KR20160020109A

KR20160020109A - 간흡충 단백질분해효소를 이용한 간흡충증 혈청학적 진단 방법

Info

Publication number: KR20160020109A
Application number: KR1020140105016A
Authority: KR
Inventors: 나병국
Original assignee: 경상대학교산학협력단
Priority date: 2014-08-13
Filing date: 2014-08-13
Publication date: 2016-02-23

Abstract

본 발명은 간흡충(Clonorchis sinensis) 단백질분해효소의 재조합 단백질 발현, 특이 항체 생산과 재조합 단백질의 특성 분석을 기초로 한 간흡충증 진단용 키트 및 진단 방법에 관한 것으로, 간흡충 단백질분해효소 중 5종류의 카텝신 B 시스테인 단백질분해효소(cathepsin B cysteine proteases)와 2종류의 아스파틱 단백질분해효소(aspartic proteases)의 유전자를 발굴하여 재조합 단백질을 생산하였고, 이렇게 제조한 재조합 단백질이 간흡충증 환자 혈청에 대해 특이적인 항원성을 나타냄을 확인함으로써, 상기 간흡충 단백질분해효소를 포함하는 간흡충 단백질분해효소 재조합 단백질은 간흡충증 특이 혈청학적 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

간흡충 단백질분해효소를 이용한 간흡충증 혈청학적 진단 방법{Serodiagnostic method of clonorchiasis using Clonorchis sinensis proteases as serodiagnostic antigens}

본 발명은 간흡충(Clonorchis sinensis)의 5종류의 카텝신 B 시스테인 단백질분해효소(cathepsin B cysteine proteases)(CsCB-1, CsCB-2, CsCB-3, CsCB-4, CsCB-5)와 2종류의 아스파틱 단백질분해효소(aspartic proteases)(CsAP-1, CsAP-2)를 암호화하는 유전자의 염기서열과 아미노산 서열을 포함하며 상기 단백질분해효소들의 재조합 단백질 발현, 특이 항체 생산과 재조합 단백질의 특성 분석을 기초로 한 간흡충증 진단용 키트 및 진단 방법에 관한 것이다.

간흡충증(clonorchiasis)은 간흡충(Clonorchis sinensis)의 감염에 의해 유발되는 기생충감염질환이다. 간흡충의 인체 감염은 간흡충의 피낭유충이 감염된 민물고기를 날로 먹거나 덜 익혀 먹었을 경우 발생하며 우리나라 전 국민의 약 2%(약 100만 명)가 간흡충에 감염되어 있는 것으로 추정된다. 특히 5대강 유역에 거주하는 주민들에서 감염률이 높은 것으로 알려져 있다. 간흡충은 전 세계적으로는 약 3,500만 명이 감염되어 있으며 중국, 타이완 그리고 베트남 북부에서 광범위하게 유행하고 있다. 간흡충증의 치료에는 프라지콴텔(praziquantel)이 매우 효과적이나 일반 세균성 또는 바이러스성 감염질환과는 달리 치료 후에도 지속적인 반복 감염이 가능하기 때문에 간흡충증의 관리 및 퇴치는 매우 어렵다. 간흡충이 경감염된 경우에는 특이적인 임상증상이 나타나지 않으나 중감염 또는 감염이 장기간 반복적으로 지속될 경우에는 다양한 합병증이 발생할 뿐 아니라 담관암을 유발하기도 한다. 간흡충 감염은 그 자체의 치료는 큰 문제가 되지 않으나, 감염상태가 오래 방치되었을 경우 그에 따른 합병증이 유발된다. 담관암, 담관내 결석, 화농성 담관염 등의 다양한 합병증은 간흡충 감염 자체에 비하여 대단히 심각한 질환이므로 이러한 중증 질환으로 발전하기 전에 조기에 감염 여부를 진단하고 치료의 시기를 앞당기는 것이 매우 중요하다.

간흡충 감염은 대변검사법으로 대변 내 충란을 현미경으로 직접 확인하여 진단한다. 대변검사법은 감염여부를 가장 정확하게 판별할 수 있을 뿐 아니라, 대변 내 충란 수를 측정하여 감염 강도를 추정할 수 있는 장점이 있지만, 대단위 기생충 감염을 조사하는 경우에는 대변수거의 어려움이 있고, 충체 부하가 낮은 간흡충 감염자의 경우에는 충란 검출율이 낮아져서 현미경대변검사를 반복해야 하기 때문에 확진까지 소요되는 시간이 길다. 보완적인 진단법으로 초음파검사와 역행성 내시경담도조영술 등의 영상진단법과 면역혈청학적 검사인 피부반응검사가 간흡충 감염의 진단에 활용될 수 있다. 간흡충 피내반응 검사는 대단위 간흡충증관리사업에 양성감염자 선별검사로 활용하기 용이하고 민감도가 높다는 장점이 있으나 특이도가 낮고, 현증과 과거 감염을 구분하지 못해 실효성이 떨어지며 알레르기 반응을 유발할 수 있다. 영상학적 진단방법인 초음파검사, 전산화 단층 촬영(CT), 자기공명영상(MRI), 내시경적 역행성 담관조영술은 간 내 담관이 불규칙적으로 확장된 소견을 확인하여 간흡충증을 의심해 볼 수 있고, 또 이차적인 합병증 즉 담낭, 담관, 간의 염증, 담관결석, 담관암 등을 알아볼 수 있지만, 이들 방법으로는 확진이 어렵고 고가의 진단장비와 전문가가 필요하여 비용적인 측면에서 일반적인 진단법으로 활용하기에 제한적인 면이 있다. 따라서 간흡충증 진단 후 적절한 치료가 요구되나 기존의 간흡충증 진단법은 대변 수거의 불편함, 검사의 복잡성, 숙달된 전문 인력과 장시간의 검사시간의 필요 등 다양한 문제점을 내포하고 있어 간편하고 신속한 혈청학적 진단법의 개발이 필요하다. 국내외에서 간흡충증을 특이적으로 진단하기 위한 다양한 혈청학적 진단법 개발 연구가 수행되어 왔으나 현재까지 유용한 진단법은 개발되지 않았으며 가장 중요한 원인은 간흡충 특이 항원의 부재이다. 따라서 간흡충 특이 항원 발굴 및 특성 분석 연구가 국내외에서 활발하게 진행되고 있다.

간흡충의 시스테인 단백질분해효소(cysteine proteases)인 카텝신(cathepsin) F(또는 cathepsin L)은 간흡충이 활발하게 충체 외부로 분비하는 주요 단백질 중 하나로서 강한 항원성을 나타내기 때문에 중요한 간흡충증 특이 진단 항원으로서 활발하게 연구되었다. 또한 간흡충의 아스파라기닐 엔도펩티다제(asparaginyl endopeptidase, legumain)와 글루타티온 S-전달효소(glutathione S-transferase, GST) 등의 다양한 간흡충 항원이 혈청학적 진단 항원으로 연구되었다. 그러나 기존에 연구된 간흡충 특이 항원으로는 만족할만한 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)를 가지는 간흡충증 혈청학적 진단법 개발이 어려우며 민감도와 특이도를 향상시킬 수 있는 새로운 진단 항원의 발굴 및 적용이 필요하다.

이에 본 발명자들은 간흡충증의 혈청학적 진단 항원으로 활용할 수 있는 간흡충 특이 항원을 발굴하고자 하였으며 간흡충의 시스테인 단백질분해효소(cystine proteases)의 발굴과 특성을 규명한 결과, 5종류의 카텝신 B 시스테인 단백질분해효소(cathepsin B cysteine proteases)와 2종류의 아스파틱 단백질분해효소(aspartic proteases)의 유전자를 발굴하고 재조합 단백질을 생산하였으며 재조합 단백질이 간흡충증 환자 혈청에 대해 특이적인 항원성을 나타냄을 확인함으로써, 상기 간흡충 단백질분해효소들이 간흡충증 특이 혈청학적 진단용 항원으로서 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 7로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 간흡충증 특이적 항원 단백질, 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 및 상기 항체를 포함하는 간흡충증 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 7로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 간흡충증 특이적 항원 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 간흡충증 특이적 항원 단백질을 암호화하는 서열번호 8 내지 14로 기재되는 염기서열을 갖는 간흡충증 특이적 항원 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 간흡충증 특이적 항원 단백질 중 어느 하나를 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 발현 벡터를 숙주세포에 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 형질전환체를 배양하여 재조합 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 간흡충증 특이적 항원 단백질 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 간흡충증 특이적 항원 단백질 제조 방법으로 제조된 간흡충증 특이적 항원 재조합 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 간흡충증 특이적 항원 단백질 또는 간흡충증 특이적 항원 재조합 단백질을 포함하는 간흡충증 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 7로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 간흡충증 특이적 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.

또한, 본 발명은 간흡충증 특이적 항원 단백질 또는 간흡충증 특이적 항원 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 간흡충증 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 피검체로부터 분리된 시료를 간흡충증 특이적 항원 단백질 또는 간흡충증 특이적 항원 재조합 단백질과 접촉시키는 단계; 및

2) 상기 단계 1)의 시료 중 상기 단백질과 결합된 항체를 검출하는 단계를 포함하는 간흡충증 진단 방법을 제공한다.

도 1은 간흡충 카텝신 B 시스테인 단백질분해효소의 재조합 단백질 발현을 확인한 도이다.
도 2는 간흡충 아스파틱 단백질분해효소의 재조합 단백질 발현을 확인한 도이다:
(A)는 CsAP-1이고, (B)는 CsAP-2이다.
도 3은 간흡충 카텝신 B 시스테인 단백질분해효소의 항원성을 확인한 도이다.
도 4는 간흡충 아스파틱 단백질분해효소인 CsAP-2의 항원성을 확인한 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1 내지 7로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 간흡충증 특이적 항원 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 간흡충증 특이적 항원 단백질을 암호화하는 서열번호 8 내지 14로 기재되는 염기서열을 갖는 간흡충증 특이적 항원 유전자를 제공한다.

상기 항원 단백질은 간흡충의 단백질분해효소인 것이 바람직하며, 상기 단백질분해효소는 간흡충 카텝신 B 시스테인 단백질분해효소(cathepsin B cysteine proteases) 또는 간흡충 아스파틱 단백질분해효소(aspartic proteases)인 것이 보다 바람직하다.

또한, 본 발명은

1) 상기 간흡충증 특이적 항원 단백질 중 어느 하나를 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;

상기 단계 1)의 발현벡터의 제작 시에는, 상기 재조합 단백질을 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(inhancer) 등과 같은 발현조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.

본 발명의 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 발현벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 상기 시그널 서열에는 숙주가 에쉐리키아속(Escherichia sp.)균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속(Bacillus sp .)균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모(yeast)인 경우에는 MF 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널 서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.

상기 단계 2)의 형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다.

상기 형질전환체는 상기 발현 벡터를 임의의 숙주세포에 도입시킴으로써 용이하게 제조될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 발현 벡터 pQE-30을 대장균 균주 M15[pREP4]에 도입하여 형질전환체를 제조하였다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 간흡충증의 혈청학적 진단 항원으로 활용할 수 있는 간흡충 특이 항원을 발굴하고자 간흡충 성충에서 간흡충 카텝신 B 시스테인 단백질분해효소 5종류(CsCB-1, CsCB-2, CsCB-3, CsCB-4 및 CsCB-5)와 간흡충 아스파틱 단백질분해효소 2종류(CsAP-1 및 CsAP-2)의 유전자를 분리하고 이의 염기서열과 아미노산 서열을 확인한 결과, 상기 간흡충 단백질분해효소 모두 N-말단에 신호 펩타이드(signal peptide) 부위를 가지고 있었으며, 활성부위(active site)를 구성하는 아미노산들이 잘 보존되어있는 것을 확인하였고, 상기 7종류의 간흡충 단백질분해효소의 재조합 단백질 생산을 위해 각 유전자에서 신호 펩타이드가 제거된 발현 컨스트럭트(expression construct)를 제작한 결과, 간흡충 단백질분해효소의 재조합 단백질 모두 비수용성 단백질로 발현되며, 잘 발현하는 것을 확인하였다(도 1 내지 도 2 참조).

또한, 본 발명자들은 정제된 재조합 간흡충 단백질분해효소에 대한 특이 항체를 제작하여 발현 위치 및 발현 정도를 분석하였고, 항원성을 분석한 결과, 재조합 간흡충 카텝신 B 시스테인 단백질분해효소는 정상인 혈청과 달리 간흡충 감염 환자의 혈청에 대해 민감도 70~80%의 항원성을 나타내는 것을 확인하였고(도 3 참조), 재조합 간흡충 아스파틱 단백질분해효소는 간흡충을 인공 감염시킨 래트(rat)의 혈청에 대해 특이적인 항원성을 나타내며, 특히 감염 후 4주 후부터 항원성이 확연히 증가하는 것을 확인하였다(도 4 참조).

따라서, 본 발명의 간흡충 단백질분해효소는 5종류의 카텝신 B 시스테인 단백질분해효소와 2종류의 아스파틱 단백질분해효소로, 상기 7종류의 간흡충 단백질분해효소로 재조합 단백질을 생산하였고, 이렇게 제조한 재조합 단백질이 간흡충증 환자 혈청에 대해 특이적인 항원성을 나타냄을 확인함으로써, 상기 간흡충 단백질분해효소는 간흡충증 특이 혈청학적 진단을 위한 항원으로 유용하게 사용할 수 있다.

상기 항체는 단일클론 또는 다클론 항체인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 단일클론 항체는 당업자에게 알려진 공지의 방법으로 제작하여도 무방하며, 당업자에게 알려진 종래 방법에 따라 본 발명의 재조합 단백질을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여할 수 있다. 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 형상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하여 항체를 분리할 수 있다.

상기 단일클론 항체는 본 발명의 항원 단백질을 특이적으로 인식하는 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체의 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab'₂) 및 Fv 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 항체는 간흡충 단백질분해효소를 인간을 제외한 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 방법으로 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 간흡충 단백질분해효소는 5종류의 카텝신 B 시스테인 단백질분해효소와 2종류의 아스파틱 단백질분해효소로, 상기 7종류의 간흡충 단백질분해효소로 재조합 단백질을 생산하였고, 이렇게 제조한 재조합 단백질이 간흡충증 환자 혈청에 대해 특이적인 항원성을 나타냄을 확인함으로써, 상기 간흡충 단백질분해효소에 대해 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 제조에 유용하게 사용할 수 있다.

상기 간흡충증 특이적 항원 단백질은 서열번호 1 내지 서열번호 7로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 것이 바람직하고, 상기 항원 단백질은 간흡충의 단백질분해효소인 것이 바람직하며, 상기 단백질 분해효소는 간흡충 카텝신 B 시스테인 단백질분해효소 또는 간흡충 아스파틱 단백질분해효소인 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 간흡충 단백질분해효소는 5종류의 카텝신 B 시스테인 단백질분해효소와 2종류의 아스파틱 단백질분해효소로, 상기 7종류의 간흡충 단백질분해효소로 재조합 단백질을 생산하였고, 이렇게 제조한 재조합 단백질이 간흡충증 환자 혈청에 대해 특이적인 항원성을 나타냄을 확인함으로써, 간흡충증 진단용 키트로 유용하게 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 1) 피검체로부터 분리된 시료를 간흡충증 특이적 항원 단백질 또는 간흡충증 특이적 항원 재조합 단백질과 접촉시키는 단계; 및

상기 단계 1)의 시료는 혈청인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 1)의 간흡충증 특이적 항원 단백질은 서열번호 1 내지 서열번호 7로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 것이 바람직하다.

상기 항원 단백질은 간흡충의 단백질분해효소인 것이 바람직하며, 상기 단백질분해효소는 간흡충 카텝신 B 시스테인 단백질분해효소 또는 간흡충 아스파틱 단백질분해효소인 것이 보다 바람직하다.

상기 단계 2)의 검출은 면역블럿(immunoblot) 또는 ELISA를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 간흡충 단백질분해효소는 5종류의 카텝신 B 시스테인 단백질분해효소와 2종류의 아스파틱 단백질분해효소로, 상기 7종류의 간흡충 단백질분해효소로 재조합 단백질을 생산하였고, 이렇게 제조한 재조합 단백질이 간흡충증 환자 혈청에 대해 특이적인 항원성을 나타냄을 확인함으로써, 상기 간흡충 단백질분해효소에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 간흡충증 진단에 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 간흡충 카텝신 B 시스테인 단백질분해효소( cathepsin B cysteine proteases) 유전자의 클로닝 ( cloning ) 및 서열분석

간흡충증의 혈청학적 진단 항원으로 활용할 수 있는 간흡충 특이 항원을 발굴하고자 간흡충 성충에서 간흡충 카텝신 B 시스테인 단백질분해효소(CsCB) 유전자를 분리하고 염기서열을 확인하였다.

구체적으로, 질병관리본부 PathOD(http://pathod.cdc.go.kr/index.jsp)의 간흡충 유전체 정보를 일부 활용하고, Rapid Amplification of cDNA Ends(RACE)법을 실시하여 5종류의 간흡충 카텝신 B 시스테인 단백질분해효소(CsCB-1, CsCB-2, CsCB-3, CsCB-4 및 CsCB-5) 유전자를 확보하였다. 5종류의 간흡충 카텝신 B 시스테인 단백질분해효소 유전자들의 염기서열을 확보한 후 간흡충 성충에서 분리한 cDNA를 주형으로, 각 유전자에 대해 특이적으로 제작한 하기 [표 1]의 올리고뉴클레오티드 프라이머(oligonucleotide primers)를 사용하여 하기 [표 2]의 조건으로 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)을 수행하였다. 상기 증폭된 각각의 유전자 단편은 아가로즈 겔에서 전기영동하여 PCR 산물을 확인한 후, T&A 클로닝 벡터(T&A cloning vector, RBC) 내로 클로닝하였다. 클로닝된 각각의 유전자 단편을 Escherichia coli(E. coli) DH5α(Real Biotech Corporation)로 제조사의 절차에 따라 형질전환하고, 클로닝된 유전자의 염기서열은 자동 염기서열분석법으로 분석하였으며, 분석된 염기서열은 DNASTAR(Lagergene) 분석 프로그램을 이용하여 염기서열을 확인하였다.

목적 유전자	primer
목적 유전자	명칭	서열	방향	서열번호
CsCB-1	CsCB1_F	ATGGATTCGATTTGGACCCTGATAATG	정방향	서열번호 : 15
CsCB-1	CsCB1_R	TCACAGTTTTGGATGACCAGCATTGGC	역방향	서열번호 : 16
CsCB-2	CsCB2_F	ATGTTACCGTCGTTCGTACTATACGGT	정방향	서열번호 : 17
CsCB-2	CsCB2_R	TCAAAAATGCGGAATGGTGGAAAGATC	역방향	서열번호 : 18
CsCB-3	CsCB3_F	ATGCTGTGGTTGATACTAGTTTTCGGT	정방향	서열번호 : 19
CsCB-3	CsCB3_R	TCACTTAAGTGGGATGCTGGACAATTC	역방향	서열번호 : 20
CsCB-4	CsCB4_F	ATGAGGGCAACGACATTCTTATGTGCT	정방향	서열번호 : 21
CsCB-4	CsCB4_R	TCACGAAAAGGATTCATGATTAACTGG	역방향	서열번호 : 22
CsCB-5	CsCB5_F	ATGATACCGCTGTTTACAGCATACAAT	정방향	서열번호 : 23
CsCB-5	CsCB5_R	TCAATACTGTGGAATGATGGGAAGATA	역방향	서열번호 : 24

PCR 조건
변성(denaturation)	95℃	5분	1회
변성(denaturation)	95℃	1분	25회
결합(annealing)	50℃	1분
신장(extension)	72℃	1분30초
최종 신장(final extension)	72℃	10분	1회

그 결과, 5종류의 간흡충 카텝신 B 시스테인 단백질분해효소(CsCB-1, CsCB-2, CsCB-3, CsCB-4 및 CsCB-5) 유전자를 발굴하였으며 각각의 간흡충 카텝신 B 시스테인 단백질분해효소의 염기서열과 아미노산서열은 하기 [표 3]에 나타낸 바와 같이 서열목록을 입력하였다. 5종류의 간흡충 카텝신 B 시스테인 단백질분해효소 모두 N-말단에 신호 펩타이드(signal peptide) 부위를 가지고 있었으며, 간흡충 카텝신 B 시스테인 단백질분해효소의 활성부위(active site)를 구성하는 아미노산들이 잘 보존되어있는 것을 확인하였다.

유전자	종류	서열번호
CsCB-1	아미노산서열	서열번호 : 1
CsCB-1	염기서열	서열번호 : 8
CsCB-2	아미노산서열	서열번호 : 2
CsCB-2	염기서열	서열번호 : 9
CsCB-3	아미노산서열	서열번호 : 3
CsCB-3	염기서열	서열번호 : 10
CsCB-4	아미노산서열	서열번호 : 4
CsCB-4	염기서열	서열번호 : 11
CsCB-5	아미노산서열	서열번호 : 5
CsCB-5	염기서열	서열번호 : 12

< 실시예 2> 간흡충 아스파틱 단백질분해효소( aspartic proteases ) 유전자의 클로닝 및 서열분석

간흡충증의 혈청학적 진단 항원으로 활용할 수 있는 간흡충 특이 항원을 발굴하고자 간흡충 성충에서 간흡충 아스파틱 단백질분해효소(CsAP) 유전자를 분리하고 염기서열을 확인하였다.

구체적으로, 상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 하기 [표 4]의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 실험하였다.

목적 유전자	primer
목적 유전자	명칭	서열	방향	서열번호
CsAP-1	CsAP1_F	ATGATTCATCTGGGCTTGTTGTTTTGG	정방향	서열번호 : 25
CsAP-1	CsAP1_R	TCACCATCCGAATCCGAACAATCTGGA	역방향	서열번호 : 26
CsAP-2	CsAP2_F	ATGCGATTTTACGCCATCTTGCTGCTT	정방향	서열번호 : 27
CsAP-2	CsAP2_R	CTAAGTGGACCTTGCAAAGCCAACACG	역방향	서열번호 : 28

그 결과 2종류의 간흡충 아스파틱 단백질분해효소(CsAP-1 및 CsAP-2) 유전자를 발굴하였으며 각각의 간흡충 아스파틱 단백질분해효소의 염기서열과 아미노산서열은 하기 [표 5]에 나타낸 바와 같이 서열목록을 입력하였다. 2종류의 간흡충 아스파틱 단백질분해효소 모두 N-말단에 신호 펩타이드 부위를 가지고 있었으며, 간흡충 아스파틱 단백질분해효소의 활성부위를 구성하는 아미노산들이 잘 보존되어있는 것을 확인하였다.

유전자	종류	서열번호
CsAP-1	아미노산서열	서열번호 : 6
CsAP-1	염기서열	서열번호 : 13
CsAP-2	아미노산서열	서열번호 : 7
CsAP-2	염기서열	서열번호 : 14

< 실시예 3> 간흡충 단백질분해효소 재조합 단백질의 생산 및 정제

간흡충 단백질분해효소(5종류의 간흡충 카텝신 B 시스테인 단백질분해효소와 2종류의 간흡충 아스파틱 단백질분해효소)의 재조합 단백질 생산을 위해 각 유전자에서 신호 펩타이드가 제거된 발현 컨스트럭트(expression construct)를 제작하였다.

구체적으로, 발현 컨스트럭트를 제작하기 위한 각 유전자의 증폭은 제한효소(restriction enzyme) 절단부위를 첨가한 하기 [표 6]의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 PCR 및 형질전환하였고, 각각의 유전자를 함유하는 플라스미드(plasmid)는 정제한 후 해당 제한효소로 절단한 후 동일한 제한효소를 처리한 pQE-30 발현벡터(Qiagen)에 클로닝하고 E. coli M15[pREP4](Qiagen)에 형질전환하였다. 상기 E. coli는 100 ug/ml 암피실린과 50 ug/ml 카나마이신이 첨가된 LB 고체배지에 도말하여 37℃ 항온기에서 하룻밤 배양하고, 형질전환된 E. coli를 선별하였다. 재조합 단백질의 발현은 E. coli를 1 mM IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactoside)(Duchefa)가 첨가된 LB 액체배지에 접종하여 37℃에서 3시간 배양하며 유도하였다. 배양한 E. coli 세포는 10,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 수집한 다음 네이티브(native) 용해 완충용액(lysis buffer)(50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸(imidazole), pH 8.0)에 부유하여 극초음파 분쇄기(ultra sonicator)로 파쇄하고 12,000 rpm에서 20분간 4℃에서 원심분리 하였다. 원심분리 후 얻어진 상층액은 수집하고 침전물(pellet)은 변형(denatured) 용해 완충용액(8 M Urea, 100 mM NaH₂PO₄, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0)에 부유한 후 실온에서 하룻밤 방치한 후 12,000 rpm에서 20분간 4℃에서 원심분리 하고 상층액을 수집하였다. Native 및 denatured 시료에서 재조합 단백질의 발현은 SDS-PAGE와 anti-6×His antibody(Qiagen)를 이용한 면역블럿(immunoblot)을 실시하여 확인하였고, 발현이 확인된 재조합 단백질은 Ni-NTA 친화성 컬럼(affinity column)(Qiagen)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 정제하였다. 정제 후, SDS-PAGE로 확인하였다.

목적 유전자	primer
목적 유전자	명칭	서열	방향	서열번호
CsCB-1	rCsCB1_F	GGATCC CTTTCGGATGAAATTGTCCAT	정방향	서열번호 : 29
CsCB-1	rCsCB1_R	AAGCTT TCACAGTTTTGGATGACCAGC	역방향	서열번호 : 30
CsCB-2	rCsCB2_F	GGATCC GAACATGTACATCCGACTGCA	정방향	서열번호 : 31
CsCB-2	rCsCB2_R	GAGCTC TCAAAAATGCGGAATGGTGGA	역방향	서열번호 : 32
CsCB-3	rCsCB3_F	GGATCC TATGTTGATTCAAAGTCGGGC	정방향	서열번호 : 33
CsCB-3	rCsCB3_R	AAGCTT TCACTTAAGTGGGATGCTGGA	역방향	서열번호 : 34
CsCB-4	rCsCB4_F	GTCGAC AAACCAAAGCACGAAGCCTTG	정방향	서열번호 : 35
CsCB-4	rCsCB4_R	AAGCTT TCACGAAAAGGATTCATGATT	역방향	서열번호 : 36
CsCB-5	rCsCB5_F	GGATCC GAACAAACAGCAAATGTAGGA	정방향	서열번호 : 37
CsCB-5	rCsCB5_R	AAGCTT TCAATACTGTGGAATGATGGG	역방향	서열번호 : 38
CsAP-1	rCsAP1_F	GAGCTC AGTGTTATTCGGATTCCTCTA	정방향	서열번호 : 39
CsAP-1	rCsAP1_R	GTCGAC TCACCATCCGAATCCGAACAA	역방향	서열번호 : 40
CsAP-2	rCsAP2_F	GGATCC GTTTTGAGAGTTCCGCTCAAA	정방향	서열번호 : 41
CsAP-2	rCsAP2_R	GTCGAC CTAAGTGGACCTTGCAAAGCC	역방향	서열번호 : 42

그 결과 도 1 내지 도 2에 나타낸 바와 같이, 5종류의 간흡충 카텝신 B 시스테인 단백질분해효소의 재조합 단백질 모두 비수용성 단백질로 발현되었으며 재조합 단백질이 잘 발현하는 것을 확인하였고(도 1), 2종류의 간흡충 아스파틱 단백질분해효소의 재조합 단백질 역시 비수용성 단백질로 발현되었으며 재조합 단백질이 잘 발현하는 것을 확인하였다(도 2).

< 실시예 4> 간흡충 단백질분해효소 특이 항체 생산

정제된 재조합 간흡충 단백질분해효소에 대한 특이 항체를 제작하였다.

구체적으로, 정제한 재조합 단백질 50 ug을 balb/c 마우스 또는 래트(rat)에 2주 간격으로 3회 복강 면역시켰으며 보조제(adjuvant)로는 완전프로인트항원보조제(Freund's Complete adjuvant)와 불완전프로인트항원보조제(Freund's Incomplete adjuvant)(Sigma)를 사용하였다. 최종 면역 후 마우스 또는 래트를 희생하고 혈액을 채혈한 다음 혈청을 분리하여 Protein G affinity column(Amersham Biosciences)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 항체를 추가 정제하였다. 제작한 항체는 면역블럿을 실시하여 특이성을 확인하였다.

< 실시예 5> 항원성 분석

<5-1> 재조합 간흡충 카텝신 B 시스테인 단백질분해효소의 항원성 분석

정제한 재조합 간흡충 카텝신 B 시스테인 단백질분해효소의 항원성을 분석하기 위하여, 면역블럿을 수행하였다.

구체적으로, 각각의 재조합 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)(Bio-Rad)으로 이동시킨 후 막을 여러 개의 스트립(strip)으로 자른 다음 3% 스킴밀크(skim milk)를 포함하는 PBST(0.05% Tween 20/PBS, pH 7.4)로 블로킹(blocking)하였다. 각각의 스트립은 3% 스킴 밀크가 첨가된 PBST에 1:100으로 희석한 간흡충증 환자(n=25) 혈청 또는 정상인(n=5) 혈청에 첨가하여 실온에서 3시간 반응하였다. 반응 후 각각의 스트립은 PBST로 3회 세척하고 3% 스킴 밀크가 첨가된 PBST에 1:1,000으로 희석한 호스라디시-퍼옥시데이즈(horseradish-peroxidase, HRP)-접합된 항-인간 IgG(Sigma)에 첨가하여 실온에서 3시간 추가 반응하였다. 반응 후 각각의 스트립은 PBST로 3회 세척하고 기질 용액(0.05% 4-클로로-1-나프톨(4-chloro-1-naphtol), 0.05% 과산화수소(hydrogen peroxide)/100 mM PBS, pH 7.0)에 첨가하여 암실에서 10분간 발색시킨 후 증류수로 수차례 세척하여 반응을 종결시켰다.

그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, 재조합 간흡충 카텝신 B 시스테인 단백질분해효소는 정상인 혈청과 달리 간흡충 감염 환자의 혈청에 대해 항원성(민감도: 70~80%)을 나타내는 것을 확인하였다(도 3).

<5-2> 재조합 간흡충 아스파틱 단백질분해효소의 항원성 분석

정제한 재조합 간흡충 아스파틱 단백질분해효소의 항원성을 분석하기 위하여, 면역블럿을 수행하였다.

구체적으로, 간흡충을 인공 감염시킨 래트에서 간흡충 단백질분해효소 특이 항체의 생성을 주기적으로 분석하기 위해, 간흡충의 피낭유충 100개를 래트에 인공 감염시키고 감염 전, 그리고 감염 후 2, 4, 6, 9 및 12주에 혈액을 채혈하였다. 채혈한 혈액은 원심분리하여 혈청을 수집하였다. 상기 실시예 <5-1>과 동일한 방법으로 간흡충증 환자 혈청 대신 래트 혈청을 첨가하고, 호스라디시-퍼옥시데이즈-접합된 항-래트 IgG(Sigma)를 사용하여 실험하였다.

그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이, 재조합 간흡충 아스파틱 단백질분해효소인 CsAP-2는 간흡충을 인공 감염시킨 래트의 혈청에 대해 특이적인 항원성을 나타내며, 감염 후 4주 후부터 항원성이 확연히 증가하는 것을 확인하였다(도 4).

따라서, 간흡충 카텝신 B 시스테인 단백질분해효소와 간흡충 아스파틱 단백질분해효소는 간흡충증 특이 혈청학적 진단을 위한 항원으로 활용이 가능한 것을 확인하였다.

<110> University-Industry Cooperation Croup of Gyeongsang National University <120> Serodiagnostic method of clonorchiasis using Clonorchis sinensis proteases as serodiagnostic antigens <130> 2014P-05-026 <160> 42 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 339 <212> PRT <213> Clonorchis sinensis <400> 1 Met Asp Ser Ile Trp Thr Leu Ile Met Tyr Ala Leu Leu Cys Ala Glu 1 5 10 15 Ser Phe Arg Ala Glu Tyr Ile Pro Ser Phe Glu Ser Leu Ser Asp Glu 20 25 30 Ile Val His Tyr Ile Asn His Lys Ala Asn Thr Thr Trp Lys Ala Ala 35 40 45 Lys Tyr Gln Arg Phe Lys Thr Ile Ser Asp Val Arg Arg Val Leu Gly 50 55 60 Ala Val Pro Asp Pro Asn Gly Phe Gly Leu Glu Lys Arg Cys Leu Leu 65 70 75 80 Ser Thr Ile Arg Glu Gln Glu Leu Pro Glu Ser Phe Asp Ala Arg Glu 85 90 95 Lys Trp Pro Tyr Cys Ser Ser Ile Ala Glu Ile Arg Asp Gln Ser Asn 100 105 110 Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Gly Ala Ala Gly Ala Ile Ser Asp Arg 115 120 125 Ile Cys Ile Ala Ser Gly Gly Lys His Gln Pro Arg Ile Ser Pro Glu 130 135 140 Asp Leu Val Asp Cys Cys Ala Asp Cys Gly Met Gly Cys Gln Gly Gly 145 150 155 160 Tyr Pro Ala Gln Ala Trp Glu Tyr Trp Val Arg Asn Gly Leu Val Thr 165 170 175 Gly Asp Leu Tyr Asn Thr Thr Asp Thr Cys Arg Pro Tyr Ser Phe Pro 180 185 190 Pro Cys Glu His His Val Val Gly Pro Arg Lys Pro Cys Thr Gly Asp 195 200 205 Pro Thr Thr Pro Gln Cys Val Lys Lys Cys Gln Pro Glu Tyr Pro Lys 210 215 220 Thr Tyr Glu Asn Asp Lys Trp Tyr Gly Leu Lys Ala Tyr Ser Ile His 225 230 235 240 Ser Asp Gln Glu Ala Ile Met Arg Asp Leu Met Thr Tyr Gly Pro Leu 245 250 255 Glu Val Asp Phe Glu Val Tyr Ala Asp Phe Pro Ser Tyr Ser Ser Gly 260 265 270 Val Tyr Arg His Val Ala Gly Gly Leu Leu Gly Gly His Ala Val Arg 275 280 285 Leu Val Gly Trp Gly Val Glu Asp Gly Ala Asp Tyr Trp Leu Ile Ala 290 295 300 Asn Ser Trp Asn Thr Asp Trp Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Lys Ile Arg 305 310 315 320 Arg Gly Val Asn Glu Cys Gly Ile Glu Ser Asp Ala Asn Ala Gly His 325 330 335 Pro Lys Leu <210> 2 <211> 343 <212> PRT <213> Clonorchis sinensis <400> 2 Met Leu Pro Ser Phe Val Leu Tyr Gly Leu Leu Phe Phe Ile Tyr Ser 1 5 10 15 Phe Glu Val Thr His Cys Glu Asn Leu Gly Ser Val Gly Val Arg Glu 20 25 30 His Val His Pro Thr Ala Gly Ala Arg Trp Ile Ser Val Arg Tyr Pro 35 40 45 Lys Pro Phe Glu Ser Asp Asn Lys Leu His His Phe Gly Ala Ile Arg 50 55 60 Glu Pro Val Glu Gln Arg Ala Gln Arg Ser Thr Val Arg His Glu Asp 65 70 75 80 Phe Asp Ser Lys Leu Ile Pro Lys Ser Phe Asp Ala Arg Ala Thr Trp 85 90 95 Pro His Cys Pro Ser Ile Ser Glu Ile Arg Asp Gln Ser Ser Cys Gly 100 105 110 Ser Cys Trp Ala Phe Gly Ala Val Glu Ala Met Ser Asp Arg Leu Cys 115 120 125 Ile His Ser Ser Gly Ala Phe Asn Lys Ser Leu Ser Ala Val Asp Leu 130 135 140 Leu Ser Cys Cys Lys Asp Cys Gly Asp Gly Cys Asp Gly Gly Phe Pro 145 150 155 160 Pro Met Ala Trp Asp Phe Trp Lys Thr His Gly Ile Val Thr Gly Gly 165 170 175 Ser Lys Glu Glu Pro Thr Gly Cys Arg Pro Tyr Pro Phe Pro Lys Cys 180 185 190 Gln His His Ser Gln Gly His Tyr Pro Pro Cys Pro Arg Arg Ile Tyr 195 200 205 Pro Thr Pro Lys Cys Val Lys His Cys Asp Thr Pro Lys Ile Asp Tyr 210 215 220 Gln Lys Asp Lys Thr Arg Ala Asn Thr Ser Tyr Asn Val His Gln Ser 225 230 235 240 Glu Val Ala Ile Met Lys Glu Ile Leu Leu Asn Gly Pro Val Glu Ala 245 250 255 Thr Phe Glu Val His Glu Asp Phe Pro Glu Tyr Lys Ser Gly Ile Tyr 260 265 270 Phe His Ala Trp Gly Gly Ser Val Gly Gly His Ala Ile Arg Ile Leu 275 280 285 Gly Trp Gly Glu Glu Asn Gly Val Pro Tyr Trp Leu Ile Ala Asn Ser 290 295 300 Trp Asn Glu Asp Trp Gly Glu Lys Gly Tyr Leu Arg Phe Leu Arg Gly 305 310 315 320 His Asn Glu Cys Gly Ile Glu Glu Glu Ala Thr Ala Gly Leu Pro Asp 325 330 335 Leu Ser Thr Ile Pro His Phe 340 <210> 3 <211> 337 <212> PRT <213> Clonorchis sinensis <400> 3 Met Leu Trp Leu Ile Leu Val Phe Gly Thr Val Phe Ala Ala Ala Ser 1 5 10 15 Lys Gly Thr Glu Ser Ile Gly Leu Arg Glu Tyr Val Asp Ser Lys Ser 20 25 30 Gly Ala Arg Trp Ile Tyr Ala Glu Pro Pro Glu Arg Phe Gln Pro Gly 35 40 45 Asn Phe Gln Leu Met Phe Gly Ala Leu Arg Glu Pro Glu Glu Gln Arg 50 55 60 Ser Lys Arg Pro Thr Val Ser His Glu Ser Phe Ser Asp Glu His Ile 65 70 75 80 Pro Lys Ala Phe Asp Ala Arg Lys Gln Trp Pro His Cys Pro Thr Ile 85 90 95 Gly Glu Ile Arg Asp Gln Ser Ser Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Gly 100 105 110 Ala Val Glu Ala Met Ser Asp Arg Leu Cys Ile His Thr Asn Gly Thr 115 120 125 Phe Thr Lys Arg Ile Ser Ala Val Asp Leu Ile Ser Cys Cys Gly Tyr 130 135 140 Cys Gly Phe Gly Cys Gln Gly Gly Phe Pro Pro Thr Ala Trp Asp Phe 145 150 155 160 Trp Gln Thr Glu Gly Ile Val Thr Gly Gly Ser Lys Glu Asn Pro Thr 165 170 175 Gly Cys Arg Ser Tyr Pro Phe Pro Arg Cys Ser His His Gly Ser Lys 180 185 190 Lys Tyr Pro Pro Cys Ser His Arg Ile Tyr Asp Thr Pro Asn Cys Val 195 200 205 Gln Lys Cys Asp Thr Pro Asp Thr Asp Tyr Ala Thr Asp Lys Thr Arg 210 215 220 Ala Asn Ile Thr Tyr Asn Val Lys Ala Lys Gln Asn Ala Ile Met Lys 225 230 235 240 Glu Ile Met Ile Asn Gly Pro Val Glu Ala Ala Phe Gln Val Tyr Glu 245 250 255 Asp Phe Leu Gly Tyr Lys Ser Gly Val Tyr Phe His Ser Asp Gly Thr 260 265 270 Leu Leu Gly Gly His Ala Ile Arg Ile Leu Gly Trp Gly Glu Glu Asn 275 280 285 Gly Val Ala Tyr Trp Leu Ile Ala Asn Ser Trp Asn Asp Gly Trp Gly 290 295 300 Glu Asp Gly Tyr Phe Lys Met Leu Arg Gly Lys Asn Glu Cys Gly Ile 305 310 315 320 Glu Asp Glu Val Thr Ala Gly Leu Pro Glu Leu Ser Ser Ile Pro Leu 325 330 335 Lys <210> 4 <211> 347 <212> PRT <213> Clonorchis sinensis <400> 4 Met Arg Ala Thr Thr Phe Leu Cys Ala Ile Ala Ile Leu Leu Asp Gly 1 5 10 15 Ser Asn Gly Lys Pro Lys His Glu Ala Leu Ser Asp Glu Leu Val Asp 20 25 30 Tyr Val Asn Ser Gln Val Asp Ala Thr Trp Lys Ala Ala Lys Ser Glu 35 40 45 Arg Phe Lys Thr Leu Glu Glu Ile Arg Ser Val Leu Gly Thr Met Arg 50 55 60 Glu Asp Gln Asn Val Lys Glu Phe Arg Arg Pro Thr Ile Ser His Glu 65 70 75 80 Asp Ile Thr Leu Glu Leu Pro Ser Glu Phe Asp Ala Arg Glu His Trp 85 90 95 Pro Glu Cys Arg Thr Ile Pro Gln Ile Arg Asp Gln Ser Gly Cys Gly 100 105 110 Ser Cys Trp Ala Phe Ala Ala Val Thr Ala Met Ser Asp Arg Val Cys 115 120 125 Ile His Ser Asn Gln Thr Leu Val Asn Val Gln Leu Ser Ala Thr Asp 130 135 140 Leu Leu Ala Cys Cys Thr Thr Cys Gly Phe Gly Cys Val Gly Gly Trp 145 150 155 160 Gly Gly Met Ala Trp Asp Tyr Trp Arg Asp Asn Gly Ile Val Thr Gly 165 170 175 Gly Glu Tyr Lys Asp Ser His Thr Cys Leu Pro Tyr Pro Phe Pro Pro 180 185 190 Cys Arg His His Gly Ala Lys Gly Ser Glu Tyr Pro Pro Cys Pro Glu 195 200 205 Lys Met Tyr Ser Thr Pro Gln Cys Val Ser Glu Cys Gln Lys Gly Tyr 210 215 220 Ala Thr Lys Tyr Glu Asp Asp Lys Ile Arg Ala Ser Thr Ser Tyr Asn 225 230 235 240 Leu Tyr Arg Ser Val Thr Ala Ile Gln Lys Glu Ile Trp Met Arg Gly 245 250 255 Pro Val Glu Ala Thr Met Asn Val Tyr Thr Asp Phe Ala Asn Tyr Ala 260 265 270 Gly Gly Val Tyr Lys His Thr Thr Gly Glu Leu Leu Gly Gly His Ala 275 280 285 Ile Arg Leu Leu Gly Trp Gly Val Glu Glu Asp Gly Thr Pro Tyr Trp 290 295 300 Leu Ala Ala Asn Ser Trp Asn Pro Ser Trp Gly Glu Lys Gly Phe Phe 305 310 315 320 Arg Ile Leu Arg Gly Ser Asp His Cys Gly Ile Glu Ser Asp Val Ser 325 330 335 Ala Gly Leu Pro Val Asn His Glu Ser Phe Ser 340 345 <210> 5 <211> 343 <212> PRT <213> Clonorchis sinensis <400> 5 Met Ile Pro Leu Phe Thr Ala Tyr Asn Ile Leu Leu Leu Ala Asn Asn 1 5 10 15 Phe Gln Asp Ala Gln Cys Glu Gln Thr Ala Asn Val Gly Val Arg Glu 20 25 30 His Val His Ser Ile Thr Gly Ala Arg Trp Ile Ser Gly Arg Leu Pro 35 40 45 Lys Arg Phe Glu Ser Gly Asp Leu Ile His Met Phe Gly Ala Lys Arg 50 55 60 Glu Thr Arg Glu Gln Lys Ala Gln Arg Pro Thr Leu Arg His Asp Gly 65 70 75 80 Phe Asp Asn Met Arg Leu Pro Lys Asn Phe Asp Ala Arg Lys Thr Trp 85 90 95 Pro His Cys Ser Ser Ile Ser Glu Ile Arg Asp Gln Ser Ser Cys Gly 100 105 110 Ser Cys Trp Ala Phe Gly Ala Val Glu Ala Met Ser Asp Arg Leu Cys 115 120 125 Ile His Ser Asn Gly Ala Phe Asn Lys Ser Leu Ser Ala Val Asp Leu 130 135 140 Leu Ser Cys Cys Lys Asp Cys Gly Phe Gly Cys Arg Gly Gly Tyr Pro 145 150 155 160 Ala Val Ala Trp Asp Tyr Trp Lys Thr His Gly Ile Val Thr Gly Gly 165 170 175 Ser Lys Glu Asp Pro Ser Gly Cys Arg Ser Tyr Pro Phe Pro Lys Cys 180 185 190 Glu His His Val Gln Gly His Tyr Pro Pro Cys Pro Arg Glu Leu Tyr 195 200 205 Pro Thr Pro Glu Cys Val Gln Gln Cys Asp Thr Pro Asp Val Gly Tyr 210 215 220 Leu Glu Asp Lys Thr Arg Ala Asn Met Ser Tyr Asn Ile Tyr Ala Ser 225 230 235 240 Glu Ile Ser Ile Met Lys Glu Ile Met Leu Arg Gly Pro Val Glu Ala 245 250 255 Ile Phe Thr Met Tyr Glu Asp Phe Leu Arg Tyr Ser Ser Gly Val Tyr 260 265 270 Phe His Ala Leu Gly Ala Pro Met Ser Gly His Ala Val Arg Ile Leu 275 280 285 Gly Trp Gly Glu Leu Gly Asn Val Pro Tyr Trp Leu Ile Ala Asn Ser 290 295 300 Trp Asn Glu Asp Trp Gly Glu Glu Gly Tyr Met Lys Phe Leu Arg Gly 305 310 315 320 Tyr Asn Glu Cys Gly Ile Glu Asp Asp Val Thr Ala Gly Leu Pro Tyr 325 330 335 Leu Pro Ile Ile Pro Gln Tyr 340 <210> 6 <211> 425 <212> PRT <213> Clonorchis sinensis <400> 6 Met Ile His Leu Gly Leu Leu Phe Trp Val Leu Leu Thr Thr Ser Glu 1 5 10 15 Cys Ser Val Ile Arg Ile Pro Leu Ile Gly Phe Lys Asn Val Arg Arg 20 25 30 Arg Leu Met Glu Val Gly Thr Pro Val Glu Gln Leu Asn Phe Thr Ser 35 40 45 Ile Arg Phe Val Gly Asn Gly Ser Ile Pro Glu Ile Leu Asn Asn Tyr 50 55 60 Leu Asp Ala Gln Tyr Tyr Gly Glu Ile Gly Ile Gly Thr Pro Pro Gln 65 70 75 80 Ser Phe Glu Val Val Phe Asp Thr Gly Ser Ser Asn Leu Trp Val Pro 85 90 95 Ser Lys His Cys Ser Ile Phe Ser Ile Ala Cys Trp Leu His His Lys 100 105 110 Tyr Asp Ser Ala Lys Ser Ser Thr Tyr Met Ala Asn Gly Thr Glu Phe 115 120 125 Ser Ile Arg Tyr Gly Ser Gly Ser Val Ser Gly Ile Leu Ser Thr Asp 130 135 140 Tyr Val Ser Val Gly Thr Val Thr Val Lys Asn Gln Thr Phe Gly Glu 145 150 155 160 Ala Met Lys Glu Pro Gly Ile Ala Phe Val Ala Ala Lys Phe Asp Gly 165 170 175 Ile Leu Gly Met Gly Phe Lys Thr Ile Ser Val Asp Gly Val Pro Thr 180 185 190 Leu Phe Asp Asn Met Ile Ser Gln Gly Leu Val Ser Glu Pro Val Phe 195 200 205 Ser Phe Tyr Leu Asp Arg Asn Ala Ser Asp Pro Val Gly Gly Glu Leu 210 215 220 Leu Leu Gly Gly Thr Asp Pro Lys Tyr Tyr Lys Gly Glu Ile Leu Trp 225 230 235 240 Ala Pro Leu Thr His Glu Ala Tyr Trp Gln Phe Lys Val Asp Gly Met 245 250 255 Asn Val Gly Ser Met Lys Leu Cys Glu Asn Gly Cys Gln Ala Ile Ala 260 265 270 Asp Thr Gly Thr Ser Leu Ile Ala Gly Pro Ser Glu Glu Val Gly Lys 275 280 285 Leu Asn Asp Ala Leu Gly Ala Ile Lys Ile Pro Gly Gly Thr Tyr Tyr 290 295 300 Ile Asp Cys Ser Arg Val Ser Thr Leu Pro Pro Val Gln Phe Ser Ile 305 310 315 320 Ser Gly Lys Leu Met Gln Leu Asp Pro Ser Asp Tyr Ile Leu Arg Met 325 330 335 Thr Ser Phe Gly Lys Thr Ile Cys Ile Ser Gly Phe Met Gly Ile Asp 340 345 350 Ile Pro Ala Gly Pro Leu Trp Ile Leu Gly Asp Val Phe Ile Gly Lys 355 360 365 Tyr Tyr Thr Ile Phe Asp Val Gly Asn Ala Arg Val Gly Phe Ala Thr 370 375 380 Ala Asn Arg Pro Pro Ser Val Pro Met Val Arg Leu Gln Pro Ala Tyr 385 390 395 400 Arg Thr Arg Ile Glu Arg Phe Lys Arg Pro Pro Lys Ser Ser Phe Val 405 410 415 Phe Ser Arg Leu Phe Gly Phe Gly Trp 420 425 <210> 7 <211> 385 <212> PRT <213> Clonorchis sinensis <400> 7 Met Arg Phe Tyr Ala Ile Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Cys Met Ser 1 5 10 15 Lys Val Leu Arg Val Pro Leu Lys Pro Leu Arg Ser Thr Arg Arg Thr 20 25 30 Val Gln Asp Ala Gln Thr Ala Leu Asp Arg Val Arg Thr Lys Trp Thr 35 40 45 Lys Arg Leu Ser Asn Gln Pro Phe Pro Glu Lys Leu Asp Asn Tyr Met 50 55 60 Asp Ser Gln Tyr Tyr Gly Glu Ile Ala Ile Gly Thr Pro Pro Gln Pro 65 70 75 80 Phe Lys Val Val Phe Asp Thr Gly Ser Ser Asn Leu Trp Val Pro Ser 85 90 95 Asn Arg Cys Ser Pro Trp Asn Glu Ala Cys Arg Leu His His Arg Tyr 100 105 110 Asp Cys Glu Lys Ser Ser Thr Tyr Lys Ala Asn Gly Lys Pro Phe Ser 115 120 125 Ile Gln Tyr Gly Thr Gly Ser Val Ser Gly Val Leu Ser Thr Asp Val 130 135 140 Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Val Gln Asp Gln Thr Phe Gly Glu Ala 145 150 155 160 Ile Asn Glu Pro Gly Leu Val Phe Val Val Ala Lys Phe Asp Gly Ile 165 170 175 Leu Gly Leu Ala Phe Gln Ser Ile Ala Val Asp Asn Val Val Pro Val 180 185 190 Phe Asp Asn Met Ile Ser Gln Gly Leu Val Glu Lys Pro Leu Phe Ser 195 200 205 Val Trp Leu Asp Arg Asn Asp Val Gln Asp Ile Gly Gly Glu Ile Met 210 215 220 Phe Gly Gly Ile Asn Lys Glu His Tyr Met Gly Asp Met Tyr Phe Val 225 230 235 240 Pro Leu Ser Ser Glu Thr Tyr Trp Gln Ile Asp Leu Asp Gly Ile Gln 245 250 255 Val Thr Ser Leu Thr Leu Cys Ala Gln Gly Cys Gln Ala Ile Val Asp 260 265 270 Thr Gly Thr Thr Leu Ile Val Gly Pro Thr Ala Asp Val Asn Gln Leu 275 280 285 Asn Glu Ala Leu Gly Ala Val Ser Ile Glu Gly Gly Leu Ser Val Leu 290 295 300 Glu Cys Ser Gln Ile Tyr Thr Leu Pro Pro Ile Glu Phe Ser Ile Asn 305 310 315 320 Gly Glu Asn Leu Thr Leu Gln Pro Thr Asp Tyr Val Gln Glu Met Ser 325 330 335 Tyr Arg Gly Gly Thr Ile Cys Thr Ser Gly Phe Ser Gly Met Glu Thr 340 345 350 Pro Gly Ala Pro Thr Trp Ile Leu Gly Asp Val Phe Ile Gly Ala Tyr 355 360 365 Tyr Thr Val Phe Asp Lys Glu Gln Arg Arg Val Gly Phe Ala Arg Ser 370 375 380 Thr 385 <210> 8 <211> 1020 <212> DNA <213> Clonorchis sinensis <400> 8 atggattcga tttggaccct gataatgtac gctctgcttt gtgcggaatc gtttagagca 60 gagtatattc catctttcga atcgctttcg gatgaaattg tccattacat caaccataag 120 gctaatacca cctggaaggc agcgaaatac cagcgtttca aaacaatatc tgatgtgcgc 180 cgtgtgcttg gagctgttcc cgacccaaac ggattcggcc tggaaaaacg ttgtttgcta 240 tccaccatac gagaacaaga actaccagaa tcttttgatg cacgtgagaa gtggccgtat 300 tgcagttcaa tagcagaaat tcgtgatcag tcaaactgcg gatcgtgttg ggctttcgga 360 gctgcgggag ctatttctga tcgtatttgc atcgcatccg ggggaaaaca tcagccccgc 420 attagtccag aagacttagt tgattgctgt gctgattgcg gcatgggttg tcaaggtggc 480 tatcccgcac aagcatggga atactgggtc cgaaatggat tagtgactgg tgatttgtac 540 aataccacgg acacctgtcg accttactct ttccctccat gcgaacatca tgttgtcggt 600 ccgcgaaaac cttgcaccgg agatcctaca acaccccagt gtgtgaaaaa gtgtcagcca 660 gaatacccga agacatacga aaatgacaag tggtacggtt taaaggcgta cagcattcat 720 tctgaccagg aggcaatcat gcgtgaccta atgacgtacg gaccactgga agttgacttt 780 gaggtgtacg ctgacttccc gagctattca agtggagtgt ataggcatgt ggcaggtgga 840 cttctgggcg gtcatgcggt tcggttggtt ggctggggag ttgaggacgg tgcagactat 900 tggctgattg ctaattcgtg gaacactgac tggggtgatg gtggttattt caagattaga 960 cgaggtgtca acgaatgtgg tattgagagt gacgccaatg ctggtcatcc aaaactgtga 1020 1020 <210> 9 <211> 1032 <212> DNA <213> Clonorchis sinensis <400> 9 atgttaccgt cgttcgtact atacggtctc ttgtttttta tctacagctt cgaagtcaca 60 cattgtgaaa atctggggag cgtgggagtg cgagaacatg tacatccgac tgcaggggca 120 cggtggatat ctgtgaggta tcccaaacca ttcgaatctg ataacaagct tcaccacttc 180 ggagccataa gggaacctgt agaacaaaga gcgcagaggt caacagtcag gcatgaggat 240 tttgattcta agctcattcc aaagagcttt gatgcacgag ctacgtggcc gcactgccct 300 tccattagtg aaattagaga tcagtccagc tgtggatcgt gttgggcatt tggggcagtg 360 gaagccatga gtgatcgatt atgcattcat tcaagtggtg ccttcaataa aagcctgagt 420 gcggtagact tgctttcttg ttgtaaagac tgtggagatg gttgtgatgg tggtttccct 480 ccgatggcat gggacttctg gaagactcat ggtatcgtca caggtggttc aaaggaagaa 540 cccactggat gccggcctta tccgtttcct aaatgtcaac accatagtca agggcattat 600 ccgccatgtc cacgtcgcat ctaccccaca ccgaaatgtg tcaaacattg tgatacgcca 660 aaaatagatt accagaagga taaaacgaga gcgaatacat cctacaacgt acaccaatcc 720 gaagtggcaa ttatgaagga gatcttgctc aatggtccgg tcgaggccac gtttgaagtg 780 cacgaagact ttcctgagta caaatctggt atatattttc acgcttgggg tgggtctgtc 840 ggcggacatg caattcgtat tttgggttgg ggagaggaga atggtgttcc ctattggttg 900 atcgcaaact cttggaatga ggactggggt gagaaaggat atctgagatt cctccgagga 960 cacaatgagt gcggaatcga ggaagaggcg acagccggtc taccagatct ttccaccatt 1020 ccgcattttt ga 1032 <210> 10 <211> 1014 <212> DNA <213> Clonorchis sinensis <400> 10 atgctgtggt tgatactagt tttcggtaca gttttcgcag ctgcgagtaa aggcacagaa 60 tcgattggac tgcgggaata tgttgattca aagtcgggcg cgagatggat ttatgcagaa 120 ccgccggaaa gattccaacc agggaatttt caactgatgt tcggggcgct acgcgaaccc 180 gaagaacaac gttccaaaag accaaccgtt tcccatgaga gttttagcga tgaacacata 240 ccaaaagcgt ttgacgcgcg gaaacaatgg ccccactgtc caaccattgg cgaaatcaga 300 gaccagtcga gctgtggatc ttgctgggct tttggagcgg tggaggcaat gagcgaccgt 360 ttgtgtattc acacaaacgg tacgtttact aaacgtataa gtgctgttga cttgatttct 420 tgctgtggat actgtggttt tggctgtcag ggtggctttc cccctactgc atgggatttc 480 tggcaaacgg aaggcatcgt caccggaggt tcgaaagaaa atcccacggg ttgccgttcc 540 tatccatttc caaggtgctc gcatcacgga tcaaagaagt acccgccatg ttcacacaga 600 atttacgaca caccaaattg tgtacagaaa tgcgacacgc ccgacactga ttatgcaact 660 gacaagacaa gagctaatat cacatacaat gtgaaagcaa agcaaaatgc gataatgaag 720 gagatcatga tcaacggacc agtcgaagca gccttccagg tgtacgaaga ctttctcggc 780 tacaaatctg gtgtgtattt ccattctgat ggcacgcttc ttggtggtca tgccattcgc 840 attttgggct ggggggaaga gaacggcgta gcgtattggt tgattgcgaa ttcatggaac 900 gatggctggg gtgaagacgg atattttaaa atgttgcgcg gaaaaaatga gtgtggcatt 960 gaagatgagg tcaccgcggg tttaccagaa ttgtccagca tcccacttaa gtga 1014 <210> 11 <211> 1044 <212> DNA <213> Clonorchis sinensis <400> 11 atgagggcaa cgacattctt atgtgctatt gcgatcctcc tcgatggctc taacgggaaa 60 ccaaagcacg aagccttgtc ggacgaactg gttgactacg tgaacagtca ggtggacgct 120 acctggaagg ctgccaagtc tgaacgcttt aagacattgg aggaaattcg ctcagtcttg 180 ggcacgatga gggaagatca gaacgtgaag gaatttcgtc ggccaaccat cagccacgaa 240 gatatcactt tggagctccc gagtgagttc gacgctcgag aacactggcc ggaatgcaga 300 accattcccc agattcgaga tcagtctggt tgtggctcct gttgggcctt tgctgctgtc 360 accgcaatga gtgaccgtgt ttgtattcat tcgaatcaga cactggtaaa cgtgcaacta 420 agcgcgaccg atctgcttgc ctgttgtacc acgtgcgggt tcggttgcgt cggaggctgg 480 ggcggaatgg cctgggacta ctggagggat aatggcattg tgacaggtgg agagtacaaa 540 gacagtcata cgtgcttgcc ctaccctttt ccaccgtgtc gccatcacgg agcaaagggt 600 tctgaatacc caccttgtcc ggaaaagatg tactcaaccc cacaatgcgt atccgaatgt 660 caaaaaggat atgctactaa atatgaagac gataaaattc gtgcttcaac ttcgtacaac 720 ctttatcgaa gtgtcacagc aatccaaaag gagatttgga tgcgtggtcc tgttgaggcg 780 actatgaacg tctatacgga tttcgcgaat tatgctggag gggtttataa acacacaacc 840 ggtgaacttt tgggtggaca cgcgatccgt cttctgggtt ggggtgtaga agaagatggg 900 acaccctatt ggttggcggc gaattcatgg aatccctcat ggggagagaa aggcttcttc 960 cggattctcc gtggatccga tcattgtgga attgaatcag atgtttcagc cggtcttcca 1020 gttaatcatg aatccttttc gtga 1044 <210> 12 <211> 1032 <212> DNA <213> Clonorchis sinensis <400> 12 atgataccgc tgtttacagc atacaatatc ctgcttttgg ccaacaattt ccaagacgct 60 cagtgcgaac aaacagcaaa tgtaggagtg cgggaacatg tacactcaat tactggggca 120 cgatggatat ctggaagact tccgaaaaga ttcgaatctg gcgacctgat tcacatgttt 180 ggagccaaga gggaaaccag agaacagaaa gcacaaagac cgacactcag gcatgatggt 240 ttcgacaata tgcgccttcc aaagaacttt gatgcacgga agacctggcc gcattgctct 300 tccatcagtg aaatcagaga tcaatccagt tgtggatcat gttgggcgtt cggggctgtg 360 gaagccatga gtgatcgact gtgcattcat tcaaatggtg ccttcaacaa aagtctgagt 420 gcggtcgact tgctgtcctg ttgtaaagac tgcggatttg gttgtcgcgg aggatatccg 480 gctgtggcat gggactactg gaagactcac ggtatcgtca caggtggttc aaaagaagac 540 ccaagtggat gccggtctta tccctttccg aaatgtgaac accatgttca aggacactat 600 ccgccatgtc cgcgtgaact ctaccccaca ccggaatgcg tgcagcaatg tgacacgcca 660 gatgtgggtt acctggagga taagacgaga gcaaacatgt cctacaatat atacgcctca 720 gagatatcga ttatgaaaga gatcatgctc cggggtccgg ttgaggccat tttcaccatg 780 tacgaagatt ttctccggta cagctctggc gtatatttcc acgctttggg tgctccgatg 840 agcgggcatg cagttcgtat tttgggttgg ggagagctgg gcaacgttcc ctactggttg 900 atcgccaact cctggaacga ggactggggt gaggaaggat acatgaagtt tcttcgagga 960 tacaatgaat gcggtatcga agatgatgtt acggctggtc tgccatatct tcccatcatt 1020 ccacagtatt ga 1032 <210> 13 <211> 1278 <212> DNA <213> Clonorchis sinensis <400> 13 atgattcatc tgggcttgtt gttttgggtg cttctcacca ccagcgaatg cagtgttatt 60 cggattcctc taatcggatt caaaaatgtg agacgccgac tgatggaagt cggcactcca 120 gttgaacaac tgaacttcac ttcaatacgc tttgttggca atggatctat accggagata 180 ctcaacaact accttgatgc gcaatattat ggggaaattg gcataggaac accgcctcag 240 tcctttgaag tagtgtttga taccggctct tcgaatcttt gggtgccttc taagcactgc 300 agcatattca gtatagcttg ttggctgcat cacaaatacg acagtgcaaa atccagcaca 360 tatatggcta atggaacgga gttcagcatt cgatatggaa gtggcagcgt ttccggaata 420 cttagtacag attacgtttc agtaggtact gtaaccgtaa aaaatcagac cttcggagag 480 gccatgaaag aaccaggtat tgcatttgtg gcagccaagt tcgatgggat tttgggaatg 540 ggtttcaaaa ccatttctgt ggacggagtg ccgactttgt tcgataatat gatatcccag 600 ggtttggttt ccgaacccgt attttcattt taccttgacc gtaacgcgtc ggatccagtt 660 ggaggcgaac ttctactggg aggcacggat ccgaaatact ataaagggga aatcctgtgg 720 gcacccttaa cgcatgaggc ttattggcaa ttcaaagttg acggtatgaa tgttggaagt 780 atgaaattat gcgagaatgg atgtcaagct atcgctgata ctggaacgtc tttaatcgct 840 ggtccctcgg aggaggttgg aaagcttaat gatgctctag gtgccatcaa gatacccgga 900 ggaacatact acattgactg tagcagagtc agtacactgc cgccggtcca gttcagcata 960 agcgggaaac tcatgcaact agatccgtcg gattatattt tacgaatgac ctcctttggc 1020 aaaactattt gtatcagcgg tttcatggga atcgacattc ctgcgggacc tttgtggatt 1080 cttggggacg tattcattgg caaatactac acaatttttg atgttgggaa tgcccgcgtt 1140 ggattcgcca cagccaatcg tcctccatct gtgcctatgg tccgtctgca gcctgcctat 1200 cgtacgcgaa ttgagcgatt caagcgacct cctaagtcat ctttcgtttt ttccagattg 1260 ttcggattcg gatggtga 1278 <210> 14 <211> 1158 <212> DNA <213> Clonorchis sinensis <400> 14 atgcgatttt acgccatctt gctgcttttg cctttattgt gcatgagcaa agttttgaga 60 gttccgctca aaccgttgcg aagtacgagg cggacagtac aagacgctca aactgcactg 120 gaccgagtga gaaccaagtg gacaaaacgt ctgtcaaacc aacctttccc agaaaaactg 180 gataattaca tggactccca atactacgga gaaattgcaa tcggtacccc tccgcaacca 240 ttcaaagtcg tctttgatac gggttcgtct aatttgtggg tcccgtccaa cagatgtagc 300 ccttggaacg aagcctgcag acttcaccac agatacgact gtgagaaatc ctcaacctac 360 aaagccaatg gaaagccatt ttcaattcag tatggtacgg gatcagtgtc cggagtgttg 420 agcacggatg tggtaacggt ttcttccgca aaggttcaag atcaaacttt tggtgaggct 480 attaacgagc cgggattggt gtttgtggtg gccaagtttg atggtatcct tggtttggca 540 tttcagtcaa tagcggtcga taatgttgtt ccggtgttcg ataacatgat ttcccaaggt 600 ctggttgaaa agccattgtt ttctgtttgg ctggatcgca acgacgttca agacattggt 660 ggagaaatca tgtttggagg aataaataag gaacattaca tgggcgacat gtactttgtt 720 ccattgagtt cggaaacata ctggcagatt gacctggacg gcattcaagt gactagtctg 780 accctgtgcg cacagggctg tcaggccatt gtcgatacgg gaacgacatt gattgttggt 840 cccactgctg atgtcaatca actcaacgag gcacttggag ctgtttcaat agagggtgga 900 ctgagcgttc tagaatgttc acaaatatat acgttaccac caatagagtt ttcaatcaat 960 ggagaaaacc taactttgca accgacagat tatgtgcagg agatgtcata ccggggtggg 1020 actatctgta ccagtggatt cagcggcatg gagactcctg gtgcgccgac gtggattctg 1080 ggggacgtat ttatcggcgc atattatacg gtttttgata aagaacaacg tcgtgttggc 1140 tttgcaaggt ccacttag 1158 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CsCB1_F <400> 15 atggattcga tttggaccct gataatg 27 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CsCB1_R <400> 16 tcacagtttt ggatgaccag cattggc 27 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CsCB2_F <400> 17 atgttaccgt cgttcgtact atacggt 27 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CsCB2_R <400> 18 tcaaaaatgc ggaatggtgg aaagatc 27 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CsCB3_F <400> 19 atgctgtggt tgatactagt tttcggt 27 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CsCB3_R <400> 20 tcacttaagt gggatgctgg acaattc 27 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CsCB4_F <400> 21 atgagggcaa cgacattctt atgtgct 27 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CsCB4_R <400> 22 tcacgaaaag gattcatgat taactgg 27 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CsCB5_F <400> 23 atgataccgc tgtttacagc atacaat 27 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CsCB5_R <400> 24 tcaatactgt ggaatgatgg gaagata 27 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CsAP1_F <400> 25 atgattcatc tgggcttgtt gttttgg 27 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CsAP1_R <400> 26 tcaccatccg aatccgaaca atctgga 27 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CsAP2_F <400> 27 atgcgatttt acgccatctt gctgctt 27 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CsAP2_R <400> 28 ctaagtggac cttgcaaagc caacacg 27 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rCsCB1_F <400> 29 ggatcccttt cggatgaaat tgtccat 27 <210> 30 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rCsCB1_R <400> 30 aagctttcac agttttggat gaccagc 27 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rCsCB2_F <400> 31 ggatccgaac atgtacatcc gactgca 27 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rCsCB2_R <400> 32 gagctctcaa aaatgcggaa tggtgga 27 <210> 33 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rCsCB3_F <400> 33 ggatcctatg ttgattcaaa gtcgggc 27 <210> 34 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rCsCB3_R <400> 34 aagctttcac ttaagtggga tgctgga 27 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rCsCB4_F <400> 35 gtcgacaaac caaagcacga agccttg 27 <210> 36 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rCsCB4_R <400> 36 aagctttcac gaaaaggatt catgatt 27 <210> 37 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rCsCB5_F <400> 37 ggatccgaac aaacagcaaa tgtagga 27 <210> 38 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rCsCB5_R <400> 38 aagctttcaa tactgtggaa tgatggg 27 <210> 39 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rCsAP1_F <400> 39 gagctcagtg ttattcggat tcctcta 27 <210> 40 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rCsAP1_R <400> 40 gtcgactcac catccgaatc cgaacaa 27 <210> 41 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rCsAP2_F <400> 41 ggatccgttt tgagagttcc gctcaaa 27 <210> 42 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rCsAP2_R <400> 42 gtcgacctaa gtggaccttg caaagcc 27

Claims

서열번호 1 내지 7로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 간흡충증 특이적 항원 단백질.
제 1항에 있어서, 상기 항원 단백질은 간흡충의 단백질분해효소인 것을 특징으로 하는 간흡충증 특이적 항원 단백질.
제 2항에 있어서, 상기 단백질분해효소는 간흡충 카텝신 B 시스테인 단백질분해효소(cathepsin B cysteine proteases) 또는 간흡충 아스파틱 단백질분해효소(aspartic proteases)인 것을 특징으로 하는 간흡충증 특이적 항원 단백질.
제 1항의 단백질을 각각 암호화하는 서열번호 8 내지 14로 기재되는 염기서열을 갖는 간흡충증 특이적 항원 유전자.
1) 제 1항의 간흡충증 특이적 항원 단백질 중 어느 하나를 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 발현 벡터를 숙주세포에 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 형질전환체를 배양하여 재조합 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 간흡충증 특이적 항원 단백질 제조 방법.
제 5항의 방법으로 제조된 간흡충증 특이적 항원 재조합 단백질.
제 1항 또는 제 6항의 단백질을 포함하는 간흡충증 진단용 키트.
서열번호 1 내지 7로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 간흡충증 특이적 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 항체.
제 8항에 있어서, 상기 항체는 단일클론 또는 다클론 항체인 것을 특징으로 하는 간흡충증 특이적 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 항체.
제 7항의 항체를 포함하는 간흡충증 진단용 키트.
1) 피검체로부터 분리된 시료를 제 1항 또는 제 6항의 단백질과 접촉시키는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 시료 중 상기 단백질과 결합된 항체를 검출하는 단계를 포함하는 간흡충증 진단 방법.
제 11항에 있어서, 상기 단계 1)의 시료는 혈청인 것을 특징으로 하는 간흡충증 진단 방법.