqüência está representado o número identificador da seqüência e à direita entre parênteses o número de freqüência do peptídeo quando apareceu mais de uma vez na população selecionada.

Após três ciclos de seleções, foram obtidos 110 sequências peptídicas distintas (Seq. ID No. 1 a Seq. ID No. 110) representadas por peptídeos recombinantes expressos em bacteriófagos filamentosos (46 clones da biblioteca Ph.D.-12mer, 28 clones da biblioteca Ph.D.-C7C, 5 clones da biblioteca F88-15mer, 11 clones da biblioteca Cys3, 3 clones da biblioteca Cys6 e 14 clones da biblioteca Fuse-6mer) e por fim 3 peptídeos de uma seleção experimental. O maior número de clones foi obtido pela utilização das bibliotecas Ph.D.-12mer e Ph.D.-C7C. A biblioteca Cys3 apresentou a menor variabilidade de seqüências.

Os peptídeos Seq. ID No. 47, Seq. ID No. 91, Seq. ID No.18, Seq. ID No. 1, Seq. ID No. 2, Seq. ID No. 75, Seq. ID No. 76, Seq. ID No. 80 foram os mais freqüentes nas seleções tornando-se alguns dos principais mimetopos selecionados, especialmente quando se considera a freqüência como um dos principais indícios na seleção em função da maior afinidade para o alvo biológico. A caracterização dos peptídeos e motivos protéicos obtidos na presente invenção foi realizada por análises de bioinformática. Inicialmente, foi utilizado o programa AAFREQ (http://relic.bio.anl.aov/aafreqs.aspx) para o cálculo da freqüência dos aminoácidos dentro da população e também sua freqüência na respectiva posição predominante dentro do inserto recombinante, indicando quais aminoácidos foram super ou sub-representados (Tabela 3). Neste estudo, foram analisados 107 peptídeos, com extensões de 6 até 16 aminoácidos por peptídeo, totalizando 1.109 aminoácidos. Os Aminoácidos tais como a Leucina (L), Pro-lina (P) e Serina (S) apresentaram freqüência de 0,1001, 0,0974 e 0,0956, respectivamente. Nesta análise foi possível a constatação do aumento ou a diminuição da freqüência de alguns Aminoácidos críticos na seqüência peptídica, fornecendo indícios de especificidade importantes no processo de reconhecimento dos ligantes ao alvo biológico.

As seqüências consenso entre os peptídeos foram determinadas através de ali- nhamento múltiplo realizados pelo programa MOTIF2 (http://relic.bio.anl.aov/motif2.asox)· 0 programa não permite substituições conservativas de aminoácidos, mas junções idênticas de três ou mais aminoácidos. Foi considerado um motivo conservado para os peptídeos alinhados quando é longo o suficiente para gerar uma estrutura secundária parcial. 0 programa M0TIF2 identifica motivos contínuos e descontínuos dentro de uma população de peptídeos. A Tabela 4 representa o alinhamento linear múltiplo entre as seqüências de aminoácidos presentes nos peptídeos selecionados dispostas de acordo com a respectiva seleção biológica. Em cada subgrupo alinhado foram apresentadas as seqüências consenso (SC) em negrito e a freqüência individual de cada peptídeo assim como a freqüência da seqüên-cia consenso na subopulação. Desta forma, as letras em negrito denotam resíduos conservados e os aminoácidos sublinhados denotam os aminoácidos alifáticos.

As seqüências consenso foram alinhadas e CARACTERIZADAS na Tabela 4. Oito grupos de peptídeos formaram seqüências consenso por alinhamento múltiplo, sendo os motivos NxxxKxxL (SC1), TPDKS (SC2), PxxKxH (SC3), LHS (SC4), LHxxL (SC5), HTS (SC6), PxFF (SC7), e LYGS (SC8). Os motivos mais freqüentes nas subpopulações selecionadas foram PxxKxH, NxxxKxxL e HTS, sendo 68,2%, 65% e 42%, respectivamente. O Motivo TPDKS, contendo as seqüências sobrepostas, TPDKS em 7 peptídeos, apresenta as seqüências consenso TPD, TPxK, TPxxS sendo constituídas de 4 peptídeos cada. Nestas seqüências, os aminoácidos TP ao longo de 7 clones distintos foram mantidos constantes. O Motivo consenso foi considerado quando ocorreu três ou mais vezes em clones distintos. Estas análises demonstraram a existência de peptídeos dentro de uma mesma subpopula-ção submetida a uma seleção por imunoafinidade a um alvo biológico.

As similaridade entre as seqüências consenso com as proteínas do Boophilus mi-croplus depositadas no GenBank foi determinada pelo programa FASTAcom (Tabela 5). Nesta tabela, foi deteminado, em ordem sequencial, o número identificador da sequência similar para cada sequência consenso (No.), a posição do alinhamento do peptídeo com o motivo protéico da proteína original (Pos), o número de acesso (N° Acesso) e o nome da proteína. O alinhamento revelou similaridades dos motivos com várias proteínas antigênicas e ainda, proteínas com funções celulares importantes. O número mínimo de identidade foi de três aminoácidos para cada consenso. Para o motivo TPDKS, no alinhamento foi considerada a presença de no mínimo três identidades exatas, pois o motivo completo não gerou alinhamento. Apenas a seqüência consenso PxxKxH, não apresentou similaridade, possivelmente devido ao fato de os peptídeos terem sido selecionados de bibliotecas Ph.D.-C7C e, desta forma, poderia representar uma estrutura conformacional de proteínas do carrapato, não sendo possível a determinação por alinhamentos lineares. Outra hipóste é que a sequência da proteína similar ainda não foi determinada e, consequentemente, ela não foi depositada no banco de dados. A sequência consenso NXXXKXXL estava alinhada com as proteínas: Metaloprote-ase de glândula salivar, Receptor associado à proteína G, Calreticulina, Glutationa S-transferase e Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase. O consenso TPDKS alinhou com pelo menos três aminoácidos das proteínas: Catepsina de ovo, Bm95, Precursor de GP80, Cista-tina intracelular, Proteina intestinal Bm86, Fosfolipídeos, Metaloprotease de glândula salivar, Precursor de proteína tipo catepsina, Paramiosina, Calreticulina, Antigeno B da membrana, P450 CYP319A, Proteinase aspártica ligante de heme, Proteína tipo transcripitase reversa e Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase. A sequência LHS alinhou apenas com uma Proteína de secreção e uma P450 CYP319A. O consenso LHXXL apresentou os seguintes alinhamentos: Acetilcolinesterase, Precursor de GP80, Proteina intestinal Bm86, Paramiosina, P450 CYP319A1, Esterase e Enzima conversora de angiotensinogênio. O consenso HTS alinhou com a proteína Precursora de GP80 e Antigeno protetor 4D8. O consenso PXFF alinhou com a Subunidade 1 da citocromo oxidase, subunidade 2 da NADH desidrogenase 2 e Citocromo P450. Finalmente, o consenso LYGS alinhou com Acetilcolinesterase, Catepsina de ovo, Precursor de GP80, Isoforma de glicose 6-fosfato desidrogenase, Actina, Metaloprotease de glândula salivar, Ferritina, Antigeno B da membrana, Acetilcolinesterase, esterase, Proteinase aspártica ligante de heme, Citocromo P450, Proteína relacionada à carboxi-lesterase, Citocromo P450 4W1 e Enzima conversora de angiotensina. A sequência consenso PXXKXH não gerou alinhamentos com proteínas depositadas em bancos de dados. Isto possivelmente se deve ao fato de a estrutura conformacional da molécula não permitir alinhamentos apenas com a estrutura linear.

Em conclusão, esta análise demonstra que os peptídeos isolados apresentam resíduos críticos que apresentam identidade e conservação nos quais eles poderiam mimetizar a estrutura e a função dos epítopos originais existentes nas proteínas do B. microplus. TABELA 4 *Letras em negrito denotam resíduos conservados. **seqüência inversa ao peptídeo IDPLMFKYWSNM Sublinhado = Aminoácidos alifáticos Com o objetivo de calcular a similaridade entre uma população de peptídeos e um grupo de seqüências de proteínas, foi utilizado para as análises de alinhamento múltiplo o programa FastaScan (http://relic.bio.anl.aov/fastaskan.asDx)· O resultado gerou uma lista de proteínas classificadas em ordem decrescente de similaridade com os peptídeos. Os escores foram gerados pelo cálculo da similaridade de cada seqüência peptídica ao longo da seqüência protéica. Na Tabela 6, as 206 proteínas de B. microplus descritas No GenBANK foram classificadas de acordo com a similaridade com a população total (107) de peptídeos. Na tabela, foram indicadas apenas as dez proteínas com os maiores índices de similaridade. Na Tabela 7, foi realizada a mesma análise, sendo feita a divisão das subpopulações de peptídeos selecionados, de acordo com as sete estratégias de seleção adotadas, e classificadas em ordem decrescente de similaridade sendo, neste caso, representado apenas a proteína com maior índice de similaridade para cada estratégia de seleção.

Posteriormente, foi investigada a presença de similaridade entre os peptídeos e as proteínas depositadas no GenBank, restritas ao carrapato bovino Boophilus microplus. Para a análise foi utilizada a função “Search for Short Nearly Exact Matches” através da matriz PAM30 do programa de software BLAST. Os aminoácidos similares em quatro ou mais AA idênticos dentro da seqüência peptídica foi determinada como mimetopo das seqüências protéicas correspondentes.

Na Tabela 8 os alinhamentos foram classificados em ordem decrescente de fre-qüências de peptídeos mimetopos. Nesta Tabela, a primeira coluna representa o ranque em ordem decrescente das proteínas depositadas no GenBank contendo os motivos similares aos peptídeos selecionados. Na terceira coluna é apresentada a relação do número de peptídeos similares as proteínas (mimetopos) e na quarta coluna o número de alinhamentos. Foram alinhadas sessenta e seis proteínas distintas referentes ao B. microplus. Foram destacadas as três proteínas que mais contêm motivos protéicos similares aos peptídeos sendo mais freqüentes as metaloproteases de glândula salivar, as proteínas Notch-símile e a precursora de GP80. As proteínas que apresentaram as maiores correspondências em ordem decrescente foram as proteínas Notch-símile, proteína precursora da proteína GP80 e as metaloproteases de glândula salivar.

Como foi demonstrado neste exemplo, através do uso de métodos de análises de bioinformática, os clones de fagos e as proteínas de B. microplus. foram CARACTERIZADOS de acordo com a seqüência dos aminoácidos lineares, que são partes constituintes nestes peptídeos de fusão. Desta forma, foi possível a demonstração do perfil antigênico do B. microplus através da seleção de bibliotecas de Phage Display e estas análises revelaram o potencial da utilização destes peptídeos epítopos específicos como futuros candidatos a vacinas.

Exemplo 4: Estudo da especificidade de reatividade dos fagos selecionados.

Diversos estudos foram realizados para a validação dos clones através da análise da interação especifica entre os peptídeos selecionados e as IgYs de galinhas anti-proteínas de B. microplus. Primeiramente, foi realizada uma análise foi conduzida para caracterizar de imunorreatividade dos clones, antes e após sequenciamento, pelo uso da metodologia Pha-ge-Elisa. A confirmação da imunorreatividade foi confirmada em ensaios de Dot Blot. A especificidade dos alvos peptídicos isolados foi confirmada por ensaios de inibição através do teste de Dot Blot. A confirmação da especificidade do inserto recombinante, no reconhecimento do anticorpo contra o peptídeo fusionado nas proteínas Plll do fago, foi determinada por Western Blot. Para a determinação da imunogenicidade, foram realizados ensaios de imunização de fagos em camundongos para detectar o reconhecimento deste soro imune contra as proteínas totais do carrapato. O teste de imunosseleção para determinação da resposta imune humoral contra os peptídeos isolados foi realizado bovinos infestados natu- ralmente com carrapatos. Em conclusão, a utilização dos testes de imunorreatividade para caracterização de especificidade dos clones contra o alvo biológico utilizado nas diversas seleções possibilitou a validação dos clones para o desenvolvimento de novos imunógenos para uma vacina potencial. A Figura 6 e a Figura 8 referem-se ao teste ELISA no qual foi determinada a imunorreatividade de 370 clones de fagos diluídos em sobrenadante de meio de cultura e obtidos na seleção S1. A imunorreatividade dos fagos foi determinada contra os soros de galinhas anti-proteínas de teleóginas (alvo biológico). Foi possível a escolha de 48 clones de fagos imunorreativos para o sequenciamento de DNA da região correspondente ao inserto (biblioteca Ph.D.-12mer).

Na Figura 7 foi representado o perfil de imunorreatividade de 48 clones, obtidos a-pós a estratégia de seleção S3 (bilblioteca Ph.D.-C7C). Os resultados avaliados por valores de índice ELISA foram significativos, embora com perfis diferenciados entre os fagos testados e os de controle (fago M13 selvagem). Neste experimento, o índice ELISA (IE) para os ensaios foi calculado realizando-se a divisão da densidade óptica (DO) pelo valor de cut off. O cut off foi calculado somando-se 2 desvios padrão à média da DO do fago M13 selvagem (negativos). Os valores de IE maiores que 1 foram considerados positivos e os valores de IE menores que 1 foram considerados negativos. É importante observar que nesta etapa os clones estão discriminados de acordo com uma numeração provisória e não representam a numeração final descrita na lista.

Na Tabela 9, foi apresentada uma compilação dos métodos utilizados para a caracterização dos clones obtidos Nos estudos de antigenicidade e imunogenicidade. Primeiramente, foi determinada a identidade das seqüências de aminoácidos selecionadas através do seqüenciamento de DNA dos insertos correspondentes (Seq. ID No.), o código de identificação destes clones nas placas de sequenciamento (Placa), bem como as suas respectivas freqüências observadas (FO) e freqüência relativa (Freq. %). Posteriormente, são apresentados sequencialmente os resultados dos testes de Fago-ELISA (PE-(IE), Dot Blot (D), Dot Blot Inibição (DC), Western blot (WB), imunizações em camundongos (IMU) e imunosse-leção em soro de bovinos (IMT).

Como apresentado na Tabela 9, a maioria das seqüências apareceu uma vez apenas, com exceção de algumas clones que sobrepuseram sobre os demais, tais como os clones Seq. ID No. 91(93,3%), Seq. ID No. 47 (48,5%), Seq. ID No. 75 (40,0%), Seq. ID No. 76 (40,0%), Seq. ID No. 80 (36,8%), Seq. ID No. 18 (29,7%), Seq. ID No. 1 (18,6%). Isto denota que os peptídeos mais frequentes apresentam maior afinidade na seleção pelo alvo biológico.

Para a confirmação da especificidade dos peptídeos, os testes foram realizados para detecção de imunorreatividade contra soros de galinhas previamente imunizadas com proteínas totais de larvas e adultos de B. microplus. No início deste estudo, as interações específicas foram determinadas através do teste Fago-ELISA (Tabela 9), Figura 8, Figura 9 e Figura 10. Neste teste, os fagos foram incubados com soro positivo, soro negativo e tampão, respectivamente. O índice ELISA para os ensaios foi calculado dividindo-se a densidade óptica (DO) pelo valor de cut off. O cut off foi calculado somando-se 2 desvios padrão à média da DO do fago M13 (controle negativo do fago sem inserto). Os valores de IE maiores que 1 foram considerados positivos e os valores de IE menores que 1 foram considerados negativos.Os resultados mostram que os peptídeos foram específicos para o alvo utilizado na seleção. A maioria dos resultados foi positiva embora com perfis diferenciados entre os fagos, sendo os valores superiores ao índice ELISA (IE). FIA = imunoensaio de campo, IE = índice ELISA, FO = frequência observada, WB = Western blotting, MU, imunização de cammundon-gos, D = Do-blotting, CD = dot-blotting competitivo, Hr = resistente a Holstein, Hs = sensível a Holstein, Nr = resistente a Nelore, Ns = sensível a Nelore, P = Positivo, N = Negativo, PF = Fracamente Positivo, FF = muito fracamente positivo.

Por esta metodologia, foi possível a confirmação da seleção por especificidade já que a maioria dos clones apresentou positividade (índice ELISA-IE maior que 1) e também, a identificação de alguns clones com maior ídice de reatividade quando comparado com os demais tais como, por exemplo, Seq. ID No. 12, Seq. ID No. 1, Seq. ID No. 7, Seq. ID No. 32, Seq. ID No. 3, 1Seq. ID No. 25, Seq. ID No. 56, Seq. ID No. 48 (Figura 8, Figura 9 e Figura 10). A Figura 8 apresenta o índice de reatividade dos clones selecionados na seleção S1; a Figura 9 mostra o índice de reatividade para os clones obtidos na seleção S2 e a Figura 10 mostra o índice de reatividde para os clones obtidos na seleção S3.

Além do teste Phage-ELISA, a imunorreatividade dos fagos foi também confirmada por ensaios de Dot Blot. Neste teste, as partículas virais foram adsorvidas em membrana de nitrocelulose recortadas em tiras e incubadas com anticorpos policlonais de galinhas específicos para proteínas de B. microplus. Os clones mais reativos foram descritos na Tabela 9 (coluna 7) e na Figura 11. Na Tabela 9, o sinal de reatividade foi alternado em valores quantitativos decrescentes (P = Positivo, N = Negativo, PF = Positivo Fraco, FF = Muito Fracamente Positivo). Na Figura 11, no teste de Dot Blot, o controle negativo (CN) foi representado pelo fago sem inserto M13 selvagem e está localizado na linha 7 e o controle positivo (CP) foi representado na linha 8, sendo esta a adsorção de proteínas totais de carrapato na membrana (Figura 11). Foi verificado por análises qualitativas que a maioria dos clones a-presentou sinal superior ao controle negativo, especialmente para as seleções S2 e S3. Estes dados confirmam o alto grau de positividade dos clones determinado por ELISA. Dentre os clones com maior reatividade estão: Seq. ID No. 9, Seq. ID No. 11, Seq. ID No. 17, Seq. ID No. 22, Seq. ID No. 25, Seq. ID No. 26, Seq. ID No. 27, Seq. ID No. 28, Seq. ID No. 40, Seq. ID No. 41, Seq. ID No. 47, Seq. ID No. 50, Seq. ID No. 67, Seq. ID No. 69, Seq. ID No. 70, Seq. ID No. 90.

Em um experimento de Western Blot, os fagos selecionados foram separados por SDS-PAGE e transferido para a membrana de nitrocelulose a fim de investigar se as IgYs purificadas poderíam reconhecer os peptídeos fusionados expressos nas proteínas PIII e PVIII dos clones de fagos (Figura 12, Figura 13, Figura 14 e Figura 15). A Figura 12 mostra os resultados do Western Blotting para clone de fago após a seleção S1 do experimento. A seta indica a posição da proteína III contendo peptídeo fusionado. São representadas bandas com intensidades variávies de sinal indicando, assim, o aumento do reconhecimento dos peptídeos selecionados pelos anticorpos anti-proteínas de carrapato. As Figuras 13 e 14 mostram os resultados do Western Blotting para os clones de fagos após a seleção S2 e S3, respectivamente. A Figura 15 mostra os resultados do Western Blotting para os clones de fagos obtidos após a seleção S4, S5 e S6. Nestas análises, a proteína Plll e a proteína PVIII, para as respectivas bibliotecas, na maioria dos clones, foram reconhecidas especificamente, em diferentes graus de intensidade, pelos anticorpos de galinhas anti-proteínas de carrapato. Os dados indicam que as proteínas Plll e PVIII contendo os peptídeos recombi-nantes podem ser reconhecidas de forma específica quando em comparação com o fago selvagem (M13) na região correspondente ao inserto.

Em ensaios de competição, as proteínas de carrapato em diferentes concentrações, inibiram a ligação das IgYs de galinhas aos clones de fagos adsorvidos em membranas de nitrocelulose por ensaios de Dot Blot (Figura 16, Figura 17 e Figura 18). Os resultados da inibição da imunorreatividade dos fagos obtidos em três estratégias de seleção (S2 e S3) são apresentados na Tabela 9. Os dados demonstram que quantidades crescentes de proteínas de carrapatos adicionadas ao soro interferem no reconhecimento das IgYs no reconhecimento dos fagos na membrana (vide Figura 16; clone Seq. ID No. 50). Estes dados indicam que os peptídeos selecionados expressos nos clones de fagos podem se ligar especificamente à IgY de galinhas e mimetizam os epítopos de B. microplus. Desta forma, foi possível provar a inibição da reatividade por ensaios de competição para os clones Seq. ID No. 12, Seq. ID No. 15, Seq. ID No. 18, Seq. ID No. 22, Seq. ID No. 26, Seq. ID No. 32, Seq. ID No. 47, Seq. ID No. 48, Seq. ID No. 50, Seq. ID No. 51, Seq. ID No. 69, Seq. ID No. 70. A imunização em animais foi realizada para verificar o potencial dos mimetopos como antígenos vacinais (Tabela 9, Figura 19 e Figura 20). A caracterização dos clones a-brangeu análises de reatividade cruzada do soro de camundongos imunizados com fagos obtidos nas sete seleções contra proteínas de B. microplus. Testes de ELISA foram realizados para a mensuração da resposta imune em camundongos para detecção de IgG no soro contra as proteínas totais de B, microplus através de imunizações com os clones de fagos. Vários fagos purificados foram utilizados para imunizar fêmeas de camundongos BALB/c através de injeção subcutânea. Os clones foram escolhidos de acordo com os seguintes critérios: frequência mais alta, reatividade com ELISA, Dot Blot, Western Blotting e reatividade diminuída nos ensaios de inibição. Cada imunização consistiu em aproximadamente 1012 PV (partículas virais) diluídas em TBS na ausência de adjuvantes. O tampão TBS e o fago M13 selvagem foram utilizados como controles negativos e as proteínas totais de B. microplus como controles positivos. Foram imunizados cinco animais por grupo de tratamento. As amostras de sangue foram coletadas a cada duas semanas de intervalo e o reforço nas semanas 2, 4, 6 e 8. Posteriormente, o título de anticorpos reativos contra as proteínas de B. microplus foi determinado por métodos ELISA para confimar a existência de mimeticidade entre os epítopos naturais e os peptídeos recombinantes isolados em fagos. O índice ELISA (IE) para os ensaios foi calculado dividindo-se a densidade óptica (DO) pelo valor de cut off. O cut off foi calculado somando-se 2 desvios padrão ao valor médio da DO do fago M13 selvagem (controle negativo do fago sem controle). Os valores de IE maiores que 1 foram considerados positivos e os valroes de IE menores que 1 foram considerados negativos. Os resultados demonstram que os peptídeos foram específicos para o alvo utilizado na seleção.

Embora com perfil diferenciado, a maioria dos resultados apresentou reatividade entre os soros, sendo os valores superiores ao índice ELISA (ΙΕ). O soro correspondente aos grupos imunizados com os fagos Seq. ID No.. 32, Seq. ID No. 26, Seq. ID No. 75, Seq. ID No. 25 e Seq. ID No. 15 apresentou o maior índice de reatividade entre os grupos testados.

Os efeitos de imunogenicidade e especificidade na resposta imune desenvolvidada por peptídeos sintetizados quimicamente, foram determinados por experimento de Dot Blot (Figura 12). O soro (Seq. ID No. 12) dos grupos de animais imunizados nos dias 0, 30 e 60 com o peptídeo sintético correspondente à seqüência Seq. ID No. 16 foi incubado com o próprio peptídeo adsorvido na membrana, o clone de fago Seq. ID No. 18 e o fago M13 selvagem. Foi constatado que o grupo de animais imunizados com o peptídeo sintético foi capaz de gerar uma resposta por anticorpos (IgG) de grau intermediário contra o próprio peptídeo adsorvido na membrana e também reagiu intensamente contra o peptídeo recombinante expresso na partícula viral. O fago M13 selvagem foi utilizado como controle negativo do vetor. O soro do dia zero (DO) foi utilizado como controle pré-imune. Estes resultados reforçam a capacidade imunogênica dos peptídeos sintetizados provenientes de seleções de bibliotecas expressas em fagos. Além disso, os fagos podem ser reconhecidos por soros de animais reativos a outras estruturas miméticas que não sejam o próprio fago utilizado na sensibilização do animal, confirmando, assim, o potencial de ratividade por imunidade cruzada.

Em função deste aspecto, foi proposta uma hipótese para verificar o potencial dos peptídeos recombinantes de serem reconhecidos por soros de animais infestados naturalmente. Por esta hipótese, poderia ocorrer a identificação de peptídeos com reatividade cruzada aos antígenos do carrapato pela verificação do reconhecimento sorológico, em testes de Dot Blot (Figura 22), destes animais submetidos à exposição natural em diferentes situações. Desta forma, um grupo de bovinos contendo oito animais da raça Holstein e oito animais da raça Nelore, foi infestado naturalmente com larvas de carrapatos, sob condições controladas. Após o tempo determinado para obtenção de infestação significativa, o soro de quatro animais foi coletado e preparado, sendo dois soros da raça Holstein e dois soros da raça Nelore. Para cada raça foi escolhido um animal com alta contagem de carrapatos e outro com baixa contagem. Foi utilizado como controle negativo o fago M13 selvagem representando o controle do vetor e as proteínas totais de B. microplus como controle positivo.

Os resultados demonstram perfis diferenciados No reconhecimento dos clones de fagos pelas IgGs do soro para quatro tratamentos (Figura 22): O clone Seq. ID No. 2 foi reconhecido exclusivamente pelo soro do animal Nelore com baixa contagem de carrapatos. Os clones Seq. ID No. 48, Seq. ID No. 51 e Seq. ID No. 93 foram reconhecidos predominantemente pelo soro dos animais Holstein. Os clones Seq. ID No. 32, Seq. ID No. 47, Seq. ID

No. 50, Seq. ID No. 67, Seq. ID No. 83, Seq. ID No. 92, Seq. ID No. 94, foram reconhecidos pelo soro dos quatro animais. Os clones Seq. ID No. 12, Seq. ID No. 15, Seq. ID No. 76, Seq. ID No. 75, Seq. ID No. 80 reagiram com maior intensidade tanto para os soros Holstein e Nelore com alta contagem de carrapatos como Nelore com baixa contagem de carrapatos. Os clones Seq. ID No. 32, Seq. ID No. 47, Seq. ID No. 67, Seq. ID No. 75, Seq. ID No. 76, Seq. ID No. 80, Seq. ID No. 82, Seq. ID No. 83, Seq. ID No. 92, Seq. ID No. 80 reagiram com maior intensidade com o soro dos animais Holstein com alta contagem de carrapatos. Os clones Seq. ID No. 12 e Seq. ID No. 15 reagiram mais intensamente com o soro dos a-nimais Nelore com alta contagem de carrapatos.

Estes resultados corroboram a hipótese de que os clones apresentam reatividade cruzada e mimetizam estruturas protéicas que são partes constituintes de órgãos específicos da parasita que poderíam entrar em contato com o hospedeiro em infestações naturais e desencadearem resposta imune humoral, produzindo os assim-chamados antígenos expostos. Por outro lado, os clones os quais não apresentaram reatividade poderíam constituir antígenos ocultos devido ao não reconhecimento destes clones por soros de animais naturalmente infestados por carrapatos. Foi verificada ainda a ocorrência de reatividade entre as raças e também entre animais com maior contagem de carrapatos. Isto pode estar relacionado com o grau de exposição do hospedeiro frente ao parasita e devido ao fato de os soros destes animais apresentarem maior reatividade com os mimetopos selecionados neste trabalho.

Exemplo 5: Reatividade de anti-soros produzidos pela imunização dos peptídeos obtidos na seleção S2 em camundongos e bovinos.

Esse exemplo se refere à confirmação adicional acerca da imunogenicidade dos peptídeos obtidos na seleção S2 por ensaios de imunizações em camundongos.

Aos doze dias, após a primeira imunização, alguns camundongos não responderam à imunização: 1 animal do clone Seq. ID No. 19, 1 animal do clone Seq. ID No.32, 1 animal do clone Seq. ID No. 37,1 animal do fago M13 selvagem e 1 animal do controle PBS (Tabela 10). A Tabela 11 evidencia os níveis de anticorpos nos soros de camundongos contra os peptídeos mimetopos fusionados ao fago, fago M13 selvagem, pool de fagos e PBS, calculados pelo teste de ELISA, nos dias 12 e 19 após a primeira imunização.

Os animais imunizados com o clone Seq. ID No. 26 foram os que responderam com o maior IE, sendo estatisticamente diferente dos outros peptídeos, do fago M13 selvagem e do PBS. A resposta dos camundongos imunizados com o clone Seq. ID No. 18 era diferente estatisticamente do Seq. ID No. 26, do fago M13 selvagem e do PBS, apresentando o segundo maior IE.

Aos dezenove dias após a primeira imunização, e sete dias após a segunda imunização, 1 animal do clone Seq. ID No. 21 e 1 animal do PBS não responderam. Os clones mais reativos foram a Seq. ID No. 22, que foi estatisticamente diferente de todos os outros, exceto pela Seq. ID No. 41, que foi estatisticamente diferente de todos os outros exceto da Seq. ID No. 22, Seq. ID No. 18 e do pool, o pool que foi estatisticamente diferente da Seq. ID No. 22, do fago M13 selvagem e do PBS, o fago M13 selvagem que foi diferente estatisticamente da Seq. ID No. 22, Seq. ID No. 41 e do Pool e o PBS foi estatisticamente diferente da Seq. ID No. 18, Seq. ID No. 22, Seq. ID No. 41 e do pool.

Entre os dias 12 e 19 após a imunização, houve diferença estatística para os peptí-deos: Seq. ID No. 21, Seq. ID No. 22, Seq. ID No. 26, Seq. ID No. 41 e o pool. Para os pep-tídeos Seq. ID No. 22, Seq. ID No. 41 e pool foi observado um aumento do IE e para os pep-tídeos Seq. ID No. 21 e Seq. ID No. 26 ocorreu uma diminuição do IE. A Tabela 11 reforça a reatividade cruzada pela reatividade dos anticorpos no soro de camundongos gerados pela imunização com peptídeos fusionados ao fago, fago selvagem, pool de fagos, PBS, que mostrou a reatividade deste soro contra as proteínas totais de larvas de carrapato. Esse experimento foi realizado pelo teste de ELISA, dezenove dias a-pós a primeira imunização. Os soros dos animais imunizados com o peptídeo Seq. ID No. 18, que foi estatisticamente diferente da Seq. ID No. 41, do fago M13 selvagem e do PBS, foi o que apresentou maior reatividade contra proteínas totais de larvas de carrapato (Tabela 11).

Tabela 10 Os dados são médias ± desvio padrão.

Letras maiúsculas diferentes na mesma linha representam diferença estatística entre os dias de coleta.

Letras minúsculas diferentes na mesma coluna representam diferença estatística entre os grupos experimentais.

Para a comparação entre os dias de coleta foi utilizado o teste t-Student com o nível de significância de 5%.

Para a comparação entre os grupos experimentais foi utilizada a análise de variân-cia, e quando houve diferença significativa, foi usado o teste de comparação múltipla Stu-dent Newman-Keuls com o nível de significância de 5% (P< 0,05) Tabelai 1 Os dados são médias ± desvio padrão.

Letras maiúsculas diferentes na mesma linha representam diferença estatística entre os dias de coleta.

Letras minúsculas diferentes na mesma coluna representam diferença estatística entre os grupos experimentais.

Para a comparação entre o dia de coleta 19 dos peptídeos com o antígeno total, foi utilizado o teste t-Student com o nível de significância de 5%.

Para a comparação entre os grupos experimentais foi utilizada a análise de variân-cia, e quando houve diferença significativa, o teste de comparação múltipla Student Newman-Keuls com o nível de significância de 5% (P< 0,05).

Doze dias após a primeira imunização (Tabela 12), os soros dos dois bovinos imunizados com o pool não foram reativos aos peptídeos Seq. ID No. 19, Seq. ID No. 20, Seq. ID No. 21, Seq. ID No. 22 e um dos bovinos não respondeu ao Seq. ID No. 37, pool, M13 selvagem e PBS. Os clones mais reativos foram os seguinted: Seq. ID No. 41, que foi estatisticamente diferente da Seq. ID No.19 e Seq. ID No. 21, Seq. ID No. 26 e Seq. ID No. 18, que não diferiram estatisticamente dos outros clones, do fago M13 selvagem, do pool e do PBS (Tabela 12). A Tabela 12 apresenta os níveis de anticorpos calculados pelo teste de Elisa, no soro de bovinos imunizados com o pool de peptídeos contra cada um dos peptí-deos fsionados ao fago, o pool de fagos, o PBS e dos bovinos imunizados com o fago selvagem contra o próprio fago M13 selvagem, nos dias 12 e 19 após a primeira imunização.

Os clones mais reativos dos bovinos foram os seguintes: Seq. ID No. 18, Seq. ID No. 26 e Seq. ID No. 41. Estes três primeiros peptídeos não diferiram estatisticamente entre si, mas foram diferentes em relação aos outros, com exceção da Seq. ID No. 41. Entre os dias 12 e 19 após a imunização, houve diferença estatística apenas para o peptídeo Seq. ID No. 21, em que houve um aumento do IE.

Tabela 12 Os dados são médias ± desvio padrão.

Letras maiúsculas diferentes na mesma linha representam diferença estatística entre os dias de coleta.

Letras minúsculas diferentes na mesma coluna representam diferença estatística entre os grupos experimentais.

Para a comparação entre os dias de coleta foi utilizado o teste t-Student com o nível de significância de 5%.

Para a comparação entre os grupos experimentais foi utilizada a análise de variân-cia, e quando houve diferença significativa, o teste de comparação múltipla Student New-man-Keuls com o nível de significância de 5% (P< 0,05). O índice Elisa foi calculado tal como para os camundongos. A similaridade dos peptídeos selecionados, Seq. ID No. 18, Seq. ID No. 26, Seq. ID No. 22 e Seq. ID No. 41 com as proteínas do carrapato B. microplus depositadas no Gen- BanK (http://www.ncbi.nlm.gov) foi avaliada e demonstrou-se que, dentre as quatro proteínas alvo alinhadas, a calreticulina foi a que obteve maior número de alinhamentos, incluindo 3 dos 4 peptídeos acima citados.

Os bovinos desafiados doze dias após a primeira inoculação, não apresentaram, 24 dias após a primeira infestação, carrapato entre 4,5 e 8,0 mm. Sabe-se que para um animal susceptível, a proporção de larvas que consegue fixar-se nele e completar o ciclo é de 20% (WILLADSEN et al., 1977, citado por VERÍSSIMO, 1990).

Pelo teste de oviposição (Figura 21) foi verificado alterações no aspecto morfológi-co das teleóginas no grupo de tratamento (A) quando comparado ao grupo de controle (B). As teleóginas apresentaram uma coloração enegrecida sugerindo lesões hemorrágicas. Foi verificada também a redução visual da massa de ovos postos no grupo de tratamento quando comparado ao controle.

Concluindo, este Exemplo mostra que: Obteve-se a resposta imune em camundon-gos e bovinos contra os peptídeos selecionados; Bovinos infestados não apresentaram quantidade de carrapatos de tamanho entre 4,5 e 8,0 mm para contagem; Peptídeos que conferiram resposta imune com o títutlo mais alto de correspondendo com a proteína calreticulina.

Dos exemplos apresentados acima, pode se concluir que os mimetopos obtidos para proteínas totais do B. microplus, através das seleções por Phage Display apresentaram resultados promissores para o desenvolvimento de uma vacina. Depois de três ciclos de seleção, com exceção do experimento S4 que ocorreu em quatro seleções, os clones foram caracterizados por validação. O número de ufc obtido após cada ciclo de seleção conferiu enriquecimento, indicando, assim, a eficácia do processo. Foi possível identificar 107 sequências distintas entre 286 sequências viáveis obtidas No seqüenciamento de DNA. As se-qüências de aminoácidos deduzidas foram analisadas usando-se diferentes metodologias de bioinformática gerando, assim, motivos importantes. Pelos testes de imunorreatividade, foi possível a caracterização da especificidade dos mimetopos. A imunização com os mimetopos em camundongos confirmou a reatividade cruzada contra as proteínas do carrapato. Pelo teste de imunosseleção, foram confirmadas a reatividade cruzada e a identificação de perfis diferenciados de reatividade entre as raças no reconhecimento dos clones de fagos pelas IgGs do soro de animais infestados naturalmente. Ainda, após o desafio em bovinos foi verificado grau significativo de lesões nos tecidos de teleóginas após o parasitismo em animais inoculados com os fagos recombinantes. Foi verificada ainda, a inexistência de fêmeas desprendidas contendo entre 4,5 e 8,0 mm. Estes resultados representam um avanço em direção à obtenção de novos imunógenos para a preparação de uma nova vacina. A presente invenção demonstra a existência de um fator de dano gerado contra o parasita conforme evidenciado pelos resultados apresentados. Estes resultados validam os clones como importantes candidatos para epítopos de antígenos vacinais candidatos de B. microplus e demonstram a grande importância desta invenção no campo de vacinas. A presença de uma ferramenta molecular que direcione o desenvolvimento de uma vacina poliimunogênica baseia-se na utilização de um grande número de dados baseados em seqüências peptídicas. Neste trabalho, foram geradas 107 seqüências distintas representando diferentes epítopos do carrapato bovino. Estas seqüências representam um banco de epítopos selecionados pela interação imune com anticorpos que reconhecem proteínas totais no estádio de larvas e teleóginas do B. microplus pronto para ser testado em diferentes formulações.

Uma possível hipótese aqui estabelecida é baseada no fato de que estes peptídeos podem representar diferentes epítopos com graus variados de importância para a geração de resposta imune em bovinos. Desta forma, alguns destes peptídeos foram submetidos a ensaios de imunizações de camundongos e bovinos para avaliar a imunogenicidade, característica essencial para vacinas, embora a maioria absoluta tenha mostra reatividade antigê-nica para reconhecedores de proteínas de B. microplus através de testes imunoquímicos. Assim, o objeto da presente invenção certamente será aperfeiçoado ou modificado, sem se desviar do conceito e escopo da invenção, que está limitada somente ao teor das reivindicações apensas.

As vantagens da presente invenção, que se refere ao desenvolvimento de imunó-genos para o controle do carrapato bovino, são: 1) Uma vacina, com potencial para o controle do carrapato, baseada na expressão em vetores ou na síntese química; 2) Alto nível de pureza porque sua produção não envolve processos de purificação complicados; 3) Completa caracterização do antígeno; 4) Segurança devido à ausência de contaminantes. 5) Reprodutibilidade em média escala. 6) Alta estabilidade em função do sistema de expressão ou síntese química, tornando-o mais adequado para a armazenagem; 6) Baixo custo de produção em escala industrial em função do fago apresentar reprodução ilimitada e purificação simplificada. O valor social e comercial da presente invenção é de grande importância, pois o conhecimento de uma forma de controle eficaz desses parasitas é fundamental para a formulação e aplicação do saneamento animal, no uso adequado dos métodos de controle já conhecidos, assim como para o desenvolvimento de novas ferramentas de controle. Por outro lado, a ausência ou inexatidão deste conhecimento compromete seriamente a eficácia de estratégias de controle destes parasitas, aumenta o desperdício de recursos públicos, elevan o custo de produção agropecuária e expõe as populações rurais à diminuição da renda em função da baixa produtividade.

Neste cenário, o conhecimento de uma forma de controle eficaz através de vacinas representa um avanço substancial para os consumidores. Já que está forma é isenta de resíduos, ela aperfeiçoará a qualidade do alimento e favorecerá assuntos segurança alimentar e questões ambientais.

Para melhor compreensão dos exemplos utlizados, segue abaixo uma descrição detalhada dos procedimentos experimentais adotados.

Os peptídeos mimetopos foram obtidos através da utilização da metodologia de seleção biológica por bibliotecas de fagos filamentosos Phage Display. A técnica é uma forma de seleção em que uma biblioteca de peptídeos ou proteínas com as seqüências aleatórias são expressas No exterior da partícula viral, enquanto o material genético codificador para cada resíduo encontra-se no genoma viral. Sendo assim, é possível a correlação entre cada seqüência da proteína variante e sua respectiva seqüência de DNA, com o qual permite rápida caracterização baseada na afinidade de ligação para uma molécula alvo.

Inicialmete, a realização da seleção biológica por imunoafinidade requer a produção de anticorpos policlonais anti-proteínas de B. microplus para a seleção dos peptídeos expressos nas bibliotecas de Phage Display. Neste processo, os alvos biológicos foram as IgYs policlonais de galinhas obtidas por imunizações com extrato protéico total dos estágios de larvas e teleóginas de B. microplus. O inóculo a ser utilizado nas imunizações é obtido por extração das proteínas totais de larvas de B. microplus por maceração em nitrogênio líquido e acrescentado éter etílico para o desengorduramento das proteínas durante 18 horas. Depois foi adicionado tampão de extração (40mM de Hepes pH 7,4, de 10mM EDTA, 2mM de EGTA, 1mM de DTT, 1mM de Benzamidina, 0,5mM de PMSF) ao macerado e centrifugado por 40 minutos a 4.000g. O sobrenadante foi coletado e dialisado extensivamente em solução salina equantificado. O perfil protéico foi medido por SDS-PAGE (10%).

Foram utilizadas para a imunização, galinhas de três semanas de idade, da raça White-Leghorn. O esquema de imunização foi o descrito por Barbas et al., 2001, com algumas modificações. A primeira dose de 200 pg e as três doses subseqüentes contendo proteínas totais de B. microplus foram administradas por via intramuscular em intervalos de 14 dias para cada dose. A primeira dose continha adjuvante completo de Freund (Sigma Chemical Co, US) e as doses subsequentes continham adjuvante incompleto de Freund (Sigma). Os animais imunizados foram sangrados a partir da terceira dose e avaliados quanto à produção de anticorpos pelo método ELISA.

Para o Ensaio Imunoenzimático (ELISA), placas de microtitulação de alta afinidade (NUNC) foram sensibilizadas com 10 pg de proteínas totais de carrapato, diluídas em tam- pão de carbonato/bicarbonato, durante toda a noite a 4°C. Em seguida, as placas foram bloqueadas com PBST a 5%, para adição das amostras de soro das galinhas antes e após as imunizações e incubadas por 60 minutos a 37°C. Após esse período, as placas foram lavadas, seguido por adição de anticorpos secundários (IgG de coelho anti-lgY de galinha) diluído em Blotto a 5%, durante 60 minutos. O conjugado imunoenzimático [IgG de cabra anti-IgG de coelho ligado à peroxidase (Sigma Chemical Co., US)] foi diluído em Blotto a 5% e incubado a 37°C por 60 minutos. A ligação específica foi revelada pela adição de substrato enzimático contendo o-fenilenodiamino (OPD). Após 15 minutos, a reação foi interrompida com ácido sulfúrico e efetuada a leitura a 492 nm em leitor de microplaca (Flow Titertek Mul-tiskan Plus - US).

Após a observação de título satisfatório, o sangue e também os ovos das galinhas inoculadas com antígenos foram coletados para a obtenção de imunoglobulinas policlonais.

As IgYs específicas para proteínas de carrapatos adultos (teleóginas) foram obtidas a partir dos ovos e foram então concentradas inicialmente pelo método de diluição em água e, posteriormente, precipitadas com sulfato de amônio. Realizou-se em seguida a cromato-grafia em DEAE-Sephacel (tampão 0,02M de Tris-HCI, pH 4,5) e as frações contendo IgY foram liofilizadas e armazenadas a 4°C. A purificação de IgY do soro de galinha foi realizada com o uso da coluna HiTrap IgY Purification HP, 5 mL (Amersham Biosciences). A bomba peristáltica foi preenchida com tampão de eluição (Na2HP04 20 mM, pH 7.5), e então conectada à coluna. A coluna foi lavada com 5 volumes (25,0 mL) de cada tampão: ligação (Na2HPO420 mM, K2SO40,5 M, pH 7.5), eluição e limpeza (Na2HP04 20 mM, 30% volume/volume de isopropanol, pH 7,5). Em seguida a coluna foi equilibrada com 5 volumes e tampão de ligação, e então a amostra foi injetada (6,0 mL de soro). A coluna foi lavada com 10 volumes da mesma (50,0 mL) de tampão de ligação. As IgYs foram então eluídas com 10 volumes da coluna de tampão de eluição, sendo coletadas amostras de 1,0 mL que foram quantificadas no espectrofotômetro à 280 nm. A coluna foi regenerada com 8 volumes (40,0 mL) de tampão de limpeza, e reequilibrada com 5 volumes de tampão de ligação. À medida que as amostras eram filtradas na coluna de purificação, as leituras ópticas (OD 280r1m) das alíquotas eram obtidas.

Para diálise das amostras obtidas foi utilizada uma membrana de celulose Fisher-brand® (tubo de diálise de celulose regenerada). As amostras purificadas foram colocadas em tubos de diálise (tubos 1 a 8), concentradas em sacarose por 1 hora a 4°C e em seguida dialisadas em PBS (Solução tampão fosfato salina: NaC1137 mM, KCI 2,7 mM, Na2HP0412 mM, KH2P041,2 mM, pH 7.4) por 12 horas a 4°C. As amostras foram quantificadas no espectrofotômetro à 280nm.

Para averiguar a qualidade das amostras de IgYs purificadas foi utilizado SDS-PAGE (16%). O tampão da amostra continha 1% de SDS, 1% de Tris pH 6,8, azul de bro- mofenol a 0,02% e 20% de glicerol, contendo ou não agentes redutores. A corrida de eletro-forese foi realizada em temperatura ambiente com tampão superior 0,1M de tris, 0,1 M de Tricina e SDS a 1% e com tampão inferior 0,2 M de Tris-HCL, pH 8,9, até a saída dos indicadores, em 100V. Após a corrida, o gel de poliacrilamida foi colocado em uma solução de azul de Coomassie R-250 como corante de proteínas. A análise de Western Blotting das proteínas totais, a eletroforese (SDS-PAGE, 16%) e a eletrotransferência das proteínas em membrana de nitrocelulose (Sigma Co., US) foram realizadas de acordo com as técnicas descritas por Sambrook, et al. (Cold Spring Harbor, p.18. 60-18.75,1989)), com algumas modificações. A membrana de nitrocelulose foi bloqueada por Blotto a 5% e incubada com os anticorpos purificados (IgY) diluídos em Blotto a 5% durante toda a noite a 4°C. Anticorpos de coelhos anti-lgY (Sigma Chemical Co., US) diluídos em Blotto a 5% foram incubados em temperatura ambiente durante duas horas. Por fim, anticorpos de cabra anti-lgG de coelhos marcados com fosfatase alcalina foram incubados durante 2 horas em temperatura ambiente e a reatividade específica foi determinada pela adição de substrato NBT/BCIP.

Desta forma, a próxima etapa foi a seleção de peptídeos recombinantes através de bibliotecas combinatoriais construídas a partir de fagos. Os fagos filamentosos (M13, f 1, fd, entre outros) pertencem à família Inoviridae de bacteriófagos e possuem como material genético DNA de fita simples (ssDNA). Para a obtenção dos mimetopos de B. microplus, foram utilizadas seis bibliotecas distintas, construídas a partir destes fagos filamentosos, compreendendo 3 vetores diferentes (M13, fUSE e f88.

Foram utilizadas 4 bibliotecas compreendendo os vetores f88 (f88 15 mer, f88 cys 3, f88 cys 6) e o vetor fUSE (fUSE 6 mer), cedidas gentilmente por Smith, sendo os peptídeos das bibliotecas f88 15 mer, f88 cys 3, f88 cys 6 expressos na PVIII e os peptídeos da biblioteca fUSE 6mer expressos na plll. Os vetores F88 15 mer e fUSE expressam peptídeos lineares e os vetores f88 cys expressam peptídeos cíclicos.

As outras duas bibliotecas foram compradas da empresa New England Biolabs. As bibliotecas são compostas por peptídeos aleatórios seguidos por uma curta seqüência es-paçadora Gly-Gly-Gly fusionada à região N-terminal da proteína capsídica menor (Proteína III) de bacteriófagos M13 filamentosos. A biblioteca Ph.D.12 mer e a biblioteca Ph.D.7 cys apresentam 12 e 7 peptídeos aleatórios, respectivamente. A biblioteca Ph.D.7cys contém petídeos cíclicos enquanto a Ph.D.12mer são linearizados pela delimitação por cisteínas nas extremidades peptídicas. Estas bibliotecas consistiam em aproximadamente 2,8 x 1011 clones independentes, os quais representam as 1,9 x 109 possíveis combinações contidas nos resíduos de aminoácidos. Todas as cinco cópias da Proteína III capsídica dos fagos, contêm peptídeos aleatórios amino-terminais (NOREN & NOREN METHODS. V. 23, pp. 169-178, 2001).

Na seleção biológica foram utilizadas sete estratégias distintas conforme a seguinte classificação: Estratégia 1: Os anticorpos policlonais de galinhas foram submetidos a uma purificação por afinidade com imunógeno de acordo com as técnicas descritas por SAMBROOK et al., (1989), com algumas modificações. O extrato protéico de carrapato foi adsorvido em uma membrana de nitrocelulose (Ge Healthcare,) durante todo a noite a 4°C e posteriormente bloqueada por leite em pó 5%, durante 1 hora à temperatura ambiente. A membrana contendo as proteínas foi incubada com a fração parcialmente purificada de IgY durante toda noite a 4°C e posteriormente lavadas com PBST (uma vez) e mais três vezes com PBS, monitoradas em leitor de espectrofotômetro no final da lavagem para investigar a liberação de proteínas da membrana. Os anticorpos foram eluídos com 100mM de glicina pH 2,8, e imediatamente após a eluição, foram neutralizados por 100mM de Tris pH 8.0 e a concentração do eluído foi estimado por espectrofotometria (OD 280). Desta forma, com o objetivo de aumentar a especificidade da seleção dos peptídeos, as IgY policlonais utilizadas na seleção foram purificadas por afinidade contra as proteínas totais do parasita pela eluição da fração ligante. Por este método, apenas IgYs específicas para o carrapato foram submetidas à seleção contra a biblioteca de peptídeos aleatórios.

Foram adsorvidos no orifício de uma placa de microtitulação de 96 poços (Maxisorp - Nunc) 150 UI de IgY policolonal anti-proteína total de teleóginas purificadas por afinidade com o imunógeno (100 pg/mL em 0,1 M NaHC03, pH 8,6) e incubadas durante a noite a 4°C em um recipiente contendo papel toalha umidificado. A placa foi bloqueada com 250 pg de um tampão de bloqueio (0,1 M de NaHC03, pH 8,6, 5 mg/mL BSA) por 2 h, à temperatura de 4°C. A placa foi então lavada (seis vezes) com TBST (TBS contendo 0,1% de Tween-20 v/v), e foram acrescentados nos orifícios da placa 4 x1010 fagos da biblioteca Ph.D.12 mer (New England Bioloabs) diluídos em 100 pL de TBST e mantido sob agitação por 1 h à temperatura ambiente. Fagos não ligantes foram removidos por lavagem dos orifícios da placa por dez vezes com TBST (Tween-20 a 0,5%) no primeiro ciclo e nos ciclos subse-qüentes com TBST (Tween-20 a 0,5%). Os fagos ligantes foram eluídos com 100 pL do tampão de eluição (0,2 M de glicina-HCI, pH 2,2, contendo 1 mg/mL de BSA) por 10 min à temperatura ambiente e imediatamente neutralizados com 15 pL do tampão de neutralização (1 M de Tris-HCI, pH 8,0). Alíquotas dos fagos eluídos foram utilizadas para a determinação da do título. O eluato remanescente contendo fagos foi utilizado para a reamplifica-ção, no ciclo seguinte, por infecção com E. coli ER2738. Foram realizados três ciclos para o enriquecimento dos fagos contendo os peptídeos ligantes.

Estratégia 2: Neste processo, foi utilizado a mesma biblioteca e o mesmo processo de seleção descrito anteriormente, exceto pela alteração do alvo biológico por adsorção em placas de ELISA de IgYs policolonais anti-proteínas totais de larvas de carrapato de B. mi- croplus purificadas por afinidade com imunógeno.

Estratégia 3: O processo foi semelhante ao anterior exceto pela utilização da biblioteca Ph.D.7 cys (New England Biolabs). A seleção ocorreu como na estratégia 1, exceto pela eluição competitiva e os anticorpos policlonais, como alvo biológico para seleção, que não foram purificados por afinidade com o imunógeno.

Estratégia 4: Foi utilizada uma biblioteca linear f88 15 mer. Placas de microtitulação (NUNC MAXSORP) foram sensibilizadas com estreptovidina por 1 h 37°C e posteriormente bloqueadas por Blotto a 37°C durante 1 h. As IgYs anti larvas de B. microplus e também as IgYs pré-imunes como controle negativo de larvas foram conjugadas com biotina. Após 3 lavagens da placa com TBST, as IgYs purificadas de soro pré e pós-imune de animais imunizados com proteínas de larvas de carrapato foram adicionados aos orifícios por 2 h em temperatura ambiente, sob agitação. Após seis lavagens com TBST, foi realizada a pré-adsorção da biblioteca contra as IgYs pré-imunes por 1 h a 37°C. O sobrenadante foi coletado e incubado posteriormente com as IgYs obtidas do soro pós-imune (alvo biológico). Foram realizadas quatro seleções para obtenção do enriquecimento da subpopulação de fagos.

Estratégia 5: A seleção foi efetuada conforme a estratégia 3, exceto pela utilização da biblioteca Cys 3. Para esta biblioteca, o título de entrada foi de 2x1012 PV na primeira entrada e 1x1012 PV nas demais entradas para o novo ciclo de seleção.

Estratégia 6: Foi utilizada a biblioteca conformacional f88 cys 6. Neste caso, anticorpos de coelhos anti-lgY foram adsorvidos em orifícios de uma placa de microtitulação (NUNC MAXISORP) durante 1 hora a 37°C e bloqueada posteriormente com TBSTB por 1 hora a 37°C. Após as lavagens com TBST, o soro dos animais pré e pós-imunes para as proteínas de larvas de carrapato foi adicionado aos orifícios separados para incubação por 2 h em temperatura ambiente, sob agitação. Após lavagem (6 vezes) com TBST, foi realizada a pré-adsorção da biblioteca contra as IgYs pré-imunes por 1 h a 37°C. O sobrenadante foi coletado e incubado posteriormente com as IgYs obtidas do soro pós-imune (alvo biológico). Foram realizadas tres seleções para enriquecimento da subpopulação de fagos.

Estratégia 7: Metodologia semelhante a utilizada na Estratégia 5 exceto pela biblioteca utilizada ser a fUSE 6mer.

Para as bibliotecas do tipo Ph.D.(New England Biolabs), durante e após a seleção por imunoafinidade, a caracterização dos clones selecionados foi efetuada através do sistema α-complementar. O vetor de fago utilizado contém o gene lacZ, permitindo, assim, que clones reativos sejam selecionados pela coloração das colônias (azuis positivas ou brancas negativas).

Para as titulações, foi feita uma mistura de fagos e bactérias em agarose na superfície. A dita mistura é plaqueada em meio LB contendo X-gal (40 pg/mL) e IPTG (0,5 mM).

Durante as etapas, uma pequena quantidade do eluato (10,0 pL) foi titulada e o titulante foi utilizado para reamplificação, realizada em 20,0 mL de cultura de E. coli (ER2537) em fase inicial de crescimento (OD6ooáO,3), contendo tetraciclina. A dita cultura foi incubada por 4-5 horas em agitador com temperatura a 37°C, antes do procedimento de precipitação dos fa-gos e posterior titulação. A cultura foi transferida para um tubo Oakridge (Hitachi, 50 mL) e centrifugada (10 min, 10.000 rpm). As células residuais foram descartadas e o sobrenadante transferido para um tubo limpo e então centrifugado. Foram pipetados 80% do sobrenadante para um tubo esterilizado onde foram adicionados 20% do volume de PEG/NaCI (20% peso/volume de Polietilenoglicol-8000, NaCI 2,5M, água), e a mistura permaneceu em repouso por 12 horas a4°C.

No dia seguinte, o precipitado foi centrifugado 15 minutos a 10.000 rpm à 4°C. O sobrenadante foi descartado e o tubo foi centrifugado brevemente, para que o sobrenadante residual pudesse ser removido. O precipitado foi ressuspendido em 1,0 mL de TBS, transferido para um microtubo e centrifugado por 5 minutos, 10.000 rpm a 4°C para precipitar os resíduos celulares. O sobrenadante foi transferido para um novo microtubo para a adição de PEG/NaCI (1/6 do volume). A mistura resultante foi incubada em gelo por 1 hora e então centrifugada (10 min, 14.000 rpm, 4°C). O sobrenadante foi descartado, e a centrifugação foi repetida para remoção de sobrenadante residual. O precipitado foi ressuspendido em 200,0 pL de TBS, obtendo-se então o eluato amplificado, pronto para a titulação.

Os fagos reamplificados a partir do primeiro ciclo de seleção foram utilizados em um segundo ciclo e assim subseqüentemente, por um total de três ciclos, sendo que a partir do segundo ciclo a estringência do tampão de lavagem foi aumentada de 0,1% para 0,5% de Tween-20 em todas as lavagens.

Para todas as titulações foi utilizado 1,0 pL de fagos, diluídos em 9,0 pL de meio de cultura LB. As diluições (10'1 a 10-4 para eluato não amplificado e de 10'8 a 10'11 para fagos amplificados) foram incubadas com 200 pL de E. coli (ER2738) em fase de crescimento inicial por 5 minutos e plaqueadas em meio LB contendo IPTG (0,5 mM) e X-gal (40 pg/mL), juntamente com 3,0 mL de Agarose Top (10 g de Bacto-Triptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCI, 1 g de MgCI2.6H20 / litro).

Após a incubação em estufa por toda a noite a 37°C, as colônias azuis foram contadas para a obtenção dos títulos de entrada e saída para todos os ciclos de seleção (número de colônias azuis x fator de diluição).

As colônias coloridas de azul, demonstrando quebra no substrato X-Gal e a expressão do gene β-galactosidase dos fagos pelas bactérias ER2738, foram reamplificadas separadamente em placas Deepwell para o armazenamento dos clones selecionados. Para isso, cada colônia isolada obtida do 4° ciclo (não amplificado) foi dispensada em um poço da De- epwell contendo 1,0 mL de meio de cultura com £ coli em fase de crescimento inicial. Esta placa foi incubada por 12 horas à 37°C, sob agitação. A placa Deepwell foi centrifugada por 60 minutos a 3.700 rpm, para a retirada do sobrenadante da cultura. Seu conteúdo foi transferido para outra placa Deepwell e então foi adicionado 1/6 do volume de PEG/NaCI (20% de polietilenoglicol-8000, NaCI 2,5 M) incubando-a por 12 horas a 4°C. A placa foi centrifugada por 1 hora a 3.700 rpm, o sobrenadante descartado, e o precipitado suspenso em 200,0 pL de PBS. A amplificação dos fagos das bibliotecas expressas nos vetores Fd-tet de cada ciclo de seleção de bopaning foi iniciado pela adição 5 mL de uma cultura de E. coli K91 em fase exponencial de crescimento. Após incubação de 10 minutos a 37° C, a resistêencia à tetra-ciclina foi iniciada pela adição de 95 mL de meio LB contendo tetraciclina em uma concentração de 0,2 pg/mL por 30 minutos a 37°C, sob agitação de 250 rpm. A tetraciclina foi adicionada a uma concentração final de 15 pg/mL. A propagação de células de bactérias infectadas foi realizada a 37°C, durante a noite, com agitação de 250 rpm. A suspenção de células de bactérias foi concentrada duas vezes (10.000 rpm. e 12 rpm). Os fagos resultantes foram purificados do sobrenadante por precipitação em PEG8000/NaCI (1/6 do volume) durante a noite a 4°C. Em uma segunda precipitação, o precipitado diluído em TBS e PEG8000/NaCI (1/6 do volume) foi incubado em gelo por 2 horas e então centrifugado (10 min, 14.000 rpm, 4°C). O sobrenadante foi descartado, e a centrifugação foi repetida para remoção de sobrenadante residual. O precipitado foi ressuspendido em 200,0 pL de TBS, obtendo-se então o eluato amplificado, pronto para a titulação. A concentração de fagos (partículas virais por mL) foi determinada por absorvância de UV em um comprimento de onda entre 240 e 320 nm, tendo como pico de absorção máximo a 269 nm. O cálculo da concentração viral foi baseado na seguinte fórmula: partículas virais por mL =(A269 x 6x1016/ número de nucleotídeos no genoma do fago). O estoque final de fagos foi armazenado a 4°C em TBS. O eluato final foi titulado para fornecer colônias separadas de forma que as colônias esteivessem bem individualizadas de forma a ser propagadas de forma independente para serem posteriormente analisadas.

Para a obtenção de DNA dos fagos, 10,0 pL dos fagos purificados em placa Deep-well foram adicionados a 1,0 mL de cultura de ER2738 era fase de crescimento inicial em tubos FALCON de 15 mL, onde permaneceram sob agitação vigorosa por 20 horas à 37°C. Após o crescimento, as culturas foram transferidas para microtubos para a sedimentação das bactérias que foram centrifugadas por 10 minutos a 4.000 rpm. 500,0 pL do sobrenadante foram transferidos para outro tubo, e 200,0 pL de PEG-NaCI foram adicionados a este, incubando o tubo em seguida à temperatura ambiente por 10 minutos. Após centrifugar por 10 minutos a 14.000 rpm, foi descartado o sobrenadante, e o precipitado foi ressuspen-so com 100,0 pL de Tampão lodeto (Tris-HCI 10mM, EDTA 1mM, Nal 4M), e então foram adicionados 250,0 μΙ_ de etanol absoluto, incubando o tubo por 10-20 minutos à temperatura ambiente. O tubo foi centrifugado por 10 minutos a 14.000 rpm, descartando o sobrena-dante, e em seguida, foi lavado o precipitado com 500,0 μΙ_ de etanol a 70%, centrifugando mais uma vez por 10 minutos a 14.000 rpm. O sobrenadante foi desprezado e o precipitado suspenso em 20,0 pL de água ultra-pura estéril. O sequenciamento foi realizado utilizando o Kit Dye Terminator (Amersham Biosci-ences) e um sequenciador automático MegaBace 1000 (Amersham Biosciences). Para a reação do sequenciamento, foram utilizados os seguintes iniciadores: M13 (5'-hoCCCTCATAGTTAGCGTAACG -3'- Amersham Biosciences), f88-4/15-mer (5’- hoAGAAGTCCGAAGACGATGA - 3’ - Invitrogen) e fUSE5/6-mer (5’- hoGGAGTATGTCI 11IAAGT-3’ - Invitrogen) que amplifica a região dos aminoácidos codifi-cantes dos peptídeos aleatórios fusionados nos fagos recombinantes. A análise das sequências de DNA provenientes do sequenciador automático foi processada em software do próprio equipamento (Sequence Analyser, BASE CALLER, Ci-marron 3.12, Phred 15). Logo após esta pré-análise, as seqüências de vetores foram retiradas e somente aqueles insertos com resíduos perfeitos foram então traduzidos.

As sequências de DNA geradas pelo sequenciamento foram analisadas utilizando-se programas de bioinformática disponíveis on-line: •A tradução das seqüências de aminoácidos obtidas no sequenciamento se deu pelo programa DNA2PR07 (http://relic.bio.anl.aov/dna2pro7.aspxL

•A população de peptídeos foi caracterizada quanto à freqüência de aminoácidos pelo programa AAFREGS (http://relic.bio.anl.aov/aafreas.aspxL •Os Motivos protéicos de peptídeos foram gerados pelo MOTIF2 (http://relic.bio.anl.aov/motif2.asPx)· Esse programa não permite substituições de aminoácidos conservativas, mas junções idênticas. É considerado um motivo conservado para os peptídeos alinhados quando eles são longos o suficiente para gerar uma estrutura secundária parcial. •O programa FASTAcom (http://relic.bio.anl.gov/fastaconsen.aspx) procura por homologias entre sequências consenso, podendo ser contínuas ou descontínuas, com múltiplas proteínas conhecidas do Boophilus microplus obtidas no “GenBank”. •A procura por similaridade entre sequências de petpídeos foi realizada pelo programa Clustal W através de alinhamento múltiplo.

•A procura por similaridade entre os peptídeos e proteínas do B. microplus foi realizada pela pesquisa em banco de dados públicos depositadas no “GenBank” por BLAST (Basic Local Alignment Search Tool - http://www.ncbi.nlm.nih.aov/BLASTT •os motivos de proteína produzidos foram analisados quanto às homologias com proteínas de carrapato depositadas no “GENBANK” pelo programa BLAST - Basic Local Alignment Search Tool (http://vww.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTi: •Para encontrar os padrões de proteína e a linhagem taxonômica referentes às famílias de proteínas e domínios comuns em espécies, gêneros ou táxons às quais os peptí-deos pertencem, foi utilizado o programa PROSCAN (PROSITE SCAN). Este programa e-xamina os peptídeos contra o PROSITE, um banco de dados de famílias de proteínas e domínios que consiste de locais biologicamente significantes, padrões e perfis que ajudam a identificar confiantemente a família conhecida da proteína, caso exista uma (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cai-bin/npsa automat.pl?paae=npsa prosite.htmli.

Com o objetivo de identificar e validar os clones obtidos por seleção biológica, estudos de imunorreatividade e imunogenicidade foram realizados em experimentos in vitro e in vivo. Inicialmente, os clones foram testados para determinação da antigenicidade por ELISA, Dot Blot, Dot Blot inhibition e Western blot. O Perfil de imunogenicidade foi investigado por ensaios de imunização em camundongos e bovinos, além de estudos para determinação de reconhecimento imune em animais infestados naturalmente (imunosseleção). Os Animais também foram imunizados e desafiados para determinação de possíveis efeitos de proteção do hospedeiro contra o parasita.

Os testes de ELISA foram realizados para determinar a reatividade dos peptídeos recombinantes (expressos nos fagos selecionados) contra os anticorpos presentes nos soros de galinhas imunizadas com proteínas totais do carrapato bovino. Foi sensibilizada uma placa de alta afinidade (NUNC) com 1 pg/poço do anticorpo policlonal purificado IgY anti-carrapato diluído em 100,0 pL/poço de tampão de carbonato (NaHC03 60 mM, pH 9,6) e incubada por 12 horas, sob agitação, à 4°C. Após 3 lavagens com PBS-T 0,05% (PBS + 0,05% volume/volume de Tween 20), foram adicionados 250,0 pL de tampão de bloqueio (PBS-T 0,05% - leite em pó desnatado 5%), sendo a placa incubada por 1 hora à temperatura ambiente. A placa foi então lavada por mais 6 vezes e adicionados 100,0 pL de solução contendo fago (um clone em cada poço). Após a incubação por 1 hora à 37°C, realizou-se mais 6 lavagens. Para a detecção, utilizou-se o anticorpo conjugado anti-M13 marcado com peroxidase na diluição de 1:5.000 (GE Healthcare) diluído em solução de bloqueio, com incubação por 1 hora à 37°C. Em seguida, a placa foi lavada por mais 6 vezes, e então revelada com 100,0 pUpoço de uma solução contendo OPD (Dicloridrato de O-fenilenodiamina -Sigma Chemical), H202, e tampão de citrato (0,1 Μ). A reação foi interrompida pela adição de 10,0 pL de H2S04 4M. A leitura da absorbância foi feita em leitor Multiscan Plus (Ther-moPlate) versão 2.03, com filtro 492 nm. Foi utilizado como controle negativo o fago M13 selvagem e também os anticorpos policlonais purificados de soro pré-imune, não reativo as proteínas totais de carrapato.

No experimento de Dot Blotting com anticorpo policlonal de galinha anti-proteína de carrapato, uma membrana de nitrocelulose foi sensibilizada com 2 pL de cada clone sele- cionado (107 clones totais) por spot. A membrana foi incubada, lavada três vezes por 5 minutos cada com TBST (TBS + 0,1% volume/volume de Tween 20). Depois completada a lavagem, a membrana foi bloqueada por 1 hora à temperatura ambiente com 1 mL de tampão de bloqueio (PBS-T a 0,1% - leite em pós desnatado 5%). Sobre a membrana recontada disposta em canaletas individuais, foram pipetados 100 μΙ_ de Blotto com soro policlonal na dilução de 1/100 em tampão de bloqueio. Anteriormente a incubação do soro na membrana, o soro foi pré-adsorvido com proteínas de extratos de células bacterianas ER2738 e partículas virais de fago M13 selvagem. Essa membrana foi incubada 2 h à temperatura ambiente, sob agitação orbital. Após este período, a membrana foi lavada novamente durante 5 vezes com TBST. Em seguida, foi adicionado o anticorpo secundário anti-lgG de galinha conjugado com fosfatase alcalina 1:5.000 (Sigma Chemical) em tampão de bloqueio e incubação por mais 1 h à temperatura ambiente. A reação foi revelada com o substrato NBT/BCIP (ni-troazul de tetrazólio/fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolila -Sigma Chemical). O fago M13 selvagem foi utilizado como controle negativo e os antígenos totais de carrapato como controles positivos.

Os experimentos de inibição foram realizados da mesma forma que o Dot Blot, exceto pela adição de uma etapa de pré-incubação do soro com proteínas de carrapato previamente à incubação da membrana. Foram adicionadas concentrações variadas de proteínas totais na ordem de 0 a 200 pg/canaleta.

Nos experimentos de Western Blot, as amostras referentes aos clones foram tratadas com DTT e imediatamente aquecidas em banho-maria por 2 min a 95°C e aplicados em gel de eletroforese. As amostras foram eletrotransferidas para uma membrana de nitrocelu-lose (Amersham Pharmacia) e bloqueadas com solução de bloqueio. Foi utilizado como anticorpo primário as IgYs policlonais, purificadas de soro de galinha de proteínas anti-S. microplus totais. Após lavagem de 5 vezes com TBST por 5 minutos cada, as membranas foram incubadas com anticorpo secundário anti-lgG de galinha marcado com fosfatase alcalina na proporção de 1/5.000 em tampão de bloqueio durante 1 hora à temperatura ambiente. Após este período, as membranas foram lavadas com TBST por 5 vezes e a revelação ocorreu pela adição do substrato NBT/BCIP (nitroazul de tetrazólio/fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolila -Sigma Chemical). Este processo foi necessário para assegurar que os pep-tídeos expressos na proteína III dos clones selecionados apresentem o reconhecimento pelos anticorpos específicos de proteínas de carrapato.

Para a amplificação de cada clone a ser testado em ensaios de imumuzações e i-munosseleção, foi utilizada a proporção de 1 μί de tetraciclina (20 mg/mL) para cada 1 mL do meio LB (Luria Bertane) líquido em frascos Erlenmeyer (concentração final de 20 pg/mL), totalizando 5 mL. A este meio foi inoculada uma colônia de bactérias isolada, cepa ER2738 de E. coli resistente à tetraciclina, que se multiplicou durante 6 horas a 37°C com agitação de 200 rpm. O meio de cultura foi diluído na proporção de 1/100, ou seja, 5 ml_ de bactérias em 500 ml_ de meio LB e tetraciclina (20 μο/ιτιί.). As bactérias infectadas pelos fagos foram preparadas pela inoculação de 50 μΙ_ (aproximadamente 1x1011 ufc) do fago no meio contendo as bactérias diluídas 1/100 e mantidas a 37°C, por 20 horas. A cultura foi transferida para tubos de centrífuga e submetida à 10.000 g por 10 minutos, a 4°C, por duas vezes, para eliminar os precipitados de bactérias. Aproximadamente 80% do sobrenadante foram transferidos para outro tubo acrescentando-se um volume de 80 ml_ de PEG (polietilenogli-col 8000 + NaCI 2,5 M), na proporção de 1/6, e incubado durante a noite a 4°C, para precipitar os fagos. Após a incubação, a preparação foi centrifugada a 10.000 g por 15 minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado com os fagos foi novamente centrifugado por 1 minuto. O precipitado com os fagos foi diluído em 10 mL de tampão TBS, em tubos Falcon de 15 mL e centrifugado a 4.000 g por 40 minutos, a 4°C. O sobrenadante foi transferido para outro microtubo, onde foi acrescentado 1/6 de PEG e então incubado por 60 minutos. Depois de centrifugado a 4.000 g, por 40 minutos, a 4°C, o sobrenadante foi descartado. O sobrenadante residual foi retirado e o pricipitado diluído em 4 mL de TBS.

Os fagos foram quantificados em partículas virais por mL por espectofotometria direta em espectofotrômetro utilizando leitura de UV a 269 nm, como descrito nos experimentos anteriores.

Para a titulação dos clones, a solução de fagos a ser titulada foi submetida a diluições seriais de 10 vezes em meio LB sólido. Para amplificação foram utilizadas diluiççoes de 107a 1012. Em cada diluição foram adicionados 200 pL da cultura de ER2738 na fase mid-log. Esta mistura foi turbilhonada brevemente e incubada por 5 minutos à temperatura ambiente. As células, assim infectadas, foram transferidas para tubos de cultura contendo 3 mL de Agarose Top a 45°C, vertidas rapidamente e espalhadas sobre uma placa de Petri contendo meio LB sólido com IPTG/Xgal e tetraciclina. Para cada diluição foi confeccionada uma placa. As placas foram vedadas com parafilme, invertidas e incubadas à temperatura de 37°C, durante 16 horas. Após este período, colônias azuis foram contadas e as placas contendo aproximadamente 100 colônias foram identificadas como compreedendo as diluições que representam os títulos.

Para testar a capacidade dos peptídeos de induzirem resposta imune, foram inocu-lados camundongos e bovinos. Estes animais foram mantidos isolados, livres de infestação de carrapatos, moscas e outros parasitas.

Foram realizados dois experimentos de imunizações em camundongos. No primeiro (Exemplo 3), para a imunização com os clones selecionados foram utilizados camundongos fêmeas de seis semanas de idade e tendo o peso médio de 28 gramas. Ciquenta grupos, de cinco animais, foram imunizados com trinta e seis clones diferentes, fago selvagem M13 e fd tet, três peptídeos sintéticos, três fagos representantes destes peptídeos e controles de rea- ção adequados. A dosagem foi de 1 X 1012 partículas virais, em um volume de 100 pl_. Foram testados os seguintes clones: Seq. ID No. 1, Seq. ID No. 2, Seq. ID No. 7, Seq. ID No. 10, Seq. ID No. 11, Seq. ID No. 12, Seq. ID No. 14, Seq. ID No. 15, Seq. ID No. 17, Seq. ID No. 18, Seq. ID No. 22, Seq. ID No. 25, Seq. ID No. 26, Seq. ID No. 27,Seq. ID No. 28, Seq. ID No. 32, Seq. ID No. 40, Seq. ID No. 41, Seq. ID No. 47, Seq. ID No. 48, Seq. ID No. 50, Seq. ID No. 51, Seq. ID No. 67, Seq. ID No. 69, Seq. ID No. 70, Seq. ID No. 75,Seq. ID No. 76, Seq. ID No. 80, Seq. ID No. 82,Seq. ID No. 83, Seq. ID No. 91, Seq. ID No. 92,Seq. ID No. 93, Seq. ID No. 94. Não foram adjunvantes de imunização, exceto para os peptideos sintéticos e os controles correspondentes, sendo o adjuvante completo de Freund na primeira imunização e o incompleto de Freund nas demais (Sigma Chemical Co, US), por via sub-cutânea. Os animais foram imunizados a cada duas semanas perfazendo sete imunizações. Sangue foi coletado pela veia orbital nos dias 0, 30, 60 e 90 pós-imuiiização.

Os níveis de anticorpos específicos no soro de camundongos foram mensurados como se segue: Cada amostra de sangue foi aliquotada em tubos tipo Eppendorf e armazenada a -20° C. Placas de microtitulação de fundo chato (96 poços: Nunc, Roskilde, Dinamarca) foram sensibilizadas com proteínas totais diluídas em PBS, pH 7,2, na dose 1 μg/mL, durante a noite à temperatura de 4°C. Depois da lavagem, os soros dos animais foram adicionados, diluídos em solução de bloqueio na diluição de 1:100 e incubados durante 2 horas à 37°C. Após este período, as placas foram lavadas e incubadas com conjugado anti-camundongo complexado com peroxidase, diluídas em solução de bloqueio 1:5.000, durante 1 hora a 37°C. O substrato utilizado para a revelação foi o OPD, após paralisação da reação com ácido sulfúrico. A leitura de absorbância foi determinada a 492 nm em leitor de micro-placa (Flow Titertek Multiskan Plus - US).

No segundo teste de inoculações em camundongos, para a imunização com os clones selecionados foram utilizados camundongos fêmeas de seis semanas de idade e peso médio de 28 gramas. Doze grupos, de três animais cada, foram imunizados com nove clones diferentes (Seq. ID No. 18, Seq. ID No. 19, Seq. ID No. 20, Seq. ID No. 2, Seq. ID No. 22, Seq. ID No. 26, Seq. ID No. 32, Seq. ID No. 37, Seq. ID No. 41), controle do tampão PBS, fago M13 selvagem, e o pool de fagos (conjunto destes clones em uma mesma dosagem) na dose de 2,5 X 1012 ufc em um volume de 100 pL, com adjuvante incompleto de Freund (Sigma Chemical Co, US), pela via intraperitonial. Os animais foram imunizados nos dias 0 e 12. Coletas de sangue, pela veia orbital, foram realizadas nos dias 0, 12 e 19 pós-imunização.

Após estas imunizações, os níveis de anticorpos específicos no soro de camundongos foram mensurados da seguinte forma: Cada amostra de sangue foi aliquotada em tubos tipo Eppendorf e armazenadas a -20°C. Placas de microtitulação de fundo chato (96 poçocs; Nunc, Roskilde, Dinamarca) foram sensibilizadas com os clones ou mesmo as proteínas totais diluídas em PBS, pH 7,2, na dose de 5 X 1010 ufc/mL, durante a noite, à temperatura ambiente. Depois da lavagem, os soros dos animais foram adicionados, diluídos em PBS 1:100 e incubados durante 1 hora à 37°C. Após este período, as placas foram lavadas e incubadas com conjugado anti-camundongo, no caso dos camundongos, e anti-modelos animais feitos em coelhos, no caso dos bovinos, diluídos em PBS 1:2.000, durante 1 hora à 37°C. O substrato utilizado para revelação foi o OPD, após finalização da reação com ácido sulfúrico. A leitura de absorbância foi determinada a 492 nm em leitor de microplaca (Flow Titertek Multiskan Plus - US).

Ensaios de infestações com carrapatos em bovinos: Inicialmente, foi realizado um teste de imunosseleção no qual 16 bovinos, sendo 3 da raça Nelore e 8 da raça Holstein, foram infestados naturalmente com 5.000 larvas de carrapatos para cada animal. Após a observação de um padrão de contagem distinto de carrapatos no qual foram escolhidos 4 animais (2 Holstein e 2 Nelore) apresentando para cada raça um animal com alta contagem e outro com baixa contagem. Isso foi feito como uma tentativa de buscar um efeito entre os animais com maior susceptibilidade e outros com maior resistência à infestação natural. A-pós determinação estatística significativa do padrão de resposta à infestação, o soro dos animais foi coletado, processado e submetido a um ensaio de Dot Blot para determinação de imunorreatividade de IgGs bovinos com os clones selecionados para o teste. Foram se-cionados os seguintes clones: Seq. ID No. 1, Seq. IO No. 2, Seq. ID No. 7, Seq. ID No. 10, Seq. ID No. 11, Seq. ID No. 12, Seq. ID No. 14, Seq. ID No. 15, Seq. ID No. 17, Seq. ID No. 18, Seq. ID No. 22, Seq. ID No. 25, Seq. ID No. 26, Seq. ID No. 27,Seq. ID No. 28, Seq. ID No. 32, Seq. ID No. 40, Seq. ID No. 41, Seq. ID No. 47, Seq. ID No. 48, Seq. ID No. 50, Seq. ID No. 51, Seq. ID No. 67, Seq. ID No. 69, Seq. ID No. 70, Seq. ID No. 75, Seq. ID No. 76, Seq. ID No. 80, Seq. ID No. 82, Seq. ID No. 83, Seq. ID No. 91, Seq. ID No. 92, Seq. ID No. 93, Seq. ID No. 94. Foi utilizado como controle negativo o fago M13 selvagem e como controle positivo as proteínas totais de carrapato.

Em outros experimentos para testes dos efeitos potencialmente vacinais dos peptí-deos obtidos, foram realizados testes de iniculações em bovinos com desafio de carrapatos em animais vacinados com os clones de fagos.

Para isto, um mês antes das imunizações, os animais passaram por uma série de quatro banhos a cada sete dias, com carrapaticidas comerciais, na tentativa de eliminar todos os carrapatos presentes, decorrentes de infestações de campo anteriores.

Nos ensaios preliminares de imunização, dois grupos de dois animais machos com idade aproximada de 18 meses, foram utilizados para o teste de inoculação e desafio. Os animais foram imunizados, por via intramuscular, com um pool dos clones mais reativos ((Seq. ID No. 18, Seq. ID No. 19, Seq. ID No. 20, Seq. ID No. 2, Seq. ID No. 22, Seq. ID No. 26, Seq. ID No. 32, Seq. ID No. 37, Seq. ID No. 41)) na dose de 2,5 X 1012 (Grupo 1) e o fago M13 selvagem na mesma dose (Grupo 2), em um volume de 1 mL, com adjuvante incompleto de Freund (Sigma Chemical Co, US). Os animais foram imunizados nos dias 0 e 12. Foram realizadas coletas de sangue nos dias 0,12 e 19 pós-imunização.

Doze dias após a primeira inoculação, os animais foram infestados com larvas do carrapato B. microplus (cepa de campo) totalizando duas infestações de 5.000 larvas cada, com intervalo de um dia. Os animais foram constantemente monitorados duas vezes ao dia durante os primeiros dias de inoculação para a checagem de possíveis reações cutâneas de hipersensibilidade aos fagos e adjunvantes.

Observações clínicas semanalmente foram realizadas até o 24° dia após a primeira infestação, para checar o desenvolvimento do desafio. Os carrapatos adultos ao desprenderem-se foram coletados no chão das baias, a qual foi devidamente preparada para a coleta, e foi realizada a identificação dos carrapatos de acordo com as baias. Cada fêmea foi pesada em uma escala de precisão e preparada para a postura dos ovos em uma estufa a 27°C e 80% de umidade (OBA, 1976, Revista da Faculdade de Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, 13:409-420). Os ovos foram pesados e dispostos em uma estufa durante 30 dias para o processo de eclosão. As larvas foram também pesadas em uma escala de precisão (MASSARD et al., 1995, Revista Brasileira de Medicina Veterinária 17:167-173).

Os níveis de anticorpos específicos no soro foram mensurados em bovinos. Cada amostra de sangue foi aliquotada em tubos tipo Eppendorf e armazenadas a -20°C. Placas de microtitulação de fundo chato (96 poços: Nunc, Roskilde, Dinamarca) foram sensibilizadas com os clones ou mesmo as proteínas totais diluídos em PBS, pH 7,2, na dose de 5 X 1010 ufc/mL, durante a noite à temperatura ambiente. Depois da lavagem, os soros dos animais foram adicionados, diluídos em PBS 1:100 e incubados durante 1 hora à 37°C. Após este período, as placas foram lavadas e incubadas com conjugado anti-bovino, conjugado com peroxidase, diluídos em solução de bloqueio na proporção de 1:2.000, durante 1 hora à 37°C. O substrato utilizado para revelação foi o OPD, após paralisação da reação com ácido sulfúrico. A leitura de absorbância foi determinada a 492 nm em leitor de microplaca (Flow Titertek Multiskan Plus - US). O índice ELISA (IE) para os soros dos camundongos foi calculado dividindo-se da densidade óptica (DO) pelo valor de cut off. O cut off foi calculado somando-se 2 desvios padrão à média dos soros pré-imunes. Os lEs maiores que 1 foram considerados positivos e os lEs menores que 1 foram considerados negativos.

Os parâmetros biológicos foram analisados após a contagem e peso das fêmeas adultas, pesagem dos ovos e larvas, bem como os parâmetros histopatológicos.

REIVINDICAÇÕES

Claims (3)

1. Composição vacinai, caracterizada por compreender um ou mais compostos definidos pelas Sequências SEQ ID NO 1 a 110 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

2. Composição vacinai, conforme definida pela reivindicação 1, caracterizada por compreender mais preferencialmente as sequências SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:25, SEQ ID ΝΟ:2β, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:40, SEQ ID N0:41, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, e SEQ ID NO:94.

3. Uso dos peptídeos, caracterizado por ser para preparar uma composição conforme definida pelas reivindicações 1 e 2 para estimular o sistema imune de animais como processo terapêutico vacinai contra artrópodes, principalmente o carrapato.