JP4321881B2 - 寄生虫に対する防御免疫測定法用の生体外動物もしくは攻撃モデルおよび当該方法において防御作用を示すワクチン - Google Patents
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Description
市場において入手可能な寄生虫に対するワクチンはほんの僅かしかない。これらワクチンの殆どは、自然の防御免疫を誘発し、深刻な病的被害をあまりともなわない弱毒化生存寄生虫に基づいている。これらの寄生虫ワクチンは、疑いなくもっとも成功した抗寄生虫ワクチンであるディクチオカウラス・ビビパラス（Dictyocaulus viviparus）に対するワクチン（例、ジクトール、グラクソ）およびその類似品であるヒツジの肺吸虫、ディクチオカウラス・フィラリア（Dictyocaulus filaria）に対するワクチン（シャーマ（Sharma）ら、１９８８）を包含する。これらのワクチンは生存してはいるが照射第三期にある幼生に基づいている（ピーコックおよびポインター（Peacock & Pointer）、１９８０）。もう一つの弱毒化ワクチンはイヌの鉤虫、アンシロストーマ・カニナム（Ancylostoma caninum）に向けられたものである。しかし、このワクチンは米国で短期間販売されただけで、米国家畜連合が承認しなかったために販売中止となった（アーカート（Urquhart）、１９８０）。バベシア・ボビス（Babesia bovis）に対する弱毒化ワクチンはほぼ一世紀にわたってオーストラリアで使用されており（パーネル（Purnell）、１９８０）、「ピロドッグ」と命名された代謝産物に基づく死菌ワクチンはビー・カニス（B. canis）に対するイヌの予防接種に用いられている（モロー（Moreau）、１９８６）。
条虫、テニア・オビス（Taenia ovis）に対する組換えワクチンにより（ジョンソン（Johnson）ら、１９８９）、また、ヘモンチャス・コントータス（Haemonchus contortus）からの隠蔽抗原Ｈ１１により（ニュートン（Newton）、１９９５、総説）ヒツジに対する予防接種試験が成功裏に実施されている。アフリカではSPf６６マラリアワクチンでの試験が最近完了した。高伝播地域での臨床上マラリアに対する有効率は３１％であり、その製品は安全であると思われていた。しかし、SPf６６が防御にどのように関わるのか十分に理解されていないために、改良ワクチンの開発はその動きが妨げられている（タンナー（Tanner）ら、１９９５、総説）。
抗寄生虫ワクチンを開発するには多くの問題がある。寄生虫は複雑なライフサイクルを有し、各期で異なる組み合わせの抗原を発現する。さらに、その異なる期は生体の異なる部位としばしば関連している。殆どの寄生虫に対して、自然免疫に関わる免疫機構について、また、この免疫を含む寄生虫の期については殆ど知られていない。
殆どの場合、これらの免疫機構を研究するために利用し得る再現性のある動物モデルは存在せず、それがワクチン開発の新しい手法を阻んでいる。上述のように、もっとも利用可能なワクチンは弱毒化した生存寄生虫に基づいている。これらのワクチンは、「ワクチン寄生虫」が穏当な感染ルートに従い一連の期−特異抗原を搬送する故に、ある場合には成功する。しかし、かかるワクチンは、特にそれらがヒト用である場合（例、シストゾーマ・マンソーニ（Schistosoma mansoni）ワクチン、テイラー（Taylor）ら、１９８６）には、公衆が受け容れることに挑戦しなければならない（例、アンシロストーマ・カニナム・ワクチン）。さらに、生ワクチンは一般に保存期間が短く、比較的高価である。こういった将来像から、寄生虫から誘導される（組換え）タンパク質に基づくワクチンが明らかに必要である。しかし、ファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）についての一例として下記に示すように、かかる防御タンパク質の同定は膨大な数の困難に遭遇する。
吸虫類寄生虫、ファシオーラ・ヘパチカは主にウシとヒツジに感染するが、場合によりヒトにも感染することがある。この寄生虫は、たとえば、西ヨーロッパ、オーストラリアおよび南アメリカではかなりの経済的損失をもたらしている。ファシオーラ・ヘパチカの被嚢幼虫は経口でその宿主に浸入し、４〜７時間以内に消化管壁に潜り込み（ドウズ（Dawes）、１９６３。バーデン（Burden）ら、１９８１；バーデンら、１９８３。カワノ（Kawano）ら、１９９２）、腹膜腔を経て標的器官である肝臓へ移行する。ウシは経口感染しても攻撃に対してほぼ完全な防御体制をとるが、他方、ヒツジではときに感染で死に至り、自然免疫を獲得しない。本来の宿主（ウシ）も動物モデル（ラット）もともに感染後自然免疫を獲得する（ドイおよびヒューズ（Doy & Hughes）１９８４。ヘイズ、ベイラーおよびミトロビッチ（Hayes、Bailer & Mitrovic）１９７３）。それ故、ラットはウシの抵抗性の研究によく使用される。ラットでは大部分の自然免疫が寄生虫の浸入部位である消化管粘膜で発現される。免疫ラットでは攻撃した約８０％が新包嚢脱出幼若期（NEJs）に消化管管腔から腹膜腔に除去される（ヘイズおよびミトロビッチ（Hayes & Mitrovic）１９７７。ラジャセカリアおよびハウエル（Rajasekariah & Howell）１９７７。ドイ、ヒューズおよびハーネス（Doy、Hughes & Harness）１９７８/１９８１。ドイおよびヒューズ、１９８２。バーデンら、１９８１/１９８３）。自然免疫に基づき、照射ファシオーラ・ギガンチカ（Fasciola gigantica）被嚢幼虫に基づくワクチンがウシ用として開発された（ビタカラミアー（Bitakaramire）１９７３）。第７期および第８期に、成虫および幼若吸虫類の抗原抽出物を用い、多数回の予防接種試験が実施された（ハロウンおよびヒルヤー（Haroun & Hillyer）１９８０、総説）。しかし、これらの研究は相矛盾するかあるいは議論の余地のある結果に終わった。たとえば、成虫または幼若吸虫類の抽出物をラットに皮下もしくは筋肉内注射しても防御作用は得られなかった（オールダムおよびヒューズ（Oldham & Hughes）１９８２；バーデンら、１９８２；オールダム、１９８３）。フロイント完全アジュバント（FCA）または不完全フロイントアジュバント（IFA）とともに腹腔内投与した成虫吸虫類の抽出物は約５０％の防御作用を示した（オールダムおよびヒューズ（Oldham & Hughes）１９８２；オールダム、１９８３）。追加のアジュバントとしてボルデテラ・ペルタッシス（Bordetella pertussis）の非常に高い抗原用量を用いると、この防御作用は８０〜８６％に達した（オールダムおよびヒューズ（Oldham & Hughes）１９８２；オールダム、１９８３）。AlOH3とともに腹腔内投与した４週令の幼若体抽出物は、ファイスター（Pfister、１９８４/８５）らの研究では防御作用を誘発しなかったが、１６日令の幼若体抽出物はアジュバントを用いずともマウスで８６％の防御作用を示した（ラングおよびホール（Lang & Hall）１９７７）。超音波処理した１６日令幼若体をウシに皮下感作すると９０％以上の防御作用を示した（ホールおよびラング、１９７８）。成虫ファシオラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）（FhSmIII）から単離した、主要成分として１２ｋＤの免疫原性タンパク質を含むフラクションを子ウシに筋肉内注射すると、５５％の防御作用が得られた（ハイリヤー（Hillyer）ら、１９８７）。
１９９０年以降、数種のファシオラ・ヘパチカ・ワクチン候補抗原が単離および/または生産された。これら抗原の殆どが成虫吸虫類から誘導したものであり、シストゾーマ・マンソーニ（Schistosoma mansoni）抗原との相同体である。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（GST）は細胞解毒系においてとりわけ活性な酵素である。ファシオラ・ヘパチカ成虫から精製したGSTでヒツジ（ｎ＝９）をFCAとともに皮下注射免疫し、さらに４週後にIFAとともに追加免疫すると、５７％の防御作用を示した（セックストン（Sexton）ら、１９９０）。GSTでラットを免疫しても防御作用は得られなかった（ハウエル（Howell）ら、１９８８）。チバ動物ヘルス研究所（スイス）およびビクトリア動物科学研究所（オーストラリア）が実施したウシの予防接種試験では、４９〜６９％の防御作用が得られた（モリソン（Morrison）ら、１９９６）。
マウスにおいて、組換えエス・マンソーニ（S. mansoni）脂肪酸結合タンパク質Sm１４によりFCAとともに皮内/皮下免疫すると、ファシオラ・ヘパチカの攻撃に対して完全な防御作用を示した（テンドラー（Tendler）ら、１９９６）。WO９４/０９１４２は、ファシオラ・ヘパチカから誘導したカテプシンＬ型活性を有するプロテアーゼを、蠕虫寄生虫除去用ワクチンの剤形として使用することを示唆している。ウサギを精製した成熟酵素で免疫するとin vitroで当該酵素の活性を減少させるウサギ抗体を産生した。
しかし、ファシオラ・ヘパチカ・カテプシンＬまたはヘモグロビンで得られたウシでの防御レベルはそれぞれ５３．７％または４３．５％にすぎなかった（ダルトン（Dalton）ら、１９９６）。カテプシンＬはシステイン・プロティナーゼの一族に属し、成長期にある寄生虫のすべての期で分泌される。ファシオラ・ヘパチカのカテプシンＬは微弱酸性または中性pHでもっとも活性である（ダルトンおよびヘファーナン（Dalton & Heffernan）１９８９）。このプロティナーゼの機能は宿主の免疫グロブリンをパパイン様様式で切断し（スミス（Smith）ら、１９９３）、免疫エフェクター細胞が寄生虫に抗体介在結合するのを妨げる（カーモナ（Carmona）ら、１９９３）ことにより宿主の免疫機能を崩壊させることである。さらに、カテプシンＬは細胞外マトリックスと基底膜成分を分解することが可能であり（ベラセイン（Berasain）ら、１９９７）、寄生虫が突抜けようようとする粘膜の表面を準備するが、これはカテプシンＬが組織浸入に関わっていることを物語っている。カテプシンＬプロテアーゼはその決定的な生物学的機能の故に、抗寄生虫ワクチンの開発にとって重要な候補であると考えられる。
カテプシンＬは１５アミノ酸長のペプチドプレ配列、９１アミノ酸長のペプチドプレ配列もしくはプロ領域および２２０アミノ酸長の（ポリ）ペプチド酵素部分を有するプレプロタンパク質として合成される。システイン・プロティナーゼのプレ領域は合成直後に除去され、プロ領域と成熟酵素を構成する部分からなるプロタンパク質はゴルジに輸送される。成熟酵素への変換とその結果としての酵素的に活性な状態への変換がリソソームで起こり、カテプシンＤとなるか自己活性化へと至る。ある場合にはプロ領域を含む前駆体が分泌される（ノース（North）ら、１９９０）。カテプシンＬそれ自体はP1位置にArgを有し、かつ、P2位置に疎水性残基（Phe）を有する基質に対し高い親和性を有する（ダウド（Dowd）ら、１９９４）。このものはまた自己触媒活性を有し、その成熟酵素活性を獲得する前にそのプロ配列を切除する。カテプシンL2もP2位置にProを含むペプチドを切断し、それ故に、フィブリノーゲンを切断し、フィブリン塊を生成することができる。
抗吸虫ワクチンの他の有力な候補は、成熟ファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）から単離されるヘモグロビン（マックゴニグルおよびダルトン（McGonigle & Dalton）１９９５）およびファシオーラ・ヘパチカ成虫が分泌するカテプシンＬ（スミス（Smith）ら、１９９３。スミスら、１９９４。スピチル（Spithill）１９９５）である。これまで、照射ファシオラ・ギガンチカ（Fasciola gigantica）被嚢幼虫（ビタカラミ（Bitakarami）１９７３）に次いでいくつかの抗原が有力なタンパクワクチンとして示されている。
−ファシオーラ・ヘパチカ・ヘモタンパク質
−シストゾーマ・マンソーニ（Schistosoma mansoni）からの脂肪酸結合タンパク質Sm１４
−カテプシンＬ型活性を有するチオールプロテアーゼ
−成虫ファシオーラ・ヘパチカから抽出されるグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ
−ファシオーラ種からのポリペプチド（Gln-Xaa5-Cys-Trp-Xaa3）
−ジペプチジルペプチダーゼ活性を有するセリンプロテアーゼ。
しかし、これら有望な候補のいずれもがファシオーラ・ヘパチカの感染に対して有効なワクチンとして作用を示さず、さらに、ワクチンを成功裏に開発する前に以下の多くの疑問に答える必要がある。宿主のどの部位で免疫は発現するのか。寄生虫のどの期に免疫は向けられるのか。宿主のどの部位でこの免疫は誘発されるのか。どの免疫機構が防御作用に関わっているのか。ファシオーラ・ヘパチカのどの期で防御作用免疫を誘発するのか。そして−最後ではあるが小さくはない問題―どの抗原が防御作用を誘発するのか。これらの疑問に答えるには、適当な動物−すなわち寄生虫感染を研究するための攻撃モデルのないことが非常に障害となることは明らかである。そして動物モデルが利用できたとしてもその進行は非常に遅い。その理由は研究対象の宿主において寄生虫感染が進展するには相当の時間がかかり、一方でその結果は経時的に変化する宿主−寄生虫の関係に関連する様々な要因に依存するからである。たとえば、注目点の多くが候補防御抗原としてファシオーラ・ヘパチカの新包嚢脱出幼若（NEJ）期から誘導されるプロテアーゼなどのタンパク質に向けられているが（たとえば、ツカルセビッチ（Tkalcevic）ら、１９９５）、真に防御作用のあるタンパク質の明確な同定は予知されていない。それに対して、ファシオーラ・ヘパチカの初期生育期では急速なタンパク質変化と感染の初期段階での抗原発現を示し、かかる変化は寄生虫が宿主免疫応答を回避することを助けさえする（ツカルセビッチ（Tkalcevic）ら、Parasite Immunology １８、１３９〜１４７、１９９６）。たとえば、寄生虫では、プロテアーゼが宿主組織浸入、免疫攻撃メカニズムの回避に関与し、寄生虫生存のために栄養の調達を助けることが証明されている。
このように、研究する必要のある可能な異なるタンパク質または抗原が多数であること、また、適当な攻撃モデルの欠如していることが寄生虫ワクチンの開発に必要な可能な進歩を妨げている。寄生虫ワクチンの進歩にとって重要なことは、種々の候補防御抗原を研究し、新しい候補防御抗原の同定を可能とするための、防御免疫性を測定する新しい方法である。このように、時間内に試験し得る候補タンパク質または基質の数を増大させるような新しい動物モデルが必要である。
本発明は研究対象寄生虫に対する自然免疫を研究、調査、評価するための迅速な方法を提供する。本発明は寄生虫に向けられる防御免疫と寄生虫感染用のワクチンを迅速に検討するための生体外動物もしくは攻撃モデル方法を提供する。生体外モデルは一般に動物の臓器または臓器系を麻酔下に検討するために設計され、本来の生体が備える状況とは違うが、適切な血液供給などの状況は維持するものである。これらのモデルは一般に処理時間が短く、in vivoモデルに見られるよりも実験動物に対する苦痛は少なくてすむ。
本発明はラットまたは他の小型の実験動物、たとえば、マウスもしくはニワトリ、あるいは他の動物種の生体外消化管モデルを提供する。攻撃寄生虫は選択した動物腸管の１以上の生体外分節に注入し、腸管壁に浸入するNEJsなどの寄生虫を、特定の消化管分節を保持するコンテナーに回収する。特に、小腸の分節、たとえば、十二指腸、空腸または回腸などを使用することができるが、腸管の他部分の分節、たとえば、胃、結腸、盲腸または直腸なども研究対象寄生虫の選択した感染経路に対応して用いることができる。本発明により提供されるこのモデルは、腸管全体にわたる抵抗性の発現を、寄生虫の異なる負荷にまたは寄生虫の異なる期に付された分節を比較することにより測定することができる。さらに、消化管粘膜、腹膜腔、肝臓および他の器官に見出すことができるような寄生虫の移動ルートの軌跡、これは粘膜抵抗性の誘発にとって本質的であるが、これらがすべて検討可能である。本発明により実施可能なこのような研究はもっとも有効な予防接種経路について、また、経口ワクチンの可能性について知識を提供する。結紮した消化管分節を用いる生体外攻撃モデルの今一つの利点は、消化管腔から腹膜腔への病原体の移行が小さな領域に限定されることであり、これが消化管粘膜での寄生虫に対する防御免疫応答の位置づけと特徴づけを可能にする。さらに、以前の感染または予防接種により誘発された抵抗性のレベルを寄生虫に対する免疫機構と相関させることができる（実験の部ではファシオーラ・ヘパチカにより証明した）。その理由は攻撃感染が定着せず、研究する必要のある対象を邪魔する追加の免疫応答を誘発しないからである。特に、粘膜もしくは皮膚表面に浸入して宿主に感染する病原体、たとえば、ファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）、パラゴニムス・ウエスターマニ（Paragonimus westermani）、シストゾーマ・マンソーニ（Schistosoma mansoni）、トキソカラ・カニス（Toxocara canis）、ディクチオカウラス・ビビパラス（Dictyocaulus viviparus）、トリキネラ・スピラリス（Trichinella spiralis）、ネマトディリス種（Nematodiris spp）、ニッポストロンギラス・ブラジリエンシス（Nippostrongylus brasiliensis）、アスカリス・スウム（Ascaris suum）、アニサキス（Anisakis）、およびプリオンから原虫類にいたる他の病原体に対する免疫と防御機構が、これらが全部もしくは部分的に当該表面に浸入し得るのか否か、本発明により提供されるモデルにより特異的に好適に測定することができる。モデルに採用される消化管分節の粘膜表面に完全に浸入する寄生虫または他の病原体は上に示したように回収し得るが、粘膜表面に部分的にのみ浸入するものは特定分節で稼動する血管もしくはリンパ管から回収することができる。
寄生虫に対する免疫性と防御機構を評価することは宿主における免疫応答のエフェクター相を調節する可能性を提供するものであり、効率的な予防接種対策の発展につながるものである。換言すれば、感染に対するワクチンとして使用する防御抗原となるべきタンパク質の能力を測定するものである。防御作用のデータが同日に得られるので、本発明により提供される生体外モデルは、多数の候補ワクチン抗原（防御タンパク質またはそれから誘導された断片）について、それらが抵抗性および免疫性を誘発する能力があるか、それらの異なる期での迅速な試験実施を可能とする。
本発明により提供されるかかる候補ワクチン抗原の一つは防御タンパク質またはそれから誘導される抗原性断片であり、当該タンパク質は少なくとも酵素のプロ領域から誘導されるアミノ酸配列から構成されるものである。寄生虫が粘膜または皮膚表面に浸入するときには幾つかのプロテアーゼが関与する。たとえば、セリン・プロテアーゼ、ジペプチジル・ペプチダーゼ様プロテアーゼ、システイン・プロテアーゼ、カテプシン様活性を有するプロテアーゼなどであるが、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼなどその他の酵素も、寄生虫が粘膜または皮膚表面に浸入しようとしている相において関与している。驚くべきことに、本発明は、成熟酵素が使用された場合よりもよりよい免疫応答を発揮するような酵素またはプロテアーゼのプロタンパク質から誘導される防御タンパク質（断片）を提供する。要すれば、プロタンパク質に向けられた免疫応答を、成熟酵素に向けられた免疫応答と組み合わせることも可能である。
本発明の好適な態様において、本発明は酵素など、好ましくはプロテアーゼなどのプロ領域から誘導される防御タンパク質（断片）を提供する。さらに他の態様において、プロ領域に向けられた免疫応答は成熟酵素に向けられた免疫応答と組み合わされる。
本発明により提供されるかかる候補ワクチン抗原の一つは防御タンパク質またはそれから誘導される抗原性断片であり、NEJsのファシオーラ・ヘパチカから誘導されるものである。候補ワクチン抗原、たとえば、NEJタンパク質から調製することの可能な抗原で予防接種したラットの防御状態は、本発明により提供される生体外モデルを用いて、予防接種の研究を経て、たとえば、選択したタンパク質で以前に免疫したラットの防御状態を測定することにより測定することができる。ファシオーラ・ヘパチカのNEJsから誘導される種々のタンパク質は、たとえば、SDS−PAGEゲル電気泳動およびエレクトロブロッティングにより、あるいは分子サイズによる排除またはろ過を介して単離し、さらに見かけの分子量およびＮ−末端配列決定により同定し、研究することができる。本発明は実施例のように、とりわけ、NEJsで見出され、３０〜３２kDの見かけの分子量とXXDVSWPFWDRMYNYのＮ−末端アミノ酸配列（アミノ酸は一文字コードで掲げ、ｘ＝未知アミノ酸である）を有する免疫優性のタンパク質に対応する防御タンパク質またはその断片を提供する。また、本発明が提供するのは、本発明が提供する防御タンパク質または（ポリ）ペプチドをエンコードするヌクレオチド配列である。
本発明の好適な態様は防御タンパク質またはその断片であり、該タンパク質は少なくともプロテアーゼ、たとえば、図２に示すヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列を有する核酸により（少なくとも一部）エンコードされているプロテアーゼのプロ領域またはプロ配列から誘導されるアミノ酸配列から構成されている。
かかる配列を（一部）単離または同定された（寄生虫）タンパク質から誘導する方法は既知技術であり、たとえば、免疫原決定基または断片を、たとえば、コンピューター解析による抗原性指標を検討することにより同定することが可能である。さらに、当該酵素またはプロテアーゼをエンコードするヌクレオチド配列は技術上既知である。カテプシン様プロテアーゼをエンコードする配列はたとえばウイジュフェルズ（Wijffels）ら（１９９４）により示されている。多くの場合、成熟酵素をエンコードする配列の一部が知られており、それが、平均的技術を有する熟練者に対し対応するプレ−および/またはプロ領域をエンコードする対応する核酸配列の同定を可能とする。かかる核酸および/またはタンパク質配列は成虫期または幼若期の生物体の双方から得られる。本発明の好適な態様は幼若期の寄生虫に主に見出されるプロテアーゼから誘導されるプロ領域に相当する防御タンパク質またはその断片を提供するが、好ましくは、当該寄生虫はファシオーラ種（Fasciola species）である。増幅もしくはスクリーニング法により単離したヌクレオチド配列を用い、機能的に等価のタンパク質または（ポリ）ペプチドをエンコードする多様なまたは異なる寄生虫での配列を関連する寄生虫内に同定し、そこから単離することができる。かかるヌクレオチド配列またはその断片のすべてを技術上既知の方法により適当な発現系内で分子的にクローン化し、上記のように、抗寄生虫ワクチンとしてまたは診断目的に使用することのできる組換えタンパク質を生成させることができる。
免疫原性決定基もしくは断片または本発明により提供される断片の例はプロテアーゼのプロ領域から誘導される断片である。代表的な例はMCF03またはMCF06などのペプチドに対応するあるいは関連するペプチド、またはプロテアーゼのプロ領域の重なり合う位置に見出されるペプチドなどであるが、例示は図２および３にも見ることができる。他の対応する断片またはペプチドは関連するプロテアーゼ（のプロ領域）に見出される。実験の部に、カテプシン様プロテアーゼのプロ領域から誘導されるかかるペプチドについて記載する。技術上周知ではあるが、合成ペプチドはアミノ酸を他のものと置き換えることによりより免疫原性とすることができる。また、かかるペプチドの１個もしくは複数個のアミノ酸を欠失させるかあるいは挿入することが一般的である。指針となっているのは、ペプスカン（PEPSCAN）などの技法あるいは置換−ネット地図作成法を用いることであり、この方法によりより免疫原性の高いペプチドが当初のペプチド配列から誘導される。免疫原性はさらにＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に置き換えることにより増強させることができる。本発明の好適な態様においては、かかるワクチンは少なくともカテプシン様プロテアーゼ（カテプシンＢ、Ｈ、Ｌ、Ｓなど）のプロ領域から誘導されるタンパク質またはその（ペプチド）断片からなり、たとえば、エス・マンソーニ（S. Mansoni）、トリポナゾーマ・クルゼイ（Tryponasoma Cruzei）またはティー・コンゴレンス（T. Congolense）から誘導されるもの、または、たとえば、ニワトリ、ラットまたはヒトの生体から誘導される脊椎動物カテプシンあるいは他のカテプシン様プロテアーゼからのものである。かかるプロテアーゼのプレ−およびプロ領域を同定する切断部位は、配列特性を比較することにより、そしてたとえば、フォン・ハイジン（Von Heijne）規則に従って容易に見出すことができる。かかるタンパク質またはワクチンの防御値もしくは能力を評価または測定することは、勿論、本発明が提供する生体外モデルにより実施することができる。当該ヌクレオチド配列は単独で、または適切なベクター系もしくは構築物に取り込んで、DNA予防接種プロトコールに採用することもできる。かかる配列は、たとえば、本発明が提供する防御タンパク質に対応する（部分的に）既知のアミノ酸配列から推定される変性プライマーを用い、PCRなどの増幅技術により誘導することができる。増幅したヌクレオチド断片はクローン化し、標準的技術により配列決定し、かくして、本発明が提供する防御タンパク質または（ポリ）ペプチドをエンコードする遺伝子もしくはその断片の単離したヌクレオチド配列を提供する。かかるタンパク質または断片は、単離したおよび/または組換えた形態において、ワクチン抗原として単独で、またはワクチンとして作用する他の製剤と組み合わせて使用するか、あるいは診断試験における診断用抗原として使用することができる。また、抗体はポリクローナルまたはモノクローナルまたは合成抗体であるか、または抗体断片であり、本発明が提供する防御タンパク質もしくは（ポリ）ペプチドに対して特異的に方向づけられているか調製された抗体であって、これらも本発明の一部である。さらに、当該防御タンパク質または当該タンパク質に対する抗体または当該タンパク質をエンコードするヌクレオチドも本発明の一部である。さらに、当該タンパク質を除くタンパク質、または当該タンパク質に対する抗体を除くタンパク質に対する抗体を測定する診断試験法であって、その場合、当該診断試験法が当該タンパク質を特異的に含むワクチンの使用のために同時試験法として用いるように特別に設計されている試験方法も本発明の一部である。かかる同時試験法により感染動物を予防接種動物から識別し得る。かかる診断試験法の一例を本明細書の実験の部に示してある。明細書中にはプロ領域から誘導される防御エピトープに対する抗体が、酵素の成熟部分に対する抗体から識別し得ること、そしてそれが感染動物を予防接種動物から識別するのを可能にすることを示している。勿論好ましいのは、本発明により提供されるような、プロテアーゼなどの酵素のプロ領域から誘導されるタンパク質（断片）からなるワクチンで動物を予防接種することである。かかる識別は、動物を酵素活性保持（成熟）プロテアーゼで予防接種する場合には可能でない。
本発明の好適な態様において、ワクチンは主にプロテアーゼのプロ領域から誘導されるタンパク質（断片）からなり、一方、診断試験法用のものは主に当該プロテアーゼの成熟酵素部分から誘導されるタンパク質（断片）かららる。かかるワクチンをかかる試験法と組合わせることにより、制御された寄生虫の感染撲滅が可能となる。
さらに、本発明はカテプシン様プロテアーゼ上の免疫優性種特異エピトープに対する抗体を測定する診断試験法を提供するが、ここで当該種とはファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）である。当該試験法は、たとえば、ペプチドMCF04に相当するペプチド、またはそれに関連するペプチドからなり、たとえば、ファシオーラ・ヘパチカで感染した動物を、他の方法では全体としてカテプシンＬプロテアーゼと強力な免疫反応性を示すディー・ビビパラス（D.viviparus）などの他の寄生虫を注射した動物から生物学的に識別するのを可能とする。
上記のように、また、本明細書の実験の部に本発明を制限するものではないものとしてさらに記載したように、本発明はとりわけ防御タンパク質またはそこから誘導される抗原性断片、および関連する核酸配列を提供するが、それらは少なくとも、たとえば、寄生虫感染症において、たとえば、ワクチンに包含させるための、プロテアーゼなどの酵素から誘導されるアミノ酸配列もしくはプロ領域からなるか、および/またはエンコードするものである。本発明は動物、好ましくは哺乳動物にいてかかるワクチンを使用する方法を提供する。ワクチン候補は、たとえば、反芻動物、たとえば、ファシオーラ感染を受け易い反芻動物、あるいはヒト、たとえば、シストゾーマ感染を受け易いヒトにおいて寄生虫感染に対し防御するためのワクチンである。
実験の部
材料と方法
ラット
特定の病原体をもたないメスのウイスターラット（チャールス・リバー、ザルツフェルド）をすべての実験で選択した。ラットには食餌と水を任意に与えた。一次および攻撃感染の１６時間前にラットの食餌を奪った。ラットは一次感染時または初回予防接種時に６週令であった。ラットは攻撃感染時に１０週令であったが、ただし、抵抗性存続期間の研究に使用したラットは例外である。これらのラットは攻撃感染時１９週令であった。
ファシオーラ・ヘパチカ
ファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）被嚢幼虫をID−DLO研究所内で産生した。被嚢幼虫のin vitro脱嚢はスミスおよびクレッグ（Smith & Clegg）（１９８１）の方法により実施した。NEJsの脱嚢直後に顕微鏡下（倍率１６０ｘ）計数した。NEJsは使用時（脱嚢後１時間以内）まで、３００μlのRPMI−１６４０培地（ICN−バイオメディカルBV、ゾエテルメール、オランダ）中、３７℃に保持した。
一次感染
２５個のファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）被嚢幼虫を水道水１mlとともに経口投与した。病原体を送達した後、被嚢幼虫の送達チェックのために注射器とカニューレを水で洗い流した。後に残った被嚢幼虫をもう１mlの水道水とともに投与した。
抵抗性の発現
総抵抗性。標的臓器である肝臓に到達した攻撃寄生虫数の計量。
ファシオーラ・ヘパチカに対する防御の総レベルを測定するために、ラットに正確に２００個の被嚢幼虫を経口攻撃した。病原体を送達した後、被嚢幼虫の送達チェックのために注射器とカニューレを水で洗い流した。後に残った被嚢幼虫をもう１mlの水道水とともに投与した。攻撃の３週間後に感染ラットを殺し、肝臓を取り出して、５０mlのRPMI−１６４０培地を容れた別々のペトリ皿に入れた。肝臓を３７℃で培養した。（６時間まで）一時間ごとに肝臓を小片に切断し、あらたなペトリ皿に入れた。回収したNEJsを計測した。
消化管レベルでの抵抗性：生体外感染モデルを使用しての消化管壁に浸入したNEJs数の計量
ラットをエーテル吸入により麻酔し、その後直ちにネンブタール（nembutal）（コンパーニ・ラウセロット、パリ、フランス）５０mg/kgを腹腔内に、また、アトロピン（atropin）（AUV、クイック、オランダ）０．０５mg/kgを皮下注射した。実験手続の間に追加のネンブタール（１６mg/kg）をエーテル吸入の３時間後に皮下注射した。麻酔の４５分後に横隔膜の下を切開（１．５cm）し、約７cmの長さの小腸ループを体腔から取り出した。約５cmの分節を２本のリンネル糸（ビー・ブラウン（B.Braun）、メルスンゲンAG）により胃からの標準位置で区割した。腸管の異なる位置での抵抗性を検討するために、十二指腸（胃から１〜５cm、ｎ＝６）、中央空腸（胃から４０〜６０cm、ｎ＝６）および回腸（胃から７０〜９０cm、ｎ＝６）の各分節を調製した。バーデン（Burden）ら（１９８３）の方法に従い、NEJsを各分節に注射した。注射後、針と注射器を培地１mlで３回ペトリ皿中に洗い流した。培養の間に注射器および/または針中の後に残ったNEJsを顕微鏡下に計量し（残余フラクション）、感染用量を計算した（計測用量マイナス残余フラクション）。実験の間、各分節を含む各消化管ループを体腔外に維持し、切開部を１または２個の留め金で閉じた。実験ごとに８匹のラットをパースペックスプレート上に横たえ、消化管ループをプレートの孔に通し、RPMI−１６４０培地の表面より十分下になるように５０mlビーカー内に固定せずに吊るした。培地５０mlの入ったビーカーを１時間ごとに取り替え、消化管壁を通してビーカー内に移動したNEJsを光学顕微鏡により定量した（腹膜フラクション。倍率１００ｘ）。実験の間、全システムを体温に維持した。体温の測定が指示通りに必要な場合、１）該ビーカーを３７℃の水浴に入れることにより、２）ラットが横たわっているパースペックスプレートの下にセントラルヒーターから温水をポンプで送りラットを暖めることにより、そして３）赤外線ランプによりラットを暖めることにより実施した。６時間後ラットを殺し、消化管分節を取り出し、分節サイズおよび胃までの距離を測定した。分節の管腔を培地で洗い流し、消化管管腔に残るNEJsを光学顕微鏡により定量した（管腔フラクション）。最終的に該分節を「スイスロール」法（ベクスター、１９８２）によりメチルブタン（−１５０℃）中に固定し、免疫組織化学用に−７０℃で保存した。
生体外消化管モデルの再現性
実験後、消化管壁（消化管フラクション）に残るNEJs数を定量するために、各消化管分節を１０μｍの凍結切片に切断した。第５切片ごとに集めてNEJ（NEJサイズ±１００μｍ）を評点し、風乾してアセトン（メルク）中１０分間固定した。固定化および引き続く洗浄、培養はすべて室温で実施した。固定化後、消化管壁のペルオキシダーゼ活性をブロックした。各切片を２％NaN3および０．２％H2O2を含む０．１Ｍトリス−HCl（pH７．５）中で２０分間培養した。各切片をトリス緩衝塩溶液（TBS、pH７．４）にて５分間３回洗浄し、3, 3’−ジアミノベンチジン１mg/ml（シグマ、セントルイス、米国）および０．０１５％H2O2を含む０．１Ｍトリス−HCl（pH７．５）中で５分間染色し、リン酸緩衝塩溶液（PBS；pH７．６）にて５分間３回洗浄し、次いで、２％正常ラット血清（NRS）および４％ウシ免疫血清を含むPBS中で１時間培養した。この血清は５ヵ月令の子ウシにファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）被嚢幼虫４５００および２２５０を１１週間の間隔で２度経口感染させることにより調製した。抗血清は２度目の感染８週後に取得した。PBSで３回洗浄した後、各断片を２％NRS/PBS中１：５００に希釈したペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ウシ免疫グロブリン（ダコパット、グロストラップ、デンマーク）と１時間培養した。次いで、洗浄し、ペルオキシダーゼ活性を、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（シグマ、セントルイス、米国）０．２mg/mlおよび０．０１５％H2O2を含む０．０５Ｍ NaAc（pH４．４）の新たに調製し濾過した溶液中で８分間培養することにより可視化した。染色後、切片を水道水流中で洗浄し、アクアマウント（BDHラボラトリー・サプライ、プール、英国）に載せた。顕微鏡下にNEJｓを計数し、NEJsを二度評点するのを防止するために連続する断片を比較した。
抵抗性の誘発
消化管レベル
１）ラット５匹を２５個の被嚢幼虫で経口感染させ、４時間後に殺吸虫剤トリクラベンダゾール（１００mg/kg、ファシネックス、チバ−ガイギー、バーゼル、スイス）で処理した。殺吸虫剤での処理はその後３日繰り返した。５週後に、消化管レベルでの抵抗性発現につき生体外消化管モデルを用いて測定し、肝臓での「突破個体」感染を剖検にて調査した。ファシネックスが攻撃寄生虫の消化管壁貫通移動に影響しないことを確認するために、非感染ファシネックス処理ラットを攻撃対照として用いた。
２）ラット４匹につき１８〜２５個のNEJsを空腸に直接注入した。４時間にわたり、消化管壁に浸入するNEJsについて生体外消化管モデルを使用し捕捉した。一次感染に際し、ラットを腹腔内注射によりケタミン（ketamine）（４０〜６０mg/kg；アルファザン、ウエルデン）で、また、皮下注射によりキシラジン（xylazine）（３〜８mg/kg；ロンパン、バイエル、ドイツ）およびアトロピン（atropine）（０．０５mg/kg）で麻酔した。感染の前日および翌日にラットを抗性物質デュオプリム（duoprim）（０．５ml/kg、皮下、ピットマン−ムーア、ハウテン）で処理した。鎮静剤フィアジン（fiadyne）（１mg/kg、筋肉内、シェリング−プラウ、アムステルベーン）を感染後最初の３日間投与した。４週後、消化管レベルでの抵抗性発現を測定し、肝臓での「突破個体」感染を剖検にて調査した。
腹膜腔/肝臓
一次感染のNEJsを腹膜腔（ｎ＝３、１３〜１７個NEJs）内または肝臓葉（ｎ＝８、７〜２５個NEJs）間に注射した。肝臓感染に対しては小さな切開（１cm）を横隔膜下に設けた。NEJsを１００μlのRPMI−１６４０とともに肝臓葉間に注射した。この操作手技の間、ラットは上記のように麻酔した。腹膜腔感染のラットについてはエーテル吸入で麻酔し、その直後にNEJsを腹腔内注射した。
ファシオーラ・ヘパチカ抗原抽出物の調製
in vitroで脱嚢後、NEJsをPBSで洗浄した。NEJs３００mgをPBS３ml中、氷上３０秒間５回、２０kHzで超音波処理した（ソニコールUPP−４００、ソニコール・インストルーメント・コーポレーション−コパック、ネバダ）。懸濁液を４℃で一夜抽出し、その後再度超音波処理した。抽出物を１０，０００ｇで２０分間遠心分離し、上清１ml量を−７０℃に保存した。抽出物中のタンパク質濃度はブラッドフォードアッセイによる定量の結果３mg/mlであった。
ファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）成虫をウシの肝臓から取得し、HMEM−培地および、次いでPBSで４℃にて完全に洗浄した。吸虫をソルバール・オムニミキサー（モデル１７１０６）にて氷上３０秒間１０回磨り潰した。次いで、上記同様、超音波処理および抽出処理を実施した。
YM−３０濾過NEJ−抗原
新たに調製したNEJ抽出物（３mg/ml抽出物１０ml）をPBSで希釈して３０mlの用量とし、１６℃、１バールでYM−３０膜（アミコン、６２mm）により濾過した（アミコン・モデル８２００）。残余フラクション５mlにPBS５mlを補給し、再度濾過して残余フラクション５mlとした。この操作は２度繰り返した。最後に、濾液４０ml（２５μg/ml）を１ml量−７０℃にて保存した。さらにタンパク質を含む（すなわち、１８３μg/ml）他の濾液を調製し、同様に保存した。
予防接種法
ラットに１００μｇのNEJまたは成虫期ファシオーラ・ヘパチカ抗原を腹腔内注入した。３週間後に、抗原５００μｇにより腹腔内に追加免疫した。追加免疫の１週間後に攻撃感染に対する抵抗性を定量した。防御の総レベルを測定するために、ラットに２００個の被嚢幼虫を経口攻撃投与し、また、消化管レベルで発現される防御レベルを測定するために、ラットにNEJsを空腸内攻撃投与した（回収手法については「抵抗性の発現」参照）。
用いたYM−３０濾液の用量は、一次および追加の免疫に対してそれぞれ２０μｇおよび６５μｇであった。
SDS−PAGEおよびウエスターン・ブロッティング
ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）を、トリス−トリシン緩衝系（シェッガーおよびホン・ヤゴウ
１９８７）および１０〜２０％（w/v）ポリアクリルアミド・グラジエント・ゲルまたは１５％スラブゲル（８ｘ１０cm）を用い実施した。タンパク質１２．５μｇ（ゲル当たり）をβ−メルカプトエタノールの存在下ゲルに塗布した。NEJタンパク質の分子量を決めるために、BRLから入手した予染色MWマーカー（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ、ブレダ、オランダ）をゲルに加えた（MW範囲：１４．３〜２００kD）。２０mAで３．５時間電気泳動した後、１０％メタノール中１０mM ３−シクロヘキシルアミノ−１−プロパンスルホン酸（CAPS）（pH１１）（アルドリッチ）を含む緩衝系により、分離したタンパク質を電気泳動的にポリビニリデンジフロリド（PVDF）型膜（アプライド・バイオシステム・インク）に移した（１６時間、２０ｍA、RT）。
Ｎ−末端配列決定
ブロットしたタンパク質を０．１％クマシーブリリアントブルーＲ−２５０（CBB）（シグマ）で染色し可視化した。CBB染色した領域または血清によりイムノブロッティング染色したタンパク質バンドをPVDF膜から切り出し、２cmの膜をアプライド・バイオシステムのタンパク質配列決定システム（モデル４７６Ａ）によりエドマン分解配列決定に付した。分析はユトレヒト大学の「生体膜および脂質酵素学研究センター（The Centre for Biomembrane and Lipid Enzymology）」生化学部門にて実施した。
免疫学的染色
免疫染色のために、４mmのPVDFストリップをPBS−０．５M NaCl−０．０５％トゥイーン−８０、pH７．２（PBS−NT）中、１０％正常ウサギ血清で１時間飽和した。次いで、ストリップを２％NRS含有PBS−NT２ml中、４０μｌのラット血清または４０μｌの子ウシ血清で１６時間培養した。子ウシ血清は４５００個のファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）被嚢幼虫で経口感染して１２週後の５ヵ月令の子ウシから採取した。２％NRSを含むPBS−NT２ml中、２０μｇのmAb抗ラットIgG1（培養上清、TNOライデン、オランダ）および１６μｇのmAb抗ウシIgG1（バン・ザーネ（van Zaane）ら）と３時間培養した後、２％正常ラット血清を含むPBS−NT中１/５００に希釈したHRPO−結合ウサギ抗マウスIg（ダコパット）を２時間添加した。基質としてクロロナフトール（シグマ；トリス緩衝塩溶液（pH７．４）中０．５mg/mlの４−クロロ−１−ナフトールおよび０．０１５％H2O2）を用いた。基質添加１時間後、ストリップを蒸留水で洗浄することにより染色を停止させた。
培養はすべて室温で実施し、培養工程間にはすべてストリップを１０分間内に３度PBS−NTで洗浄した。
ペプチド合成
試薬
Ｎ−メチルピロリドン（NMP）、N,N−ジメチルホルムアミド（DMF）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）、２−（1H−ベンゾトリアゾール−１−イル）−1,1,3,3−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート（HBTU）およびピペリジンはペプチド合成用基準のものであり、パーキン・エルマー/ABI（ワーリントン、英国）から入手した。アセトニトリルはグラジエント用基準のものであり、ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）、トリフルオロ酢酸（TFA）、チオアニソール（TA）、フェノールおよびエタンジチオール（EDT）は合成用基準のものであり、メルク（ダルムシュタット、ドイツ）から入手した。使用前、ジエチルエーテルは活性化した塩基性酸化アルミニウムのカラム上で精製し、DIEAはニンヒドリンおよび水酸化カリウム上２度蒸留した。Fmoc−アミノ酸誘導体およびリンク樹脂（４−（2’,4’−ジメトキシフェニル−Fmoc−アミノメチル）フェノキシ樹脂）はサクソン・バイオケミカルズ（ハノーバー、ドイツ）から入手した。
ペプチド合成
５種類のペプチドは鎖長約２０アミノ酸のものをウイジュフェルズ（Wijffels）（１９９４）らからのカテプシンLの配列に従って製造した。該ペプチドはジェイムソンおよびウオルフ（Jameson and Wolf）が記載した抗原性指標に基づき、分子上の可能性のある免疫原性決定基から誘導した。ペプチドMCF 03およびMCF06はカテプシンLのプロ配列から誘導し、ペプチドMCF05、MCF04およびMCL13は当該分子の酵素部分から誘導した。ペプチドMCF03はアミノ酸１５〜３３（Gly-Ser-Asn-Asp-Asp-Leu-Trp-His-Gln-Trp-Lys-Arg-Met-Tyr-Asn-Lys-Glu-Tyr-Asn）、ペプチドMCF06はアミノ酸２５〜４２（Lys-Arg-Met-Tyr-Asn-Lys-Glu-Tyr-Asn-Gly-Ala-Asp-Asp-Gln-His-Arg-Arg-Asn）、ペプチドMCF05はアミノ酸１０３〜１２２（Ala-Asn-Asn-Arg-Ala-Val-Pro-Asp-Lys-Ile-Asp-Trp-Arg-Glu-Ser-Gly-Tyr-Val-Thr-Glu）、ペプチドMCF04はアミノ酸１１０〜１２９（Asp-Lys-Ile-Asp-Trp-Arg-Glu-Ser-Gly-Tyr-Val-Thr-Glu-Val-Lys-Asp-Gln-Gly-Asn-Cys）およびペプチドMCL13はアミノ酸２９６〜３１１（Gly-Glu-Arg-Gly-Tyr-Ile-Arg-Met-Ala-Arg-Asn-Arg-Gly-Asn-Met-Cys）をそれぞれ包含する。該ペプチドの分子質量は予測値に対応していた。
我々は３０mmolスケールで４０種までのアミノ酸を同時に合成するためにハミルトン・ミクロラブ２２００（レノ、ネバダ、米国）を使用した。ハミルトン・ミクロラブ２２００は、ペプチド合成用樹脂を含み、洗浄用溶媒と試薬を２０本の個々にフィルターを備えた４mlカラムをもつ２つのラックに搬送するようにプログラムした。カラムは各工程ごとに自動的に真空乾燥した。カップリングサイクルは４０分の二重カップリング工程によるFmoc/HBTUの化学（フィールズ（Fields）ら、１９９１）に基づいた。ペプチドMCF03、MCF06およびMCR05はＮ−末端に追加のシステインをもつように合成した。最終アミノ酸をカップリングさせた後、Fmoc基を３０％（v/v）ピペリジン/NMPで３分および１５分処理して除去した。ペプチドをNMPで洗浄し（５回）、NMP/無水酢酸/DIEA（１０/１/０．１；v/v/v）で３０分間アセチル化し、NMPおよびエタノールで連続的に洗浄し、次いで乾燥した。ペプチドをTFA/フェノール/TA/水/EDT（１０/０．７５/０．５/０．５/０．２５、v/w/v/v/v）の混合物１．５mlを用いて２時間脱保護し、切断し、次いで、ヘキサン/ジエチルエーテル（1/1；v/v）を加え２度沈殿させた。沈殿を乾燥し、水/アセトニトリル（1/1；ｖ/ｖ）から凍結乾燥した。
HPLCおよびマススペクトロメトリー
分析用HPLCとして、我々は２つのウオーターズ・ポンプ・モデル５１０、ウオーターズ・グラジエントコントローラー・モデル６８０、ウオーターズWISP７１２オートインジェクター、およびウオーターズ９９１ホトダイオード・アレイ検出器を使用した。マイクロマス・クアトロIIsqマススペクトロメーターをHPLCシステムと組合わせて、エレクトロスプレーイオン化による個々のピークの分子質量を定量するために用いた。産生物はウオーターズ・デルタ・パックＣ１８−１００Aカラム（３．９×１５０mm、５mm）上、０．１％（v/v）TFAを含む１０％（v/v）アセトニトリル/水から０．１％（v/v）TFAを含む７０％（v/v）アセトニトリル/水までの３０分の直線勾配により１ml/分で分析した。
ペプチドとキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）との接合
ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）を用い、ペプチドをKLHキャリアー・タンパク質に接合させた。１mgのKLH（カルビオケム、０．１Mリン酸緩衝塩溶液中１０mg/ml、pH７）に、MBS１００ml（ピアース、ジメチルホルムアミド中４０mg/ml、メルク）およびアセトニトリル３００mlを滴下し、その混合物を氷上１時間培養した。次いで、PBS１．１mlを加え、活性化したキャリアーをPD１０カラム（ファルマシア）を用い、過剰のMBSから分離した。ペプチド１mgを活性化KLH２．３mgに加え、室温で１時間培養した。次いで、ペプチドと接合体をPBSに対する透析により分離し、該接合体を−２０℃で貯蔵した。
カテプシンLから誘導された合成ペプチドによるラットの予防接種
ラット（１群４匹）の後肢大腿筋にペプチド１００mgを以下のように予防接種した。（i）PBS中、（ii）製造業者の指示書に従いスペコール（specol）（イド−ドロ（id-dlo）、ライシュタッド）と混合して、（iii）KLHに接合し、スペコールと混合して。３週間後、腹腔内追加免疫をスペコールは使用せずに対応するペプチド１００mgで実施した。追加免疫１週間後にラットを経口攻撃し、３週間後に肝臓の寄生虫負荷を測定した。
PCR、サブクローニングおよび配列決定
クイックプレップｍRNA精製キット（ファルマシア・バイオテック）を使用し、充填NEJs４５０μl（±４５．０００NEJs）および２個のエフ・ヘパチカ（F. hepatica）それぞれからｍRNAを単離した。
第一鎖ｃDNA合成キット（ファルマシア・バイオテック）を使用し、ｃDNAを製造した。PCR増幅反応は、ｃDNA１００ng、２．５mM MgCl2、２００μM−ｄTNPs、１．０８〜１．４６μMのエフ・ヘパチカ（F. hepatica）特異プライマーまたは１μMオリゴ（dT）、およびTaq DNAポリメラーゼ・ゴールド（パーキン・エルマー）０．５単位を含むPCRバッファーII（パーキン・エルマー）２５μl反応容量で実施した。特異カテプシンＬ配列を増幅するために用いたオリゴヌクレオチド・プライマーセットの配列は以下のとおりであった。
増幅反応はあらかじめ加熱したパーキン・エルマー・シータスDNAターマル・サイクラー（８０℃）中９２℃１０分間実施し、次いで、９４℃で３０秒、６２℃で３０秒、および７２℃で２分、３０サイクル実施した。
増幅した断片を製造業者の指示書（TAクローニングキット、インビトロゲン）に従い、ｐCRTMIIベクターのLacZ遺伝子にTAクローニングにより挿入した。TAクローニング・ワンショット適格細胞の形質転換の後、挿入断片を包含するクローンをその白色により識別した。挿入断片のサイズを確認するために、ウイザード・プラス・SVミニプレップスDNA精製システム（プロメガ）を用い、プラスミドDNAを単離し、製造業者の指示書に従い、BamHIおよびEcoRV（ファルマシアLKBバイオケミカルズ）により消化した。
クローン化物質の配列決定はサンガー（Sanger）ら（１９７７）記載の鎖終結反応を用い実施した。各生産物の内、少なくとも２つの陽性クローンにつき、Ｍ１３逆進および前進プライマー両方を用い配列決定した。これらのプライマーを用いたが、我々はプロカテプシンＬ分子全体の配列決定を一度ではなしえなかった。失われた部分の配列決定のために、得られた分子配列に基づき、追加のプライマー（5’〜3’）を設計した。
これらのプライマーについて、その位置がウイジュフェルズ（Wijffels）ら（１９９４）からのカテプシンＬ配列に関するものであるので、前進（fw）配列かまたは逆進（rv）配列かその用途が示される。
ウシおよびヒツジのエフ・ヘパチカ感染診断用カテプシンＬペプチド酵素標識免疫吸着測定法（ELISA）
実験用血清
モノ特異抗ファシオーラ血清を得るために、寄生虫の汚染なしに飼育した５〜８月齢のホルシュタイン・フリシアン子ウシ２４頭にファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）被嚢幼虫１００〜３０００個を感染させた。血清標本は週間隔で採取した。糞便中の卵数を週ごとに計測することにより、子ウシの感染をモニターした。屠殺時、すべての子ウシの胆管に吸虫を検出した。さらに、４ないし８月齢の子ウシにディクチオカウラス・ビビパラス（Dictyocaulus viviparus）（Dv、ｎ＝４）、オステルタギア・オステルタギ（Ostertagia ostertagi）（ｎ＝１）、ネマトディラス・ヘルベチアヌス（Nematodirus helvetianus）（ｎ＝１）、コーペリア・オンコホーラ（Cooperia oncophora）（ｎ＝１）またはアスカリス・スウム（Ascaris suum）（ｎ＝１）を単回感染させた。血清標本はすべての感染子ウシが寄生虫卵またはディクチオカウラス・ビビパラスの幼生を排出したときに採取した。これら血清に関する詳報は別途提供する（デ・リーユ（de Leeuw）ら、１９９３）。
寄生虫の汚染なしに飼育した３月齢と１２月齢の間のテクセル種メスヒツジ５頭にファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）被嚢幼虫２０個を感染させた。血清標本は週間隔で採取した。糞便中の卵数を週ごとに計測することによりヒツジの感染をモニターした。屠殺時、すべてのヒツジの胆管に吸虫を検出した。ヘモンチャス・コントータス（Haemonchus contortus）に対する単一特異血清（ｎ＝１２）は５，０００ないし２０，０００個用量の幼生で繰り返し（５〜５０回）感染させたヒツジからのものであった。オステルタギア・サーカムシンクタ（Ostertagia circumcincta）に対する抗血清（ｎ＝８）は３０，０００個の幼生で単回感染させたヒツジからのものであった。テニア・オビス（Taenia ovis）に対する単一特異血清（ｎ＝８）はテニア・オビスの卵で汚染された牧草を食べたヒツジからのものであった。屠殺時、すべてのヒツジに嚢尾虫が認められた。コーペリア・オンコホーラ（Cooperia oncophora）に対する単一特異血清（ｎ＝１２）は２０，０００個の幼生で単回感染させたヒツジからのものであった。ネマトディラス・バッタス（Nematodirus battus）に対する単一特異血清（ｎ＝３）は５，０００個の幼生で５回感染させたヒツジからのものであった。血液標本は、感染したヒツジすべてが寄生虫卵または接合子嚢を排泄する感染後１０〜１５週目に採取した。陰性対照血清は寄生虫未感染ヒツジ（ｎ＝１２）から採取した。
ファシオーラ・ヘパチカの排出/分泌産物からのカテプシンＬの精製
実験的に感染させたウシの胆管から採取した吸虫成虫を０．０１Ｍ PBS（pH７．０）で１時間３〜４回洗浄した。吸虫２０匹をストレプトマイシン（１００μg/ml）およびペニシリン（１００IU/ml）含有HMEM培地１リットル中３７℃で６日間培養した。培地は毎日取り替え、３〜６日目から採取した上清をプールした。このプールを４℃、１０，０００ｇで１時間遠心分離し、上清を使用時まで−７０℃で保存した。平均タンパク濃度は１０μg/mlであった。総タンパク収量は吸虫１０ｇ当たり１mgであった。
これらの排出/分泌抗原をYM−３０膜（アミコン）により濾過した。濾液のpHを０．５Ｍトリス−HCl（pH１１）でpH９．５に調整し、０．０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（pH９．５）により平衡化したジエチルアミノエチル（DEAE）−セファセル・カラム（ファルマシアLKB、ウプサラ、スウェーデン）上のイオン交換クロマトグラフィーに付した。濾液を添加後、DEAE−セファセル・カラムを２００mM NaCl含有の０．０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（pH９．５）で洗浄した。次いで、カラムを５００ｍＭ NaCl含有の同一緩衝液で溶出した。溶出液をSDS−PAGE、エレクトロブロッティングおよびCBB染色に付し、１つのタンパク質バンドを示した。１５個のＮ−末端アミノ酸、Ala-Val-Pro-Asp-Lys-Ile-Asp-Trp-Arg-Glu-Gln-Gly-Tyr-Val-Thrは、ウイジュフェルズ（Wijffels）ら（１９９４）のカテプシンＬ配列との相同性９５．４％を示した。
ELISA手法
ペプチドMCF02、MCF03、MCF04、MCF05およびMCL13それぞれ１００μｇを０．０１Ｍリン酸緩衝液（pH７．５）に溶かし、ELISAプレート（グライナー．６５５００１、アルフェン・アーン・デ・リジュン、オランダ）に固相化し、４℃で一夜培養した。陽性対照として、０．０５Ｍ炭酸緩衝液（pH９．５）に溶かした精製カテプシンＬ１００μｇでプレートを固相化し、３７℃で一夜培養した。各培養工程の間に、０．０５％トゥイーン−８０の水道水溶液でプレートを３回洗浄した。さらなるプレートのブロッキング工程と乾燥は「社内方法」により一夜で実施した。子ウシまたはヒツジの血清１００μｇを０．０５％トゥイーン−８０および０．０５Ｍ NaCl含有の０．０１Ｍリン酸緩衝液（pH７．５）に１/２５に希釈し、添加して３７℃に１時間保持した。ウシIgG1に対するHRPO−接合モノクローナル抗体（１/３０、イド−ドロ（id-dlo）、ライシュタッド）およびポリクローナル抗ヒツジIgG（１/１５．０００、ダコパット）を０．０５％トゥイーン−８０、０．５Ｍ NaClおよび１％正常ウマ血清含有の０．０１Ｍリン酸緩衝液（pH７．５）に溶かして添加し、３７℃に１時間保持した。基質としてテトラメチルベンチジン（０．１Ｍ酢酸ナトリウム/０．１Ｍクエン酸緩衝液（pH６．０）中の０．００５％H2O2および１mg/ml TMB）を使用した。基質添加５分後、反応を０．５Ｍ H2SO4で停止させ、簡易読取りスペクトロホトメーター（SLT、ウイーン）により４５０nmでの吸光度を測定した。陽性および陰性間のカットオフ値は、寄生虫未感染ヒツジまたはウシから得られたそれぞれの血清のOD４５０ｎｍにおける標準偏差の三倍値プラス平均値として計算した。
結 果
生体外消化管モデルの再現性
我々の感染・免疫モデルにおけるNEJ適格試験の精度を１８匹のラットで試験した。まず、我々は正確な感染用量を決めた。正確な数のNEJs消化管分節に接種した後、針と注射器に残ったNEJsを計測した。この残余フラクションは接種用量の平均２４％（６〜５６％の範囲）あり、接種用量から差し引いた。接種６時間後、我々は腹膜フラクション、管腔フラクションおよび消化管フラクションを（免疫組織化学的手法を用いて）定量し、これらフラクションの合計を感染用量（４ないし７８NEJs/cmの範囲）と比較した。腹膜フラクションは４ないし３３NEJs/cm（感染用量の４３〜８０％、平均５７％）の範囲にあり、管腔フラクションは０ないし１０NEJs/cm（０〜６％、平均１％）、また、消化管フラクションは０．２ないし１９NEJs/cm（６〜４４％、平均３２％）である。回収されたNEJsの平均総量合計は感染用量の８７％（±３．６％、平均値標準誤差（SEM））であり、これは消化管モデルの再現性の程度を表している。
抵抗性の発現
ファシオーラ・ヘパチカによる感染が消化管レベルでの攻撃に対する抵抗性となる
ファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）による経口感染の４週間後、ラットは殆ど完全に攻撃感染に対して防御された。感染ラットの肝臓に到達した攻撃寄生虫の数は未処理ラットに比べ、９７％（±１．１％平均値標準誤差、ｎ＝１３）減少していた。
ファシオーラ・ヘパチカに対する抵抗性の大部分は、寄生虫の浸入部分である消化管粘膜で発現された。免疫ラットと未処理ラットの腸管壁を通過するNEJsの移動を、生体外消化管モデルを使用して比較した。免疫ラットにおいては攻撃後２時間以内に抵抗性が発現された。６時間後、移動が完了したとき、攻撃NEJsの５２％（±２．３７％平均値標準誤差、ｎ＝４０）が未処理ラットの空腸に浸入し、一方、免疫ラットでは１２％（±１．７７％平均値標準誤差、ｎ＝４０）が消化管壁を通過しただけであった。このように、感染の結果として空腸壁を通過移動するNEJは７８％減少していた。相当の抵抗性が十二指腸（NEJ移動として５０％減少）、中央空腸（６５％減少）および回腸（７５％減少）にも検出された。このように、小腸全体が重要な免疫防壁である。抵抗性の期間は少なくとも３ヵ月であった（ｎ＝６）。
抵抗性の誘発
ファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）に対する抵抗性が誘発される宿主の部位を検討するために、我々は寄生虫の感染経路、消化管粘膜−腹膜腔−肝臓を辿った。
抵抗性の誘発における消化管浸入の役割を以下の方法により検討した。一次感染NEJsが消化管に浸入した後のさらなる肝臓への移動は、１）ラットを殺吸虫剤で処理すること、または２）生体外消化管モデルを用いNEJsを捕捉することにより防止した。消化管浸入後ラットの殺吸虫剤処理およびNEJs捕捉の両方が肝臓へのさらなる移動を防止した。感染４週後、すべてのラットは健常所見の肝臓を有していたという理由による。驚くべきことに、攻撃感染に対して防御されたラットはなかった。このように、消化管通過それ自身は消化管粘膜で発現されたファシオーラ・ヘパチカに対して抵抗性を発現しない。
腸管壁浸入後、ファシオーラ・ヘパチカは腹膜腔に入り、肝臓に向かって移動する。このルートは一次感染NEJsを腹膜腔内に、または肝臓葉の間に注射することにより模倣した。結果として、感染４週後、すべてのラットは攻撃感染に対し高度に抵抗性であった。防御の平均レベルは消化管レベルで７８．８％（±４．６％平均値標準誤差、ｎ＝１１）であった。明らかに、免疫は腹膜腔−肝臓ルートで誘発されるが、消化管通過の間には誘発されない。後期予防接種におけるこれらの結果に基づき、抗原は腹膜腔に注射した。
消化管粘膜におけるファシオーラ・ヘパチカに対する免疫機構
免疫ラットおよび未処理ラットの消化管分節を（免疫）組織化学用に調製し、免疫グロブリン、Ｔ細胞、NK細胞、杯状細胞、マクロファージ、粘膜肥満細胞および顆粒球の応答につき比較した。免疫ラットでは、粘膜肥満細胞、好酸球およびIgE−陽性細胞の頻度が、未処理ラットに比べて有意に増大した。免疫ラットの空腸分節に対するファシオーラ・ヘパチカでの再感染により、攻撃寄生虫が２時間以内に消化管粘膜において除去される。感染後のこの時間間隔において、攻撃NEJsはIgGlおよびIgG2a抗体で被覆された。同時に好酸球の浸透物がNEJsと関係していた。さらに、消化管レベルでの防御レベルは消化管粘膜での好酸球応答および血清中NEJ抗原に対するIgG1応答と強く相関していた。これらの観察はIgG1（およびIgG2a）抗体および好酸球が防御作用にとって本質的であることを示している。
予防接種の検討
ファシオーラ・ヘパチカの段階
最良の防御作用を誘発するファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）の発育段階を検討した。NEJsおよび吸虫成虫の抽出物を調製し、腹腔内に注射した。NEJ期からの抗原が遥かに優れていると思われた。消化管レベルで５７．３％（±６．２％平均値標準誤差、ｎ＝１０）の防御が達成されたのに対し、成虫段階の抗原では１３．３％（±６．２％平均値標準誤差、ｎ＝１１）の防御に過ぎなかった。
両段階からの抗原により誘発される総防御レベルを測定するために、標的臓器、肝臓に到達している攻撃寄生虫を回収した。ワクチンとしてNEJ抗原を用い、殆ど完全な防御作用が達成された。これらラットの防御レベルは９２．６％（±２．５％平均値標準誤差、ｎ＝１３）であった。成虫期抗原では５６．３％（±１５．９％平均値標準誤差、ｎ＝８）の防御作用となった。
NEJ抗原フラクションの単離
ウシおよびラットの血清による免疫ブロットの研究が免疫ラットによってのみ認識される２種類の低分子量（LMW）NEJ抗原（＞７０％防御作用）を解明したことにより、限られたNEJ抗原フラクションをYM−３０濾過により単離した。処理に際し、タンパク質の３％のみがYM−30膜を通過し、抗原数は５０以上から約５に減少した。このLMWフラクションでラットを予防接種すると防御作用は、標的臓器、肝臓に到達した寄生虫数に基づき、８０％（±１４％平均値標準誤差、ｎ＝１１）となった。試験したラット１１匹の内、６匹が１００％防御であったが、これはすべてアジュバントを使用しないものであった。また、消化管レベルでは相当の抵抗性、５４％（±１２％平均値標準誤差、ｎ＝７）が発現された。
ワクチン抗原の同定
YM−30濾液に存在する防御抗原を同定するために、タンパク質をSDS−PAGEにより分離した。該タンパク質をPVDF膜にエレクトロブロッティングした後、膜の異なる部分を免疫ブロッティング、タンパク染色およびＮ−末端配列分析にそれぞれ使用した。タンパク染色は５本のタンパク質バンドを示し、その分子量はそれぞれ大凡３０〜３２ｋＤ、２８ｋＤ、２５ｋＤ、２０ｋＤおよび１２ｋＤであった。これらのタンパク質の内、３０〜３２kDのタンパク質のみがYM−30単離物で予防接種したラットのすべて（ｎ＝６）により認識され、明らかに免疫優性であった。自然免疫ラットにおいて攻撃NEJsはIgG1抗体により被覆されること、また、血清中IgG1レベルが防御作用と強く相関するという観察から、我々は３０〜３２kDのタンパク質が防御抗原であると結論する。３０〜３２kDのタンパク質はまた、経口感染させたラット（ｎ＝６）、NEJ抽出物を予防接種したラット（ｎ＝６）、および経口感染させた子ウシ（ｎ＝６）によっても認識された。それに対し、該抗原は成虫期の抗原を予防接種したラットによっては認識されなかった。
逆に、吸虫成虫から得られたYM−30濾液の免疫ブロット上には、予防接種ラット、感染ラットあるいは感染ウシの血清との反応は観測されなかった。
３０〜３２kDのタンパク質バンドをPVDF膜から切出し、Ｎ−末端配列決定法を用いさらに同定した。当該タンパク質は配列XXDVSWPFWDRMY NY（ただし、アミノ酸を１文字コードで表す）からなるＮ−末端アミノ酸配列を表出していた。
３０〜３２kD免疫原のＮ−末端アミノ酸はツカルセビッチ（Tkalcevic）ら（１９９５）の記載のように、非還元条件下で４０kDのタンパク質であるNEJタンパク質４のＮ−末端と６９％の相同性を示した。ここに開示した３０〜３２kDのタンパク質のＮ−末端はファシオーラ・ヘパチカ成虫から誘導されるカテプシンＬのプロ配列との相同性５４％を示した（ウイジュフェルズ（Wijffels）ら（１９９４））。PVDF膜からの２８kDおよび２５kDのタンパク質Ｎ−末端を特性化して、以下の配列が明らかになった。
(i) XXWAVLVAGGSD。この配列はツカルセビッチ（Tkalcevic）ら（１９９５）によるNEJヘモグロビナーゼのＮ−末端と７０％の相同性を示した。
(ii) DVPASIDWRQYGYVTEVKDQ。この配列はツカルセビッチ（Tkalcevic）ら（１９９５）によるNEJカテプシンＬのＮ−末端と９５％相同であり、ウイジュフェルズ（Wijffels）ら（１９９４）による成熟カテプシンＬのＮ−末端（１０７〜１２６アミノ酸）と８０％相同である。
Ｎ−末端配列分析と同時に行った免疫ブロッティングの研究は、プロカテプシンＬが免疫優性防御抗原であり、一方、酵素的に活性なカテプシンＬは場合により免疫ウシまたはラットにより認識されるのみであるということを示している。カテプシンＬのプロ配列（プロ領域）の存在は免疫原性と防御作用にとって重要であることを我々はここに示す。さらに、当該研究はNEJsなどの幼若期から誘導されるプロカテプシンＬが成虫期から誘導されるプロカテプシンＬよりもより防御的であるということを示している。
カテプシンＬから誘導される合成ペプチドでのラットの予防接種
カテプシンＬのプロ配列から誘導される２種の合成ペプチド、MCF03（１５〜３３アミノ酸）およびMCF06（２５〜４２アミノ酸）、および成熟酵素から誘導されるペプチド、MCF04（１１０〜１２９アミノ酸）でラットの予防接種を行った。ラットをペプチドMCF03またはMCF06で予防接種すると、これらのラットは攻撃感染に対し防御された（図１）。最良の防御作用は当該ペプチドをキャリアーに接合し、アジュバントの存在下に投与した場合に得られた。しかし、ラットをペプチドMCF04で予防接種しても、攻撃感染に対する防御作用は得られなかった。これらの結果は、カテプシンＬのプロ配列（プロ領域）またはその断片は防御作用の誘発に重要であるという我々の知見を再び支持するものである。
NEJ−特異プライマーを用いるファシオーラ・ヘパチカからのカテプシンＬ分子ユニーク系統群の増幅
プライマーセット（i）により、鋳型としてファシオーラ・ヘパチカ成虫のｃDNAを用い、カテプシンＬのプロ配列を増幅した。３種の陽性クローン（da16、da12、およびda13）につき配列決定した。我々のプライマー選択の故に、クローンはウイジュフェルズ（Wijffels）ら（１９９４）の配列に従い、核酸８５（Trp ２１）で始まり、核酸３８１（Tyr １１９）で終わった。これらクローンのプロペプチド配列はウイジュフェルズ（Wijffels）ら（１９９４）からの配列に対し９６．５〜９８．４％の相同性を示した。誘導されたアミノ酸配列はウイジュフェルズ（Wijffels）ら（１９９４）の配列に対し９５．３〜９７．７％の相同性を示した。プライマーセット（iii）により、鋳型としてNEJsからのｃDNAを用い、カテプシンＬのプロ配列を増幅した。アガロースゲル上、２種類のPCR産物を確認した。３００ｂｐの予測サイズをもつオリゴヌクレオチドをプリックし、同じプライマーを用いて再度増幅し、次いでTAクローニングベクター中に結合した。５種類の異なるクローンにつきヌクレオチド配列を決定した。前進および逆進配列を分析し、一致する配列を明らかにした。クローンda27、da26、da214およびda210は非常に相同性であり、９０．３〜９８．４％の同一性を有していた。これらのクローンはウイジュフェルズ（Wijffels）からのプロ配列（プロ領域）と７９．５〜８２．２％の相同性を示した。誘導されたアミノ酸配列はウイジュフェルズ（Wijffels）からの配列と７９．１〜８０．２％の相同性を示した。クローンda211はより異なる配列を有し、ウイジュフェルズ（Wijffels）のプロ配列とより相同（８７．４）であった。誘導されたアミノ酸配列はウイジュフェルズ（Wijffels）からの配列と８７．２％の相同性を示した。これらのデータは、NEJ−特異プライマーによる異なるサブ系統群のファシオーラ・ヘパチカ・カテプシンＬプロペプチドが、ファシオーラ・ヘパチカ成虫特異プライマーセットを用いてファシオーラ・ヘパチカ成虫から増幅した産物と比較して、NEJsから増幅されたことを示している（１６．６〜２３％不一致）。
さらに、「NEJクローン」から誘導されたアミノ酸配列は、カテプシンＬからのプロ配列が切断される部位に有意な変化のあることを明らかにする。ファシオーラ・ヘパチカ成虫から誘導されるカテプシンＬにおいて、プロ配列はアミノ酸１０６と１０７の間で切断され、P1位にArgを、P2位に未変化極性Asnを、そしてP1’位にAlaを有する。しかし、NEJ−特異プライマーにより得あられた４種の同族カテプシンＬクローンにおいて、我々はP1位にAsnを、P2位にAspまたはGlyを、そしてP1’位にAspを見出した。他の酵素が「NEJカテプシンＬ」のプロペプチドを切除する必要のあることは可能である。このことは結果として、寄生虫成虫と比べて、NEJプロタンパク質の（自己）活性化をあまり有効としない。プロ配列が防御作用の誘発にとって重要であることが判明しているので、これは成虫期抗原と比べて、NEJ抗原により得られる高レベルの防御作用を恐らく説明している。また、免疫ブロットが証明しているように、これはファシオーラ・ヘパチカ成虫からの抗原抽出物に免疫反応性のプロタンパク質が存在しないことをも説明している可能性がある。
プライマーセット（ii）および（iv）により、完全プロカテプシンＬが成虫期ｃDNAを鋳型として増幅された。
ウシおよびヒツジのファシオーラ・ヘパチカ感染を診断するためのカテプシンＬペプチドELISA
子ウシ２頭の血清をファシオーラ・ヘパチカで感染後、一定間隔で標本として採取し、カテプシンＬからのペプチドのエピトープをスクリーニングするために用いた（図４）。カテプシンＬのプロ配列から誘導したペプチドエピトープ、MCF03およびMCF06では反応性が観測されなかったが、ペプチドMCL13についてのみ１頭の子ウシで低い反応性を検出した。それに対し、ペプチドMCF 05、特にペプチドMCF04では両方の子ウシで、感染後５４日目から少なくとも１５４日目まで、精製カテプシンＬにより得られた反応に匹敵する強い反応を与えた。ペプチドMCF04とMCF05を組合わせても免疫反応性は上昇しなかった。したがって、ペプチドMCF04とMCF05は４頭のヒツジの血清（ファシオーラ・ヘパチカ感染後１０週）によって特異的に認識された。
ファシオーラ・ヘパチカにより単回感染させた子ウシ２４頭の血清および他の関連寄生虫により単回感染させた複数頭の子ウシの血清につき、ペプチドMCF04と精製カテプシンＬでのELISAにより試験した。ファシオーラ・ヘパチカ感染の子ウシはすべてカテプシンＬとペプチドMCF04の両方に陽性反応であった。それに対し、他の関連寄生虫により感染させた子ウシはいずれもペプチドMCF04と反応しなかった。したがって、ディクチオカウラス・ビビパラス（Dictyocaulus viviparus）感染の子ウシはペプチドMCF04を認識しなかったが、カテプシンＬとは強く反応した（交差反応性）。
ペプチドMCF04はファシオーラ・ヘパチカで感染した感染後５週目から少なくとも１６週目までのヒツジにより認識された。他の関連寄生虫により感染させたヒツジの血清パネルについてもペプチドELISAにより試験した（図５）。これら血清とペプチドMCF04との反応性は殆ど検出されなかった。
これらの結果は、カテプシンＬからのペプチドMCF04に基づくELISAが高感度でかつ特異的であることを証明している。このELISAはウシとヒツジ双方に対するファシオーラ・ヘパチカ感染の診断目的に非常に価値があると我々は結論する。このペプチドELISAは交差反応性の問題、特にディクチオカウラス・ビビパラスに感染した子ウシに見られる問題を克服する。さらに、自然感染の子ウシおよびヒツジは防御性ペプチドのエピトープMCF03およびMCF06を認識しないので、診断目的のMCF04と予防接種目的のMCF03/MCF06などのペプチドとを組合わせることは、ワクチンとして非常に高い可能性を有する。
PCR、サブクローニングおよび配列決定
広範な寄生虫感染に対する予防接種に有用な防御タンパク質の単離したヌクレオチド配列をさらに検討し入手するために、技術上既知の増幅、クローニングおよび配列決定技法を用いる。たとえば、ファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）の防御性３０〜３２kDタンパク質の場合には、RT−PCRの第一工程において、プライマーＡおよびＢを用いる。プライマーＡの配列はＮ−末端アミノ酸配列から推定される変性オリゴヌクレオチドのセットを必要とする。プライマーＢは、たとえば、寄生虫ｍRNAの5’末端の上流に位置するスプライス・リーダー配列から推定される（デイビス（Davis）ら、The Journal of Biological Chemistry、３１、２００２６〜２００３０、１９９４）。増幅後、得られた断片をクローン化し、配列決定する。プライマーＣは選択するというよりも、ＡとＢの間の配列に位置しており、所望のヌクレオチド配列の対応する３’部分を増幅するためのポリ（ｄＴ）プライマーとともに使用し、その後に全遺伝子またはその選択した断片をクローン化し配列決定する。増幅またはスクリーニング法により単離したヌクレオチド配列を用いることにより、機能的に等価のタンパク質をエンコードする種々のあるいは異なる寄生虫の配列を関連する寄生虫内に確認し、そこから単離することができる。かかるヌクレオチド配列またはその断片のすべてが技術上既知の方法により適切な発現系においてクローン化され、上記のように抗寄生虫ワクチンとしてまたは診断目的に使用することのできる組換えタンパク質を産生させることができる。かかるタンパク質の防御価値の評価は勿論本発明が提供する生体外モデルにより実施し得る。当該ヌクレオチド配列は単独で、あるいは適切なベクター系または構築物に包含させてDNA予防接種プロトコールに採用することも可能である。
図面の説明
図１。経口攻撃３週間後の肝臓内ファシオーラ・ヘパチカの平均回収数（±SD）。（ａ）非免疫ラット、（ｂ）経口感染ラット、（ｃ）MCF03接種ラット、（ｄ）MCF03＋スペコール接種ラット、（ｅ）MCF03−KLH＋スペコール接種ラット、（ｆ）MCF06接種ラット、（ｇ）MCF06＋スペコール接種ラット、（ｈ）MCF06−KLH＋スペコール接種ラット、（ｉ）MCF04接種ラット、（ｊ）MCF04＋スペコール接種ラット、（ｋ）MCF04−KLH＋スペコール接種ラット。
図２。異なる期のファシオーラ・ヘパチカから増幅したカテプシンＬプロ領域の核酸配列（２Ａ）と推定アミノ酸配列（２Ｂ）。吸虫成虫および新たに脱嚢した幼若体からそれぞれｍRNAを単離し、ｃDNAに変換した。プライマーセット、TGG CAT CAG TGG AAG CGA ATG//ATA ACC AGA TTC ACG CCA GTCにより、鋳型としてファシオーラ・ヘパチカ成虫のｃDNAを用い、カテプシンＬを増幅した（da13pro）。プライマーセット、TGG CAY GAR TGG AAR MGN ATG//RTA NCC RTA YTC NCK CCA RTCにより、鋳型として新たに脱嚢した幼若体からのｃDNAを用い、カテプシンＬのプロ配列を増幅した（da210pro、da211pro）。増幅した産物をｐCRTMベクターにクローン化し、配列決定した。得られたカテプシンＬプロ領域の核酸配列および推定アミノ酸配列をウイジュフェルズ（Wijffels）ら（１９９４）からの配列と並列させた。
図３。ファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）（Ｆ−hep、ウイジュフェルズ（Wijffels）ら、１９９４）、シストゾーマ・マンソーニ（Schistosoma manosoni）（Ｓ−man1、マイケル、クリンカートおよびクンツ（Michel,Klinkert & Kunz）１９９４。Ｓ−man２、スミス（Smith）ら、１９９４）、シストゾーマ・ヤポニクム（Schistosoma japonicum）（Ｓ−jap、デイおよびブリンドレイ（Day & Brindley）１９９５）およびホモ・サピエンス（Ｈ−sap、ジョセフ（Joseph）ら、１９８８）からのカテプシンＬプロ配列の並列図。ファシオーラ・ヘパチカの配列に正確に一致するアミノ酸残基を囲みにより示す。
ファシオーラ・ヘパチカ・カテプシンＬのプロ領域は、シストゾーマ・マンソーニ（１）、シストゾーマ・ヤポニクム、ホモ・サピエンスおよびシストゾーマ・マンソーニ（２）のカテプシンＬプロ領域とそれぞれ４１．８％、３８．５％、３０．８％および２０．２％の相同性を示した。
図４。カテプシンＬから誘導される合成ペプチドおよびそのELISAにより試験したファシオーラ・ヘパチカ感染子ウシ血清との反応性を示す図式説明。５種類のカテプシンＬ合成ペプチドを、カテプシンＬ分子上の可能な免疫性領域を表すウイジュフェルズ（Wijffels）ら（１９９４）のアミノ酸配列に従って製造した（ジェイムソンおよびウオルフ（Jameson and Wolf）の抗原性指標に基づく）。ペプチドおよび精製カテプシンＬをそれぞれELISAプレート上に被覆し、ファシオーラ・ヘパチカ感染後一定間隔で標本採取した２頭の子ウシの血清（１／５０希釈）につき試験した。両方の子ウシの強い反応性（OD値＞０．８）が、ペプチドMCF05およびMCF04で、また、精製カテプシンＬで、感染５４日以降に検出された。
図５。ファシオーラ・ヘパチカのペプチドMCD04のELISAでの感度（Ａ）および特異性（Ｂ）。
Ａ）カテプシンＬから誘導されるペプチドMCF04（図４）をELISAプレート上に被覆し、ファシオーラ・ヘパチカ感染後一定間隔で標本採取した５頭のヒツジの血清につき試験した。感染後５週目からOD値が上昇し、感染後少なくとも１６週目まで高値を維持した。
Ｂ）ペプチドMCF04をELISAプレート上に被覆し、ファシオーラ・ヘパチカ（ｎ＝５）、エキノコッカス・グラニュロザス（Echinococcus granulosus）（ｎ＝９）、ネマトディラス・バッタス（Nematodirus battus）（ｎ＝３）、ヘモンチャス・コントータス（Haemonchus contortus）（ｎ＝１２）、トキソプラズマ・ゴンジイ（Toxoplasma gondii）（ｎ＝１２）、エイメリア種（Eimeria spp.）（ｎ＝１２）、オステルタギア・サーカムチンクタ（Ostertagia circumcincta）（ｎ＝８）、コーペリア・オンコホーラ（Cooperia oncophora）（ｎ＝１２）、テニア・オビス（Taenia ovis）（ｎ＝８）を感染させたヒツジおよび寄生虫未感染ヒツジ（ｎ＝１２）の血清につき試験した。
参考文献：
条虫、テニア・オビス（Taenia ovis）に対する組換えワクチンにより（ジョンソン（Johnson）ら、１９８９）、また、ヘモンチャス・コントータス（Haemonchus contortus）からの隠蔽抗原Ｈ１１により（ニュートン（Newton）、１９９５、総説）ヒツジに対する予防接種試験が成功裏に実施されている。アフリカではSPf６６マラリアワクチンでの試験が最近完了した。高伝播地域での臨床上マラリアに対する有効率は３１％であり、その製品は安全であると思われていた。しかし、SPf６６が防御にどのように関わるのか十分に理解されていないために、改良ワクチンの開発はその動きが妨げられている（タンナー（Tanner）ら、１９９５、総説）。
抗寄生虫ワクチンを開発するには多くの問題がある。寄生虫は複雑なライフサイクルを有し、各期で異なる組み合わせの抗原を発現する。さらに、その異なる期は生体の異なる部位としばしば関連している。殆どの寄生虫に対して、自然免疫に関わる免疫機構について、また、この免疫を含む寄生虫の期については殆ど知られていない。
殆どの場合、これらの免疫機構を研究するために利用し得る再現性のある動物モデルは存在せず、それがワクチン開発の新しい手法を阻んでいる。上述のように、もっとも利用可能なワクチンは弱毒化した生存寄生虫に基づいている。これらのワクチンは、「ワクチン寄生虫」が穏当な感染ルートに従い一連の期−特異抗原を搬送する故に、ある場合には成功する。しかし、かかるワクチンは、特にそれらがヒト用である場合（例、シストゾーマ・マンソーニ（Schistosoma mansoni）ワクチン、テイラー（Taylor）ら、１９８６）には、公衆が受け容れることに挑戦しなければならない（例、アンシロストーマ・カニナム・ワクチン）。さらに、生ワクチンは一般に保存期間が短く、比較的高価である。こういった将来像から、寄生虫から誘導される（組換え）タンパク質に基づくワクチンが明らかに必要である。しかし、ファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）についての一例として下記に示すように、かかる防御タンパク質の同定は膨大な数の困難に遭遇する。
吸虫類寄生虫、ファシオーラ・ヘパチカは主にウシとヒツジに感染するが、場合によりヒトにも感染することがある。この寄生虫は、たとえば、西ヨーロッパ、オーストラリアおよび南アメリカではかなりの経済的損失をもたらしている。ファシオーラ・ヘパチカの被嚢幼虫は経口でその宿主に浸入し、４〜７時間以内に消化管壁に潜り込み（ドウズ（Dawes）、１９６３。バーデン（Burden）ら、１９８１；バーデンら、１９８３。カワノ（Kawano）ら、１９９２）、腹膜腔を経て標的器官である肝臓へ移行する。ウシは経口感染しても攻撃に対してほぼ完全な防御体制をとるが、他方、ヒツジではときに感染で死に至り、自然免疫を獲得しない。本来の宿主（ウシ）も動物モデル（ラット）もともに感染後自然免疫を獲得する（ドイおよびヒューズ（Doy & Hughes）１９８４。ヘイズ、ベイラーおよびミトロビッチ（Hayes、Bailer & Mitrovic）１９７３）。それ故、ラットはウシの抵抗性の研究によく使用される。ラットでは大部分の自然免疫が寄生虫の浸入部位である消化管粘膜で発現される。免疫ラットでは攻撃した約８０％が新包嚢脱出幼若期（NEJs）に消化管管腔から腹膜腔に除去される（ヘイズおよびミトロビッチ（Hayes & Mitrovic）１９７７。ラジャセカリアおよびハウエル（Rajasekariah & Howell）１９７７。ドイ、ヒューズおよびハーネス（Doy、Hughes & Harness）１９７８/１９８１。ドイおよびヒューズ、１９８２。バーデンら、１９８１/１９８３）。自然免疫に基づき、照射ファシオーラ・ギガンチカ（Fasciola gigantica）被嚢幼虫に基づくワクチンがウシ用として開発された（ビタカラミアー（Bitakaramire）１９７３）。第７期および第８期に、成虫および幼若吸虫類の抗原抽出物を用い、多数回の予防接種試験が実施された（ハロウンおよびヒルヤー（Haroun & Hillyer）１９８０、総説）。しかし、これらの研究は相矛盾するかあるいは議論の余地のある結果に終わった。たとえば、成虫または幼若吸虫類の抽出物をラットに皮下もしくは筋肉内注射しても防御作用は得られなかった（オールダムおよびヒューズ（Oldham & Hughes）１９８２；バーデンら、１９８２；オールダム、１９８３）。フロイント完全アジュバント（FCA）または不完全フロイントアジュバント（IFA）とともに腹腔内投与した成虫吸虫類の抽出物は約５０％の防御作用を示した（オールダムおよびヒューズ（Oldham & Hughes）１９８２；オールダム、１９８３）。追加のアジュバントとしてボルデテラ・ペルタッシス（Bordetella pertussis）の非常に高い抗原用量を用いると、この防御作用は８０〜８６％に達した（オールダムおよびヒューズ（Oldham & Hughes）１９８２；オールダム、１９８３）。AlOH3とともに腹腔内投与した４週令の幼若体抽出物は、ファイスター（Pfister、１９８４/８５）らの研究では防御作用を誘発しなかったが、１６日令の幼若体抽出物はアジュバントを用いずともマウスで８６％の防御作用を示した（ラングおよびホール（Lang & Hall）１９７７）。超音波処理した１６日令幼若体をウシに皮下感作すると９０％以上の防御作用を示した（ホールおよびラング、１９７８）。成虫ファシオラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）（FhSmIII）から単離した、主要成分として１２ｋＤの免疫原性タンパク質を含むフラクションを子ウシに筋肉内注射すると、５５％の防御作用が得られた（ハイリヤー（Hillyer）ら、１９８７）。
１９９０年以降、数種のファシオラ・ヘパチカ・ワクチン候補抗原が単離および/または生産された。これら抗原の殆どが成虫吸虫類から誘導したものであり、シストゾーマ・マンソーニ（Schistosoma mansoni）抗原との相同体である。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（GST）は細胞解毒系においてとりわけ活性な酵素である。ファシオラ・ヘパチカ成虫から精製したGSTでヒツジ（ｎ＝９）をFCAとともに皮下注射免疫し、さらに４週後にIFAとともに追加免疫すると、５７％の防御作用を示した（セックストン（Sexton）ら、１９９０）。GSTでラットを免疫しても防御作用は得られなかった（ハウエル（Howell）ら、１９８８）。チバ動物ヘルス研究所（スイス）およびビクトリア動物科学研究所（オーストラリア）が実施したウシの予防接種試験では、４９〜６９％の防御作用が得られた（モリソン（Morrison）ら、１９９６）。
マウスにおいて、組換えエス・マンソーニ（S. mansoni）脂肪酸結合タンパク質Sm１４によりFCAとともに皮内/皮下免疫すると、ファシオラ・ヘパチカの攻撃に対して完全な防御作用を示した（テンドラー（Tendler）ら、１９９６）。WO９４/０９１４２は、ファシオラ・ヘパチカから誘導したカテプシンＬ型活性を有するプロテアーゼを、蠕虫寄生虫除去用ワクチンの剤形として使用することを示唆している。ウサギを精製した成熟酵素で免疫するとin vitroで当該酵素の活性を減少させるウサギ抗体を産生した。
しかし、ファシオラ・ヘパチカ・カテプシンＬまたはヘモグロビンで得られたウシでの防御レベルはそれぞれ５３．７％または４３．５％にすぎなかった（ダルトン（Dalton）ら、１９９６）。カテプシンＬはシステイン・プロティナーゼの一族に属し、成長期にある寄生虫のすべての期で分泌される。ファシオラ・ヘパチカのカテプシンＬは微弱酸性または中性pHでもっとも活性である（ダルトンおよびヘファーナン（Dalton & Heffernan）１９８９）。このプロティナーゼの機能は宿主の免疫グロブリンをパパイン様様式で切断し（スミス（Smith）ら、１９９３）、免疫エフェクター細胞が寄生虫に抗体介在結合するのを妨げる（カーモナ（Carmona）ら、１９９３）ことにより宿主の免疫機能を崩壊させることである。さらに、カテプシンＬは細胞外マトリックスと基底膜成分を分解することが可能であり（ベラセイン（Berasain）ら、１９９７）、寄生虫が突抜けようようとする粘膜の表面を準備するが、これはカテプシンＬが組織浸入に関わっていることを物語っている。カテプシンＬプロテアーゼはその決定的な生物学的機能の故に、抗寄生虫ワクチンの開発にとって重要な候補であると考えられる。
カテプシンＬは１５アミノ酸長のペプチドプレ配列、９１アミノ酸長のペプチドプレ配列もしくはプロ領域および２２０アミノ酸長の（ポリ）ペプチド酵素部分を有するプレプロタンパク質として合成される。システイン・プロティナーゼのプレ領域は合成直後に除去され、プロ領域と成熟酵素を構成する部分からなるプロタンパク質はゴルジに輸送される。成熟酵素への変換とその結果としての酵素的に活性な状態への変換がリソソームで起こり、カテプシンＤとなるか自己活性化へと至る。ある場合にはプロ領域を含む前駆体が分泌される（ノース（North）ら、１９９０）。カテプシンＬそれ自体はP1位置にArgを有し、かつ、P2位置に疎水性残基（Phe）を有する基質に対し高い親和性を有する（ダウド（Dowd）ら、１９９４）。このものはまた自己触媒活性を有し、その成熟酵素活性を獲得する前にそのプロ配列を切除する。カテプシンL2もP2位置にProを含むペプチドを切断し、それ故に、フィブリノーゲンを切断し、フィブリン塊を生成することができる。
抗吸虫ワクチンの他の有力な候補は、成熟ファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）から単離されるヘモグロビン（マックゴニグルおよびダルトン（McGonigle & Dalton）１９９５）およびファシオーラ・ヘパチカ成虫が分泌するカテプシンＬ（スミス（Smith）ら、１９９３。スミスら、１９９４。スピチル（Spithill）１９９５）である。これまで、照射ファシオラ・ギガンチカ（Fasciola gigantica）被嚢幼虫（ビタカラミ（Bitakarami）１９７３）に次いでいくつかの抗原が有力なタンパクワクチンとして示されている。
−ファシオーラ・ヘパチカ・ヘモタンパク質
−シストゾーマ・マンソーニ（Schistosoma mansoni）からの脂肪酸結合タンパク質Sm１４
−カテプシンＬ型活性を有するチオールプロテアーゼ
−成虫ファシオーラ・ヘパチカから抽出されるグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ
−ファシオーラ種からのポリペプチド（Gln-Xaa5-Cys-Trp-Xaa3）
−ジペプチジルペプチダーゼ活性を有するセリンプロテアーゼ。
しかし、これら有望な候補のいずれもがファシオーラ・ヘパチカの感染に対して有効なワクチンとして作用を示さず、さらに、ワクチンを成功裏に開発する前に以下の多くの疑問に答える必要がある。宿主のどの部位で免疫は発現するのか。寄生虫のどの期に免疫は向けられるのか。宿主のどの部位でこの免疫は誘発されるのか。どの免疫機構が防御作用に関わっているのか。ファシオーラ・ヘパチカのどの期で防御作用免疫を誘発するのか。そして−最後ではあるが小さくはない問題―どの抗原が防御作用を誘発するのか。これらの疑問に答えるには、適当な動物−すなわち寄生虫感染を研究するための攻撃モデルのないことが非常に障害となることは明らかである。そして動物モデルが利用できたとしてもその進行は非常に遅い。その理由は研究対象の宿主において寄生虫感染が進展するには相当の時間がかかり、一方でその結果は経時的に変化する宿主−寄生虫の関係に関連する様々な要因に依存するからである。たとえば、注目点の多くが候補防御抗原としてファシオーラ・ヘパチカの新包嚢脱出幼若（NEJ）期から誘導されるプロテアーゼなどのタンパク質に向けられているが（たとえば、ツカルセビッチ（Tkalcevic）ら、１９９５）、真に防御作用のあるタンパク質の明確な同定は予知されていない。それに対して、ファシオーラ・ヘパチカの初期生育期では急速なタンパク質変化と感染の初期段階での抗原発現を示し、かかる変化は寄生虫が宿主免疫応答を回避することを助けさえする（ツカルセビッチ（Tkalcevic）ら、Parasite Immunology １８、１３９〜１４７、１９９６）。たとえば、寄生虫では、プロテアーゼが宿主組織浸入、免疫攻撃メカニズムの回避に関与し、寄生虫生存のために栄養の調達を助けることが証明されている。
このように、研究する必要のある可能な異なるタンパク質または抗原が多数であること、また、適当な攻撃モデルの欠如していることが寄生虫ワクチンの開発に必要な可能な進歩を妨げている。寄生虫ワクチンの進歩にとって重要なことは、種々の候補防御抗原を研究し、新しい候補防御抗原の同定を可能とするための、防御免疫性を測定する新しい方法である。このように、時間内に試験し得る候補タンパク質または基質の数を増大させるような新しい動物モデルが必要である。
本発明は研究対象寄生虫に対する自然免疫を研究、調査、評価するための迅速な方法を提供する。本発明は寄生虫に向けられる防御免疫と寄生虫感染用のワクチンを迅速に検討するための生体外動物もしくは攻撃モデル方法を提供する。生体外モデルは一般に動物の臓器または臓器系を麻酔下に検討するために設計され、本来の生体が備える状況とは違うが、適切な血液供給などの状況は維持するものである。これらのモデルは一般に処理時間が短く、in vivoモデルに見られるよりも実験動物に対する苦痛は少なくてすむ。
本発明はラットまたは他の小型の実験動物、たとえば、マウスもしくはニワトリ、あるいは他の動物種の生体外消化管モデルを提供する。攻撃寄生虫は選択した動物腸管の１以上の生体外分節に注入し、腸管壁に浸入するNEJsなどの寄生虫を、特定の消化管分節を保持するコンテナーに回収する。特に、小腸の分節、たとえば、十二指腸、空腸または回腸などを使用することができるが、腸管の他部分の分節、たとえば、胃、結腸、盲腸または直腸なども研究対象寄生虫の選択した感染経路に対応して用いることができる。本発明により提供されるこのモデルは、腸管全体にわたる抵抗性の発現を、寄生虫の異なる負荷にまたは寄生虫の異なる期に付された分節を比較することにより測定することができる。さらに、消化管粘膜、腹膜腔、肝臓および他の器官に見出すことができるような寄生虫の移動ルートの軌跡、これは粘膜抵抗性の誘発にとって本質的であるが、これらがすべて検討可能である。本発明により実施可能なこのような研究はもっとも有効な予防接種経路について、また、経口ワクチンの可能性について知識を提供する。結紮した消化管分節を用いる生体外攻撃モデルの今一つの利点は、消化管腔から腹膜腔への病原体の移行が小さな領域に限定されることであり、これが消化管粘膜での寄生虫に対する防御免疫応答の位置づけと特徴づけを可能にする。さらに、以前の感染または予防接種により誘発された抵抗性のレベルを寄生虫に対する免疫機構と相関させることができる（実験の部ではファシオーラ・ヘパチカにより証明した）。その理由は攻撃感染が定着せず、研究する必要のある対象を邪魔する追加の免疫応答を誘発しないからである。特に、粘膜もしくは皮膚表面に浸入して宿主に感染する病原体、たとえば、ファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）、パラゴニムス・ウエスターマニ（Paragonimus westermani）、シストゾーマ・マンソーニ（Schistosoma mansoni）、トキソカラ・カニス（Toxocara canis）、ディクチオカウラス・ビビパラス（Dictyocaulus viviparus）、トリキネラ・スピラリス（Trichinella spiralis）、ネマトディリス種（Nematodiris spp）、ニッポストロンギラス・ブラジリエンシス（Nippostrongylus brasiliensis）、アスカリス・スウム（Ascaris suum）、アニサキス（Anisakis）、およびプリオンから原虫類にいたる他の病原体に対する免疫と防御機構が、これらが全部もしくは部分的に当該表面に浸入し得るのか否か、本発明により提供されるモデルにより特異的に好適に測定することができる。モデルに採用される消化管分節の粘膜表面に完全に浸入する寄生虫または他の病原体は上に示したように回収し得るが、粘膜表面に部分的にのみ浸入するものは特定分節で稼動する血管もしくはリンパ管から回収することができる。
寄生虫に対する免疫性と防御機構を評価することは宿主における免疫応答のエフェクター相を調節する可能性を提供するものであり、効率的な予防接種対策の発展につながるものである。換言すれば、感染に対するワクチンとして使用する防御抗原となるべきタンパク質の能力を測定するものである。防御作用のデータが同日に得られるので、本発明により提供される生体外モデルは、多数の候補ワクチン抗原（防御タンパク質またはそれから誘導された断片）について、それらが抵抗性および免疫性を誘発する能力があるか、それらの異なる期での迅速な試験実施を可能とする。
本発明により提供されるかかる候補ワクチン抗原の一つは防御タンパク質またはそれから誘導される抗原性断片であり、当該タンパク質は少なくとも酵素のプロ領域から誘導されるアミノ酸配列から構成されるものである。寄生虫が粘膜または皮膚表面に浸入するときには幾つかのプロテアーゼが関与する。たとえば、セリン・プロテアーゼ、ジペプチジル・ペプチダーゼ様プロテアーゼ、システイン・プロテアーゼ、カテプシン様活性を有するプロテアーゼなどであるが、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼなどその他の酵素も、寄生虫が粘膜または皮膚表面に浸入しようとしている相において関与している。驚くべきことに、本発明は、成熟酵素が使用された場合よりもよりよい免疫応答を発揮するような酵素またはプロテアーゼのプロタンパク質から誘導される防御タンパク質（断片）を提供する。要すれば、プロタンパク質に向けられた免疫応答を、成熟酵素に向けられた免疫応答と組み合わせることも可能である。
本発明の好適な態様において、本発明は酵素など、好ましくはプロテアーゼなどのプロ領域から誘導される防御タンパク質（断片）を提供する。さらに他の態様において、プロ領域に向けられた免疫応答は成熟酵素に向けられた免疫応答と組み合わされる。
本発明により提供されるかかる候補ワクチン抗原の一つは防御タンパク質またはそれから誘導される抗原性断片であり、NEJsのファシオーラ・ヘパチカから誘導されるものである。候補ワクチン抗原、たとえば、NEJタンパク質から調製することの可能な抗原で予防接種したラットの防御状態は、本発明により提供される生体外モデルを用いて、予防接種の研究を経て、たとえば、選択したタンパク質で以前に免疫したラットの防御状態を測定することにより測定することができる。ファシオーラ・ヘパチカのNEJsから誘導される種々のタンパク質は、たとえば、SDS−PAGEゲル電気泳動およびエレクトロブロッティングにより、あるいは分子サイズによる排除またはろ過を介して単離し、さらに見かけの分子量およびＮ−末端配列決定により同定し、研究することができる。本発明は実施例のように、とりわけ、NEJsで見出され、３０〜３２kDの見かけの分子量とXXDVSWPFWDRMYNYのＮ−末端アミノ酸配列（アミノ酸は一文字コードで掲げ、ｘ＝未知アミノ酸である）を有する免疫優性のタンパク質に対応する防御タンパク質またはその断片を提供する。また、本発明が提供するのは、本発明が提供する防御タンパク質または（ポリ）ペプチドをエンコードするヌクレオチド配列である。
本発明の好適な態様は防御タンパク質またはその断片であり、該タンパク質は少なくともプロテアーゼ、たとえば、図２に示すヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列を有する核酸により（少なくとも一部）エンコードされているプロテアーゼのプロ領域またはプロ配列から誘導されるアミノ酸配列から構成されている。
かかる配列を（一部）単離または同定された（寄生虫）タンパク質から誘導する方法は既知技術であり、たとえば、免疫原決定基または断片を、たとえば、コンピューター解析による抗原性指標を検討することにより同定することが可能である。さらに、当該酵素またはプロテアーゼをエンコードするヌクレオチド配列は技術上既知である。カテプシン様プロテアーゼをエンコードする配列はたとえばウイジュフェルズ（Wijffels）ら（１９９４）により示されている。多くの場合、成熟酵素をエンコードする配列の一部が知られており、それが、平均的技術を有する熟練者に対し対応するプレ−および/またはプロ領域をエンコードする対応する核酸配列の同定を可能とする。かかる核酸および/またはタンパク質配列は成虫期または幼若期の生物体の双方から得られる。本発明の好適な態様は幼若期の寄生虫に主に見出されるプロテアーゼから誘導されるプロ領域に相当する防御タンパク質またはその断片を提供するが、好ましくは、当該寄生虫はファシオーラ種（Fasciola species）である。増幅もしくはスクリーニング法により単離したヌクレオチド配列を用い、機能的に等価のタンパク質または（ポリ）ペプチドをエンコードする多様なまたは異なる寄生虫での配列を関連する寄生虫内に同定し、そこから単離することができる。かかるヌクレオチド配列またはその断片のすべてを技術上既知の方法により適当な発現系内で分子的にクローン化し、上記のように、抗寄生虫ワクチンとしてまたは診断目的に使用することのできる組換えタンパク質を生成させることができる。
免疫原性決定基もしくは断片または本発明により提供される断片の例はプロテアーゼのプロ領域から誘導される断片である。代表的な例はMCF03またはMCF06などのペプチドに対応するあるいは関連するペプチド、またはプロテアーゼのプロ領域の重なり合う位置に見出されるペプチドなどであるが、例示は図２および３にも見ることができる。他の対応する断片またはペプチドは関連するプロテアーゼ（のプロ領域）に見出される。実験の部に、カテプシン様プロテアーゼのプロ領域から誘導されるかかるペプチドについて記載する。技術上周知ではあるが、合成ペプチドはアミノ酸を他のものと置き換えることによりより免疫原性とすることができる。また、かかるペプチドの１個もしくは複数個のアミノ酸を欠失させるかあるいは挿入することが一般的である。指針となっているのは、ペプスカン（PEPSCAN）などの技法あるいは置換−ネット地図作成法を用いることであり、この方法によりより免疫原性の高いペプチドが当初のペプチド配列から誘導される。免疫原性はさらにＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に置き換えることにより増強させることができる。本発明の好適な態様においては、かかるワクチンは少なくともカテプシン様プロテアーゼ（カテプシンＢ、Ｈ、Ｌ、Ｓなど）のプロ領域から誘導されるタンパク質またはその（ペプチド）断片からなり、たとえば、エス・マンソーニ（S. Mansoni）、トリポナゾーマ・クルゼイ（Tryponasoma Cruzei）またはティー・コンゴレンス（T. Congolense）から誘導されるもの、または、たとえば、ニワトリ、ラットまたはヒトの生体から誘導される脊椎動物カテプシンあるいは他のカテプシン様プロテアーゼからのものである。かかるプロテアーゼのプレ−およびプロ領域を同定する切断部位は、配列特性を比較することにより、そしてたとえば、フォン・ハイジン（Von Heijne）規則に従って容易に見出すことができる。かかるタンパク質またはワクチンの防御値もしくは能力を評価または測定することは、勿論、本発明が提供する生体外モデルにより実施することができる。当該ヌクレオチド配列は単独で、または適切なベクター系もしくは構築物に取り込んで、DNA予防接種プロトコールに採用することもできる。かかる配列は、たとえば、本発明が提供する防御タンパク質に対応する（部分的に）既知のアミノ酸配列から推定される変性プライマーを用い、PCRなどの増幅技術により誘導することができる。増幅したヌクレオチド断片はクローン化し、標準的技術により配列決定し、かくして、本発明が提供する防御タンパク質または（ポリ）ペプチドをエンコードする遺伝子もしくはその断片の単離したヌクレオチド配列を提供する。かかるタンパク質または断片は、単離したおよび/または組換えた形態において、ワクチン抗原として単独で、またはワクチンとして作用する他の製剤と組み合わせて使用するか、あるいは診断試験における診断用抗原として使用することができる。また、抗体はポリクローナルまたはモノクローナルまたは合成抗体であるか、または抗体断片であり、本発明が提供する防御タンパク質もしくは（ポリ）ペプチドに対して特異的に方向づけられているか調製された抗体であって、これらも本発明の一部である。さらに、当該防御タンパク質または当該タンパク質に対する抗体または当該タンパク質をエンコードするヌクレオチドも本発明の一部である。さらに、当該タンパク質を除くタンパク質、または当該タンパク質に対する抗体を除くタンパク質に対する抗体を測定する診断試験法であって、その場合、当該診断試験法が当該タンパク質を特異的に含むワクチンの使用のために同時試験法として用いるように特別に設計されている試験方法も本発明の一部である。かかる同時試験法により感染動物を予防接種動物から識別し得る。かかる診断試験法の一例を本明細書の実験の部に示してある。明細書中にはプロ領域から誘導される防御エピトープに対する抗体が、酵素の成熟部分に対する抗体から識別し得ること、そしてそれが感染動物を予防接種動物から識別するのを可能にすることを示している。勿論好ましいのは、本発明により提供されるような、プロテアーゼなどの酵素のプロ領域から誘導されるタンパク質（断片）からなるワクチンで動物を予防接種することである。かかる識別は、動物を酵素活性保持（成熟）プロテアーゼで予防接種する場合には可能でない。
本発明の好適な態様において、ワクチンは主にプロテアーゼのプロ領域から誘導されるタンパク質（断片）からなり、一方、診断試験法用のものは主に当該プロテアーゼの成熟酵素部分から誘導されるタンパク質（断片）かららる。かかるワクチンをかかる試験法と組合わせることにより、制御された寄生虫の感染撲滅が可能となる。
さらに、本発明はカテプシン様プロテアーゼ上の免疫優性種特異エピトープに対する抗体を測定する診断試験法を提供するが、ここで当該種とはファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）である。当該試験法は、たとえば、ペプチドMCF04に相当するペプチド、またはそれに関連するペプチドからなり、たとえば、ファシオーラ・ヘパチカで感染した動物を、他の方法では全体としてカテプシンＬプロテアーゼと強力な免疫反応性を示すディー・ビビパラス（D.viviparus）などの他の寄生虫を注射した動物から生物学的に識別するのを可能とする。
上記のように、また、本明細書の実験の部に本発明を制限するものではないものとしてさらに記載したように、本発明はとりわけ防御タンパク質またはそこから誘導される抗原性断片、および関連する核酸配列を提供するが、それらは少なくとも、たとえば、寄生虫感染症において、たとえば、ワクチンに包含させるための、プロテアーゼなどの酵素から誘導されるアミノ酸配列もしくはプロ領域からなるか、および/またはエンコードするものである。本発明は動物、好ましくは哺乳動物にいてかかるワクチンを使用する方法を提供する。ワクチン候補は、たとえば、反芻動物、たとえば、ファシオーラ感染を受け易い反芻動物、あるいはヒト、たとえば、シストゾーマ感染を受け易いヒトにおいて寄生虫感染に対し防御するためのワクチンである。
実験の部
材料と方法
ラット
特定の病原体をもたないメスのウイスターラット（チャールス・リバー、ザルツフェルド）をすべての実験で選択した。ラットには食餌と水を任意に与えた。一次および攻撃感染の１６時間前にラットの食餌を奪った。ラットは一次感染時または初回予防接種時に６週令であった。ラットは攻撃感染時に１０週令であったが、ただし、抵抗性存続期間の研究に使用したラットは例外である。これらのラットは攻撃感染時１９週令であった。
ファシオーラ・ヘパチカ
ファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）被嚢幼虫をID−DLO研究所内で産生した。被嚢幼虫のin vitro脱嚢はスミスおよびクレッグ（Smith & Clegg）（１９８１）の方法により実施した。NEJsの脱嚢直後に顕微鏡下（倍率１６０ｘ）計数した。NEJsは使用時（脱嚢後１時間以内）まで、３００μlのRPMI−１６４０培地（ICN−バイオメディカルBV、ゾエテルメール、オランダ）中、３７℃に保持した。
一次感染
２５個のファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）被嚢幼虫を水道水１mlとともに経口投与した。病原体を送達した後、被嚢幼虫の送達チェックのために注射器とカニューレを水で洗い流した。後に残った被嚢幼虫をもう１mlの水道水とともに投与した。
抵抗性の発現
総抵抗性。標的臓器である肝臓に到達した攻撃寄生虫数の計量。
ファシオーラ・ヘパチカに対する防御の総レベルを測定するために、ラットに正確に２００個の被嚢幼虫を経口攻撃した。病原体を送達した後、被嚢幼虫の送達チェックのために注射器とカニューレを水で洗い流した。後に残った被嚢幼虫をもう１mlの水道水とともに投与した。攻撃の３週間後に感染ラットを殺し、肝臓を取り出して、５０mlのRPMI−１６４０培地を容れた別々のペトリ皿に入れた。肝臓を３７℃で培養した。（６時間まで）一時間ごとに肝臓を小片に切断し、あらたなペトリ皿に入れた。回収したNEJsを計測した。
消化管レベルでの抵抗性：生体外感染モデルを使用しての消化管壁に浸入したNEJs数の計量
ラットをエーテル吸入により麻酔し、その後直ちにネンブタール（nembutal）（コンパーニ・ラウセロット、パリ、フランス）５０mg/kgを腹腔内に、また、アトロピン（atropin）（AUV、クイック、オランダ）０．０５mg/kgを皮下注射した。実験手続の間に追加のネンブタール（１６mg/kg）をエーテル吸入の３時間後に皮下注射した。麻酔の４５分後に横隔膜の下を切開（１．５cm）し、約７cmの長さの小腸ループを体腔から取り出した。約５cmの分節を２本のリンネル糸（ビー・ブラウン（B.Braun）、メルスンゲンAG）により胃からの標準位置で区割した。腸管の異なる位置での抵抗性を検討するために、十二指腸（胃から１〜５cm、ｎ＝６）、中央空腸（胃から４０〜６０cm、ｎ＝６）および回腸（胃から７０〜９０cm、ｎ＝６）の各分節を調製した。バーデン（Burden）ら（１９８３）の方法に従い、NEJsを各分節に注射した。注射後、針と注射器を培地１mlで３回ペトリ皿中に洗い流した。培養の間に注射器および/または針中の後に残ったNEJsを顕微鏡下に計量し（残余フラクション）、感染用量を計算した（計測用量マイナス残余フラクション）。実験の間、各分節を含む各消化管ループを体腔外に維持し、切開部を１または２個の留め金で閉じた。実験ごとに８匹のラットをパースペックスプレート上に横たえ、消化管ループをプレートの孔に通し、RPMI−１６４０培地の表面より十分下になるように５０mlビーカー内に固定せずに吊るした。培地５０mlの入ったビーカーを１時間ごとに取り替え、消化管壁を通してビーカー内に移動したNEJsを光学顕微鏡により定量した（腹膜フラクション。倍率１００ｘ）。実験の間、全システムを体温に維持した。体温の測定が指示通りに必要な場合、１）該ビーカーを３７℃の水浴に入れることにより、２）ラットが横たわっているパースペックスプレートの下にセントラルヒーターから温水をポンプで送りラットを暖めることにより、そして３）赤外線ランプによりラットを暖めることにより実施した。６時間後ラットを殺し、消化管分節を取り出し、分節サイズおよび胃までの距離を測定した。分節の管腔を培地で洗い流し、消化管管腔に残るNEJsを光学顕微鏡により定量した（管腔フラクション）。最終的に該分節を「スイスロール」法（ベクスター、１９８２）によりメチルブタン（−１５０℃）中に固定し、免疫組織化学用に−７０℃で保存した。
生体外消化管モデルの再現性
実験後、消化管壁（消化管フラクション）に残るNEJs数を定量するために、各消化管分節を１０μｍの凍結切片に切断した。第５切片ごとに集めてNEJ（NEJサイズ±１００μｍ）を評点し、風乾してアセトン（メルク）中１０分間固定した。固定化および引き続く洗浄、培養はすべて室温で実施した。固定化後、消化管壁のペルオキシダーゼ活性をブロックした。各切片を２％NaN3および０．２％H2O2を含む０．１Ｍトリス−HCl（pH７．５）中で２０分間培養した。各切片をトリス緩衝塩溶液（TBS、pH７．４）にて５分間３回洗浄し、3, 3’−ジアミノベンチジン１mg/ml（シグマ、セントルイス、米国）および０．０１５％H2O2を含む０．１Ｍトリス−HCl（pH７．５）中で５分間染色し、リン酸緩衝塩溶液（PBS；pH７．６）にて５分間３回洗浄し、次いで、２％正常ラット血清（NRS）および４％ウシ免疫血清を含むPBS中で１時間培養した。この血清は５ヵ月令の子ウシにファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）被嚢幼虫４５００および２２５０を１１週間の間隔で２度経口感染させることにより調製した。抗血清は２度目の感染８週後に取得した。PBSで３回洗浄した後、各断片を２％NRS/PBS中１：５００に希釈したペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ウシ免疫グロブリン（ダコパット、グロストラップ、デンマーク）と１時間培養した。次いで、洗浄し、ペルオキシダーゼ活性を、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（シグマ、セントルイス、米国）０．２mg/mlおよび０．０１５％H2O2を含む０．０５Ｍ NaAc（pH４．４）の新たに調製し濾過した溶液中で８分間培養することにより可視化した。染色後、切片を水道水流中で洗浄し、アクアマウント（BDHラボラトリー・サプライ、プール、英国）に載せた。顕微鏡下にNEJｓを計数し、NEJsを二度評点するのを防止するために連続する断片を比較した。
抵抗性の誘発
消化管レベル
１）ラット５匹を２５個の被嚢幼虫で経口感染させ、４時間後に殺吸虫剤トリクラベンダゾール（１００mg/kg、ファシネックス、チバ−ガイギー、バーゼル、スイス）で処理した。殺吸虫剤での処理はその後３日繰り返した。５週後に、消化管レベルでの抵抗性発現につき生体外消化管モデルを用いて測定し、肝臓での「突破個体」感染を剖検にて調査した。ファシネックスが攻撃寄生虫の消化管壁貫通移動に影響しないことを確認するために、非感染ファシネックス処理ラットを攻撃対照として用いた。
２）ラット４匹につき１８〜２５個のNEJsを空腸に直接注入した。４時間にわたり、消化管壁に浸入するNEJsについて生体外消化管モデルを使用し捕捉した。一次感染に際し、ラットを腹腔内注射によりケタミン（ketamine）（４０〜６０mg/kg；アルファザン、ウエルデン）で、また、皮下注射によりキシラジン（xylazine）（３〜８mg/kg；ロンパン、バイエル、ドイツ）およびアトロピン（atropine）（０．０５mg/kg）で麻酔した。感染の前日および翌日にラットを抗性物質デュオプリム（duoprim）（０．５ml/kg、皮下、ピットマン−ムーア、ハウテン）で処理した。鎮静剤フィアジン（fiadyne）（１mg/kg、筋肉内、シェリング−プラウ、アムステルベーン）を感染後最初の３日間投与した。４週後、消化管レベルでの抵抗性発現を測定し、肝臓での「突破個体」感染を剖検にて調査した。
腹膜腔/肝臓
一次感染のNEJsを腹膜腔（ｎ＝３、１３〜１７個NEJs）内または肝臓葉（ｎ＝８、７〜２５個NEJs）間に注射した。肝臓感染に対しては小さな切開（１cm）を横隔膜下に設けた。NEJsを１００μlのRPMI−１６４０とともに肝臓葉間に注射した。この操作手技の間、ラットは上記のように麻酔した。腹膜腔感染のラットについてはエーテル吸入で麻酔し、その直後にNEJsを腹腔内注射した。
ファシオーラ・ヘパチカ抗原抽出物の調製
in vitroで脱嚢後、NEJsをPBSで洗浄した。NEJs３００mgをPBS３ml中、氷上３０秒間５回、２０kHzで超音波処理した（ソニコールUPP−４００、ソニコール・インストルーメント・コーポレーション−コパック、ネバダ）。懸濁液を４℃で一夜抽出し、その後再度超音波処理した。抽出物を１０，０００ｇで２０分間遠心分離し、上清１ml量を−７０℃に保存した。抽出物中のタンパク質濃度はブラッドフォードアッセイによる定量の結果３mg/mlであった。
ファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）成虫をウシの肝臓から取得し、HMEM−培地および、次いでPBSで４℃にて完全に洗浄した。吸虫をソルバール・オムニミキサー（モデル１７１０６）にて氷上３０秒間１０回磨り潰した。次いで、上記同様、超音波処理および抽出処理を実施した。
YM−３０濾過NEJ−抗原
新たに調製したNEJ抽出物（３mg/ml抽出物１０ml）をPBSで希釈して３０mlの用量とし、１６℃、１バールでYM−３０膜（アミコン、６２mm）により濾過した（アミコン・モデル８２００）。残余フラクション５mlにPBS５mlを補給し、再度濾過して残余フラクション５mlとした。この操作は２度繰り返した。最後に、濾液４０ml（２５μg/ml）を１ml量−７０℃にて保存した。さらにタンパク質を含む（すなわち、１８３μg/ml）他の濾液を調製し、同様に保存した。
予防接種法
ラットに１００μｇのNEJまたは成虫期ファシオーラ・ヘパチカ抗原を腹腔内注入した。３週間後に、抗原５００μｇにより腹腔内に追加免疫した。追加免疫の１週間後に攻撃感染に対する抵抗性を定量した。防御の総レベルを測定するために、ラットに２００個の被嚢幼虫を経口攻撃投与し、また、消化管レベルで発現される防御レベルを測定するために、ラットにNEJsを空腸内攻撃投与した（回収手法については「抵抗性の発現」参照）。
用いたYM−３０濾液の用量は、一次および追加の免疫に対してそれぞれ２０μｇおよび６５μｇであった。
SDS−PAGEおよびウエスターン・ブロッティング
ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）を、トリス−トリシン緩衝系（シェッガーおよびホン・ヤゴウ
Ｎ−末端配列決定
ブロットしたタンパク質を０．１％クマシーブリリアントブルーＲ−２５０（CBB）（シグマ）で染色し可視化した。CBB染色した領域または血清によりイムノブロッティング染色したタンパク質バンドをPVDF膜から切り出し、２cmの膜をアプライド・バイオシステムのタンパク質配列決定システム（モデル４７６Ａ）によりエドマン分解配列決定に付した。分析はユトレヒト大学の「生体膜および脂質酵素学研究センター（The Centre for Biomembrane and Lipid Enzymology）」生化学部門にて実施した。
免疫学的染色
免疫染色のために、４mmのPVDFストリップをPBS−０．５M NaCl−０．０５％トゥイーン−８０、pH７．２（PBS−NT）中、１０％正常ウサギ血清で１時間飽和した。次いで、ストリップを２％NRS含有PBS−NT２ml中、４０μｌのラット血清または４０μｌの子ウシ血清で１６時間培養した。子ウシ血清は４５００個のファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）被嚢幼虫で経口感染して１２週後の５ヵ月令の子ウシから採取した。２％NRSを含むPBS−NT２ml中、２０μｇのmAb抗ラットIgG1（培養上清、TNOライデン、オランダ）および１６μｇのmAb抗ウシIgG1（バン・ザーネ（van Zaane）ら）と３時間培養した後、２％正常ラット血清を含むPBS−NT中１/５００に希釈したHRPO−結合ウサギ抗マウスIg（ダコパット）を２時間添加した。基質としてクロロナフトール（シグマ；トリス緩衝塩溶液（pH７．４）中０．５mg/mlの４−クロロ−１−ナフトールおよび０．０１５％H2O2）を用いた。基質添加１時間後、ストリップを蒸留水で洗浄することにより染色を停止させた。
培養はすべて室温で実施し、培養工程間にはすべてストリップを１０分間内に３度PBS−NTで洗浄した。
ペプチド合成
試薬
Ｎ−メチルピロリドン（NMP）、N,N−ジメチルホルムアミド（DMF）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）、２−（1H−ベンゾトリアゾール−１−イル）−1,1,3,3−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート（HBTU）およびピペリジンはペプチド合成用基準のものであり、パーキン・エルマー/ABI（ワーリントン、英国）から入手した。アセトニトリルはグラジエント用基準のものであり、ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）、トリフルオロ酢酸（TFA）、チオアニソール（TA）、フェノールおよびエタンジチオール（EDT）は合成用基準のものであり、メルク（ダルムシュタット、ドイツ）から入手した。使用前、ジエチルエーテルは活性化した塩基性酸化アルミニウムのカラム上で精製し、DIEAはニンヒドリンおよび水酸化カリウム上２度蒸留した。Fmoc−アミノ酸誘導体およびリンク樹脂（４−（2’,4’−ジメトキシフェニル−Fmoc−アミノメチル）フェノキシ樹脂）はサクソン・バイオケミカルズ（ハノーバー、ドイツ）から入手した。
ペプチド合成
５種類のペプチドは鎖長約２０アミノ酸のものをウイジュフェルズ（Wijffels）（１９９４）らからのカテプシンLの配列に従って製造した。該ペプチドはジェイムソンおよびウオルフ（Jameson and Wolf）が記載した抗原性指標に基づき、分子上の可能性のある免疫原性決定基から誘導した。ペプチドMCF 03およびMCF06はカテプシンLのプロ配列から誘導し、ペプチドMCF05、MCF04およびMCL13は当該分子の酵素部分から誘導した。ペプチドMCF03はアミノ酸１５〜３３（Gly-Ser-Asn-Asp-Asp-Leu-Trp-His-Gln-Trp-Lys-Arg-Met-Tyr-Asn-Lys-Glu-Tyr-Asn）、ペプチドMCF06はアミノ酸２５〜４２（Lys-Arg-Met-Tyr-Asn-Lys-Glu-Tyr-Asn-Gly-Ala-Asp-Asp-Gln-His-Arg-Arg-Asn）、ペプチドMCF05はアミノ酸１０３〜１２２（Ala-Asn-Asn-Arg-Ala-Val-Pro-Asp-Lys-Ile-Asp-Trp-Arg-Glu-Ser-Gly-Tyr-Val-Thr-Glu）、ペプチドMCF04はアミノ酸１１０〜１２９（Asp-Lys-Ile-Asp-Trp-Arg-Glu-Ser-Gly-Tyr-Val-Thr-Glu-Val-Lys-Asp-Gln-Gly-Asn-Cys）およびペプチドMCL13はアミノ酸２９６〜３１１（Gly-Glu-Arg-Gly-Tyr-Ile-Arg-Met-Ala-Arg-Asn-Arg-Gly-Asn-Met-Cys）をそれぞれ包含する。該ペプチドの分子質量は予測値に対応していた。
我々は３０mmolスケールで４０種までのアミノ酸を同時に合成するためにハミルトン・ミクロラブ２２００（レノ、ネバダ、米国）を使用した。ハミルトン・ミクロラブ２２００は、ペプチド合成用樹脂を含み、洗浄用溶媒と試薬を２０本の個々にフィルターを備えた４mlカラムをもつ２つのラックに搬送するようにプログラムした。カラムは各工程ごとに自動的に真空乾燥した。カップリングサイクルは４０分の二重カップリング工程によるFmoc/HBTUの化学（フィールズ（Fields）ら、１９９１）に基づいた。ペプチドMCF03、MCF06およびMCR05はＮ−末端に追加のシステインをもつように合成した。最終アミノ酸をカップリングさせた後、Fmoc基を３０％（v/v）ピペリジン/NMPで３分および１５分処理して除去した。ペプチドをNMPで洗浄し（５回）、NMP/無水酢酸/DIEA（１０/１/０．１；v/v/v）で３０分間アセチル化し、NMPおよびエタノールで連続的に洗浄し、次いで乾燥した。ペプチドをTFA/フェノール/TA/水/EDT（１０/０．７５/０．５/０．５/０．２５、v/w/v/v/v）の混合物１．５mlを用いて２時間脱保護し、切断し、次いで、ヘキサン/ジエチルエーテル（1/1；v/v）を加え２度沈殿させた。沈殿を乾燥し、水/アセトニトリル（1/1；ｖ/ｖ）から凍結乾燥した。
HPLCおよびマススペクトロメトリー
分析用HPLCとして、我々は２つのウオーターズ・ポンプ・モデル５１０、ウオーターズ・グラジエントコントローラー・モデル６８０、ウオーターズWISP７１２オートインジェクター、およびウオーターズ９９１ホトダイオード・アレイ検出器を使用した。マイクロマス・クアトロIIsqマススペクトロメーターをHPLCシステムと組合わせて、エレクトロスプレーイオン化による個々のピークの分子質量を定量するために用いた。産生物はウオーターズ・デルタ・パックＣ１８−１００Aカラム（３．９×１５０mm、５mm）上、０．１％（v/v）TFAを含む１０％（v/v）アセトニトリル/水から０．１％（v/v）TFAを含む７０％（v/v）アセトニトリル/水までの３０分の直線勾配により１ml/分で分析した。
ペプチドとキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）との接合
ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）を用い、ペプチドをKLHキャリアー・タンパク質に接合させた。１mgのKLH（カルビオケム、０．１Mリン酸緩衝塩溶液中１０mg/ml、pH７）に、MBS１００ml（ピアース、ジメチルホルムアミド中４０mg/ml、メルク）およびアセトニトリル３００mlを滴下し、その混合物を氷上１時間培養した。次いで、PBS１．１mlを加え、活性化したキャリアーをPD１０カラム（ファルマシア）を用い、過剰のMBSから分離した。ペプチド１mgを活性化KLH２．３mgに加え、室温で１時間培養した。次いで、ペプチドと接合体をPBSに対する透析により分離し、該接合体を−２０℃で貯蔵した。
カテプシンLから誘導された合成ペプチドによるラットの予防接種
ラット（１群４匹）の後肢大腿筋にペプチド１００mgを以下のように予防接種した。（i）PBS中、（ii）製造業者の指示書に従いスペコール（specol）（イド−ドロ（id-dlo）、ライシュタッド）と混合して、（iii）KLHに接合し、スペコールと混合して。３週間後、腹腔内追加免疫をスペコールは使用せずに対応するペプチド１００mgで実施した。追加免疫１週間後にラットを経口攻撃し、３週間後に肝臓の寄生虫負荷を測定した。
PCR、サブクローニングおよび配列決定
クイックプレップｍRNA精製キット（ファルマシア・バイオテック）を使用し、充填NEJs４５０μl（±４５．０００NEJs）および２個のエフ・ヘパチカ（F. hepatica）それぞれからｍRNAを単離した。
第一鎖ｃDNA合成キット（ファルマシア・バイオテック）を使用し、ｃDNAを製造した。PCR増幅反応は、ｃDNA１００ng、２．５mM MgCl2、２００μM−ｄTNPs、１．０８〜１．４６μMのエフ・ヘパチカ（F. hepatica）特異プライマーまたは１μMオリゴ（dT）、およびTaq DNAポリメラーゼ・ゴールド（パーキン・エルマー）０．５単位を含むPCRバッファーII（パーキン・エルマー）２５μl反応容量で実施した。特異カテプシンＬ配列を増幅するために用いたオリゴヌクレオチド・プライマーセットの配列は以下のとおりであった。
増幅した断片を製造業者の指示書（TAクローニングキット、インビトロゲン）に従い、ｐCRTMIIベクターのLacZ遺伝子にTAクローニングにより挿入した。TAクローニング・ワンショット適格細胞の形質転換の後、挿入断片を包含するクローンをその白色により識別した。挿入断片のサイズを確認するために、ウイザード・プラス・SVミニプレップスDNA精製システム（プロメガ）を用い、プラスミドDNAを単離し、製造業者の指示書に従い、BamHIおよびEcoRV（ファルマシアLKBバイオケミカルズ）により消化した。
クローン化物質の配列決定はサンガー（Sanger）ら（１９７７）記載の鎖終結反応を用い実施した。各生産物の内、少なくとも２つの陽性クローンにつき、Ｍ１３逆進および前進プライマー両方を用い配列決定した。これらのプライマーを用いたが、我々はプロカテプシンＬ分子全体の配列決定を一度ではなしえなかった。失われた部分の配列決定のために、得られた分子配列に基づき、追加のプライマー（5’〜3’）を設計した。
ウシおよびヒツジのエフ・ヘパチカ感染診断用カテプシンＬペプチド酵素標識免疫吸着測定法（ELISA）
実験用血清
モノ特異抗ファシオーラ血清を得るために、寄生虫の汚染なしに飼育した５〜８月齢のホルシュタイン・フリシアン子ウシ２４頭にファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）被嚢幼虫１００〜３０００個を感染させた。血清標本は週間隔で採取した。糞便中の卵数を週ごとに計測することにより、子ウシの感染をモニターした。屠殺時、すべての子ウシの胆管に吸虫を検出した。さらに、４ないし８月齢の子ウシにディクチオカウラス・ビビパラス（Dictyocaulus viviparus）（Dv、ｎ＝４）、オステルタギア・オステルタギ（Ostertagia ostertagi）（ｎ＝１）、ネマトディラス・ヘルベチアヌス（Nematodirus helvetianus）（ｎ＝１）、コーペリア・オンコホーラ（Cooperia oncophora）（ｎ＝１）またはアスカリス・スウム（Ascaris suum）（ｎ＝１）を単回感染させた。血清標本はすべての感染子ウシが寄生虫卵またはディクチオカウラス・ビビパラスの幼生を排出したときに採取した。これら血清に関する詳報は別途提供する（デ・リーユ（de Leeuw）ら、１９９３）。
寄生虫の汚染なしに飼育した３月齢と１２月齢の間のテクセル種メスヒツジ５頭にファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）被嚢幼虫２０個を感染させた。血清標本は週間隔で採取した。糞便中の卵数を週ごとに計測することによりヒツジの感染をモニターした。屠殺時、すべてのヒツジの胆管に吸虫を検出した。ヘモンチャス・コントータス（Haemonchus contortus）に対する単一特異血清（ｎ＝１２）は５，０００ないし２０，０００個用量の幼生で繰り返し（５〜５０回）感染させたヒツジからのものであった。オステルタギア・サーカムシンクタ（Ostertagia circumcincta）に対する抗血清（ｎ＝８）は３０，０００個の幼生で単回感染させたヒツジからのものであった。テニア・オビス（Taenia ovis）に対する単一特異血清（ｎ＝８）はテニア・オビスの卵で汚染された牧草を食べたヒツジからのものであった。屠殺時、すべてのヒツジに嚢尾虫が認められた。コーペリア・オンコホーラ（Cooperia oncophora）に対する単一特異血清（ｎ＝１２）は２０，０００個の幼生で単回感染させたヒツジからのものであった。ネマトディラス・バッタス（Nematodirus battus）に対する単一特異血清（ｎ＝３）は５，０００個の幼生で５回感染させたヒツジからのものであった。血液標本は、感染したヒツジすべてが寄生虫卵または接合子嚢を排泄する感染後１０〜１５週目に採取した。陰性対照血清は寄生虫未感染ヒツジ（ｎ＝１２）から採取した。
ファシオーラ・ヘパチカの排出/分泌産物からのカテプシンＬの精製
実験的に感染させたウシの胆管から採取した吸虫成虫を０．０１Ｍ PBS（pH７．０）で１時間３〜４回洗浄した。吸虫２０匹をストレプトマイシン（１００μg/ml）およびペニシリン（１００IU/ml）含有HMEM培地１リットル中３７℃で６日間培養した。培地は毎日取り替え、３〜６日目から採取した上清をプールした。このプールを４℃、１０，０００ｇで１時間遠心分離し、上清を使用時まで−７０℃で保存した。平均タンパク濃度は１０μg/mlであった。総タンパク収量は吸虫１０ｇ当たり１mgであった。
これらの排出/分泌抗原をYM−３０膜（アミコン）により濾過した。濾液のpHを０．５Ｍトリス−HCl（pH１１）でpH９．５に調整し、０．０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（pH９．５）により平衡化したジエチルアミノエチル（DEAE）−セファセル・カラム（ファルマシアLKB、ウプサラ、スウェーデン）上のイオン交換クロマトグラフィーに付した。濾液を添加後、DEAE−セファセル・カラムを２００mM NaCl含有の０．０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（pH９．５）で洗浄した。次いで、カラムを５００ｍＭ NaCl含有の同一緩衝液で溶出した。溶出液をSDS−PAGE、エレクトロブロッティングおよびCBB染色に付し、１つのタンパク質バンドを示した。１５個のＮ−末端アミノ酸、Ala-Val-Pro-Asp-Lys-Ile-Asp-Trp-Arg-Glu-Gln-Gly-Tyr-Val-Thrは、ウイジュフェルズ（Wijffels）ら（１９９４）のカテプシンＬ配列との相同性９５．４％を示した。
ELISA手法
ペプチドMCF02、MCF03、MCF04、MCF05およびMCL13それぞれ１００μｇを０．０１Ｍリン酸緩衝液（pH７．５）に溶かし、ELISAプレート（グライナー．６５５００１、アルフェン・アーン・デ・リジュン、オランダ）に固相化し、４℃で一夜培養した。陽性対照として、０．０５Ｍ炭酸緩衝液（pH９．５）に溶かした精製カテプシンＬ１００μｇでプレートを固相化し、３７℃で一夜培養した。各培養工程の間に、０．０５％トゥイーン−８０の水道水溶液でプレートを３回洗浄した。さらなるプレートのブロッキング工程と乾燥は「社内方法」により一夜で実施した。子ウシまたはヒツジの血清１００μｇを０．０５％トゥイーン−８０および０．０５Ｍ NaCl含有の０．０１Ｍリン酸緩衝液（pH７．５）に１/２５に希釈し、添加して３７℃に１時間保持した。ウシIgG1に対するHRPO−接合モノクローナル抗体（１/３０、イド−ドロ（id-dlo）、ライシュタッド）およびポリクローナル抗ヒツジIgG（１/１５．０００、ダコパット）を０．０５％トゥイーン−８０、０．５Ｍ NaClおよび１％正常ウマ血清含有の０．０１Ｍリン酸緩衝液（pH７．５）に溶かして添加し、３７℃に１時間保持した。基質としてテトラメチルベンチジン（０．１Ｍ酢酸ナトリウム/０．１Ｍクエン酸緩衝液（pH６．０）中の０．００５％H2O2および１mg/ml TMB）を使用した。基質添加５分後、反応を０．５Ｍ H2SO4で停止させ、簡易読取りスペクトロホトメーター（SLT、ウイーン）により４５０nmでの吸光度を測定した。陽性および陰性間のカットオフ値は、寄生虫未感染ヒツジまたはウシから得られたそれぞれの血清のOD４５０ｎｍにおける標準偏差の三倍値プラス平均値として計算した。
結 果
生体外消化管モデルの再現性
我々の感染・免疫モデルにおけるNEJ適格試験の精度を１８匹のラットで試験した。まず、我々は正確な感染用量を決めた。正確な数のNEJs消化管分節に接種した後、針と注射器に残ったNEJsを計測した。この残余フラクションは接種用量の平均２４％（６〜５６％の範囲）あり、接種用量から差し引いた。接種６時間後、我々は腹膜フラクション、管腔フラクションおよび消化管フラクションを（免疫組織化学的手法を用いて）定量し、これらフラクションの合計を感染用量（４ないし７８NEJs/cmの範囲）と比較した。腹膜フラクションは４ないし３３NEJs/cm（感染用量の４３〜８０％、平均５７％）の範囲にあり、管腔フラクションは０ないし１０NEJs/cm（０〜６％、平均１％）、また、消化管フラクションは０．２ないし１９NEJs/cm（６〜４４％、平均３２％）である。回収されたNEJsの平均総量合計は感染用量の８７％（±３．６％、平均値標準誤差（SEM））であり、これは消化管モデルの再現性の程度を表している。
抵抗性の発現
ファシオーラ・ヘパチカによる感染が消化管レベルでの攻撃に対する抵抗性となる
ファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）による経口感染の４週間後、ラットは殆ど完全に攻撃感染に対して防御された。感染ラットの肝臓に到達した攻撃寄生虫の数は未処理ラットに比べ、９７％（±１．１％平均値標準誤差、ｎ＝１３）減少していた。
ファシオーラ・ヘパチカに対する抵抗性の大部分は、寄生虫の浸入部分である消化管粘膜で発現された。免疫ラットと未処理ラットの腸管壁を通過するNEJsの移動を、生体外消化管モデルを使用して比較した。免疫ラットにおいては攻撃後２時間以内に抵抗性が発現された。６時間後、移動が完了したとき、攻撃NEJsの５２％（±２．３７％平均値標準誤差、ｎ＝４０）が未処理ラットの空腸に浸入し、一方、免疫ラットでは１２％（±１．７７％平均値標準誤差、ｎ＝４０）が消化管壁を通過しただけであった。このように、感染の結果として空腸壁を通過移動するNEJは７８％減少していた。相当の抵抗性が十二指腸（NEJ移動として５０％減少）、中央空腸（６５％減少）および回腸（７５％減少）にも検出された。このように、小腸全体が重要な免疫防壁である。抵抗性の期間は少なくとも３ヵ月であった（ｎ＝６）。
抵抗性の誘発
ファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）に対する抵抗性が誘発される宿主の部位を検討するために、我々は寄生虫の感染経路、消化管粘膜−腹膜腔−肝臓を辿った。
抵抗性の誘発における消化管浸入の役割を以下の方法により検討した。一次感染NEJsが消化管に浸入した後のさらなる肝臓への移動は、１）ラットを殺吸虫剤で処理すること、または２）生体外消化管モデルを用いNEJsを捕捉することにより防止した。消化管浸入後ラットの殺吸虫剤処理およびNEJs捕捉の両方が肝臓へのさらなる移動を防止した。感染４週後、すべてのラットは健常所見の肝臓を有していたという理由による。驚くべきことに、攻撃感染に対して防御されたラットはなかった。このように、消化管通過それ自身は消化管粘膜で発現されたファシオーラ・ヘパチカに対して抵抗性を発現しない。
腸管壁浸入後、ファシオーラ・ヘパチカは腹膜腔に入り、肝臓に向かって移動する。このルートは一次感染NEJsを腹膜腔内に、または肝臓葉の間に注射することにより模倣した。結果として、感染４週後、すべてのラットは攻撃感染に対し高度に抵抗性であった。防御の平均レベルは消化管レベルで７８．８％（±４．６％平均値標準誤差、ｎ＝１１）であった。明らかに、免疫は腹膜腔−肝臓ルートで誘発されるが、消化管通過の間には誘発されない。後期予防接種におけるこれらの結果に基づき、抗原は腹膜腔に注射した。
消化管粘膜におけるファシオーラ・ヘパチカに対する免疫機構
免疫ラットおよび未処理ラットの消化管分節を（免疫）組織化学用に調製し、免疫グロブリン、Ｔ細胞、NK細胞、杯状細胞、マクロファージ、粘膜肥満細胞および顆粒球の応答につき比較した。免疫ラットでは、粘膜肥満細胞、好酸球およびIgE−陽性細胞の頻度が、未処理ラットに比べて有意に増大した。免疫ラットの空腸分節に対するファシオーラ・ヘパチカでの再感染により、攻撃寄生虫が２時間以内に消化管粘膜において除去される。感染後のこの時間間隔において、攻撃NEJsはIgGlおよびIgG2a抗体で被覆された。同時に好酸球の浸透物がNEJsと関係していた。さらに、消化管レベルでの防御レベルは消化管粘膜での好酸球応答および血清中NEJ抗原に対するIgG1応答と強く相関していた。これらの観察はIgG1（およびIgG2a）抗体および好酸球が防御作用にとって本質的であることを示している。
予防接種の検討
ファシオーラ・ヘパチカの段階
最良の防御作用を誘発するファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）の発育段階を検討した。NEJsおよび吸虫成虫の抽出物を調製し、腹腔内に注射した。NEJ期からの抗原が遥かに優れていると思われた。消化管レベルで５７．３％（±６．２％平均値標準誤差、ｎ＝１０）の防御が達成されたのに対し、成虫段階の抗原では１３．３％（±６．２％平均値標準誤差、ｎ＝１１）の防御に過ぎなかった。
両段階からの抗原により誘発される総防御レベルを測定するために、標的臓器、肝臓に到達している攻撃寄生虫を回収した。ワクチンとしてNEJ抗原を用い、殆ど完全な防御作用が達成された。これらラットの防御レベルは９２．６％（±２．５％平均値標準誤差、ｎ＝１３）であった。成虫期抗原では５６．３％（±１５．９％平均値標準誤差、ｎ＝８）の防御作用となった。
NEJ抗原フラクションの単離
ウシおよびラットの血清による免疫ブロットの研究が免疫ラットによってのみ認識される２種類の低分子量（LMW）NEJ抗原（＞７０％防御作用）を解明したことにより、限られたNEJ抗原フラクションをYM−３０濾過により単離した。処理に際し、タンパク質の３％のみがYM−30膜を通過し、抗原数は５０以上から約５に減少した。このLMWフラクションでラットを予防接種すると防御作用は、標的臓器、肝臓に到達した寄生虫数に基づき、８０％（±１４％平均値標準誤差、ｎ＝１１）となった。試験したラット１１匹の内、６匹が１００％防御であったが、これはすべてアジュバントを使用しないものであった。また、消化管レベルでは相当の抵抗性、５４％（±１２％平均値標準誤差、ｎ＝７）が発現された。
ワクチン抗原の同定
YM−30濾液に存在する防御抗原を同定するために、タンパク質をSDS−PAGEにより分離した。該タンパク質をPVDF膜にエレクトロブロッティングした後、膜の異なる部分を免疫ブロッティング、タンパク染色およびＮ−末端配列分析にそれぞれ使用した。タンパク染色は５本のタンパク質バンドを示し、その分子量はそれぞれ大凡３０〜３２ｋＤ、２８ｋＤ、２５ｋＤ、２０ｋＤおよび１２ｋＤであった。これらのタンパク質の内、３０〜３２kDのタンパク質のみがYM−30単離物で予防接種したラットのすべて（ｎ＝６）により認識され、明らかに免疫優性であった。自然免疫ラットにおいて攻撃NEJsはIgG1抗体により被覆されること、また、血清中IgG1レベルが防御作用と強く相関するという観察から、我々は３０〜３２kDのタンパク質が防御抗原であると結論する。３０〜３２kDのタンパク質はまた、経口感染させたラット（ｎ＝６）、NEJ抽出物を予防接種したラット（ｎ＝６）、および経口感染させた子ウシ（ｎ＝６）によっても認識された。それに対し、該抗原は成虫期の抗原を予防接種したラットによっては認識されなかった。
逆に、吸虫成虫から得られたYM−30濾液の免疫ブロット上には、予防接種ラット、感染ラットあるいは感染ウシの血清との反応は観測されなかった。
３０〜３２kDのタンパク質バンドをPVDF膜から切出し、Ｎ−末端配列決定法を用いさらに同定した。当該タンパク質は配列XXDVSWPFWDRMY NY（ただし、アミノ酸を１文字コードで表す）からなるＮ−末端アミノ酸配列を表出していた。
３０〜３２kD免疫原のＮ−末端アミノ酸はツカルセビッチ（Tkalcevic）ら（１９９５）の記載のように、非還元条件下で４０kDのタンパク質であるNEJタンパク質４のＮ−末端と６９％の相同性を示した。ここに開示した３０〜３２kDのタンパク質のＮ−末端はファシオーラ・ヘパチカ成虫から誘導されるカテプシンＬのプロ配列との相同性５４％を示した（ウイジュフェルズ（Wijffels）ら（１９９４））。PVDF膜からの２８kDおよび２５kDのタンパク質Ｎ−末端を特性化して、以下の配列が明らかになった。
(i) XXWAVLVAGGSD。この配列はツカルセビッチ（Tkalcevic）ら（１９９５）によるNEJヘモグロビナーゼのＮ−末端と７０％の相同性を示した。
(ii) DVPASIDWRQYGYVTEVKDQ。この配列はツカルセビッチ（Tkalcevic）ら（１９９５）によるNEJカテプシンＬのＮ−末端と９５％相同であり、ウイジュフェルズ（Wijffels）ら（１９９４）による成熟カテプシンＬのＮ−末端（１０７〜１２６アミノ酸）と８０％相同である。
Ｎ−末端配列分析と同時に行った免疫ブロッティングの研究は、プロカテプシンＬが免疫優性防御抗原であり、一方、酵素的に活性なカテプシンＬは場合により免疫ウシまたはラットにより認識されるのみであるということを示している。カテプシンＬのプロ配列（プロ領域）の存在は免疫原性と防御作用にとって重要であることを我々はここに示す。さらに、当該研究はNEJsなどの幼若期から誘導されるプロカテプシンＬが成虫期から誘導されるプロカテプシンＬよりもより防御的であるということを示している。
カテプシンＬから誘導される合成ペプチドでのラットの予防接種
カテプシンＬのプロ配列から誘導される２種の合成ペプチド、MCF03（１５〜３３アミノ酸）およびMCF06（２５〜４２アミノ酸）、および成熟酵素から誘導されるペプチド、MCF04（１１０〜１２９アミノ酸）でラットの予防接種を行った。ラットをペプチドMCF03またはMCF06で予防接種すると、これらのラットは攻撃感染に対し防御された（図１）。最良の防御作用は当該ペプチドをキャリアーに接合し、アジュバントの存在下に投与した場合に得られた。しかし、ラットをペプチドMCF04で予防接種しても、攻撃感染に対する防御作用は得られなかった。これらの結果は、カテプシンＬのプロ配列（プロ領域）またはその断片は防御作用の誘発に重要であるという我々の知見を再び支持するものである。
NEJ−特異プライマーを用いるファシオーラ・ヘパチカからのカテプシンＬ分子ユニーク系統群の増幅
プライマーセット（i）により、鋳型としてファシオーラ・ヘパチカ成虫のｃDNAを用い、カテプシンＬのプロ配列を増幅した。３種の陽性クローン（da16、da12、およびda13）につき配列決定した。我々のプライマー選択の故に、クローンはウイジュフェルズ（Wijffels）ら（１９９４）の配列に従い、核酸８５（Trp ２１）で始まり、核酸３８１（Tyr １１９）で終わった。これらクローンのプロペプチド配列はウイジュフェルズ（Wijffels）ら（１９９４）からの配列に対し９６．５〜９８．４％の相同性を示した。誘導されたアミノ酸配列はウイジュフェルズ（Wijffels）ら（１９９４）の配列に対し９５．３〜９７．７％の相同性を示した。プライマーセット（iii）により、鋳型としてNEJsからのｃDNAを用い、カテプシンＬのプロ配列を増幅した。アガロースゲル上、２種類のPCR産物を確認した。３００ｂｐの予測サイズをもつオリゴヌクレオチドをプリックし、同じプライマーを用いて再度増幅し、次いでTAクローニングベクター中に結合した。５種類の異なるクローンにつきヌクレオチド配列を決定した。前進および逆進配列を分析し、一致する配列を明らかにした。クローンda27、da26、da214およびda210は非常に相同性であり、９０．３〜９８．４％の同一性を有していた。これらのクローンはウイジュフェルズ（Wijffels）からのプロ配列（プロ領域）と７９．５〜８２．２％の相同性を示した。誘導されたアミノ酸配列はウイジュフェルズ（Wijffels）からの配列と７９．１〜８０．２％の相同性を示した。クローンda211はより異なる配列を有し、ウイジュフェルズ（Wijffels）のプロ配列とより相同（８７．４）であった。誘導されたアミノ酸配列はウイジュフェルズ（Wijffels）からの配列と８７．２％の相同性を示した。これらのデータは、NEJ−特異プライマーによる異なるサブ系統群のファシオーラ・ヘパチカ・カテプシンＬプロペプチドが、ファシオーラ・ヘパチカ成虫特異プライマーセットを用いてファシオーラ・ヘパチカ成虫から増幅した産物と比較して、NEJsから増幅されたことを示している（１６．６〜２３％不一致）。
さらに、「NEJクローン」から誘導されたアミノ酸配列は、カテプシンＬからのプロ配列が切断される部位に有意な変化のあることを明らかにする。ファシオーラ・ヘパチカ成虫から誘導されるカテプシンＬにおいて、プロ配列はアミノ酸１０６と１０７の間で切断され、P1位にArgを、P2位に未変化極性Asnを、そしてP1’位にAlaを有する。しかし、NEJ−特異プライマーにより得あられた４種の同族カテプシンＬクローンにおいて、我々はP1位にAsnを、P2位にAspまたはGlyを、そしてP1’位にAspを見出した。他の酵素が「NEJカテプシンＬ」のプロペプチドを切除する必要のあることは可能である。このことは結果として、寄生虫成虫と比べて、NEJプロタンパク質の（自己）活性化をあまり有効としない。プロ配列が防御作用の誘発にとって重要であることが判明しているので、これは成虫期抗原と比べて、NEJ抗原により得られる高レベルの防御作用を恐らく説明している。また、免疫ブロットが証明しているように、これはファシオーラ・ヘパチカ成虫からの抗原抽出物に免疫反応性のプロタンパク質が存在しないことをも説明している可能性がある。
プライマーセット（ii）および（iv）により、完全プロカテプシンＬが成虫期ｃDNAを鋳型として増幅された。
ウシおよびヒツジのファシオーラ・ヘパチカ感染を診断するためのカテプシンＬペプチドELISA
子ウシ２頭の血清をファシオーラ・ヘパチカで感染後、一定間隔で標本として採取し、カテプシンＬからのペプチドのエピトープをスクリーニングするために用いた（図４）。カテプシンＬのプロ配列から誘導したペプチドエピトープ、MCF03およびMCF06では反応性が観測されなかったが、ペプチドMCL13についてのみ１頭の子ウシで低い反応性を検出した。それに対し、ペプチドMCF 05、特にペプチドMCF04では両方の子ウシで、感染後５４日目から少なくとも１５４日目まで、精製カテプシンＬにより得られた反応に匹敵する強い反応を与えた。ペプチドMCF04とMCF05を組合わせても免疫反応性は上昇しなかった。したがって、ペプチドMCF04とMCF05は４頭のヒツジの血清（ファシオーラ・ヘパチカ感染後１０週）によって特異的に認識された。
ファシオーラ・ヘパチカにより単回感染させた子ウシ２４頭の血清および他の関連寄生虫により単回感染させた複数頭の子ウシの血清につき、ペプチドMCF04と精製カテプシンＬでのELISAにより試験した。ファシオーラ・ヘパチカ感染の子ウシはすべてカテプシンＬとペプチドMCF04の両方に陽性反応であった。それに対し、他の関連寄生虫により感染させた子ウシはいずれもペプチドMCF04と反応しなかった。したがって、ディクチオカウラス・ビビパラス（Dictyocaulus viviparus）感染の子ウシはペプチドMCF04を認識しなかったが、カテプシンＬとは強く反応した（交差反応性）。
ペプチドMCF04はファシオーラ・ヘパチカで感染した感染後５週目から少なくとも１６週目までのヒツジにより認識された。他の関連寄生虫により感染させたヒツジの血清パネルについてもペプチドELISAにより試験した（図５）。これら血清とペプチドMCF04との反応性は殆ど検出されなかった。
これらの結果は、カテプシンＬからのペプチドMCF04に基づくELISAが高感度でかつ特異的であることを証明している。このELISAはウシとヒツジ双方に対するファシオーラ・ヘパチカ感染の診断目的に非常に価値があると我々は結論する。このペプチドELISAは交差反応性の問題、特にディクチオカウラス・ビビパラスに感染した子ウシに見られる問題を克服する。さらに、自然感染の子ウシおよびヒツジは防御性ペプチドのエピトープMCF03およびMCF06を認識しないので、診断目的のMCF04と予防接種目的のMCF03/MCF06などのペプチドとを組合わせることは、ワクチンとして非常に高い可能性を有する。
PCR、サブクローニングおよび配列決定
広範な寄生虫感染に対する予防接種に有用な防御タンパク質の単離したヌクレオチド配列をさらに検討し入手するために、技術上既知の増幅、クローニングおよび配列決定技法を用いる。たとえば、ファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）の防御性３０〜３２kDタンパク質の場合には、RT−PCRの第一工程において、プライマーＡおよびＢを用いる。プライマーＡの配列はＮ−末端アミノ酸配列から推定される変性オリゴヌクレオチドのセットを必要とする。プライマーＢは、たとえば、寄生虫ｍRNAの5’末端の上流に位置するスプライス・リーダー配列から推定される（デイビス（Davis）ら、The Journal of Biological Chemistry、３１、２００２６〜２００３０、１９９４）。増幅後、得られた断片をクローン化し、配列決定する。プライマーＣは選択するというよりも、ＡとＢの間の配列に位置しており、所望のヌクレオチド配列の対応する３’部分を増幅するためのポリ（ｄＴ）プライマーとともに使用し、その後に全遺伝子またはその選択した断片をクローン化し配列決定する。増幅またはスクリーニング法により単離したヌクレオチド配列を用いることにより、機能的に等価のタンパク質をエンコードする種々のあるいは異なる寄生虫の配列を関連する寄生虫内に確認し、そこから単離することができる。かかるヌクレオチド配列またはその断片のすべてが技術上既知の方法により適切な発現系においてクローン化され、上記のように抗寄生虫ワクチンとしてまたは診断目的に使用することのできる組換えタンパク質を産生させることができる。かかるタンパク質の防御価値の評価は勿論本発明が提供する生体外モデルにより実施し得る。当該ヌクレオチド配列は単独で、あるいは適切なベクター系または構築物に包含させてDNA予防接種プロトコールに採用することも可能である。
図面の説明
図１。経口攻撃３週間後の肝臓内ファシオーラ・ヘパチカの平均回収数（±SD）。（ａ）非免疫ラット、（ｂ）経口感染ラット、（ｃ）MCF03接種ラット、（ｄ）MCF03＋スペコール接種ラット、（ｅ）MCF03−KLH＋スペコール接種ラット、（ｆ）MCF06接種ラット、（ｇ）MCF06＋スペコール接種ラット、（ｈ）MCF06−KLH＋スペコール接種ラット、（ｉ）MCF04接種ラット、（ｊ）MCF04＋スペコール接種ラット、（ｋ）MCF04−KLH＋スペコール接種ラット。
図２。異なる期のファシオーラ・ヘパチカから増幅したカテプシンＬプロ領域の核酸配列（２Ａ）と推定アミノ酸配列（２Ｂ）。吸虫成虫および新たに脱嚢した幼若体からそれぞれｍRNAを単離し、ｃDNAに変換した。プライマーセット、TGG CAT CAG TGG AAG CGA ATG//ATA ACC AGA TTC ACG CCA GTCにより、鋳型としてファシオーラ・ヘパチカ成虫のｃDNAを用い、カテプシンＬを増幅した（da13pro）。プライマーセット、TGG CAY GAR TGG AAR MGN ATG//RTA NCC RTA YTC NCK CCA RTCにより、鋳型として新たに脱嚢した幼若体からのｃDNAを用い、カテプシンＬのプロ配列を増幅した（da210pro、da211pro）。増幅した産物をｐCRTMベクターにクローン化し、配列決定した。得られたカテプシンＬプロ領域の核酸配列および推定アミノ酸配列をウイジュフェルズ（Wijffels）ら（１９９４）からの配列と並列させた。
図３。ファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）（Ｆ−hep、ウイジュフェルズ（Wijffels）ら、１９９４）、シストゾーマ・マンソーニ（Schistosoma manosoni）（Ｓ−man1、マイケル、クリンカートおよびクンツ（Michel,Klinkert & Kunz）１９９４。Ｓ−man２、スミス（Smith）ら、１９９４）、シストゾーマ・ヤポニクム（Schistosoma japonicum）（Ｓ−jap、デイおよびブリンドレイ（Day & Brindley）１９９５）およびホモ・サピエンス（Ｈ−sap、ジョセフ（Joseph）ら、１９８８）からのカテプシンＬプロ配列の並列図。ファシオーラ・ヘパチカの配列に正確に一致するアミノ酸残基を囲みにより示す。
ファシオーラ・ヘパチカ・カテプシンＬのプロ領域は、シストゾーマ・マンソーニ（１）、シストゾーマ・ヤポニクム、ホモ・サピエンスおよびシストゾーマ・マンソーニ（２）のカテプシンＬプロ領域とそれぞれ４１．８％、３８．５％、３０．８％および２０．２％の相同性を示した。
図４。カテプシンＬから誘導される合成ペプチドおよびそのELISAにより試験したファシオーラ・ヘパチカ感染子ウシ血清との反応性を示す図式説明。５種類のカテプシンＬ合成ペプチドを、カテプシンＬ分子上の可能な免疫性領域を表すウイジュフェルズ（Wijffels）ら（１９９４）のアミノ酸配列に従って製造した（ジェイムソンおよびウオルフ（Jameson and Wolf）の抗原性指標に基づく）。ペプチドおよび精製カテプシンＬをそれぞれELISAプレート上に被覆し、ファシオーラ・ヘパチカ感染後一定間隔で標本採取した２頭の子ウシの血清（１／５０希釈）につき試験した。両方の子ウシの強い反応性（OD値＞０．８）が、ペプチドMCF05およびMCF04で、また、精製カテプシンＬで、感染５４日以降に検出された。
図５。ファシオーラ・ヘパチカのペプチドMCD04のELISAでの感度（Ａ）および特異性（Ｂ）。
Ａ）カテプシンＬから誘導されるペプチドMCF04（図４）をELISAプレート上に被覆し、ファシオーラ・ヘパチカ感染後一定間隔で標本採取した５頭のヒツジの血清につき試験した。感染後５週目からOD値が上昇し、感染後少なくとも１６週目まで高値を維持した。
Ｂ）ペプチドMCF04をELISAプレート上に被覆し、ファシオーラ・ヘパチカ（ｎ＝５）、エキノコッカス・グラニュロザス（Echinococcus granulosus）（ｎ＝９）、ネマトディラス・バッタス（Nematodirus battus）（ｎ＝３）、ヘモンチャス・コントータス（Haemonchus contortus）（ｎ＝１２）、トキソプラズマ・ゴンジイ（Toxoplasma gondii）（ｎ＝１２）、エイメリア種（Eimeria spp.）（ｎ＝１２）、オステルタギア・サーカムチンクタ（Ostertagia circumcincta）（ｎ＝８）、コーペリア・オンコホーラ（Cooperia oncophora）（ｎ＝１２）、テニア・オビス（Taenia ovis）（ｎ＝８）を感染させたヒツジおよび寄生虫未感染ヒツジ（ｎ＝１２）の血清につき試験した。
参考文献：
Claims (18)
- 寄生虫プロテアーゼのプロ領域から誘導されるアミノ酸配列を含む防御タンパク質またはその抗原性断片を含むワクチンであって、
該プロテアーゼが該寄生虫の幼若期から誘導され、
該寄生虫がファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）であり、
該プロテアーゼがカテプシン様のものであり、
該タンパク質がＧＳＮＤＤＬＷＨＱＷＫＲＭＹＮＫＥＹＮのアミノ酸配列またはＫＲＭＹＮＫＥＹＮＧＡＤＤＱＨＲＲＮのアミノ酸配列を含むことを特徴とするワクチン。 - 配列ＸＸＤＶＳＷＰＦＷＤＲＭＹＮＹを含むＮ−末端アミノ酸配列を含み、Ｘは任意の天然のアミノ酸を指す防御タンパク質またはその抗原性断片を含むことを特徴とする請求項１記載のワクチン。
- ＧＳＮＤＤＬＷＨＱＷＫＲＭＹＮＫＥＹＮのアミノ酸配列またはＫＲＭＹＮＫＥＹＮＧＡＤＤＱＨＲＲＮのアミノ酸配列を含む防御タンパク質（抗原性断片）をエンコードする単離されたヌクレオチド配列またはその相補的配列を含むことを特徴とするワクチン。
- 配列ＸＸＤＶＳＷＰＦＷＤＲＭＹＮＹを含むＮ−末端アミノ酸配列を含む防御タンパク質（抗原性断片）をエンコードする単離されたヌクレオチド配列またはその相補的配列を含み、Ｘは任意の天然のアミノ酸を指すことを特徴とする請求項３記載のワクチン。
- ＧＳＮＤＤＬＷＨＱＷＫＲＭＹＮＫＥＹＮのアミノ酸配列またはＫＲＭＹＮＫＥＹＮＧＡＤＤＱＨＲＲＮのアミノ酸配列を含む防御タンパク質（抗原性断片）をエンコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞または発現系またはベクターを含むことを特徴とするワクチン。
- 配列ＸＸＤＶＳＷＰＦＷＤＲＭＹＮＹを含むＮ−末端アミノ酸配列を含む防御タンパク質（抗原性断片）をエンコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞または発現系またはベクターを含み、Ｘは任意の天然のアミノ酸を指すことを特徴とする請求項５記載のワクチン。
- ＧＳＮＤＤＬＷＨＱＷＫＲＭＹＮＫＥＹＮのアミノ酸配列またはＫＲＭＹＮＫＥＹＮＧＡＤＤＱＨＲＲＮのアミノ酸配列を含む防御タンパク質（抗原性断片）をエンコードするヌクレオチド配列によりエンコードされる組換えタンパク質を含むことを特徴とするワクチン。
- ＧＳＮＤＤＬＷＨＱＷＫＲＭＹＮＫＥＹＮのアミノ酸配列またはＫＲＭＹＮＫＥＹＮＧＡＤＤＱＨＲＲＮのアミノ酸配列、および配列ＸＸＤＶＳＷＰＦＷＤＲＭＹＮＹを含むＮ−末端アミノ酸配列を含む防御タンパク質（抗原性断片）をエンコードするヌクレオチド配列によりエンコードされ、Ｘは任意の天然のアミノ酸を指す組換えタンパク質を含むことを特徴とするワクチン。
- 請求項１〜８のいずれかに記載のワクチンの製造方法。
- 寄生虫が引起こす感染に対するワクチンの製造方法であって、該寄生虫が粘膜もしくは皮膚表面に侵入し、宿主に感染するものである請求項９記載の方法。
- 該寄生虫がファシオーラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）である請求項１０記載のワクチンの製造方法。
- 請求項１〜８のいずれかに記載のワクチンに対する抗体。
- 請求項１〜８のいずれかに記載のワクチン、または請求項１２記載の抗体を用いるヒト以外の動物の診断試験法。
- ＧＳＮＤＤＬＷＨＱＷＫＲＭＹＮＫＥＹＮのアミノ酸配列もしくはＫＲＭＹＮＫＥＹＮＧＡＤＤＱＨＲＲＮのアミノ酸配列を含む防御タンパク質、
ＧＳＮＤＤＬＷＨＱＷＫＲＭＹＮＫＥＹＮのアミノ酸配列もしくはＫＲＭＹＮＫＥＹＮＧＡＤＤＱＨＲＲＮのアミノ酸配列、および配列ＸＸＤＶＳＷＰＦＷＤＲＭＹＮＹを含むＮ−末端アミノ酸配列を含む防御タンパク質、
ＧＳＮＤＤＬＷＨＱＷＫＲＭＹＮＫＥＹＮのアミノ酸配列もしくはＫＲＭＹＮＫＥＹＮＧＡＤＤＱＨＲＲＮのアミノ酸配列を含む防御タンパク質（抗原性断片）をエンコードするヌクレオチド配列によりエンコードされる組換えタンパク質、または
ＧＳＮＤＤＬＷＨＱＷＫＲＭＹＮＫＥＹＮのアミノ酸配列もしくはＫＲＭＹＮＫＥＹＮＧＡＤＤＱＨＲＲＮのアミノ酸配列、および配列ＸＸＤＶＳＷＰＦＷＤＲＭＹＮＹを含むＮ−末端アミノ酸配列を含む防御タンパク質（抗原性断片）をエンコードするヌクレオチド配列によりエンコードされる組換えタンパク質、を含み、
Ｘは任意の天然のアミノ酸を指すタンパク質に対する抗体の検出を除く寄生虫に対する抗体を検出するヒト以外の動物の診断試験法であって、当該診断試験法が当該タンパク質またはその断片を特異的に含む当該寄生虫に対する請求項１〜８のいずれかに記載のワクチンの使用のための随伴試験法として用いるように特に設計されている試験法。 - 請求項１〜８のいずれかに記載のワクチン、または請求項１２記載の抗体を用いるヒトのサンプルの試験法。
- ＧＳＮＤＤＬＷＨＱＷＫＲＭＹＮＫＥＹＮのアミノ酸配列もしくはＫＲＭＹＮＫＥＹＮＧＡＤＤＱＨＲＲＮのアミノ酸配列を含む防御タンパク質、
ＧＳＮＤＤＬＷＨＱＷＫＲＭＹＮＫＥＹＮのアミノ酸配列もしくはＫＲＭＹＮＫＥＹＮＧＡＤＤＱＨＲＲＮのアミノ酸配列、および配列ＸＸＤＶＳＷＰＦＷＤＲＭＹＮＹを含むＮ−末端アミノ酸配列を含む防御タンパク質、
ＧＳＮＤＤＬＷＨＱＷＫＲＭＹＮＫＥＹＮのアミノ酸配列もしくはＫＲＭＹＮＫＥＹＮＧＡＤＤＱＨＲＲＮのアミノ酸配列を含む防御タンパク質（抗原性断片）をエンコードするヌクレオチド配列によりエンコードされる組換えタンパク質、または
ＧＳＮＤＤＬＷＨＱＷＫＲＭＹＮＫＥＹＮのアミノ酸配列もしくはＫＲＭＹＮＫＥＹＮＧＡＤＤＱＨＲＲＮのアミノ酸配列、および配列ＸＸＤＶＳＷＰＦＷＤＲＭＹＮＹを含むＮ−末端アミノ酸配列を含む防御タンパク質（抗原性断片）をエンコードするヌクレオチド配列によりエンコードされる組換えタンパク質、を含み、
Ｘは任意の天然のアミノ酸を指すタンパク質に対する抗体の検出を除く寄生虫に対する抗体を検出するヒトのサンプルの試験法であって、当該試験法が当該タンパク質またはその断片を特異的に含む当該寄生虫に対する請求項１〜８のいずれかに記載のワクチンの使用のための随伴試験法として用いるように特に設計されている試験法。 - 請求項１〜８のいずれかに記載のワクチンを使用する、ヒト以外の動物の保護方法。
- 該動物が哺乳動物である請求項１７記載のヒト以外の動物の保護方法。
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