PL217731B1

PL217731B1 - Sposób wykrywania genetycznie uwarunkowanej obniżonej odpowiedzi na chemioterapię cytostatykiem taksanowym, zastosowanie mutacji założycielskiej oraz zestawu do wykrywania takiej odpowiedzi

Info

Publication number: PL217731B1
Application number: PL379827A
Authority: PL
Inventors: Tomasz Byrski; Jacek Gronwald; Jan Lubiński; Tomasz Huzarski; Steven Narod
Original assignee: Tomasz Byrski; Jacek Gronwald; Tomasz Huzarski; Jan Lubiński; Steven Narod; Pomorska Akademia Medyczna
Priority date: 2006-06-01
Filing date: 2006-06-01
Publication date: 2014-08-29
Also published as: RU2008146886A; ZA200810173B; EP2032720B1; PL379827A1; EP2032720A2; AU2007268378A1; WO2007139411A3; CA2650448A1; US20080241834A1; WO2007139411A2

Description

Opis wynalazku

Przedmiotami wynalazku są sposób i zestaw do wykrywania genetycznie uwarunkowanej obniżonej odpowiedzi na taksany zastosowane w chemioterapii nowotworów, zwłaszcza raka piersi u kobiet poprzez identyfikację mutacji występujących w obrębie genu BRCA1. Ogólnie wynalazek dotyczy nowej metody diagnostycznej, która znajduje zastosowanie w optymalizacji skuteczności leczenia chemioterapeutycznego. Przedmioty wynalazku służą do syntezy DNA oraz identyfikacji zaburzeń w materiale genetycznym pacjenta, które są skorelowane z dziedziczną-obniżoną wrażliwością komórek nowotworowych na chemioterapię z zastosowaniem taksanów.

Mutacje genów BRCA1 (MIM# 113-705) i BRCA2 (MIM# 600185) odpowiadają za większość przypadków dziedzicznych predyspozycji do raka piersi i jajnika [Ford D. i wsp., Genetic heterogeneity and penetrance analysis of the BRCA1 and BRCA2 genes in breast cancer families, The Breast Cancer Linkage Consortium. Am J Human Genet 1998; 62: 676-89; Narod S.A. i wsp., An evaluation of genetic heterogeneity in 145 breast ovarian cancer families, The Breast Cancer Linkage Consortium. Am J Hum Genet 1995; 56; 254-64; Narod S.A. i wsp., Genetic heterogeneity of breast-ovarian cancer revisited. Am J Hum Genet 1995; 57: 957-8.].

Do chwili obecnej opisano ponad 1000 mutacji w obrębie tych genów [BIC database]. Większość z tych mutacji to zmiany wykrywane w pojedynczych rodzinach. Ponadto, istnieją przypadki mutacji powtarzalnych wykazujące efekt założyciela w obrębie tych genów, przykładami mogą być izolowane populacje Żydów Aszkenazyjskich [Tonin P. i wsp. Frequency of recurrent BRCA1 and BRCA2 mutations in Ashkenazi Jewish breast cancer families, Nat Medicine 1996; 2: 1179-1183; Neuhausen S. i wsp., Recurrent BRCA2 6174delT mutations in Ashkenazi Jewish women affected by breast cancer. Nat Genet 1996; 13: 126-8], Islandczykow [Johannesdottir G. i wsp., High prevalence of the 999del5 mutation in Icelandic breast and ovarian cancer patients. Cancer Res. 1996 56:3663-5], Finów [Huusko P. i wsp., Evidence of founder mutations in Finnish BRCA1 and BRCA2 families. Am J Hum Genet. 1998; 62:1544-8] jak również część populacji Holendrów [Peelen T. i wsp., A high proportion of novel mutations in BRCA1 with strong founder effects among Dutch and Belgian hereditary breast and ovarian cancer families. Am J Hum Genet. 1997 60: 1041-9; Petrij-Bosch A. i wsp., BRCA1 genomic deletions are major founder mutations in Dutch breast cancer patients. Nat Genet. 1997; 17:341-5] oraz Francuskich Kanadyjczyków [Tonin P.N. i wsp., Founder BRCA1 and BRCA2 mutations in French Canadian breast and ovarian cancer families. Am J Hum Genet. 1998; 63: 1341- 51.]. Przykładem populacji przejawiających powtarzalny charakter mutacji występujących w tych genach są także populacje Słowian, w tym Polaków.

Polskie zgłoszenie patentowe nr P. 335 917 sugeruje powtarzalny charakter mutacji genu BRCA1 obserwowanych w populacji polskiej, ujawniając listę ośmiu mutacji w obrębie genów BRCA1 i BRCA2 występujących wśród osób pochodzenia polskiego. Późniejsze polskie zgłoszenie patentowe nr P. 364 413 ujawnia, że co najmniej 80% przypadków genetycznie uwarunkowanych predyspozycji do raka piersi i/lub jajnika u kobiet pochodzenia polskiego związanych z występowaniem mutacji genu BRCA1 skorelowanych jest z występowaniem następujących mutacji: BRCA1 ex.20 5382 ins C, BRCA1 ex.5 300T—>G oraz BRCA1 ex. 11 4153 del A.

Podsumowując, można uznać, że dotychczasowy stan wiedzy o występowaniu mutacji genu BRCA1 pozwala uznać je za silnie skorelowane z występowaniem genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raków piersi/jajnika, przy czym można oczekiwać, że częstość występowania poszczególnych mutacji w różnych populacjach będzie różna. Taksoidy są związkami diterpenowymi stosowanymi w farmacji, głównie jako cytostatyki. Przykładami leków należących do rodziny taksaoidów są paklitaksel (Taxol) i docetaksel (Taxotere). Paklitaksel jest związkiem diterpenowym o bardzo skomplikowanej budowie posiadającym ponad 20 chiralnych atomów węgla. Paklitaksel został zidentyfikowany w 1960 roku w trakcie programu poszukiwania związków aktywnych pochodzenia roślinnego prowadzonego przez Narodowy Instytut Zdrowia USA obejmującego 35 tysięcy gatunków roślin, jako składnik ekstraktu z kory cisu Taxus brevifolia posiadający ciekawe działanie przeciwnowotworowe. W 1969 wyizolowano składnik aktywny ekstraktu, a w 1971 określono strukturę paklitakselu (Eric K. Rowinsky et al., J. National Can. Inst., 82, 11247 (1990)).

W odróżnieniu od innych związków takich jak kolchicyny i alkaloidy vinca, których działanie przeciwnowotworowe polega na depolimeryzacji mikrotubul, paklitaksel wykazuje odmienny mechanizm działania, tj. hamuje depolimeryzację mikrotubuli, powodując ich stabilizację, czego następstwem

PL 217 731 B1

US4857653, US4876399, US4942184, Dotychczasowe stosowanie taksanów jest zahamowanie reorganizacji sieci mikrotubuli (Schiff, P. B., J. Fant and S. B. Horwitz, Nature, 277,

665 (1979)).

Paklitaksel został dopuszczony do obrotu przez FDA jako lek przeciwnowotworowy w 1993 roku, ze wskazaniem do stosowania w chemioterapii raków jajnika, piersi, prostaty, płuc oraz białaczki i czerniaka, przy czym szczególnie skuteczny okazał się w leczeniu raków jajnika, piersi i płuc dając skuteczność 30%, 50% i 20% odpowiednio (David, G., et al., J. Nat. Prod., 53,(1990)).

Również docetaksel przyspiesza polimeryzację mikrotubuli i tworzenie nieprawidłowych konfiguracji podczas mitozy, hamując podział komórki (Katzung's Pharmacology, 9th Edition (2004)). Docetaksel został uznany za cytostatyk nowej generacji okazał się być szczególnie skuteczny w zwalczaniu raków płuc i piersi (Piccart, M. Anticancer Drugs. 1995 Suppl 4:7-11). Dotychczas opisano także wiele innych taksanów oraz ich pochodnych, a także sposobów ich otrzymywania, które mogą znaleźć zastosowanie w zwalczaniu nowotworów (np. WO94/14787, US6916942, US6750246, US6610860, US6476242, US6369244, US6353120, US6248908, US6017935, US5977386, US5902822,

US5840929, US5773464, US5773629, US4814470,

US4960790, US5278324, US5283253, US5352806).

w zwalczaniu nowotworów ujawniło szereg niepożądanych efektów ubocznych związanych z ich podawaniem. Należą do nich następujące mutacje: BRCA1 ex.20 5382 ins C, BRCA1 ex.5 300T —> G oraz BRCA1 ex.11 4153 del A do wykrywania genetycznie uwarunkowanej obniżonej podatności na przeciwnowotworową chemioterapię cytostatykiem taksanowym.

Korzystnie, zestaw zawiera oligonukleotydy wybrane spośród zestawów:

a) SEQ NR ID 9, SEQ NR ID 10, SEQ NR ID 15, SEQ NR ID 14, SEQ NR ID 1, SEQ NR ID 2;

b) SEQ NR ID 11, SEQ NR ID 12, SEQ NR ID 19, SEQ NR ID 16, SEQ NR ID 7, SEQ NR ID 4;

c) SEQ NR ID 9, SEQ NR ID 12, SEQ NR ID 15, SEQ NR ID 16, SEQ NR ID 3, SEQ NR ID 2. Jako „mutację w obrębie genu BRCA1” rozumie się dowolną mutację występującą w tym genie. Dane dotyczące pełnej sekwencji genu BRCA1, a także informacje o wszystkich wykrytych do tej pory mutacjach w jego obrębie zawarte są w bazie danych Breast Cancer Information Core (BIC) database. Baza ta jest dostępna w sieci internet pod adresem http://research.nhgri.nih.gov/bic/. Stosowany w niniejszym opisie system numerowania sekwencji genu BRCA1 oraz nazewnictwo dotyczące wybranych mutacji są zgodne z powszechnie przyjętą praktyką stosowaną w tym zakresie.

W sposobie według wynalazku cytostatyk taksanowy jest wybrany z grupy obejmującej: paklitaksel, docetaksel oraz ich znane pochodne i analogi. Zwalczany nowotwór jest wybrany z grupy obejmującej raki jajnika, piersi, prostaty, płuc oraz białaczkę i czerniaka, korzystnie jest rakiem piersi lub jajnika. Mutacja w obrębie genu BRCA1 jest znaną mutacją związaną z podwyższonym ryzykiem choroby nowotworowej. W przypadku, gdy pacjent jest osobą pochodzenia polskiego, z uwagi na obserwacje dotyczące mutacji występujących w tej populacji ujawnione w omówionych powyżej zgłoszeniach P. 335 917 oraz P. 364 413, mutacja wybrana jest z grupy obejmującej następujące mutacje genu BRCA1: 5382insC, C61G (300T—>G), 4153delA, 5370 C/T, 3819del5, 794delT, 185delAG, 2985del5, 5149del4, w szczególności mutacja wybrana jest z grupy obejmującej następujące mutacje: BRCA1 ex.20 5382 ins C, BRCA1 ex.5 300T—>G oraz BRCA1 ex. 11 4153 del A. W sposobie według wynalazku obecność mutacji bada się w DNA, RNA lub białku, przy czym korzystnie badanie DNA lub RNA wykonywane jest techniką wybraną spośród następujących metod pośredniego wykrywania mutacji: ASO PCR (ang. Allele specific - PCR), SSCP (ang. single-strand conformation polymorphism), neutropenia III i IV stopnia, wyłysienie, osłabienie, bóle mięśni i stawów, reakcje skórne, anemia, zespół retencji płynów III i IV stopnia, a nawet uszkodzenie wątroby i kardiotoksyczność. Zauważono także, że skuteczność terapeutyczna cytostatyków jest różna u różnych pacjentów leczonych z powodu nowotworów.

W świetle zaprezentowanego stanu techniki obiektywnym problemem jest brak metody umożliwiającej przewidywanie skuteczności przeciwnowotworowego działania taksanów, w szczególności raka piersi lub jajnika, u pacjentów poddawanych chemioterapii, która to metoda pozwoliłaby na indywidualny dobór odpowiedniego cytostatyku i zwiększenie efektywności chemioterapii.

W związku z powyższym, celem wynalazku jest dostarczenie sposobu i zestawu do wykrywania genetycznie uwarunkowanej obniżonej podatności na taksany w chemioterapii nowotworów, zwłaszcza raka piersi u kobiet, przy czym pożądany test powinien być stosunkowo łatwy w wykonaniu.

Nieoczekiwanie, tak określony problem został rozwiązany w niniejszym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania genetycznie uwarunkowanej obniżonej podatności na przeciwnowotworową chemioterapię cytostatykiem taksanowym, w którym w próbce materia4

PL 217 731 B1 łu genetycznego pobranej od pacjenta określa się obecność mutacji założycielskich w obrębie genu

BRCA1, przy czym obecność rzeczonej mutacji wskazuje na obniżoną podatność na przeciwnowotworową chemioterapię cytostatykiem taksanowym, przy czym, korzystnie w przypadku pacjenta pochodzenia polskiego mutacja wybrana jest z grupy obejmującej mutacje genu BRCA1: 5382insC, C61G (300T—>G), 4153delA, 5370 C/T, 3819del5, 794delT, 185delAG, 2985del5, 5149del4.

Korzystnie, cytostatyk taksanowy jest wybrany z grupy obejmującej: paklitaksel, docetaksel.

Korzystnie, zwalczany nowotwór jest wybrany z grupy obejmującej raki jajnika, piersi, prostaty, płuc oraz białaczkę i czerniaka, korzystnie jest rakiem piersi lub jajnika.

Korzystnie, mutacja wybrana jest z grupy obejmującej następujące mutacje: BRCA1 ex.20 5382 ins C, BRCA1 ex.5 300T—>G oraz BRCA1 ex.11 4153 del A.

Korzystnie, obecność mutacji określa się w DNA, RNA lub białku, przy czym korzystnie badanie DNA lub RNA wykonywane jest techniką wybraną spośród następujących metod pośredniego wykrywania mutacji: ASO PCR (ang. Allele specific - PCR), SSCP (ang. single-strand conformation polymorphism), ASA (ang. allele specific analysis), RFLP-PCR (ang. restriction fragment length polymorphism - polymerase chain reaction), lub bezpośredniego wykrywania mutacji jak sekwencjonowanie.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie mutacji założycielskiej w obrębie genu BRCA1 albo polinukleotydu zawierającego tą mutację albo polipeptydu kodowanego przez allel genu BRCA1 zawierający tą mutację do wykrywania in vitro obniżonej podatności pacjenta na przeciwnowotworową chemioterapię cytostatykiem taksanowym, przy czym, korzystnie w przypadku pacjenta pochodzenia polskiego mutacja wybrana jest z grupy obejmującej następujące mutacje genu BRCA1: 5382insC, C61G (300T—>G), 4153delA, 5370 C/T, 3819del5, 794delT, 185delAG, 2985del5, 5149del4.

Korzystnie, cytostatyk taksanowy jest wybrany z grupy obejmującej: paklitaksel, docetaksel oraz ich znane pochodne i analogi.

Korzystnie, zwalczany nowotwór jest wybrany z grupy obejmującej raki jajnika, piersi, prostaty, płuc oraz białaczkę i czerniaka, korzystnie jest rakiem piersi lub jajnika. Korzystnie, mutacja wybrana jest z grupy obejmującej następujące mutacje: BRCA1 ex.20 5382 ins C, BRCA1 ex.5 300T—>G oraz BRCA1 ex.11 4153 del A.

Korzystnie, rzeczony polinukleotyd zawiera sekwencję genu BRCA1 lub jego fragmentu obejmującego wykrywaną mutację.

Korzystnie, obecność mutacji określa się w DNA, RNA lub białku, przy czym korzystnie badanie DNA lub RNA wykonywane jest techniką wybraną spośród następujących metod pośredniego wykrywania mutacji: ASO PCR (ang. Allele specific - PCR), SSCP (ang. single-strand conformation polymorphism), ASA (ang. allele specific analysis), RFLP-PCR (ang. restriction fragment length polymorphism - polymerase chain reaction), Iub bezpośredniego wykrywania mutacji jak sekwencjonowanie.

Korzystnie, obecność polipeptydu kodowanego przez allel genu BRCA1 zawierający mutację określa się za pomocą przeciwciała lub innej substancji specyficznej wobec tego polipeptydu lub jego fragmentu.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie zestawu zawierającego przynajmniej dwa oligonukleotydy do amplifikacji regionu zawierającego mutację założycielską w obrębie genu BRCA1, przy czym, korzystnie w przypadku pacjenta pochodzenia polskiego amplifikowany region zawiera mutację wybraną z grupy obejmującej następujące mutacje genu BRCA1: 5382insC, C61G (300T—>G), 4153delA, 5370 C/T, 3819del5, 794delT, 185delAG, 2985del5, 5149del4, korzystnie mutację wybraną z grupy obejmującej ASA (ang. allele specific analysis), RFLP-PCR (ang. restriction fragment length polymorphism polymerase chain reaction), lub bezpośredniego wykrywania mutacji jak sekwencjonowanie.

Kolejno wynalazek dotyczy zastosowania mutacji w obrębie genu BRCA1 albo polinukleotydu zawierającego tą mutację albo polipeptydu kodowanego przez allel genu BRCA1 zawierający tą mutację do wykrywania obniżonej podatności pacjenta na przeciwnowotworową chemioterapię cytostatykiem taksanowym. Cytostatyk taksanowy jest wybrany z grupy obejmującej: paklitaksel, docetaksel oraz ich znane pochodne i analogi, a zwalczany nowotwór jest wybrany z grupy obejmującej raki jajnika, piersi, prostaty, płuc oraz białaczkę i czerniaka, korzystnie jest rakiem piersi lub jajnika. Mutacja w obrębie genu BRCA1 jest znaną mutacją związaną z podwyższonym ryzykiem choroby nowotworowej. W szczególnej realizacji tego aspektu wynalazku pacjent jest osobą pochodzenia polskiego, a mutacja wybrana jest z grupy obejmującej następujące mutacje genu BRCA1: 5382insC, C61G (300T—>G), 4153delA, 5370 C/T, 3819del5, 794delT, 185delAG, 2985del5, 5149del4, szczególnie korzystnie mutacja wybrana jest z grupy obejmującej następujące mutacje: BRCA1 ex.20 5382 ins C, BRCA1 ex.5 300T—>G oraz BRCA1 ex.11 4153 del A. Rzeczony polinukleotyd zawiera sekwencję

PL 217 731 B1 genu BRCA1 lub jego fragmentu obejmującego wykrywaną mutację. Obecność mutacji bada się w DNA, RNA lub białku, przy czym korzystnie badanie DNA lub RNA wykonywane jest techniką wybraną spośród następujących metod pośredniego wykrywania mutacji: ASO PCR (ang. Allele specific PCR), SSCP (ang. single-strand conformation polymorphism), ASA (ang. allele specific analysis), RFLP-PCR (ang. restriction fragment length polymorphism - polymerase chain reaction), lub bezpośredniego wykrywania mutacji jak sekwencjonowanie, przy czym korzystnie obecność polipeptydu kodowanego przez allel genu BRCA1 zawierający mutację ustala się za pomocą przeciwciała lub innej substancji specyficznej wobec tego polipeptydu lub jego fragmentu.

Kolejno ujawniono zestaw do wykrywania genetycznie uwarunkowanej obniżonej podatności na przeciwnowotworową chemioterapię cytostatykiem taksanowym, charakteryzujący się tym, że zawiera przynajmniej dwa różne oligonukleotydy pozwalające na amplifikację regionu zawierającego mutację w obrębie genu BRCA1. Amplifikowany region zawiera znaną mutację w obrębie genu BRCA1 związaną z podwyższonym ryzykiem choroby nowotworowej. W korzystnej realizacji zestawu, zwłaszcza gdy jest on przeznaczony do stosowania wobec pacjentów pochodzenia polskiego, amplifikowany region zawiera mutację wybraną z grupy obejmującej następujące mutacje genu BRCA1: 5382insC, C61G (300T—>G), 4153delA, 5370 C/T, 3819del5, 794delT, 185delAG, 2985del5, 5149del4, korzystnie mutację wybraną z grupy obejmującej następujące mutacje: BRCA1 ex.20 5382 ins C, BRCA1 ex.5 300T—>G oraz BRCA1 ex.11 4153 del A. Przykładowe zestawy primerów, które mogą być wykorzystane do przygotowania zestawu zostały przedstawione w tabeli 2.

W celu lepszego zaprezentowania istoty wynalazku została ona zilustrowana poniżej opisanymi przykładami. Nie należy jednak ograniczać zakresu wynalazku do tych przykładów.

P r z y k ł a d. Obniżona podatność na przedoperacyjne leczenie taksanami u pacjentek z rakiem piersi będących jednocześnie nosicielkami mutacji w genie BRCA1.

Dotychczas nie przeprowadzono badań nad skutecznością różnych rodzajów chemioterapii u kobiet z rakiem piersi, które są nosicielkami mutacji genu BRCA1. Dokonano próby porównania odpowiedzi na neoadjuwantową chemioterapię u nosicielek mutacji BRCA1 i w grupie kontrolnej pacjentek nie będących nosicielkami mutacji.

Spośród 3479 pacjentek, zidentyfikowano 44 chore nosicielki mutacji BRCA1, które wymagały leczenia neoadjuwantową chemioterapią. U wszystkich pacjentek rak piersi wystąpił poniżej 51 roku życia. Do tych przypadków dobrano odpowiednią grupę kontrolną.

z 44 nosicielek (71%) wykazało częściową lub całkowitą odpowiedź na neoadjuwantową chemioterapię, dla porównania - w grupie 41 pacjentek nie będących nosicielkami mutacji 39 wykazało reakcję na chemioterapię (95%; p= 0.004). Odpowiedź na leczenie różniła się zasadniczo w podgrupie pacjentek BRCA1, w zależności od tego, czy był zastosowany docetaksel. Spośród 15 kobiet nosicielek mutacji BRCA1 otrzymujących docetaksel, jedynie sześć wykazało odpowiedź, w porównaniu z 29 z 29, które poddano innym (uszkadzającym DNA) terapiom (p = 0.001). W grupie pacjentek nie będących nosicielkami mutacji (grupa kontrolna), odpowiedzi na wspomniane typy chemioterapii kształtowały się na podobnym poziomie.

Z opisanych powyżej badań wynika, że rak piersi u nosicielek mutacji BRCA1 nie wykazuje oczekiwanego poziomu odpowiedzi na chemioterapię opartą na zastosowaniu taksanów. Prawdopodobnie, do uzyskania odpowiedzi klinicznej na związki zakłócające funkcjonowanie wrzeciona mitotyczego, wymagana jest obecność prawidłowego (niezmutowanego) BRCA1.

Jednym z kluczowych elementów leczenia dziedzicznego raka piersi jest dobór odpowiedniej chemioterapii. Nowotwory związane z mutacjami genu BRCA1 różnią się od niedziedzicznych nowotworów pod wieloma względami, włączając wielkość guza, obraz histologiczny i obecność dodatkowych somatycznych mutacji genetycznych (1-4). Należy, zatem wnioskować, że przebieg choroby i odpowiedź na leczenie mogą również różnić się między podgrupą pacjentów z nowotworami dziedzicznymi a podgrupą z nowotworami powstającymi spontanicznie. Biorąc pod uwagę brak dobieranych losowo prób klinicznych w tak wybranej populacji pacjentów, przeprowadzono badanie mające na celu ocenę względnych korzyści płynących z zastosowania odmiennych typów chemioterapii. Badania nad wrażliwością przeprowadzone na liniach komórkowych i na modelach zwierzęcych pozwoliły na określenie poziomu odpowiedzi na różne czynniki (5-7). Podejście uzupełniające obejmuje ocenę odpowiedzi klinicznej na chemioterapię neoadjuwantową. Inaczej, niż w przypadku chemioterapii zastosowanej po operacji, rezultat zastosowania chemioterapii neoadjuwantowej może zostać szybko oszacowany przed i po leczeniu poprzez ocenę wielkości nowotworu i stanu węzłów chłonnych. Możliwe jest porównanie różnych rodzajów leczenia. Mimo, że odpowiedź nie zawsze definitywnie wskazu6

PL 217 731 B1 je na ostateczny wynik leczenia pacjenta, to uzyskanie pełnej odpowiedzi jest często skorelowane z przeżywalnością (8). W związku z powyższym, porównano odpowiedzi uzyskane dla różnych rodzajów chemioterapii neoadjuwantowej w grupie nosicielek mutacji BRCA1 i dla podobnej liczby w grupie nienosicielek (kontrolna). W 1996 r. zgłaszający rozpoczęli narodową akcję w Polsce, mającą na celu dokonanie szerokiej oceny istotnych patologicznych i klinicznych cech dziedzicznego raka piersi (9). Projekt badań oparty był na analizie dużej ilości nieselekcjonowanych przypadków rozpoznanych raków piersi na terenie Polski. Pacjenci pochodzili z wielu ośrodków onkologicznych, rozmieszczonych na terenie całego kraju.

W Polsce obserwowane są trzy mutacje założycielskie BRCA1 (5328insC, C61G i 4153delA), które stanowią większość mutacji genu BRCA1 występujących w polskich rodzinach (10, 11). Badani pacjenci oceniani byli pod kątem obecności trzech mutacji założycielskich BRCA1. Przypadki dziedziczne i niedziedziczne mogły być zatem bezpośrednio porównane pod kątem różnych cech, włączając odpowiedź na leczenie. Preparaty histopatologiczne były oceniane centralnie przez patologów, którzy nie znali statusu mutacji.

W trakcie badań zidentyfikowano 4316 przypadków inwazyjnego raka piersi, pochodzących z 18 różnych ośrodków. Z tego 3484 kobiet wyraziło zgodę na uczestnictwo w badaniach (80.7%). Pięciu pacjentów wycofało swoje uczestnictwo w późniejszym terminie. Próbki krwi uzyskano od 3479 pacjentów. Historie choroby i stan pacjentek oceniane były przez lekarzy miejscowych, biorących udział w badaniu, a odpowiednie informacje były przekazywane do centrum badań w Szczecinie. Odnotowano informacje na temat wieku zachorowania oraz stanu węzłów chłonnych, ekspresji receptorów estrogenowych, wieloogniskowości i obustronności.

Analiza histopatologiczna

Preparaty histopatologiczne oraz bloczki parafinowe z guza uzyskano z odpowiednich ośrodków leczniczych. Otrzymano co najmniej jeden preparat od każdego z 3136 z grupy 3472 pacjentów. Główne badanie histopatologiczne przeprowadziło dwóch histopatologów z ośrodka w Szczecinie. Histopatolodzy nie posiadali wiedzy dotyczącej statusu mutacji w poszczególnych przypadkach.

W każdym przypadku postawiono rozpoznanie histopatologiczne (typ przewodowy, zrazikowy, rdzeniasty, cewkowo-zrazikowy, inny).

Analiza mutacji

W Polsce przeważają trzy mutacje założycielskie w BRCA1. Dla dwóch z nich wykonano analizę mutacji (4153delA i 5328insC) stosując technikę reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), przy czym startery do reakcji zostały zaprojektowane w sposób umożliwiający jednoczesne wykrywanie obecności obu typów mutacji. Trzecia mutacja (C61G) powoduje powstanie nowego miejsca cięcia dla enzymu restrykcyjnego w eksonie 5. Badającym udało się skutecznie ustalić genotyp 3472 przypadków z 3479 pacjentów (99.8%).

Przykładowe pary starterów służące do wykrywania obecność mutacji BRCA1 ex.20 5382 ins C, BRCA1 ex.5 300T—>G oraz BRCA1 ex.11 4153 delA przedstawiono w Tabeli 1.

PL 217 731 B1

Para starterów para 1 dla BRCA1 ex.2O 5382 ins C para 2 dla BRCA1 ex.2O 5382 ins C para 3 dla BRCA1 ex.2O 5382 ins C para 4 dla BRCA1 ex.2O 5382 ins C para 1 dla BRCA1 ex.5 300T—*G para 2 dla BRCA1 ex.5 300T-+G para 1 dla BRCA1 ex.ll 4153 delA para 2 dla BRCA1 ex.ll

4153 delA para 3 dla BRCA1 ex.lł

4154 delA para 4 dla BRCA1 ex.ll 4153 delA

Nazwa starerów Funkcja starter dla nici sensownej starter dla nici

[F| 5' ->3' antysensownej fR] 5'->3'

B1-5382INSCI1 Identyfikacja CAC TTCCATTGAAGG TAC CTT TCT GTC CTG AAG CTT C GGG AT

B1-5382INSCI2 Identyfikacja TGA CGT GTC TGC TCC ACC TTT CTG TCC TGG ACT TC GGA TT

B1-5382INSCK1 Kontrola CAC TTC CAT TGA AGG CAA AGG GGA GTG GAA

AAG CTT C TAC AG

Bł-5382INSCK2Kontrola ATA TGA CGT GTC TGC CAA AGG GGA GTG GAA TCC AC TAC AG

Β1ΕΧ5ΙΚ1 Identyfikacja/CTC TTA AGG GCA GTT kontrola GTG AG

Β1ΕΧ5ΙΚ2 Identyfikacja/ATG GCT CTT AAG GGC

Kontrola AGT TG

Bl_4154DELAI Identyfikacja CAA AGG CAT CTC AGG 1 AAC ATC

B14154DELAI Identyfikacja TTG GCT CAG GGT TAC 2 CGA AG

Bl_4154DELAKKontrola

B 1_4154DELAKKontrola 2

TTG GCT CAG GGT TAC CGA AG

TCC TAG CCC TTT CAC CCA TAC A

TTC CTA CTG TGG TTG CTT CC

TGT GGT TGC TTC CAA CCT AG

CAA GCC CGT TCC TCT TTC TCA

AAG CCC GTT CCT CTT TGT CA

GTG CTC CCC AAA AGC ATA AAC

Wykrywanie mutacji można prowadzić oddzielnie dla każdej mutacji lub łącznie. W przypadku osobnego wykrywania mutacji zestaw starterów obejmuje parę identyfikującą i parę kontrolną dla badanej mutacji.

Korzystne jest prowadzenie testu w postaci jednej reakcji PCR. Przykładowe zestawy starterów dla takiego multiplex-PCR wymieniono w Tabeli 2.

zestaw⁷ startery

B1EX5IK1F, _B1EX5IK1R, Bi J1154DELAI2F, B1_4154DELAI1R,

B1-5382INSCI1F, B1-5382INSCI1R

B1EX5IK2F, B1EX5IK2R, B14154DELAK2F, B1_4154DELAI2R,

B1-5382INSCK2F, B1-5382INSCI2R

B1EX5IK1F, B1EX51K2R, B1_4154DELAI2F, B1„4I54DELAI2R,

B1-5382INSCI2F, B1-5382INSCI1R

W niektórych przypadkach, w celu uzyskania optymalnej, porównywalnej ilości produktów amplifikacji należy zoptymalizować proporcje ilościowe stosowanych starterów. Zależą one od wielu czynni8

PL 217 731 B1 ków, m.in. takich jak rodzaj i aktywność zastosowanej polimerazy, długość i skład nukleotydowy produktów amplifikowanych. W oparciu o powszechnie dostępną wiedzę laboratoryjną specjalista będzie w stanie każdorazowo zoptymalizować proporcje starterów.

Korzystnie, aby w skład zestawu diagnostycznego weszły również pozostałe składniki mieszaniny dla reakcji PCR (nukleotydy, termostabilna polimeraza, bufor reakcyjny optymalny dla stosowanej polimerazy).

Izolację DNA z leukocytów krwi obwodowej prowadzono techniką opisaną powyżej. Uzyskane DNA wykorzystywano jako matrycę w testowej reakcji PCR.

Przykładowy test diagnostyczny na obecność charakterystycznych dla populacji polskiej mutacji genu BRCA1 opiera się na zastosowaniu multipleksowej reakcji ASO PCR (dla mutacji 4153delA i 5382insC) w połączeniu z techniką RFLP (dla mutacji C61G).

Mieszanina reakcyjna opisywanego testu diagnostycznego zawiera mieszaninę starterów będących syntetycznymi fragmentami genu BRCA1 umożliwiającymi:

1. Amplifikacje fragmentu eksonu 5 zawierającego w sobie miejsce występowania mutacji C61G. Powyższy produkt PCR powstaje w każdym przypadku prawidłowo przeprowadzonej reakcji PCR stanowiąc wewnętrzną kontrolę. W celu wykrycia mutacji C61G uzyskany produkt dla eksonu 5 poddaje się trawieniu enzymem restrykcyjnym AvaII. Przecięcie produktu na dwa krótsze fragmenty następuje jedynie w przypadku obecności mutacji C61G.

2. Amplifikacje fragmentu ekson 11 jedynie w przypadku obecności w badanym DNA mutacji 4153delA.

3. Amplifikacje fragmentu ekson 20 jedynie w przypadku obecności w badanym DNA mutacji 5382insC.

Długość produktów reakcji multiplex PCR dla eksonów 5,11,20 genu BRCA1 została dobrana w sposób umożliwiający łatwy rozdział techniką elektroforezy na żelu agarozowym.

Reakcję ASO PCR przeprowadzano w automatycznym termocyklerze (DNA ThermalCycler 9600 Perkin Elmer). Mieszanina reakcyjna o objętości 25 μΐ zawierała: 1 μΐ (50ng-200ng) genomowego DNA, 2.5 μΐ buforu reakcyjnego (100mM Tris-HCl, 500mM KCL, 15mM MgCl2, 1 mg/ml żelatyny; pH 8.6), 2-14 pM każdego ze starterów 200 μΜ każdego z deoksynukleotydów (dATP, dCTP, dGTP i dTTP) oraz 1 U Taq polimerazy DNA. W każdej reakcji stosowano 3 kontrole dodatnie (kontrole z DNA od nosicieli mutacji gen BRCA1-5382insC, 300T/G i 4153 del A) oraz 2 kontrole ujemne (kontrola z DNA od pacjenta bez mutacji genu BRCA1 oraz kontrola, która nie zawierała DNA).

Amplifikację przeprowadzano w następujących warunkach:

a) wstępna denaturacja - 95°C 5 minut

b) wstępnych 10 cykli składających się z: denaturacji - 94°C 30 sekund przyłączania starterów - 68 do 58°C 30 sekund* wydłużania komplementarnego DNA - 72°C 35 sekund

c) kolejnych 30 cykli, każdy składający się z: denaturacji - 94°C 30 sekund przyłączania starterów - 57°C 30 sekund wydłużania komplementarnego DNA - 72°C 30 sekund * - podczas pierwszych 10 cykli temperatura przyłączania starterów była obniżana o 1,2°C w każdym kolejnym cyklu (w pierwszym cyklu wynosiła 68°C, w drugim 66,8°C, w trzecim 65,6°C, w czwartym 64,4°C, w piątym 63,2°C, w szóstym 62°C, siódmym 60,8°C, w ósmym 59,6°C, w dziewiątym 58,4°C, w dziesiątym 57,2°C,)

Produkty reakcji PCR w ilości 5 μl mieszano z 10 μl buforu „Stop” (roztwór sacharozy zabarwiony barwnikiem bromophenol blue) i poddawano elektroforezie w żelu agarozowym (1.5% agaroza (SeaKem FMC), IX bufor TBE, 25 μg/ml bromku etydyny) w warunkach 6V/cm przez 30 min. Rozdzielone produkty uwidaczniano w świetle UV.

Badania kliniczne

Informacje na temat odpowiedzi na chemioterapię neoadjuwantową uzyskano na podstawie przeglądu historii chorób. Uzyskano historie chorób pacjentek dla przypadków BRCA1-pozytywnych i odpowiednio dobranych dla nich przypadków kontrolnych bez mutacji, które poddane były chemioterapii neoadjuwantowej. Zwrócono szczególną uwagę na wielkość nowotworu, przed i po zastosowaniu chemioterapii neoadjuwantowej, oraz na stan węzłów chłonnych. Przed leczeniem wielkość nowotwoPL 217 731 B1 ru określana była z uwzględnieniem wyników badania klinicznego, ultrasonografii i mammografii. Po leczeniu wielkość oceniano jedynie na podstawie raportu patologicznego.

Stan węzłów chłonnych oceniano przed i po leczeniu. Przed rozpoczęciem leczenia stan węzłów chłonnych oceniano na podstawie badania klinicznego, ultrasonografii i biopsji aspiracyjnej cienkoigłowej (BAC). Stan węzłów chłonnych po leczeniu oceniany był na podstawie badania histopatologicznego (po usunięciu pachowych węzłów chłonnych).

Każdy badany przypadek klasyfikowano na podstawie odpowiedzi: - całkowita remisja (zanik nowotworu po leczeniu, miejscowo lub w pachowych węzłach chłonnych); częściowa remisja (wielkość nowotworu mniejsza niż wyjściowo) i brak odpowiedzi (wielkość nowotworu po leczeniu taka sama lub większa niż wielkość początkowa). U żadnej z pacjentek, u której wykazano całkowitą remisję nie stwierdzono w badaniu histopatologicznym obecności komórek nowotworowych w obrębie usuniętej tkanki gruczołowej (całkowita remisja histopatologicznie).

Pacjentów podzielono w zależności od zastosowanego rodzaju leczenia, opisanego w karcie. Stan zdrowia oceniano na podstawie historii choroby i wywiadu telefonicznego z pacjentką lub jej najbliższą rodziną.

Analiza statystyczna

Do każdego z 44 BRCAl-pozytywnych przypadków dobrano przypadek kontrolny, z rakiem piersi i nie posiadający mutacji. Pacjentki z grupy kontrolnej (nie posiadające mutacji) także poddane były chemioterapii neoadjuwantowej. Pary - nosicielka mutacji i nienosicielka dobierane były na podstawie ośrodka, czasu diagnozy (w ciągu jednego roku) i roku urodzenia (w tym samym roku). Stosując taki dobór zdołano znaleźć parę dla każdego z 44 BRCA1-pozytywnych przypadków. Jednakże, uzyskano informacje o danych klinicznych tylko dla 41 z 44 wybranych kontroli. Znaczenie statystyczne różnic między grupami oszacowywano stosując test Fisher'a.

Wyniki

Stwierdzono, że spośród przebadanych 3472 pacjentek z wcześnie rozpoznanym rakiem piersi, 198 jest nosicielkami mutacji w genie BRCA1 (5.7%) i 820 kobiet było poddanych chemioterapii neoadjuwantowej (23.6%). Leczeniu z wykorzystaniem chemioterapii neoadjuwantowej poddano 29.8% spośród nosicielek mutacji BRCA1, w przypadku pacjentek bez mutacji - 23.2%. Do każdej pacjentki z mutacją BRCA1 i poddanej chemioterapii neoadjuwantowej dobrano odpowiednią z grupy kontrolnej. Pacjentki z grupy kontrolnej sparowane były co do wieku i ośrodka. W tabeli 1 zamieszczono porównanie wyników dla przypadków nosicielek i grupy kontrolnej. Przypadki i kontrole były zbliżone pod względem wieku oraz wielkości guza i wystąpienia przerzutów do pachowych węzłów chłonnych.

Pełną odpowiedź uzyskano jedynie dla 9.1% nosicielek mutacji i 4.9% nienosicielek (p=0.7) (tabela 2). Dużo częściej odnotowywano odpowiedzi częściowe. W sumie, 31 z 44 nosicielek BRCA1 wykazało pełną lub częściową odpowiedź (70.5%), w porównaniu z 39 z 41 nienosicielek (95%; p=0.004). Różnica w ilości przypadków nie wykazujących odpowiedzi, między grupą nosicielek a nienosicielek, odnotowana została jedynie wśród osób poddanych terapii opartej na taksanach. Dziewięć z 15 nosicielek BRCA1, które otrzymywały taksany nie wykazało odpowiedzi, dla porównania - nie stwierdzono tego dla żadnej z 12 nienosicielek (p=0.001). Natomiast, u wszystkich 29 nosicielek mutacji poddawanych chemioterapii innym schematem leczenia (bez taksonów) wykazano częściową lub całkowitą odpowiedź, w porównaniu z 27 przypadkami z 29 kontroli. Zatem, obniżenie poziomu odpowiedzi na chemioterapię neoadjuwantową u nosicielek BRCA1 ograniczała się tylko do podgrupy kobiet leczonych taksanami. Trzy z dziewięciu nosicielek BRCA1 otrzymujących taksany zmarło, w porównaniu z dwiema osobami spośród 35 nosicielek poddanych innemu schematowi leczenia. Spośród nienosicielek przypadki śmiertelne występowały na podobnym poziomie wśród tych, u których zastosowano taksany (2 z 12), jak i stosujących inne schematy leczenia (5 z 25).

Podsumowanie

Zaobserwowano, że w przypadku kobiet z mutacją BRCA1, które otrzymały docetaksel w połączeniu z doksorubicyną, jako chemioterapię neoadjuwantową w leczeniu raka piersi, uzyskano średnio, dużo słabszą odpowiedź, niż u kobiet bez stwierdzonej mutacji. Inne wyniki uzyskano w przypadku, gdy nosicielki BRCA1 były poddawane jedynie chemioterapii uszkadzającej DNA, w tym wypadku odpowiedź była taka sama, a nawet czasami lepsza, niż u osób nie będących nosicielkami.

Przeprowadzone badania wykazały jasno przeciwwskazanie do stosowania taksanów w neoadjuwantowej chemioterapii raka piersi u nosicielek mutacji BRCA1. W USA, a także w wielu innych krajach, w tym w Polsce, taksany znalazły m.in. zastosowanie w chemioterapii neoadjuwantowej oraz w drugim rzucie leczenia raka piersi. Istotne jest, aby w kolejnych badaniach, oceniających

PL 217 731 B1 korzyści zastosowania taksanów, wzięto pod uwagę czy podgrupa nosicielek mutacji BRCA1 może wykazywać idiosynchratyczną odpowiedź.

T a b e l a 3

Charakterystyka raków piersi u nosicielek mutacji BRCA1 i dobranych odpowiednio kontroli

	Nosicielki BRCA1	Brak	mutacji
(nienosicielki)
	N=44	N=41

Średni wiek	42.3 lata		42.0 lata
Grupa wiekowa
20-30	3	6.8%		1	2.4%
31-40	10	22.7%		14	34.2%
41-50	31	70.5%		26	63.4%
Histologia raka
Przewodowy		24	54.5%		21	51.2%
Zrazikowy		1	2.3%		6	14.6%
Rdzeniasty		4	9.1%		0	0
Inny		15	34.1%		14	34.2%
Receptory estrogenowe
Obecne		1	2.3%		13	31.7%
Nieobecne		33	75%		16	39%
Brak danych		10	22.7%		12	29.3%
Wieloogniskowość raka
Jednoogniskowy		23	52.3%		21	51.2%
Wieioogniskowy		6	13.6%		9	21.9%
Brak danych		15	34.1%		11	26.9%
Wielkość guza (cm)
<lcm	0	0%		0	0%
l-2cm	4	9,1%		4	9.8%
2-5cm	30	68.2%		26	63.4%
>5cm	9	20.5%		11	26.8%
Brak	1	2.2%		0	0
Stan węzłów
Negatywny	12	27.3%		11	26.8%
Pozytywny	32	72.3%		29	70.7%
Brak 0	0		1	2.5%

Występowanie raka piersi/jajnika wśród krewnych

Nie stwierdzono	4	9,1%	9	22%
Stwierdzono	37	84,1%	17	41.5%
Brak danych	3	6.8%	15	36.5%

PL 217 731 B1

T a b e l a 4

Charakterystyka pacjentek z rozpoznanym rakiem piersi i leczonych neoadjuwantową chemioterapią

1	2	3	4	5	6	7	Receptory	8	Odpowiedź na chemioterapię	Vital status
ER (IHC)	PgR (IHC)	HER2 (IHC)	CR	PR	BO
1	46	2003	5382insC	CMF	10.0	1.5	bd	bd	bd	+/-		4		D
2	35	2002	C61G	CMF	4.5	3.0	ujemny	ujemny	444	+/+		4		A
3	47	2003	5382insC	CMF	4.0	2.0	ujemny	ujemny	ujemny	+/+		4		A
4	41	2000	5382insC	CMF	18,	5.0	ujemny	ujemny	bd	4/-		4		A
5	48	1998	5382insC	CMFP	4.0	2.0	ujemny	ujemny	negative	4-/4		4		A
6	47	1998	5382insC	CMF	3.5	1.0	ujemny	ujemny	44	+/-		4		A
7	47	2001	5382insC	CMFP	3.0	0.5	ujemny	ujemny	ujemny	+/-		4		A
8	48	2002	C61G	CMFP	2.5	0.5	ujemny	ujemny	ujemny	4/4		4		A
9	35	2002	C61G	AC	6.0	2.0	ujemny	ujemny	ujemny	+/+		4		A
10	45	2001	5382insC	AC	2.0	1.4	ujemny	ujemny	ujemny	+/-		4		A
11	46	1999	5382insC	AC	3.5	1.0	ujemny	bd	bd			4		A
12	45	2001	5382insC	AC	4.0	1.3	ujemny	ujemny	ujemny	4/4		4		A
13	44	2002	C61G	AC	3.4	1.0	ujemny	4	ujemny	-/-		4		A
14	30	2002	5382śnsC	AC	2.5	brak guza	ujemny	ujemny	44	+/-	4			A
15	46	2002	5382tnsC	FAC	2.5	1.0	ujemny	ujemny	negative	+/-		4		A
16	40	2003	5382insC	FAC	4,5	1,5	ujemny	ujemny	bd	+/-		4		A
17	43	2003	5382insC	FAC	5.0	3.0	ujemny	ujemny	negative			4		D
18	39	1996	CÓ1G	FAC	4.5	2.2	ujemny	ujemny	44-	-/*		4		A
19	38	2002	5382insC	FAC	3,0	1.0	ujemny	ujemny	neeatiec			4		A
20	33	2003	5382insC	FAC	2.5	1.5	ujemny	ujemny	44			4		A
21	44	2000	5382insC	FAC	3.0	1.5	ujemny	ujemny	bd			4		A
22	41	1997	5382insC	FAC	.15.0	7.0	bd	bd	bd	+/+		4		A
23	43	2002	5382insC	FAC	3.5	2.5	ujemny	ujemny	ujemny			4		A
24	50	2003	C61G	FAC	6.0	3.5	ujemny	ujemny	4™b			4		A
25	43	2004	5382insC	FAC	7,0	brak guza	ujemny	ujemny	ujemny	+/-	4			A
26	45	2004	5382insC	FAC	5.0	brak guza	ujemny	4	ujemny	4/-	₊			A
27	39	2004	5382 insC	FAC	5.0	brak guza	ujemny	ujemny	bd	+/-	4			A
28	31	2004	C61G	AT	8.0	8.0	bd	bd	bd	4/4			4	D
29	30	2001	5382itisC	AT	4.5	5.0	ujemny	4	bd	+/+			4	A
30	44	2002	5382insC	AT	1.8	1.8	ujemny	ujemny	bd	+/+			4	A
31	48	2002	C61G	AT	3.5	3.5	ujemny	ujemny	ujemny	4/4			4	A
32	46	2002	5382insc	AT	3.5	3.5	44	ujemny	ujemny				4	A
33	43	2003	5382inse	AT	4.0	4.0	ujemny	ujemny	ujemny				4	A
34	43	2003	5382insC	AT	4.5	4.5	ujemny	ujemny	ujemny	+/+			4	A
35	49	2003	4153deIA	AT	2.5	2.5	ujemny	ujemny	ujemny	+/+			4	D
36	43	2003	C61G	AT	6.5	13.0	ujemny	ujemny	ujemny	+/+			4	D
37	46	2002	5382insC	AT	rak zapal nv	MWZ 0	ujemny	ujemny	4-4-4-	4/4		₊		A
38	48	2003	5382insC	AT	3.4	1.7	ujemny	ujemny	ujemny	4/4		4		A
39	30	2001	C61G	AT	10.0	1.8	ujemny	ujemny	ujemny			4		A
40	45	2001	4153delA	AT	2.0	1.0	bd	bd	bd	4/4		4		A
41	38	2002	5382insC	AT	3.0	2.0	ujemny	ujemny	ujemny	4/4		4		A
42	45	2004	5382insC	AT	2.5	brak guza	ujemny	ujemny	+++	+/+		4		A
43	49	2000	5382insC	CMF	5.0	2.5	ujemny	ujemny	bd	4/4		4		A
44	35	2001	5382insC	CMFP	2.0	brak guza	ujemny	ujemny	ujemny	+/+		4		A

PL 217 731 B1

T a b e l a 4 (c.d.)

Pacjentki bez zdiagnozowanej mutacji BRCA1

1	2	3	4	5	6	7	Receptory	8	Odpowiedź na chemioterapię	Vital status
ER (IHC)	PgR (IHC)	HER2 (IHC)	CR	PR	BO
1	37	1997	-	CMF	5.0	2.0	4	ujemny	ujemny	4/4		4		D
2	37	2003	-	CMF	6.0	1.0	ujemny	ujemny	ujemny	-/-		4		A
3	32	2003	-	CMF	2.5	1.5	ujemny	ujemny	ujemny	+/+		4		A
4	47	2002	-	CMF	2.8	0.5	bd	bd	bd	+/+		4		A
5	47	1998	-	CMF	3.0	1.5	+	ujemny	ujemny			4		A
6	50	2002	-	CMF	4.8	2.2	ujemny	ujemny	44	+/+		4		A
7	49	2003		CMF P	2.8	1.8	ujemny	ujemny	ujemny	+/+		4		A
8	45	1998	-	CMF P	1.6	1.0	4	ujemny	ujemny	+/+		4		A
9	45	2002	-	AC	4.0	1.0	44	4	44	+/+		4		D
10	40	1997	-	CMF P	3.8	brak guza	bd	bd	bd	+/+		4		A
U	48	2002	-	AC	3.0	1.5	44	ujemny	ujemny	-/-		4		A
12	46	1999		AC	4.5	1.0	+	brak danych	brak danych	_+/+		4		D
13	47	2003		AC	3.5	2.5	44	ujemny	ujemny			4		A
14	46	2002	-	AC	1.5	0.8	ujemny	ujemny	bd			4		A
15	36	2002	-	AC	2.0	2.0	ujemny	ujemny	444	+/+			4	A
16	44	2002	-	FAC	7.0	4.0	4-	4	ujemny			4		A
17	44	2002	-	FAC	3.5	2.5	4	44	ujemny	+/+		4		A
18	45	2003	-	FAC	3.0	1.2	ujemny	ujemny	444	+/+		4		D
19	48	2003	-	FAC	2.0	1,2	ujemny	ujemny	ujemny	+/+		4		A
20	40	2004	-	FAC	8.0	0.8	ujemny	ujemny	bd			+		A
21	40	2000	-	FAC	4.5	3.0	44	4	bd			+		A
22	33	2003	-	FAC	4.0	brak guza	ujemny	ujemny	ujemny	+/-	4			A
23	45	2003		FAC	4.0	1.5	₊₊	+	ujemny	4/ bd		4		A
24	43	2003	-	FAC	8.0	5.0	ujemny	ujemny	444	4/4		4		A
25	46	2003	-	FAĆ	6.0	brak guza	ujemny	ujemny	bd		4			A
26	24	2003	-	FAC	5.0	10.0	ujemny	ujemny	+44	+/+			4	A
27	43	2003	-	FAC	7.0	5.0	ujemny	ujemny	444	+/+		4		D
28	39	2003	-	NA	4.0	1.5	4	44	ujemny	+/+		4		A
29	48	2001	-	NA	3.5	1.5	44	444	ujemny	4/4		4		A
30	34	2002	-	AT	10.0	2.5	44	44	ujemny			4		D
31	31	2002	-	AT	5.5	2.0	44	4	444	+/+		4		D
32	32	2003	-	AT	3.5	2.0	ujemny	ujemny	ujemny	+/+		4		A
33	45	200J	-	AT	4.5	2.5	ujemny	ujemny	bd	+/-		4		A
34	47	2003	-	AT	6.0	3.5	444	4	44	+/+		4		A
35	44	2001	-	AT	5.0	1.5	ujemny	brak danych	brak danych	+/+		4		A
36	43	2003	-	AT	6.5	4.5	bd	bd	bd	bd		4		A
37	31	2003	-	AT	2.5	0.7	4	ujemny	444	+/+		4		A
38	46	2002	-	AT	2.8	1.4	bd	bd	bd			₊		A
39	38	2003	-	AT	5.0	2.0	4	444	ujemny	+/+		4		A
40	49	2000	-	AT	5.8	3.8	ujemny	ujemny	+++	+/+		4		A
41	48	2001	-	AT	4.5	2.0	bd	bd	bd	+/-		4		A

Oznaczenia kolumn:

- Pacjenci; 2 - Wiek diagnozy; 3 - Rok diagnozy; 4 - Rodzaj mutacji BRCA1; 5 - Rodzaj chemioterapii; 6 - Maksymalny wymiar guza przed chemioterapią (cm), 7 - Maksymalny wymiar guza po chemioterapii (cm); 8 - Obecność przerzutów w pachowych węzłów chłonnych - przed/po CHTH

Inne użyte oznaczenia:

IHC - immunohistochemia; Vital status - A - żyje, D - zmarła; BO - brak odpowiedzi, MWZO - możliwość wykonania zab. operacyjnego, bd - brak danych

PL 217 731 B1

Literatura

1. Marcus JN, Watson P, Page DL, et al. BRCA2 hereditary breast cancer pathophenotype.

Breast Cancer Res Treat 1997; 44: 275 - 277.

2. Lakhani SR, Jacquemier J, Sloane JP, et al. Multifactorial analysis of differences between sporadic breast cancers and cancers involving BRCA1 and BRCA2 mutations. J Natl Cancer Inst 1998; 90: 1138 - 1145.

3. Foulkes WD, Brunet JS, Stefansson IM, et al. The prognostic implication of the basal-like (cyclin E high/p27 low/p53+/glomeruloid-microvascular-proliferation+) phenotype of BRCA1-related breast cancer Cancer Res 2004; 64: 830 - 5.

4. Johannsson OT, Idvall I, Anderson C, et al. Tumour biological features of BRCA1- induced breast and ovarian cancer. Eur J Cancer 1997: 33: 362 - 371.

5. Moynahan ME, Cui TY, Jasin M. Homology-directed dna repair, mitomycin-c resistance, and chromosome stability is restored with correction of a Brca1 mutation. CancerRes. 2001;61: 4842-50.

6. Bhattacharyya A, Ear US, Koller BH, Weichselbaum RR, Bishop DK. The breast cancer susceptibility gene BRCA1 is required for subnuclear assembly of Rad51 and survival following treatment with the DNA cross-linking agent cisplatin. J Biol Chem. 2000; 275: 23899 - 903.

7. Fedier A, Steiner RA, Schwartz VA et al. The effect of loss of Brca1 on the sensitivity of anticancer agents in p53-deficient cells. Int J Onc01 2203; 22: 1169 - 73.

8. Carey LA, Metzger R, Dees EC et al. Amerian Joint Committee on Cancer tumournoed-metastses stage after neoadjuvant chemotherapy and breast cancer outcome. J Natl Cancer Inst 2005; 97: 1137 - 42.

9. Lubiński J, Górski B, Huzarski T et al. BRCA1-positive breast cancers in young women from Poland. Breast Cancer Res Treat. 2006 Mar 16.

10. Górski B, Byrski T, Huzarski T, et al. Founder mutations in BRCA1 gene in Polish families with breast-ovarian cancer. Am J Hum Genet 2000: 66: 1963 - 1968.

11. Górski B, Jakubowska A, Huzarski T, et al. A high proportion of founder BRCA1 mutations in Polish breast cancer families. Int J Cancer 2004; 110: 683 - 686.

12. Kennedy RD, Quinn JE, Mullan PB et al. The role of BRCA1 in the cellular response to chemotherapy.

J Natl Cancer Inst 2004; 96: 1659 - 1668.

13. Zhoue C, Smith JL, Lui J. Role of BRCA1 in cellular resistance to paclitaxel and ionizing radiation in an ovarian cancer cell line carrying a defective BRCA1. Oncogene, 2003; 22: 2396 - 404.

14. Lafarge S, Sulvain V, Ferrara M, Bignon YJ. Inhibition of BRCA1 leads to increased chemoresistance to micotubule-interfering agents, an effect that involves the JNK pathway. Oncogene, 2001; 20: 6597-606.

15. Quinn JE, Kennedy RD, Mullan PB et al. BRCA1 functions as a diferential modulator of chemotherapyinduced apoptosis. Cancer Res. 2003; 63: 6221 - 8.

16. Tassone P, Tagliaferri P, Perricelli A et al. BRCA1 expression modulates chemosensitivity of BRCA1defective HCC1937 human breast cancer cells. Br J Cancer 2003; 88: 1285 - 91.

17. Chappuis PO, Goffin J, Wong N et al. A significant response to neoadjuant chemotherapy in BRCA1/2 related breast cancer. J Med Genet; 2002; 39: 608 - 610.

18. Delaloge S, Kloos I et al. BRCA1-Iinked breast cancer is highly more chemosensitive than its BRCA2linked or sporadic counterparts. Program and abstracts of the 27^th congeess of the European Society for Medical oncology 2002.

19. Rouzier R, Perou CM, Symmans WF et al. Breast cancer molecular subtypes respond differently to pre-operative chemotherapy. Clin Cancer Res 2005; 11: 5678 - 5685.

20. Foulkes WD. Stefansson IM, Chappuis PO et al. Germline BRCA1 mutations and a basal epithelial phenotype in breast cancer. J natl Cancer Inst 2003; 95: 1482 - 5.

21. Boyd J, Sonada Y, Federici MG et al. Clinicopathologic features of BRCA-Iinked and sporadic ovarian cancer. J Amer Medic Assoc. 2000; 283: 2260 - 5.

22. Cass I, Baldwin RL, Varkey T et al. Imporoved survival in women with BRCA- associated ovarian cancer. Cancer 2003; 97: 2187 - 95.

23. Wojciechowska-Lacka A, Markowska J, Skasko E et al. Frequent disease progression and early recurrence in patients with familial ovarian cancer primarily treated with paclitaxel and cis- or carboplatin. Eur J Gyneaecol Oncol 2003; 24: 21 - 4.

24. Egawa C, Mioyoshi Y, Takamura Y et al. Decreased expression of BRCA2 mRNA predicts favorable

PL 217 731 B1 response to docetaxel in breast cancer. Int J Cancer, 2001; 95: 255 - 9.

25. Risch H, McLaughlin J, Rosen B et al. Prevalence and penetrance of germline BRCA1 and BRCA2 mutations in a population series of 649 women with ovarian cancer. Am J Hum Genet 2001 68: 700-10.

26. Menkisak J, Gronwald J, Gorski B et al. Hereditary ovarian cnacer in Poland. Int J Cancer, 2003;106: 942 - 5.

Claims

1. Sposób wykrywania genetycznie uwarunkowanej obniżonej podatności na przeciwnowotworową chemioterapię cytostatykiem taksanowym, znamienny tym, że w próbce materiału genetycznego pobranej od pacjenta określa się obecność mutacji założycielskich w obrębie genu BRCA1, przy czym obecność rzeczonej mutacji wskazuje na obniżoną podatność na przeciwnowotworową chemioterapię cytostatykiem taksanowym, przy czym, korzystnie w przypadku pacjenta pochodzenia polskiego mutacja wybrana jest z grupy obejmującej mutacje genu BRCA1: 5382insC, C61G (300T—>G), 4153delA, 5370 C/T, 3819del5, 794delT, 185delAG, 2985del5, 5149del4

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że cytostatyk taksanowy jest wybrany z grupy obejmującej: paklitaksel, docetaksel.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zwalczany nowotwór jest wybrany z grupy obejmującej raki jajnika, piersi, prostaty, płuc oraz białaczkę i czerniaka, korzystnie jest rakiem piersi lub jajnika.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mutacja wybrana jest z grupy obejmującej następujące mutacje: BRCA1 ex.20 5382 ins C, BRCA1 ex.5 300T—>G oraz BRCA1 ex.11 4153 del A.

5. Sposób według zastrz. 1 albo zastrz. 2, albo zastrz. 3, albo zastrz. 4, znamienny tym, że obecność mutacji określa się w DNA, RNA lub białku, przy czym korzystnie badanie DNA lub RNA wykonywane jest techniką wybraną spośród następujących metod pośredniego wykrywania mutacji: ASO PCR (ang. Allele specific - PCR), SSCP (ang. single-strand conformation polymorphism), ASA (ang. allele specific analysis), RFLP-PCR (ang. restriction fragment length polymorphism - polymerase chain reaction), Iub bezpośredniego wykrywania mutacji jak sekwencjonowanie.

6. Zastosowanie mutacji założycielskiej w obrębie genu BRCA1 albo polinukleotydu zawierającego tą mutację albo polipeptydu kodowanego przez allel genu BRCA1 zawierający tą mutację do wykrywania in vitro obniżonej podatności pacjenta na przeciwnowotworową chemioterapię cytostatykiem taksanowym, przy czym, korzystnie w przypadku pacjenta pochodzenia polskiego mutacja wybrana jest z grupy obejmującej następujące mutacje genu BRCA1: 5382insC, C61G (300T—>G), 4153delA, 5370 C/T, 3819del5, 794delT, 185delAG, 2985del5, 5149del4

7. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że cytostatyk taksanowy jest wybrany z grupy obejmującej: paklitaksel, docetaksel oraz ich znane pochodne i analogi.

8. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że zwalczany nowotwór jest wybrany z grupy obejmującej raki jajnika, piersi, prostaty, płuc oraz białaczkę i czerniaka, korzystnie jest rakiem piersi lub jajnika.

9. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że mutacja wybrana jest z grupy obejmującej następujące mutacje: BRCA1 ex.20 5382 ins C, BRCA1 ex.5 300T—>G oraz BRCA1 ex. 11 4153 del A.

10. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że rzeczony polinukleotyd zawiera sekwencję genu BRCA1 lub jego fragmentu obejmującego wykrywaną mutację.

11. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że obecność mutacji określa się w DNA, RNA lub białku, przy czym korzystnie badanie DNA lub RNA wykonywane jest techniką wybraną spośród następujących metod pośredniego wykrywania mutacji: ASO PCR (ang. Allele specific - PCR), SSCP (ang. single-strand conformation polymorphism), ASA (ang. allele specific analysis), RFLP-PCR (ang. restriction fragment length polymorphism - polymerase chain reaction), lub bezpośredniego wykrywania mutacji jak sekwencjonowanie.

12. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że obecność polipeptydu kodowanego przez allel genu BRCA1 zawierający mutację określa się za pomocą przeciwciała lub innej substancji specyficznej wobec tego polipeptydu lub jego fragmentu.

13. Zastosowanie zestawu zawierającego przynajmniej dwa oligonukleotydy do amplifikacji regionu zawierającego mutację założycielską w obrębie genu BRCA1, przy czym, korzystnie w przypadku pacjenta pochodzenia polskiego amplifikowany region zawiera mutację wybraną z grupy

PL 217 731 B1 obejmującej następujące mutacje genu BRCA1: 5382insC, C61G (300T—>G), 4153delA, 5370 C/T, 3819del5, 794delT, 185delAG, 2985del5, 5149del4, korzystnie mutację wybraną z grupy obejmującej następujące mutacje: BRCA1 ex.20 5382 ins C, BRCA1 ex.5 300T—>G oraz BRCA1 ex.11 4153 del A do wykrywania genetycznie uwarunkowanej obniżonej podatności na przeciwnowotworową chemioterapię cytostatykiem taksanowym.

14. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że zestaw zawiera oligonukleotydy wybrane spośród zestawów:

a) SEQ NR ID 9, SEQ NR ID 10, SEQ NR ID

15, SEQ NR ID 14, SEQ NR ID 1, SEQ NR ID 2;

b) SEQ NR ID 11, SEQ NR ID 12, SEQ NR ID 19, SEQ NR ID

16, SEQ NR ID 7, SEQ NR ID 4;

c) SEQ NR ID 9, SEQ NR ID 12, SEQ NR ID 15, SEQ NR ID 16, SEQ NR ID 3, SEQ NR ID 2.