PL224245B1 - Przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec epitopu ludzkiego białka BLCA-4(56-73), sposób ich wytwarzania oraz ich zastosowanie - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku są przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec epitopu białka BLCA-4(56-73) izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci koniugatów peptydów z białkiem nośnikowym hemocyjaniną o sekwencji peptydu przedstawionej wzorem 1. Sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec epitopu białka BLCA-4(56-73) polega na tym, że drób, korzystnie kury ras hodowlanych, poddaje się immunizacji antygenem w postaci koniugatów peptydów z białkiem nośnikowym hemocyjaniną o sekwencji peptydu przedstawionej wzorem 1. Mmunizację prowadzi się w trzech osobnych dawkach, a jako adiuwantu używa się pełnego adiuwantu Freund'a, po czym znaną metodą izoluje się przeciwciała z wydajnością 80-150 mg/jajko i czystością 85-95%. Wynalazek obejmuje również zastosowanie przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec epitopu białka BLCA-4(56-73) do wytwarzania testu diagnostycznego do detekcji białka BLCA-4.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec epitopu ludzkiego białka BLCA-4(56-73) znajdujące zastosowanie w diagnostyce chorób nowotworowych w szczególności nowotworu pęcherza moczowego. Przedmiotem wynalazku jest również sposób ich wytwarzania oraz ich zastosowanie.

Białko BLCA-4 (ang. bladder cancer antigen 4) jest markerem nowotworu pęcherza moczowego, którego ekspresja obserwowana jest tylko w komórkach nowotworowych. Pojawia się ono w moczu osób cierpiących na nowotwór pęcherza moczowego. BLCA-4 należy do rodziny białek macierzy jądrowej (NMP, ang. nuclear matrix protein), które tworzą szkielet jądra komórkowego. Sekwencja nukleotydowa białka BLCA-4 jest homologiczna z rodziną czynników transkrypcyjnych ETS, które odpowiedzialne są m.in. za regulację ekspresji onkogenów, genów supresorowych oraz genów odpowiedzialnych za procesy takie jak angiogeneza czy apoptoza. Nadekspresja białka BLCA-4 prowadzi do aktywacji genów kodujących m.in. IL-1, IL-8, trombomodulinę czy czynnik wzrostu śródbłonka naczyń, które mogą stymulować wzrost oraz przerzutowanie nowotworu. [Myers-Irvin JM, Van Le TS, Getzenberg RH. Mechanistic analysis of the role of BLCA-4 in bladder cancer pathobiology. Cancer Res. 2005; 65; 7145-50].

Homologia białka BLCA-4 względem domeny charakterystycznej dla rodziny czynników transkrypcyjnych ETS sięga 99% identyczności w porównaniu z przedstawicielami takimi jak białko ELK-1. Sekwencja fragmentu BLCA-4 homologicznego do domeny EST jest następująca: MDPSVTLWQFLLQLLREQGNGHIIWTSRDGGEFKLVDAEEVARLWGLRKMKTNMNYDKLSRALRYYYDKNIIRKVSGQKFVYKFV [Van Le TS, Myers J, Konety BR, Barder T, Getzenberg RH. Functional characterization of the bladder cancer marker, BLCA-4. Clin Cancer Res. 2004; 10; 1384-91], w której zaznaczono sekwencja fragmentu epitopowego BLCA-4(56-73).

Diagnostyka chorób nowotworowych, w szczególności nowotworu pęcherza moczowego, opiera się na metodach badań obrazowych oraz laboratoryjnych, w tym histologicznych i histopatologicznych. Metody immunochemiczne oparte o detekcję markerów nowotworowych, które stosuje się w diagnostyce nowotworu pęcherza moczowego, najczęściej skierowane są na wykrywanie obecności dwóch markerów: NMP 22 oraz BTA.

Opisane w literaturze naukowej oraz dostępne handlowo do celów badawczych przeciwciała monoklonalne oraz poliklonalne specyficzne wobec natywnego ludzkiego białka BLCA-4, jak i jego fragmentów, należą do klasy IgG i pochodzą głównie z organizmu królika.

Dotychczas nie opisano w literaturze oraz nie ma dostępnych handlowo przeciwciał IgY specyficznych wobec ludzkiego białka BLCA-4 oraz jego fragmentów.

Przeciwciała klasy IgY produkowane są w organizmach płazów, gadów i ptaków, gdzie pełnią istotną rolę w humoralnej odpowiedzi układu odpornościowego. Ssacze przeciwciała klasy IgG i IgE wyewoluowały z przeciwciał IgY, przy czym IgG pełnią zbliżone do IgY funkcje, natomiast ssacze przeciwciała IgE są strukturalnymi analogami IgY. Przeciwciała IgY obecne są we krwi ptaków, lecz także w dużej ilości (około 100-150 mg) transportowane są do żółtka jaja zapewniając pasywną ochronę immunologiczną piskląt. Tak znacząca ilość przeciwciał obecnych w żółtku jaj pozwala na pozyskanie ich w krótkim czasie bez konieczności skrwawiania zwierząt, co stanowi istotną zaletę w porównaniu do klasycznych metod produkcji przeciwciał. Dodatkowo odpowiedź immunologiczna w postaci produkcji specyficznych przeciwciał IgY utrzymuje się do końca życia zwierząt. Ogromną zaletą stosowania technologii opartej na przeciwciałach IgY jest duża odległość filogenetyczną między ptakami a ssakami, dzięki czemu możliwe jest się otrzymywanie specyficznych przeciwciał skierowanych wobec konserwatywnych białek ssaków. Ponadto, w przeciwieństwie do ssaczych przeciwciał klasy IgG, przeciwciała ptasie nie aktywują ludzkiego systemu dopełniacza oraz nie reagują z ludzkim czynnikiem reumatoidalnym czy przeciwciałami HAMA, co w konsekwencji prowadzi do znacznego zmniejszenia fałszywie pozytywnych wyników uzyskiwanych w testach serologicznych.

Istotą wynalazku są przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec epitopu białka BLCA-4(56-73) izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci koniugatów peptydów z białkiem nośnikowym hemocyjaniną o sekwencji przedstawionej wzorem I.

Korzystnie przeciwciała mają masę cząsteczkową od 175000 do 200000 daltonów.

Sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec BLCA-4(56-73) polega na tym, iż drób, korzystnie kury ras hodowlanych, poddaje się immunizacji antygenem w postaci koniugatów peptydów z białkiem nośnikowym (hemocyjaniną) o sekwencji przedstawionej wzoPL 224 245 B1 rem 1, przy czym immunizację prowadzi się w trzech osobnych dawkach, a jako adiuwantu używa się pełnego adiuwantu Freund'a, po czym znaną metodą izoluje się przeciwciała z wydajnością 80-150 mg/jajko i czystością 85-95%.

Zastosowanie przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec epitopu białka BLCA-4(56-73) do wytwarzania testu diagnostycznego do detekcji białka BLCA-4.

Wyizolowane przeciwciała poddaje się analizie biochemicznej w celu określenia ich czystości, miana, specyficzności antygenowej, awidności i stężenia. W trakcie procesu immunizacji analizę przeciwciał przeprowadzono dla każdego pobranego jaja w okresie 20 tygodni. Odpowiedź organizmu w postaci produkcji specyficznych przeciwciał IgY pojawiła się w 3 tygodniu od momentu pierwszej immunizacji.

Sposób według wynalazku cechuje duża ilości izolowanych przeciwciał oraz niska inwazyjność, ponieważ nie wymaga skrwawiania zwierząt w określonych odstępach czasu w celu izolacji przeciwciał.

Przeciwciała według wynalazku mogą znaleźć zastosowanie w diagnostyce chorób nowotworowych, w szczególności nowotworów pęcherza moczowego. Wykorzystanie otrzymanych przeciwciał IgY anty-BLCA-4(56-73) w diagnostyce polega na ich zdolności do specyficznego wiązania epitopu (56-73) białka BLCA-4. Dzięki związaniu przeciwciał IgY z antygenem możliwa jest detekcja białka

BLCA-4 przy użyciu handlowo dostępnych drugorzędowych przeciwciał anty-IgY (np. królicze przeciwciała IgG anty-IgY) zawierających dowolny znacznik z grupy obejmującej peroksydazę chrzanową, fosfatazę alkaliczną, biotynę, fluoresceinę oraz inne znaczniki o podobnym mechanizmie działania.

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładach oraz na rysunku na którym:

Fig. 1 przedstawia analizę elektroforetyczną (SDS-PAGE, 4-12%) w warunkach nieredukujących otrzymanych przeciwciał IgY specyficznych wobec epitopu białka BLCA-4(56-73). Barwienie wykonano przy użyciu barwnika Coomassie R 250.

Fig. 2 przedstawia wykres przedstawiający odpowiedź w postaci produkcji specyficznych wobec epitopu białka BLCA-4(56-73) przeciwciał IgY. Strzałkami oznaczono czas immunizacji. Abs* - przedstawione wartości absorbancji po odjęciu wartości absorbancji otrzymanych dla kontrolnych przeciwciał IgY.

Fig. 3 przedstawia detekcję epitopu białka BLCA-4(56-73) przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY (western blotting).

Fig. 4 przedstawia wykres przedstawiający zdolność przeciwciał IgY do wykrywania epitopu białka BLCA-4(56-73).

Fig. 5 przedstawia wykres mianowania przeciwciał IgY do detekcji epitopu białka BLCA-4(56-73).

Fig. 6 przedstawia reaktywność przeciwciał anty- BLCA-4(56-73) IgY albuminą wołową (BSA).

Fig. 7 przedstawia zdolność detekcji natywnej i zdenaturowanej formy epitopu białka BLCA-4(56-73) przez przeciwciała IgY.

Fig. 8 przedstawia wykres przedstawiający awidność otrzymanych przeciwciał anty-BLCA-4(56-73) w czasie immunizacji. Abs* - przedstawione wartości absorbancji po odjęciu wartości absorbancji otrzymanych dla kontrolnych przeciwciał IgY.

Fig. 9 przedstawia zdolność detekcji epitopu białka BLCA-4(56-73) przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY (western blotting).

Fig. 10 przedstawia detekcję epitopu białka BLCA-4(56-73) przez specyficzne przeciwciała IgY (western blotting).

1.1. Synteza epitopu polipeptydowego.

Peptyd o wzorze CysNYDK.LSRALRYYYDK.NII otrzymano wykorzystując technikę syntezy na podłożu stałym z użyciem żywicy H-L-Ile-2-Cl-Trt o podstawieniu 0,57 mmol/g. Etapy sprzęgania kolejnych aminokwasów prowadzono z wykorzystaniem strategii Fmoc/Boc. Sprzęganie aminokwasów prowadzono z użyciem HBTU jako czynnika sprzęgającego w obecności DIPEA. Do usunięcia grupy ochronnej Fmoc stosowano 20% roztwór piperydyny w DMF. W celu odłączenia peptydu od żywicy zastosowano mieszaninę TFA/TIPS/EDT/fenol w stosunku 92,5:2,5:2,5:2,5 (v/v). Otrzymany peptyd oczyszczono z wykorzystaniem techniki HPLC, a masę cząsteczkową potwierdzono przy pomocy wysokorozdzielczej spektrometrii masowej.

1.2. Otrzymywanie koniugatu BLCA-4(56-73)-KLH

Do roztworu białka KLH w 10 mM buforze fosforanowym (pH 7,0) dodano powoli roztwór GMBS w DMSO. Reakcję prowadzono 2h w temperaturze pokojowej delikatnie mieszając, po czym zaktywowane białko KLH-MB oczyszczono z wykorzystaniem chromatografii żelowej. Frakcje zawierające

PL 224 245 B1 białko połączono, a następnie rozcieńczono acetonitrylem aż jego końcowe stężenie wyniosło 25%. Do roztworu KLH-MB dodano powoli roztwór peptydu rozpuszczonego w 50% acetonitrylu w wodzie delikatnie mieszając. Wartość pH mieszaniny utrzymywano w granicach 7,2-7,4 przy pomocy 1M wodnego roztworu NaOH. Postęp reakcji monitorowano przy użyciu chromatografii HPLC.

1.3. Otrzymywanie koniugatu BLCA-4(56-73)-BSA

Do roztworu białka BSA w buforze fosforanowym, pH 7.0 powoli dodano roztwór GMBS w DMSO. Reakcję prowadzono 30 min w temperaturze pokojowej delikatnie mieszając, po czym zaktywowane białko BSA-MB oczyszczono z wykorzystaniem chromatografii żelowej. Frakcje zawierające białko połączono, a następnie rozcieńczono acetonitrylem aż jego końcowe stężenie wyniosło 25%. Do roztworu BSA-MB dodano powoli roztwór peptydu rozpuszczonego w 50% roztworze acetonitrylu w wodzie delikatnie mieszając. Wartość pH mieszaniny utrzymywano w granicach 7,0-7,4 przy pomocy 1M wodnego roztworu NaOH. Postęp reakcji monitorowano przy użyciu chromatografii HPLC.

2.1 Przygotowanie antygenu do immunizacji.

Koniugat BLCA-4(56-73)-KLH o sekwencji peptydu CysNYDKLSRALRYYYDKNII rozpuszcza się tuż przed wykonaniem iniekcji w mieszaninie sterylnego roztworu soli fizjologicznej i pełnego adiuwantu Freund'a przy pierwszej immunizacji oraz niepełnego adiuwantu Freund'a (dla dawek przypominających) w stosunku 1:1 (v/v).

2.2. Immunizacja zwierząt.

Kury hodowlane rasy White Leghorn immunizuje się przez podanie domięśniowe antygenu, w ilości 100 μg/zwierzę (300 μ^. Immunizację powtarza się następnie po 4 i 8 tygodniach stosując antygen w ilości 50 μg na zwierzę. Grupa kontrolna otrzymuje iniekcję roztworu soli fizjologicznej zawierającej jedynie odpowiedni adiuwant Freund'a (1:1, v/v, 300 μl/zwierzę).

2.3. Pobieranie i przechowywanie materiału biologicznego.

Jaja kolekcjonuje się codziennie od dnia następnego po immunizacji przez 20 tygodni i przechowuje w temperaturze 4°C do czasu izolacji przeciwciał.

Izolacja przeciwciał IgY.

Jaja przemywa się 50% wodnym roztworem izopropanolu, a następnie rozdziela żółtko od białka. Po usunięciu błony białkowej otaczającej worek żółtkowy płynną zawartość rozcieńcza się pięciokrotnie buforem fosforanowym (PBS, 10 mM, pH 7,4) z 4,75% dodatkiem glikolu polietylenowego

6000 (PEG 6000), aby zapewnić końcowe stężenie PEG 6000 3,5%. Po dokładnym wymieszaniu całość wiruje się przy 11 000 rpm przez 15 min w 4°C a otrzymany supernatant filtruje przez sączek bibułowy. Do supernatantu dodaje się następnie PEG 6000 do końcowego stężenia 12%. Po dokładnym wymieszaniu wytrącony osad odwirowuje się (11 000 obr/min przez 15 min w 4°C). Supernatant odrzuca się, a osad zawierający przeciwciała IgY rozpuszcza dokładnie w buforze fosforanowym (pH 7,4) w objętości 10 ml i dodaje PEG 6000 do końcowego stężenia 12%. Wytrącony osad zawierający czyste przeciwciała IgY, po odwirowaniu i odrzuceniu supernatantu, rozpuszcza się w 5 ml buforu PBS. Po wykonaniu analiz biochemicznych roztwory przeciwciał przechowuje się w temperaturze -20°C. Stężenie otrzymanych białek określa się spektrofotometrycznie (A280). Czystość wyizolowanych przeciwciał zawiera się w zakresie 85-95% (fig.1).

P r z y k ł a d 3. Analiza odpowiedzi immunologicznej na antygen BLCA-4(56-73) w czasie procesu immunizacji.

Do analizy odpowiedzi immunologicznej immunizowanych zwierząt i określenia miana produkowanych przeciwciał zastosowano test ELISA. Płytki mikrotitracyjne 96 dołkowe pokryto antygenem w postaci koniugatu BLCA-4(56-73)-BSA (50 ng peptydu/100 μL) rozpuszczonym w buforze węglanowym (50 mM, pH 9,6) i inkubowano w temperaturze 4°C przez 12 godzin. Wolne miejsca zablokowano następnie przy użyciu 10% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym w temperaturze 37°C w czasie 120 minut. Po odmyciu czynnika blokującego specyficzne oraz kontrolne przeciwciała rozcieńczone (1:500) w 0,5% roztworze mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% (v/v) Tween-20 (PBST, 10 mM, pH 7,4) naniesiono na opłaszczoną antygenem płytkę mikrotitracyjną i inkubowano przez godzinę w temperaturze 37°C. Detekcję kompleksów BLCA-4(56-73)-przeciwciało IgY wykonano przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY sprzężonego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylenodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Dla każdego tygodnia procesu immunizacji pomiar przeprowadzony został dla czterech izolatów przeciwciał anty-BLCA4(56-73) IgY (fig. 2).

PL 224 245 B1

P r z y k ł a d 4. Analiza specyficzności przeciwciał IgY anty-BLCA-4(56-73) w teście western blotting w czasie procesu immunizacji.

W celu potwierdzenia specyficzności otrzymanych przeciwciał wobec BLCA-4(56-73) wykonano analizę western blotting. Po rozdziale elektroforetycznym w warunkach denaturujących (SDS PAGE,

4%-12%) koniugatu BLCA-4(56-73)-BSA (100 ng peptydu na studzienkę) przeprowadzono elektrotransfer na membranę nitrocelulozową. Blokowanie wolnych miejsc wiążących na membranie nitrocelulozowej wykonano przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% Tween-20 (v/v) przez 12h w temperaturze 4°C. Następnie przeciwciała specyficzne wobec BLCA-4(56-73) oraz kontrolne rozcieńczono (1:100) w 0,5% roztworze mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% Tween-20 (v/v) i inkubowano z membraną w czasie 1h w temperaturze 37°C. Po wypłukaniu membrany buforem PBST detekcję związanych z antygenem specyficznych przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY sprzężonego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD.

P r z y k ł a d 5. Limit detekcji epitopu BLCA-4(56-73) w teście ELISA.

W celu określenia limitu detekcji epitopu BLCA-4(56-73) przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY wykorzystano enzymatyczny test immunosorpcyjny fazy stałej (ELISA) w sposób opisany w przykładzie 3. W tym celu 96 dołkową płytkę mikrotitracyjną opłaszczono koniugatem BLCA-4(56-73)-BSA w różnych stężeniach w przedziale od 1000 ng/ml do 0,5 ng/ml peptydu (100 μΐ/studzienkę). Następnie inkubowano z roztworem specyficznego wobec epitopu białka BLCA-4(56-73) przeciwciała rozcieńczonego 1000-krotnie 0,5% roztworem mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% (v/v) Tween-20. Detekcję kompleksów BLCA-4(56-73)-IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylenodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Jako kontroli użyto przeciwciała z grupy kontrolnej w analogicznych rozcieńczeniach. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (fig. 4).

P r z y k ł a d 6. Miano przeciwciał - test ELISA.

Miano otrzymanych przeciwciał specyficznych wobec antygenu BLCA-4(56-73) określono przy użyciu testu ELISA. Płytkę opłaszczono koniugatem BLCA-4(56-73)-BSA w ilości 50 ng peptydu/studzienkę. Przygotowano następnie serię rozcieńczeń specyficznych oraz kontrolnych przeciwciał IgY w zakresie od 1:100 do 1:100000 i inkubowano z opłaszczoną antygenem płytką. Detekcję kompleksów BLCA-4(56-73)-IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylenodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (fig. 5).

P r z y k ł a d 7. Reaktywność przeciwciał anty-BLCA-4(56-73) IgY z BSA.

Reaktywność z albuminą wołową (BSA) otrzymanych przeciwciał specyficznych wobec antygenu BLCA-4(56-73) określono przy użyciu testu ELISA. Płytkę opłaszczono antygenem (BLCA-4(56-73)-BSA lub albuminą wołową) w ilości 50 ng na studzienkę. Przygotowano następnie rozcieńczenia przeciwciał IgY (specyficznych wobec epitopu białka BLCA-4(56-73) oraz przeciwciał kontrolnych) w zakresie 1:500, 1:1000 oraz 1:2500 i inkubowano z opłaszczoną antygenami płytką mikrotitracyjną. Detekcję kompleksów BLCA-4(56-73)-IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego antyIgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylenodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (fig. 6). Przeciwciała kontrolne wykazały brak reaktywności z epitopem białka BLCA-4(56-73) oraz przeciwciała specyficzne wobec epitopu BLCA-4(56-73) nie wykazywały reaktywności z albuminą wołową.

P r z y k ł a d 8. Określenie zdolności przeciwciał IgY do detekcji zdenaturowanego epitopu BLCA-4(56-73).

W celu określenia zdolności otrzymanych przeciwciał anty-BLCA-4(56-73) do detekcji zdenaturowanego epitopu BLCA-4(56-73) wykorzystano test ELISA. W tym celu studzienki płytki mikrotitracyjnej opłaszczono natywnym koniugatem BLCA-4(56-73)-BSA (kontrola) oraz koniugatem BLCA-4(56-73)-BSA, który został poddany wcześniejszej denaturacji termicznej (koniugat zagotowano przez 10 minut w temperaturze 100°C) w ilości 50 ng peptydu na studzienkę. Po inkubacji (12h, 4°C) i zablokowaniu wolnych miejsc (5% mleko w buforze PBST) inkubowano z roztworem specyficznego wobec epitopu BLCA-4(56-73) przeciwciała IgY lub przeciwciała kontrolnego w rozcieńczeniach 1:500,

PL 224 245 B1

1:1000 oraz 1:2500. Detekcję kompleksów BLCA-4(56-73)-IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylenodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (fig. 7).

P r z y k ł a d 9. Awidność przeciwciał anty-BLCA-4(56-73) - test ELISA

W celu określenia awidności otrzymanych przeciwciał anty-BLCA-4(56-73) wykorzystano test ELISA. W tym celu studzienki płytki mikrotitracyjnej opłaszczono natywnym koniugatem BLCA-4(56-73)-BSA w ilości 50 ng peptydu/studzienkę. Po inkubacji (12h, 4°C) i zablokowaniu wolnych miejsc (10% mleko w buforze PBS) inkubowano z roztworami specyficznych przeciwciał IgY lub przeciwciała kontrolnego (1:100). Po wypłukaniu płytki mikrotitracyjnej każde z badanych przeciwciał inkubowano z 6M roztworem mocznika lub PBST przez 10 min. w temperaturze pokojowej. Detekcję kompleksów BLCA4(56-73)-IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylenodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (fig. 8).

P r z y k ł a d 10. Limit detekcji epitopu BLCA-4(56-73) - western blotting

W celu określenia limitu detekcji epitopu białka BLCA-4(56-73) w technice western blotting w pierwszym etapie wykonano rozdział elektroforetyczny (SDS PAGE, 4%-12%) koniugatu BLCA-4(56-73)-BSA w warunkach redukujących w ilości mieszczącej się w zakresie od 100 ng do 1 ng peptydu na studzienkę, a następnie transfer białek na membranę nitrocelulozową. Po zablokowaniu wolnych miejsc wiążących przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze PBST membranę inkubowano z roztworem otrzymanego przeciwciała IgY specyficznego wobec epitopu BLCA-4(56-73) (1:100, 0,5% mleko/PBST). Detekcję kompleksów BLCA-4(56-73)-IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (fig. 9).

P r z y k ł a d 11. Miano przeciwciał - western blotting.

W celu określenia zakresu stężeń otrzymanych specyficznych przeciwciał klasy IgY w technice western blotting niezbędnego do detekcji epitopu białka BLCA-4(56-73) wykonano analizę techniką western blotting wykorzystując koniugat BLCA-4(56-73)-BSA (50 ng peptydu na studzienkę). Po transferze białek na membranę nitrocelulozową i blokowaniu wolnych miejsc paski membrany inkubowano z roztworami specyficznego wobec epitopu białka BLCA-4(56-73) przeciwciała IgY rozcieńczonego w zakresie od 1:500 do 1:100000. Po wypłukaniu pasków membrany buforem PBST detekcję związanych z antygenem specyficznych przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (fig. 10).

Claims (5)

1. Przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec epitopu białka BLCA-4(56-73) izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci koniugatów peptydów z białkiem nośnikowym hemocyjaniną o sekwencji peptydu przedstawionej wzorem 1.

2. Przeciwciała według zastrz. 1, znamienne tym, że mają masę cząsteczkową od 175000 do 200000 daltonów.

3. Sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec epitopu białka BLCA-4(56-73), znamienny tym, że immunizuje się drób białkowym antygenem w postaci koniugatów peptydów z białkiem nośnikowym hemocyjaniną o sekwencji peptydu przedstawionej wzorem 1, przy czym immunizację prowadzi się w trzech osobnych dawkach, a jako adiuwantu używa się pełnego adiuwantu Freund'a, po czym znaną metodą izoluje się przeciwciała z wydajnością 80-150 mg/jajko i czystością 85-95%.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że immunizuje się kury ras hodowlanych.

5. Zastosowanie przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyf icznych wobec epitopu białka BLCA-4(56-73) do wytwarzania testu diagnostycznego do detekcji białka BLCA-4 oraz jego fragmentu epitopowego in vitro.