PL224560B1 - Test diagnostyczny do detekcji białka gp120 wirusa HIV-1 - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest test diagnostyczny do detekcji białka gp120 wirusa HIV-1 charakteryzujący się tym, że jako czynnik detekcyjny zawiera przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec epitopu białka gp120(416-439) izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci koniugatu fragmentu epitopowego białka gp120(416-439) o sekwencji Cys-LPSRIKQIINMWQEVGKAMYAPPI z białkiem nośnikowym -albuminą wołową.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest test diagnostyczny do detekcji białka gp120(416-439) wirusa HIV-1, znajdujący zastosowanie w diagnostyce infekcji wirusem HIV-1.

Białko gp120 jest powierzchniowym białkiem wirusa ludzkiego niedoboru odporności typu 1 (HIV-1), które odpowiedzialne jest za wnikanie wirusa do komórek ludzkiego układu immunologicznego. Specyficzne oddziaływanie białka gp120 z receptorem CD4 obecnym na powierzchni komórek układu immunologicznego zmienia konformację białka gp120, co prowadzi do powstania dodatkowego miejsca wiązania z koreceptorem CCR5 lub CXCR4. Powoduje to zbliżenie cząsteczki wirusa do membrany oraz fuzji wirusa z komórką docelową. Po wniknięciu do wnętrza komórki wirus ulega repl ikacji co prowadzi do rozwoju infekcji [Tomaras GD, Greenberg ML, Mechanisms for HIV-1 Entry: Current Strategies to Interfere with This Step, Curr Infect Dis Rep. 2001, 3:93-99; Sierra-Aragón S, Walter H, Targets for inhibition of HIVreplication: entry, enzyme action, release and naturation. Intervirology, 2012, 55:84-97].

Opisane w literaturze i używane w diagnostyce infekcji HIV-1 przeciwciała (zarówno poliklonalne i monoklonalne) pochodzą głównie z myszy, królika, owcy oraz kozy. Brak jest doniesień literatur owych i patentowych dotyczących wytwarzania i zastosowania przeciwciał ptasich (IgY) specyficznych wobec białka gp120 pochodzącego z wirusa HIV-1 zarówno w celach diagnostycznych i terapeutycznych. Znane są jedynie przeciwciała IgY skierowane wobec białka tat wirusa HIV-1 [produkty firm Novus Biologicals czy Acris].

Epitop białka gp120(416-439) został wybrany ze względu na swą potencjalnie wysoką immunogenność, a także ze względu na niski współczynnik mutacji w różnych typach i szczepach wirusa HIV-1. Epitop gp120(416-439) jest częścią pętli β19-β21 odpowiedzialnej za wiązanie białka gp120 z receptorem CD4. Obejmuje aminokwasy od reszty 416 do 439 (PDB:1G9M) o strukturze przedstawionej wzorem 1.

Immunoglobuliny Y są podstawową klasą przeciwciał występującą u ptaków. Pełnią analogiczne funkcje do ssaczych przeciwciał IgG. Przeciwciała IgY nie wykazują interakcji z czynnikiem reumatoidalnym, białkiem A oraz białkiem G, nie aktywują ludzkiego systemu dopełniacza oraz nie wiążą się z przeciwciałami HAMA, co znacznie ogranicza ilość fałszywie pozytywnych wyników uzyskiwanych w testach diagnostycznych. Dodatkowo, ze względu na dużą odległość filogenetyczną, immunizacja ptaków z wykorzystaniem antygenów pochodzących od ssaków daje wysoką i długo utrzymującą się odpowiedź immunologiczną w postaci produkcji specyficznych przeciwciał IgY. Dzięki obecności dużej ilości (około 80-130 mg) przeciwciał IgY w żółtku jaj możliwe jest wykorzystanie ich jako źródła spec yficznych przeciwciał bez konieczności skrwawiania zwierząt. Ptasie przeciwciała klasy IgY stanowią cenne narzędzie diagnostyczne, ze względu na zalety wynikające z nieinwazyjnej technologii ich produkcji oraz reaktywności odróżniających je od stosowanych w diagnostyce ssaczych przeciwciał IgG. Immunoglobuliny Y specyficzne wobec epitopu białka gp120(416-439) umożliwiające detekcję antygenu specyficznego dla wirusa HIV-1 nie zostały dotychczas opisane w literaturze naukowej i patentowej, a także nie są dostępne handlowo.

Istotą testu diagnostycznego do detekcji białka gp120 wirusa HIV-1 według wynalazku jest to, że jako czynnik detekcyjny zawiera przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wo bec epitopu białka gp120(416-439), które izolowane są z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antyg enem w postaci koniugatu fragmentu epitopowego białka gp120(416-439) o sekwencji Cys-LPSRIKQIINMWQEVGKAMYAPPI, z białkiem nośnikowym - albuminą wołową.

Korzystnie przeciwciała mają masę cząsteczkową od 175000 do 200000 daltonów.

Test diagnostyczny do detekcji białka gp120 wirusa HIV-1 według wynalazku znajduje zastosowanie w diagnostyce infekcji wirusem HIV-1 do wykrywania antygenu gp120 wirusa HIV-1, dzięki temu, że zastosowane przeciwciała skierowane wobec krótkiego fragmentu rozpoznają całe białko.

Wyizolowane przeciwciała poddaje się analizie biochemicznej w celu określenia ich czystości, miana, specyficzności antygenowej i stężenia. W trakcie procesu immunizacji analizę przeciwciał prowadzi się dla każdego pobranego jaja w okresie 20 tygodni. Odpowiedź organizmu w postaci produkcji specyficznych przeciwciał IgY pojawia się po 4 tygodniu od momentu rozpoczęcia immunizacji.

Diagnostyczne wykorzystanie otrzymanych przeciwciał anty-gp120(416-439) IgY polega na ich zdolności do specyficznego wiązania z antygenem, którym jest natywne/pełnołańcuchowe białko gp120. Dzięki związaniu przeciwciał IgY możliwa jest pośrednia detekcja białka gp120 przy użyciu

PL 224 560 B1 dowolnych przeciwciał drugorzędowych anty-IgY (np. królicze przeciwciała IgG anty-IgY) zawierających dowolny znacznik (peroksydaza chrzanowa, fosfataza alkaliczna, biotyna, fluoresceina).

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładach jego wykonania oraz na rysunku na którym:

Fig. 1 przedstawia analizę elektroforetyczna (SDS-PAGE, 4-12%) w warunkach nieredukujących otrzymanych przeciwciał IgY specyficznych wobec białka gp120. Barwienie wykonano przy użyciu barwnika Coomassie R 250.

Fig. 2 przedstawia wykres przedstawiający odpowiedź w postaci produkcji specyficznych wobec białka gp120 przeciwciał IgY. Strzałkami oznaczono czas immunizacji.

Fig. 3 przedstawia wykres przedstawiający limit detekcji epitopu gp120(416-439) przez otrzymane przeciwciała IgY.

Fig. 4 przedstawia wykres mianowania przeciwciał IgY do detekcji gp120(416-439).

Fig. 5 przedstawia limit detekcji epitopu gp120(416-439) przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY (dot blot).

Fig. 6 przedstawia miano przeciwciał IgY anty-gp120(416-439) (dot blot).

Fig. 7 przedstawia zdolność krzyżowej detekcji białka gp120 przez otrzymane przeciwciała IgY specyficzne wobec epitopu gp120(416-439); P - kontrola pozytywna, K - kontrola negatywna, 1,2,3-przeciwciała IgY specyficzne wobec epitopu gp120(416-439) (różne izolaty).

P r z y k ł a d 1

1.1 Synteza peptydowego antygenu

Peptyd o sekwencji Cys-LPSRIKQIINMWQEVGKAMYAPPI otrzymuje się na drodze syntezy na podłożu stałym z użyciem żywicy H-_L-Ile-2-Cl-Trt (0,92 mmol/g). Etapy sprzęgania kolejnych aminokwasów prowadzi się przy użyciu HBTU jako czynnika sprzęgającego w obecności DIPEA. Do usunięcia grupy ochronnej Fmoc stosuje się 20% roztwór piperydyny w DMF. W celu odłączenia peptydu od żywicy stosuje się mieszaninę TFA/TIPS/EDT/fenol w stosunku 92,5:2,5:2,5:2,5 (v/v). Otrzymany peptyd oczyszcza się z za pomocą chromatografii HPLC, a masę cząsteczkową oczekiwanego produktu potwierdza metoda wysokorozdzielczej spektrometrii mas (HRMS).

1.2 Otrzymywanie koniugatu gp120(416-439)-BSA

Do roztworu białka BSA w 10 mM buforze fosforanowym (pH 7,0) dodaje się roztwór GMBS w DMSO. Reakcję prowadzi się 2 h w temperaturze pokojowej, po czym zaktywowane białko BSA-MB oczyszcza z wykorzystaniem chromatografii żelowej. Frakcje zawierające białko łączy się i dodaje roztwór peptydu delikatnie mieszając. Wartość pH mieszaniny utrzymuje się w granicach 7,2-7,4 przy pomocy 1M wodnego roztworu NaOH. Postęp reakcji monitoruje się przy użyciu chromatografii HPLC.

1.3 Synteza koniugatu gp120(416-439)-KLH

Do roztworu białka KLH w buforze fosforanowym powoli dodaje się roztwór GMBS w DMSO. Reakcję prowadzi się 30 min w temperaturze pokojowej po czym zaktywowane białko KLH-MB oczyszcza się z wykorzystaniem chromatografii żelowej. Frakcje zawierające białko łączy się a następnie dodaje się roztwór peptydu. Wartość pH mieszaniny utrzymuje się w granicach 7,0-7,4 przy pomocy 1 M wodnego roztworu NaOH. Postęp reakcji monitoruje się przy użyciu chromatografii HPLC.

P r z y k ł a d 2

2.1. Przygotowanie antygenu do immunizacji

Koniugat gp120(416-439)-BSA (o sekwencji peptydu przedstawionej wzorem 1) rozpuszcza się tuż przed wykonaniem iniekcji w mieszaninie sterylnego roztworu soli fizjologicznej i pełnego adiuwa ntu Freund'a (1:1, v/v) przy pierwszej immunizacji oraz niepełnego adiuwantu Freund'a (1:1, v/v) dla dawek przypominających.

2.2. Immunizacja zwierząt

Kury hodowlane, rasy White Leghorn immunizuje się przez podanie domięśniowe antygenu, w ilości 100 pg/zwierzę (300 pl). Immunizację powtarza się następnie po 4 i 8 tygodniach stosując antygen, w ilości 100 pg na zwierzę. Grupa kontrolna otrzymuje iniekcję roztworu soli fizjologicznej zawierającej jedynie pełny adiuwant Freund'a (1:1, v/v, 300 pl/zwierzę).

2.3. Pobieranie i przechowywanie materiału biologicznego

Jaja kolekcjonuje się codziennie od następnego dnia po immunizacji przez 20 tygodni i przechowuje w temperaturze 4°C do czasu izolacji przeciwciał.

2.4. Izolacja przeciwciał IgY

Jaja przemywa się 50% roztworem izopropanolu, a następnie rozdziela żółtko od białka. Po usunięciu błony białkowej otaczającej worek żółtkowy płynną zawartość rozcieńcza się pięciokrot4

PL 224 560 B1 nie buforem fosforanowym (10 mM, pH 7,4), a następnie dodaje glikol polietylenowy 6000 (PEG 6000) do końcowego stężenia 3,5%. Po dokładnym wymieszaniu całość wiruje się (11 000 rpm, 15 min, 4°C), a otrzymany supernatant filtruje przez sączek bibułowy. Do supernatantu dodaje się następnie PEG 6000 do końcowego stężenia 12%. Po dokładnym wymieszaniu wytrącony osad odwirowuje się (11 000 rpm przez 15 min. w 4°C). Supernatant odrzuca się, a osad zawierający przeciwciała klasy IgY rozpuszcza dokładnie w buforze fosforanowym (pH 7,4) w objętości 10 ml i dodaje PEG 6000 do końcowego stężenia 12%. Wytrącony osad zawierający czyste przeciwciała IgY odwirowuje się a uz yskany osad rozpuszcza w 5 ml buforu PBS. Po wykonaniu analiz biochemicznych roztwory przeciwciał przechowuje się w temperaturze -20°C. Stężenie otrzymanych białek określa się spektrofotometrycznie (A₂₈₀). Czystość wyizolowanych przeciwciał zawiera się w zakresie 85-95% (Fig. 1.).

P r z y k ł a d 3.

Analiza odpowiedzi immunologicznej na podany antygen oraz awidność przeciwciał anty-gp120(416-439) w czasie procesu immunizacji

Do analizy odpowiedzi immunologicznej immunizowanych zwierząt i określenia miana produkowanych przeciwciał zastosowano test ELISA. Płytki mikrotitracyjne 96-cio dołkowe pokryto antygenem KLH-gp120(416-439) (50 ng/100 pL) rozpuszczonym w buforze węglanowym (50 mM, pH 9,6) i inkubowano w temperaturze 4°C przez 12 godzin. Wolne miejsca zablokowano następnie przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% (v/v) Tween-20 w temperaturze 37°C w czasie 120 minut. Po odmyciu czynnika blokującego specyficzne oraz kontrolne przeciwciała rozcieńczone w 0,5% roztworze mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% (v/v) Tween-20 (10 mM, pH 7,4) naniesiono na opłaszczoną antygenem płytkę mikrotitracyjną (1:100) i inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 37°C. W celu oznaczenia awidności przeciwciał część próbek inkubowano z 6M roztworem mocznika w PBS-T. Detekcję kompleksów gp120(416-439)-przeciwciało IgY wykonano przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY sprzężonego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (Fig. 2).

P r z y k ł a d 4.

Limit detekcji gp120(416-439) w teście ELISA

W celu określenia limitu detekcji epitopu gp120(416-439) przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY wykorzystano enzymatyczny test immunosorpcyjny fazy stałej (ELISA) w sposób opisany powyżej. W tym celu 96-cio dołkową płytkę mikrotitracyjną opłaszczono koniugatem KLH-gp120 (416-439) w różnych stężeniach w przedziale od 1000 ng/ml do 2,5 ng/ml (100 pl/studzienkę; w przeliczeniu na ilość peptydu). Następnie inkubowano z roztworem otrzymanego specyficznego wobec gp120(416-439) przeciwciała IgY rozcieńczonego 500-krotnie roztworem mleka odtłuszczonego w PBS-T. Detekcję kompleksów gp1 20(416-439)-IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylenodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Jako kontroli użyto przeciwciała IgY z grupy kontrolnej w analogicznych rozcieńczeniach. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (Fig. 4).

P r z y k ł a d 5.

Miano przeciwciał - test ELISA.

Miano otrzymanych przeciwciał specyficznych wobec epitopu gp120(416-439) określono przy użyciu testu ELISA. Płytkę opłaszczono koniugatem KLH-gp120(416-439) w ilości 50 ng/studzienkę. Przygotowano następnie serię rozcieńczeń przeciwciał IgY w zakresie od 1:100 do 1:50000 i inkubowano z opłaszczoną antygenem płytką. Detekcję kompleksów gp120(416-439)-IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylenodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (Fig. 5).

P r z y k ł a d 6.

Limit detekcji epitopu gp120(416-439) - technika dot blot

W celu określenia limitu detekcji epitopu gp120(416-439) w technice dot blot na membranę nitrocelulozową naniesiono koniugat KLH-gp120(416-439) (PBS, pH 7,4) w zakresie stężeń od 50 ng do 0,5 ng/dołek. Po zablokowaniu wolnych miejsc wiążących przy użyciu 5% roztworu mleka odtłus zczonego w buforze PBST membranę inkubowano z roztworem otrzymanego specyficznego wobec

PL 224 560 B1 gp120(416-439) przeciwciała IgY (1:500, 0,5% mleko/PBST). Detekcję kompleksów gp120(416-439)IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY-HRP stosując chemiluminescencyjny substrat. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD.

P r z y k ł a d 7.

Miano przeciwciał - technika dot biot

W celu określenia miana otrzymanych przeciwciał IgY w technice dot blot na membranę nitrocelulozową naniesiono 50 ng koniugatu KLH-gp120(416-439)/dołek). Po zablokowaniu wolnych miejsc paski membrany inkubowano z roztworami specyficznego wobec epitopu gp120(416-439) przeciwciała IgY rozcieńczonego w zakresie od 1:500 do 1:50000. Po wypłukaniu pasków membrany buforem PBST detekcję związanych z antygenem specyficznych, przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY HR P stosując chemiluminescencyjny substrat. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD.

P r z y k ł a d 8.

Reaktywność krzyżowa przeciwciał anty-gp120(416-439) z białkiem gp120 - Western biot

Zdolność przeciwciał specyficznych wobec epitopu gp120(416-439) do rozpoznawania pełnołańcuchowego białka gp120 potwierdzono testem Western blotting. W tym celu natywne białko gp120 (100 ng/studzienkę) poddano rozdziałowi elektroforetycznemu (SDS-PAGE, 4%-12%) w warunkach redukujących. Następnie wykonano dektrotransfer białek na membranę nitrocelulozową i zablokowano wolne miejsca wiążące przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze PBS-T i inkubowano z roztworem przeciwciał IgY specyficznych wobec epitopu gp120(416-439) w rozcieńczeniu 1:100 (0,5% mleko odtłuszczone w PBS-T, pH 7,4). Jako kontrolę negatywną (1:100) zastosowano roztwór przeciwciał IgY wyizolowanych z nieimmunizowanych kur, natomiast jako kontrolę pozytywną użyto roztworu przeciwciał IgY (1:100) specyficznych wobec natywnego białka gp120. Detekcję kompleksów gp120-lgY wykonano z wykorzystaniem przeciwciał króliczego anty-lgY-HRP przy zastosowaniu chemiluminscencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD.

Claims (2)

1. Test diagnostyczny do detekcji białka gp120 wirusa HIV-1, znamienny tym, że jako czynnik, detekcyjny zawiera przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec epitopu białka gp120 (416-439) izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci koniugatu fragmentu epitopowego białka gp120(416-439) o sekwencji Cys-LPSRIKQIINMWQEVGKAMYAPPI z białkiem nośnikowym - albuminą wołową.

2. Test według zastrz. 1 , znamienny tym, że przeciwciała mają masę cząsteczkową od 175000 do 200000 daltonów.