PL224246B1 - Przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec epitopu białka BLCA -4(5-21) sposób ich wytwarzania i zastosowanie - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku są przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec epitopu białka BLCA-4(5-21) izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci koniugatów peptydów z białkiem nośnikowym hemocyjaniną o sekwencji peptydu przedstawionej wzorem 1. Sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec epitopu białka BLCA-4(5-21) polega na tym, że drób, korzystnie kury ras hodowlanych, poddaje się immunizacji antygenem w postaci koniugatów peptydów z białkiem nośnikowym hemocyjaniną o sekwencji peptydu przedstawionej wzorem 1. Mmunizację prowadzi się w trzech osobnych dawkach, a jako adiuwantu używa się pełnego adiuwantu Freund'a, po czym znaną metodą izoluje się przeciwciała z wydajnością 100-160 mg/jajko i czystością 85-95%. Wynalazek obejmuje również zastosowanie przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec epitopu białka BLCA-4(5-21) do wytwarzania testu diagnostycznego do detekcji białka BLCA-4 oraz jego fragmentu epitopowego.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec epitopu białka BLCA-4(5-21) znajdujące zastosowanie w diagnostyce i monitorowaniu przebiegu choroby nowotworowej pęcherza moczowego. Przedmiotem wynalazku jest również sposób ich wytwarzania oraz zastosowanie przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec epitopu białka BLCA-4(5-21).

Nowotwór nabłonka dróg moczowych jest czwartym z najczęściej występujących nowotworów u mężczyzn w Stanach Zjednoczonych. Najczęstsze objawy nowotworu pęcherza moczowego to hematuria (dotyczy około 80% chorych) oraz bolesne oddawanie moczu. Do standardowych metod diagnostyki nowotworów pęcherza moczowego zaliczana jest cystoskopia - badanie inwazyjne i bolesne wymagające znieczulenia miejscowego. Wykonywane są także testy wykorzystujące markery nowotworowe. Detekcja specyficznych markerów nowotworowych pozwala na szybkie i dokładne diagnozowanie nowotworów oraz monitorowanie przebiegu choroby (van Le TS, Miller R, Barder T, Babjuk M, Potter DM, Getzenberg RH; Highly specific urine-based marker of bladder cancer. Urology. 2005, 66:1256-1260).

Białko BLCA-4 (ang. bladder cancer antigen 4) będące markerem nowotworowym nabłonka dróg moczowych, należy do rodziny białek macierzy jądrowej (NMP, ang. nuclear matrix protein). Ekspresja białka BLCA-4 ma miejsce wyłącznie w komórkach nowotworowych, natomiast nie dochodzi do jego ekspresji w zdrowych komórkach pęcherza moczowego. Badania in vivo przeprowadzone na modelu zwierzęcym nowotworu pęcherza moczowego wykazały obecność białka BLCA-4 w początkowych stadiach nowotworu, w których nie jest jeszcze widoczna masa guza (Van Le TS, Meyers J, Konety BR, Barder T, Getzenberg RH: Functional Characterization of the Bladder Cancer Marker. BLCA-4. Clinical Cancer Research. 2004, 10:1384-1391).

Poszukiwania homologu białka BLCA-4 w programie BLAST bazujące na sekwencji docelowego peptydu (Tabela 1) wykazują homologię białka BLCA-4 do czynnika transkrypcyjnego ELK1 (normalizowana baza danych non-redundant, algorytm blastp).

T a b e l a 1

Homologia białka BLCA-4 i czynnika transkrypcyjnego ELK1: program: BLAST. algorytm: blastp.

ELK1, członek rodziny onkogenów ETS [Homo sapiens] _gb|AAH48296.1|_

Wartość oczekiwana E = 4·10^-44. Identyczne reszty = 84/86 (98%). Przerwy w dopasowaniu = 1/86(1%)

BLCA-4 MDPSVTLWQFLLQLLREQGNGHIISWTSRDGGEFKLVDAEEVARLWGLRK-MTNMNY 56 ^ELK1 MDPSVTLWQFLLQLLREQGNGHIISWTSRDGGEFKLVDAEEVARLWGLRKNKTNMNY 83 ************************************************************************************ **********

BLCA-4

DKLSRALRYYYDKNIIRKVSGQKFVYKFV 85 ELK1 DKLSRALRYYYDKNIIRKVSGQKFVYKFV 112

Dopasowanie sekwencji obu protein wykazało 98% identyczności, natomiast przypadkowe prawdopodobieństwo homologii cząsteczek o podobnym rozmiarze wynosi 4·10^-44 co oznacza, że podobieństwo sekwencji BLCA-4 oraz ELK1 jest istotne statystycznie.

Dzięki znajomości sekwencji fragmentu białka BLCA-4 możliwe było otrzymanie przeciwciał skierowanych przeciwko epitopowi białka BLCA-4. Korzystając z metody syntezy peptydów na podłożu stałym zsyntetyzowano fragment peptydowy, który po koniugacji z białkiem nośnikowym - hemocyjnaniną posłużył jako antygen do immunizacji zwierząt. Sekwencję epitopu ustalono biorąc pod uwagę jego strukturę drugorzędową (helisa) oraz potencjalnie wysoką immunogenność peptydu. Długość epitopu została wybrana tak, aby zawierać w sobie wszystkie reszty istotne dla stabilizacji struktury helikalnej. Sekwencja epitopu obejmuje fragment o sekwencji VTLWQFLLQLLREQGNG obecny w strukturze natywnego białka BLCA-4.

PL 224 246 B1

Immunizacja kury domowej (Gallus gallus domesticus) skutkuje efektywną produkcją znacznej ilości antygenowo specyficznych przeciwciał IgY transportowanych z krwi do żółtka jaja. Istnieje wiele korzyści płynących z praktycznego zastosowania ptasich immunoglobulin Y. Po pierwsze, stosunkowo duże ilości przeciwciał izolowane mogą być w sposób nieinwazyjny i szybki z żółtka jaj. Ponadto dystans ewolucyjny dzielący ssaki, z którego pochodzi immunogen oraz ptaki skutkuje ich zwiększoną immunogennością, gdy użyte zostaną one do immunizacji ptaków (Gassmann MA, Thommes P, Weiser T, Hubscher U, Efficient production of chicken egg yolk antibodies against a conserved mammalian protein. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 1990, 4:25282532). Przeciwciała klasy IgY nie wykazują reaktywności z ludzkim czynnikiem reumatoidalnym oraz nie aktywują ludzkiego systemu dopełniacza, dzięki czemu możliwość uzyskania fałszywie pozytywnych wyników w testach immunoenzymatycznych ulega znacznej redukcji.

Dotychczas nie zostały opisane w literaturze przeciwciała IgY specyficzne wobec fragmentu ludzkiego białka BLCA-4 odpowiadającego sekwencji aminokwasowej VTLWQFLLQLLREQGNG.

Istotą wynalazku są przeciwciała poliklonalne IgY specyficzne wobec epitopu BLCA4(5-21) izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci koniugatów peptydu z białkiem nośnikowym hemocyjnaniną o sekwencji przedstawionej wzorem 1, przy czym immunizację prowadzi się w trzech osobnych dawkach a jako adiuwantu używa się pełnego adiuwantu Freund'a. Przeciwciała izoluje się znaną metodą z wydajnością 100-160 mg/jajo i czystością 85-95%.

Korzystnie przeciwciała mają masę cząsteczkową od 175000 do 200000Da.

Zastosowanie przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec epitopu BLCA-4(5-21) do wytwarzania testu diagnostycznego do detekcji białka BLCA-4 oraz jego fragmentu epitopowego.

Przeciwciała według wynalazku mogą znaleźć zastosowanie w diagnostyce chorób nowotworowych pęcherza moczowego, dzięki zdolności specyficznego wiązania z fragmentem białka BLCA-4.

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładach jego wykonania, wzorem 1 oraz na rysunku na którym:

Fig. 1 przedstawia analizę elektroforetyczna (SDS-PAGE, 4-12%) w warunkach nieredukujących otrzymanych przeciwciał IgY specyficznych wobec epitopu białka BLCA-4(5-21). Barwienie wykonano przy użyciu barwnika Coomassie R 250.

Fig. 2 przedstawia wykres przedstawiający odpowiedź w postaci produkcji specyficznych wobec epitopu białka BLCA-4(5-21) przeciwciał IgY. Strzałkami oznaczono czas immunizacji.

Fig. 3 przedstawia detekcję epitopu białka BLCA-4(5-21) przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY (western blotting)

Fig. 4 przedstawia wykres przedstawiający zdolność przeciwciał IgY do wykrywania epitopu białka BLCA-4(5-21).

Fig. 5 przedstawia wykres mianowania przeciwciał IgY do detekcji epitopu białka BLCA-4(5-21).

Fig. 6 przedstawia reaktywność przeciwciał anty-BLCA-4(5-21) wobec albuminy wołowej.

Fig, 7 przedstawia zdolność detekcji epitopu białka BLCA-4(5-21) przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY.

Fig. 8 przedstawia miano przeciwciał IgY specyficznych wobec epitopu białka BLCA-4(5-21).

Fig. 9 przedstawia zdolność detekcji natywnej i zdenaturowanej formy epitopu białka BLCA-4(5-21) przez przeciwciała IgY.

Fig. 10 przedstawia wykres przedstawiający awidność otrzymanych przeciwciał anty-BLCA-4(5-21) w czasie immunizacji.

P r z y k ł a d 1

1.1 Synteza epitopu BLCA-4(5-21)

Peptyd o wzorze Cys-VTLWQFLLQLLREQGNG otrzymano na drodze syntezy peptydów na podłożu stałym. Do syntezy użyto żywicy H2N-GIy-2ClTrt o podstawieniu 0,38 mmol. Kolejne aminokwasy sprzęgano z wykorzystaniem strategii Fmoc/Boc. Stosowanym odczynnikiem sprzęgającym był HBTU w obecności DIPEA. Do usunięcia grup ochronnych używano 20% roztworu piperydyny w DMF. Peptyd odłączono od żywicy stosując mieszaninę TFA/TIPS/EDT/fenol w stosunku 92,5:2,5:2,5:2,5 (v/v/v/w). Peptyd oczyszczono metodą HPLC, a jego masę potwierdzono przy pomocy wysokorozdzielczej spektorskopii mas.

1.2 Synteza koniugatu BLCA-4(5-21)-KLH

Białko KLH rozpuszczono w 10 mM buforze fosforanowym (pH 7,0) i powoli dodano roztwór GMBS w DMSO. Aktywację białka KLH prowadzono 120 min w temperaturze pokojowej, po czym zaktywowane białko KLH-MB oczyszczono przy użyciu chromatografii żelowej. Frakcje zawierające

PL 224 246 B1 zaktywowane białko połączono i rozcieńczono acetonitrylem do końcowego stężenia acetonitrylu wynoszącego 25%. Do tak przygotowanego roztworu KLH-MB dodano roztwór peptydu w 50% acetonitrylu w wodzie. Wartość pH monitorowano i utrzymywano w granicach 7,2-7,4 przy pomocy 1M NaOHaq. Postęp reakcji monitorowano przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej.

1.3 Synteza koniugatu BLCA-4(5-21)-BSA

Sporządzono roztwór albuminy wołowej (BSA) w 10 mM buforze fosforanowym (pH 7,0) i powoli dodano roztwór GMBS w DMSO. Reakcję prowadzono 30 min w temperaturze pokojowej delikatnie mieszając. Zaktywowane białko BSA-MB oczyszczono z wykorzystaniem chromatografii żelowej, a następnie rozcieńczono acetonitrylem do jego końcowego stężenia wynoszącego 25%. Do roztworu zaktywowanego białka nośnikowego dodano roztwór peptydu w 50% roztworze acetonitrylu w wodzie. Zapewniono delikatne mieszanie mieszaniny reakcyjnej, pH utrzymywano na poziomie 7,0-7,4. Postęp reakcji monitorowano przy użyciu chromatografii HPLC.

P r z y k ł a d 2

2.1 Przygotowanie antygenu do immunizacji

Koniugat peptydu z hemocyjaniną rozpuszcza się bezpośrednio przed wykonaniem iniekcji w mieszaninie pełnego Adjuwantu Freund'a i soli fizjologicznej (1:1, v/v).

2.2 Immunizacja kurcząt

Immunizowano kury hodowlane rasy White Leghorn, poprzez podanie domięśniowe antygenu w ilości 100 gg peptydu/zwierzę (300 gl). Immunizację powtórzono w 5 i 12 tygodniu, stosując dawkę 50 ug peptydu/zwierzę. Grupę kontrolną stanowią kurczęta, które otrzymały iniekcję roztworu pełnego

Adjuwantu Freunda w soli fizjologicznej (1:1, v/v).

2.3 Pobieranie i przechowywanie materiału biologicznego

Jaja kolekcjonuje się każdego dnia od następnego dnia po immunizacji przez 21 tygodni. Jaja do momentu izolacji przeciwciał przechowywane są w temperaturze 4°C.

2.4 Izolacja przeciwciał IgY

Przed rozpoczęciem izolacji jaja przemywa się 50% roztworem izopropanolu. Następnie oddziela się żółtko od białka. Błona białkowa otaczająca worek żółtkowy jest usuwana, a płynna zawartość żółtka rozcieńczana jest pięciokrotnie buforem fosforanowym (PBS, pH 7,4). Do mieszaniny dodawany jest glikol polietylenowy 6000 (PEG 6000), którego końcowe stężenie w roztworze wynosi 3,5%. Całość dokładnie miesza się, a następnie wiruje przez 15 min przy 11 000 rpm w 4°C. Supernatant otrzymany po wirowaniu filtruje się przez sączek bibułowy. Do uzyskanego przesączu dodaje się PEG 6000 do końcowego stężenia 12%. Mieszaninę dokładnie miesza się, a następnie wiruje przez 1 min przy 11 000 rpm w 4°C. Supernatant jest odrzucany, a otrzymany osad rozpuszczany w 10 ml buforu fosforanowego (PBS, pH 7,4). Do mieszaniny po dokładnym rozmieszaniu dodaje się PEG 6000 do końcowego stężenia 12% i wiruje się przez 15 min w 4°C przy 11000 obrotów. Supernatant odrzuca się, natomiast osad rozpuszcza się w 5 ml buforu fosforanowego. Następnie wykonuje się analizę biochemiczną przeciwciał, po której przechowywane są w temperaturze -20°C.

2.5 Analiza czystości i stężenia przeciwciał

Stężenie otrzymanych białek oznacza się spektrofotometrycznie (A280). Czystość otrzymanych przeciwciał sprawdza się poprzez wykonanie analizy elektroforetycznej SDS-PAGE (4-12%) w warunkach nieredukujących (fig. 1). Czystość otrzymanych przeciwciał zawiera się w zakresie 86-95%.

P r z y k ł a d 3. Analiza odpowiedzi immunologicznej na podany antygen w czasie procesu immunizacji w teście ELISA.

W celu wykonania analizy odpowiedzi immunologicznej immunizowanych kurcząt na podany antygen zastosowano test immunoenzymatyczny ELISA. Płytki mikrotitracyjne 96 dołkowe pokryto antygenem (50 ng peptydu/100 ul) rozpuszczonym w buforze węglanowym pH 9,6. Inkubacja (12 godzin) prowadzona była w temperaturze 4°C. Zablokowano wolne miejsca przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym (pH 7.4) zawierającym 0,05% Tween-20 (v/v). Blokowanie prowadzono w temperaturze 37°C przez 120 min. Po odmyciu czynnika blokującego na płytkę naniesiono przeciwciała specyficzne oraz kontrolne rozcieńczone stukrotnie w 0,5% roztworze mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym (pH 7,4) zawierającym 0,05% Tween-20 (v/v). Całość inkubowano 60 min w temperaturze 37°C. Detekcję kompleksów epitopu białka BLCA-4(5-21) ze specyficznymi przeciwciałami IgY prowadzono z wykorzystaniem króliczych przeciwciał detekcyjnych anty-IgY sprzężonych z peroksydazą chrzanową. Jako chromogenicznego substratu użyto O-fenylenodiaminy. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek (fig. 2).

PL 224 246 B1

P r z y k ł a d 4. Analiza specyficzności przeciwciał IgY anty-BLCA-4(5-21) w eksperymencie western blottingu podczas immunizacji.

W celu potwierdzenia specyficzności otrzymanych przeciwciał skierowanych wobec epitopu BLCA-4(5-21) wykonano analizę western blotting. Po rozdziale elektroforetycznym w warunkach denaturujących (SDS-PAGE, 4%-12%) koniugatu BLCA-4(5-21)-BSA (fig. 3) w obecności czynnika redukującego (50ng peptydu na studzienkę) przeprowadzono elektrotransfer na membranę nitrocelulozową. Blokowanie wolnych miejsc wiążących na membranie nitrocelulozowej wykonano przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym (pH 7,4) z 0,05% (v/v) dodatkiem detergentu Tween-20 przez 12h w temperaturze 4°C. Następnie membrany inkubowano w roztworach przeciwciał specyficznych wobec docelowego fragmentu oraz przeciwciał kontrolnych w rozcieńczeniu 1:100 (0,5% roztwór mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym, pH 7,4; 0,05% Tween-20) przez 1h w temperaturze 37°C. Detekcję związanych z antygenem specyficznych przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY sprzężonego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (fig. 3).

P r z y k ł a d 5. Limit detekcji epitopu białka BLCA-4(5-21) w teście ELISA.

Aby określić limit detekcji epitopu BLCA-4(5-21) przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY wykorzystano enzymatyczny test immunosorpcyjny fazy stałej (ELISA) w sposób opisany powyżej. W tym celu 96 dołkową płytkę mikrotitracyjną opłaszczono koniugatami w różnych stężeniach w przedziale od 250 ng peptydu/ml do 0,5 ng peptydu/ml (100 μl/studzienkę). Następnie inkubowano z roztworem specyficznego przeciwciała rozcieńczonego 500-krotnie roztworem mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% (v/v) Tween-20. Detekcję kompleksów BLCA-4(5-21)IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylenodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Jako kontroli użyto przeciwciała z grupy kontrolnej w analogicznych rozcieńczeniach. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (fig. 4).

P r z y k ł a d 6. Miano przeciwciał specyficznych wobec BLCA-4(5-21) (ELISA).

Miano przeciwciał specyficznych wobec epitopu BLCA-4(5-21) określono przy użyciu testu ELISA. Płytkę mikrotitracyjną opłaszczono koniugatami BSA z fragmentami peptydowymi odpowiadającymi epitopowi BLCA-4(5-21) w ilości 50 ng peptydu na studzienkę. Następnie płytkę zablokowano przy użyciu 5% mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% (v/v) Tween-20. Po inkubacji ze specyficznym przeciwciałem IgY w zakresie rozcieńczeń od 1:100 do 1:100 000, detekcji kompleksów BLCA-4(5-21)-BSA z przeciwciałami IgY dokonano przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylenodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Jako kontroli użyto przeciwciała z grupy kontrolnej w analogicznych rozcieńczeniach. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (fig. 5).

P r z y k ł a d 7. Reaktywność przeciwciał specyficznych wobec epitopu białka BLCA-4(5-21) z albuminą wołową.

W celu określenia reaktywności przeciwciał anty-BLCA-4(5-21) z albuminą wołową wykonano test ELISA. Płytkę mikrotitracyjną opłaszczono koniugatami (50 ng/studzienkę, 100 ul) lub albuminą wołową (50 ng/studzienkę, 100 ul). Po zablokowaniu miejsc wiążących na płytce inkubowano z roztworem specyficznego lub kontrolnego przeciwciała rozcieńczonego 500, 1000 oraz 2500-krotnie roztworem mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% (v/v) Tween-20. Detekcję kompleksów BLCA-4(5-21)-BSA ze specyficznymi przeciwciałami oraz kompleksów przeciwciał IgY z albuminą wołową przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylenodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Jako kontroli użyto przeciwciała z grupy kontrolnej w analogicznych rozcieńczeniach. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach.

P r z y k ł a d 8. Określenie limitu detekcji BLCA-4(5-21) techniką western blott

W celu określenia limitu detekcji fragmentu białka BLCA-4 w technice western blott, w pierwszym etapie wykonano rozdział elektroforetyczny (SDS PAGE, 4%-12%) koniugatów BLCA-4(5-21)BSA w warunkach redukujących, w zakresie od 100 ng peptydu/studzienkę do 250 pg peptydu/studzienkę. Następnie wykonano transfer białek na membranę nitrocelulozową. Po zablokowaniu wol6

PL 224 246 B1 nych miejsc wiążących przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze PBST membranę inkubowano z roztworem otrzymanego przeciwciała IgY specyficznego wobec epitopu BLCA-4(5-21) w rozcieńczeniu 1:100 (0.5% mleko/PBST). Detekcję kompleksów epitopów BLCA-4 z przeciwciałami IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (fig. 7).

P r z y k ł a d 9. Miano przeciwciał specyficznych wobec BLCA-4(5-21) (western blotting)

W celu określenia maksymalnego rozcieńczenia otrzymanych przeciwciał klasy IgY w technice western blotting niezbędnego do detekcji BLCA-4(5-21)-BSA wykonano rozdział elektroforetyczny (SDS PAGE, 4-12%) BLCA-4(5-21)-BSA (50 ng peptydu/studzienkę). Po transferze białek na membranę nitrocelulozową i zablokowaniu wolnych miejsc wiążących paski membrany inkubowano z roztworami specyficznego wobec BLCA-4(5-21) przeciwciała IgY rozcieńczonego w zakresie od 1:1000 do 1:250000. Po wypłukaniu pasków membrany buforem PBST detekcję związanych z antygenem specyficznych przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (fig. 8).

P r z y k ł a d 10. Określenie zdolności przeciwciał IgY do detekcji zdenaturowanego epitopu BLCA-4(5-21)

W celu określenia zdolności otrzymanych przeciwciał IgY do detekcji zdenaturowanego epitopu BLCA-4(5-21) wykorzystano test ELISA. W tym celu studzienki 96 dołkowej płytki mikrotitracyjnej opłaszczono (50 ng peptydu/studzienkę) natywnym koniugatem BLCA-4(5-21)-BSA lub koniugatem poddanym wcześniejszej denaturacji termicznej (po zagotowaniu przez 15 minut w temperaturze 100°C). Po inkubacji (12h, 4°C) i zablokowaniu wolnych miejsc (5% mleko w buforze PBS-T) płytkę inkubowano z roztworem specyficznego wobec BLCA-4(5-21) przeciwciała IgY lub przeciwciała kontrolnego w trzech rozcieńczeniach (1:500, 1:1000, 1:2500). Detekcję kompleksów BLCA-4(5-21) z IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylenodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (fig. 9).

P r z y k ł a d 11. Awidność przeciwciał IgY anty-BLCA-4(5-21)

W celu określenia awidności otrzymanych przeciwciał specyficznych wobec BLCA-4(5-21) wykorzystano test ELISA. W tym celu studzienki płytki mikrotitracyjnej opłaszczono koniugatem BLCA-4(5-21)-BSA w ilości 50 ng peptydu/studzienkę. Po inkubacji (12h, 4°C) i zablokowaniu wolnych miejsc (5% mleko w buforze PBS-T) inkubowano z roztworem specyficznych wobec epitopu białka BLCA-4 przeciwciał IgY lub przeciwciał kontrolnych (1:100). Następnie połowę analizowanych roztworów inkubowano z 6M roztworem mocznika w PBS-T. Detekcję kompleksów epitopów z IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenyIenodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (fig. 10).

Claims (5)

1. Przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec epitopu BLCA-4(5-21) izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci koniugatów peptydów z białkiem nośnikowym hemocyjaniną o sekwencji epitopowej przedstawionej wzorem 1.

2. Przeciwciała według zastrz. 1, znamienne tym, że mają masę cząsteczkową od 175000 do 200000 daltonów.

3. Sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec epitopu białka BLCA-4(5-21), znamienny tym, że immunizuje się drób białkowym antygenem w postaci koniugatów z białkiem nośnikowym hemocyjaniną o sekwencji epitopowej przedstawionej wzorem 1, przy czym immunizację prowadzi się w trzech osobnych dawkach a jako adiuwantu używa się pełnego adiuwantu

Freund'a, po czym znaną metodą izoluje się przeciwciała z wydajnością 80-150 mg/jajko i czystością 85-95%.

PL 224 246 B1

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że immunizuje się kury ras hodowlanych.

5. Zastosowanie przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec epitopu BLCA-4(5-21) do wytwarzania testu diagnostycznego do detekcji białka BLCA-4 oraz jego fragmentu epitopowego in vitro.