PL185957B1 - Sposób i zestaw diagnostyczny do wykrywania mutacji genów BRCA1 i BRCA2 w polskich rodzinach z agregacją raków sutka i/lub jajnika - Google Patents

Abstract

1. Sposób wykrywania mutacji genów BRCA1 i BRCA2 związanych z silną agregacją raka sutka i/lub jajnika w polskich rodzinach, znamienny tym, że analizy ograniczone są do mutacji obserwowanych w polskiej populacji, przy czym w szczególności wybiera się do badania przynajmniej jedną z mutacji: bRcA1 ex.2 185 del AG, BRCA1 ex.5 300T—>G, BRCA1 ex.5 309 T->C, BRCA1 ex.11.15 3819 del GTAAA, BRCA1 ex.11.17 4154 del A, BRCA1 ex.20 5382 ins C, BRCA2 ex.11 5972 C->T, BRCA2 ex.27 10430 C->T, przy czym korzystnie obecność mutacji bada się techniką ASA (ang. allele specific analysis), RFLP-PCR (ang. restriction fragment lenght polymorphism - polymerase chain reaction), SSCP (ang. single-strand conformation polymorphism). 2. Zastosowanie przynajmniej jednej mutacji wybranej spośród: BRCA1 ex.2 185 del AG, BRCA1 ex.5 300T->G, BRCA1 ex.5 309 T->C, BRCA1 ex.11.15 3819 del GTAAA, BRCA1 ex.11.17 4154 del A, BRCA1 ex.20 5382 ins C, BRCA2 ex.11 5972 C->T, BRCA2 ex.27 10430 C->T do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka sutka i/lub jajnika u osoby pochodzenia polskiego.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania mutacji genów BRCA1 i BRCA2 w polskich rodzinach z agregacją raków sutka i/lub jajnika oraz zestaw diagnostyczny służący do stosowania tego sposobu.

Geny BRCA1 (US5654155) i BRCA2 są związane z wysoką genetyczną predyspozycją do nowotworów. Geny BRCA1 i BRCA2 zostały sklonowane i od tego czasu możliwe jest wykrywanie ich zaburzeń na poziomie DNA i RNA. Jest to utrudnione ze względu na znaczne rozmiary tych genów. Nosiciele mutacji tych genów mają wysokie ryzyko zachorowania zwłaszcza na raka sutka i/lub jajnika (1,2). BRCA1 jest pierwszym genem uznanym za związany ze zwiększonym ryzykiem zachorowania na raka piersi i jajnika [Miki et al., Science, 266:66-71 (1994)]. Gen BRCA1 (GENBANK Accession Numbers: U 14680 oraz 15595) składa się z 24 eksonów rozmieszczonych w genomowym DNA długości 100 kb, a samo mRNA dla BRCA1 ma długość 7,8 KB. Intensywne badania zmienności tego genu pozwoliły na ustalenie licznych mutacji, związanych z predyspozycją do nowotworów, występujących w obrębie tego genu. Przykładowo, US5693473 opisuje bogaty zbiór takich polimorfizmów BRCA1 WO99/29903 dotyczy kolejnych piętnastu mutacji BRCA1 wiązanych ze zwiększonym ryzykiem zachorowania na raka .piersi i jajnika. Gen BRCA2 (GENBANK accession Number U43746) składa się z 27 eksonów rozmieszczonych w genomowym DNA długości 70kb; mRNA dla BRCA2 ma długość 11-12 kb. Opisano wiele mutacji związanych z predyspozycją do nowotworów w obrębie tego genu (patrz przykładowo W09928506).

Poznane mutacje w obrębie BRCA1 i BRCA2 rozproszone są w różnych eksonach. Pełen zbiór tych mutacji zaprezentowano na stronie HTTP://www.nchgr.nih.gov/dir/lab-transfer/bic.

Zwiększoną częstość pojedynczych mutacji w rodzinach z agregacją raków sutka i jajnika (Hb/OC) zaobserwowano jedynie w nielicznych grupach etnicznych takich jak Żydzi Aszkenazyjscy, u których opisano wysoką częstość 185 del Ag i 5382 ins C wBRCA1 oraz 1674 del T w BRCA2.

W związku z powyższym w większości populacji wykrywanie mutacji w rodzinach z HB/OC nie może być ograniczone do badania pojedynczych miejsc w genomie, lecz musi polegać na ocenie wszystkich fragmentów kodujących. W przypadku genów BRCA1

185 957 i BRCA2 oznacza to analizę około 100 produktów PCR przy zastosowaniu najpopularniejszej metody - SSCP/sekwencjowanie (ang. single-strand conformation polymorphism, patrz przykładowo US05693473). Ogranicza to dostępność tej metody i uniemożliwia powszechne wykorzystanie w praktyce medycznej analizy mutacji genów BRCA1 i BRCA2 jako wyznacznika predyspozycji do nowotworów.

Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobu wykrywania mutacji genów BRCA1 iBRCA2 w polskich rodzinach z agregacją raków sutka i/lub jajnika, który byłby pozbawiony opisanych powyżej ograniczeń i nadawał się do powszechnego stosowania w praktyce medycznej.

Nieoczekiwanie został on zrealizowany zgodnie z niniejszym wynalazkiem.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania mutacji genów BRCA1 i BRCA2 związanych z silną agregacją raka sutka i/lub jajnika w polskich rodzinach, charakteryzujący się tym, że analizy ograniczone są do mutacji obserwowanych w polskiej populacji, przy czym w szczególności wybiera się do badania przynajmniej jedną z mutacji: BRCA1 ex.2 185 del AG, BRCA1 ex.5 300T->G, BRCA1 ex.5 309 T->C, BRCA1 ex.11.15 3819 del GTAAA, BRCA1 ex. 11.17 4154 del A, BRCA1 ex.20 5382 ins C, BRCA2 ex.11 5972 C-^T, BRCA2 ex.27 10430 C—>T, przy czyn korzystnie obecność mutacji bada się techniką ASA (ang. allele specific analysis), RFLP-PCR (ang. restriction fragment lenght polymorphism - polymerase chain reaction), SSCP (ang. single-strand conformation polymorphism).

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przynajmniej jednej mutacji wybranej spośród: BRCA1 ex.2 185 del AG, BRCA1 ex.5 300t—»G, BRCA1 ex.5 309 T—>C, BRCA1 ex. 11.15 3819 del GTAAA, BRCA1 ex.11.17 4154 del A, BRCA1 ex.20 5382 ins C, BRCA2 ex.11 5972 C—>T, BRCA2 ex.27 10430 C—>T do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka sutka i/lub jajnika u osoby pochodzenia polskiego.

Nieoczekiwanie okazało się, że w populacji polskiej do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka sutka i/lub jajnika można zastosować znacznie ograniczoną ilość mutacji występujących w genach BRCA1 i BRCA2.

Pozwala to na znaczne uproszczenie testów i umożliwia powszechne wykorzystanie w praktyce medycznej analizy mutacji genów BRCA1 i BRCA2 jako wyznacznika predyspozycji do nowotworów u osoby pochodzenia polskiego.

Przykład 1. Mutacje BRCA1 i BRCA2 występujące w polskich rodzinach z rakiem sutka i/lub jajnika (HB/OC)

Stosując techniki SSCP/sekwencjonowanie na poziomie DNA i sekwencjonowanie RNA (patrz przykładowo US05710001), nieoczekiwanie wykryto ograniczoną serię konstytucyjnych mutacji BRCA1 i BRCA2 w polskich rodzinach z rakiem sutka i/lub jajnika: BRCA1 - ex.2 185 del AG, ex.5 300T->G, ex.5 309 T->C, ex.11.15 3819 del GTAAA. ex.11.17 4154 del A, ex.20 5382 ins C; BRCA2 -ex.11 5972 C-^T, ex.27 10430 C-^T. Niektóre z tych mutacji wystąpiły w 2-3 niespokrewnionych rodzinach. Ponieważ mutacje BRCA1 i BRCA2 tylko wyjątkowo powstają w wyniku zaburzeń germinalnych „de novo”, sprawdzono, czy ocena zaburzeń genów BRCA1 i BRCA2 ograniczona do badania serii wykrytych mutacji (określonych powyżej) umożliwia zdiagnozowanie na poziomie molekularnym przyczyn występowania rodzin agregacji raków sutka i/lub jajnika w większości polskich rodzin z HB/OC. W tym celu zbadano częstość wykrytych mutacji BRCA1 i BRCA2 (określonych powyżej u chorych z rakiem sutka lub jajnika z grupy wszystkich niespokrewnionych rodzin zdiagnozowanych przez Pomorską Akademię Medyczną. W rodzinach tych stwierdzono co najmniej 3 raki sutka i/lub jajnika. W grupie objętej badaniami, rozpoznanie - dziedziczny rak sutka specyficzny narządowo - postawiliśmy w 34 rodzinach, a rozpoznanie - zespół rak sutka jajnika - w 22 rodzinach. Wskazane mutacje BRCA1/BRCA2 stwierdzono w większości (> 60%) badanych rodzin z HB/OC co potwierdziło, że u kobiet z polskich rodzin z rakami sutka i/lub jajnika można efektywnie diagnozować mutacje ograniczając się jedynie do badania serii wykrytych mutacji (określonych powyżej) (tab. 1).

185 957

Tabela 1

Mutacje BRCA1 i BRCA2 występujące w polskich rodzinach z rakiem sutka i/lub jajnika (HB/OC)

	BRCA1	BRCA2
Ex.2nt 185	Ex.5nt 300	Ex.5nt 309	Ex. 11nt 3819 del5	Ex. 11nt 4154 delA	Ex.20 5382 ins C	Ex. 11 5972 C->T	Ex.27 10430 C->T
HOC	+	+	+	+	+	+	-	+
HBC	+	+	-	+	+	+	+	-

Ograniczenie liczby badanych mutacji BRCA1 i BRCA2 związanych z HB/OC w polskich rodzinach zdecydowanie zwiększa dostępność opartego na ich wykrywaniu testu diagnostycznego i umożliwia jego powszechne stosowanie w praktyce medycznej. Wynika to nie tylko z ograniczenia ilości analiz do badania wybranych fragmentów genów, ale i z tego, że dla poszczególnych mutacji można ustalić metody analityczne prostsze niż SSCP/sekwencjonowanie na poziomie DNA i sekwencjonowanie RNA, przykładowo analizy techniką ASA, RFLP-PCR i/lub SSCP. Dobór stosownej metody znanej ze stanu techniki i wykonanie odpowiedniego testu leży w zakresie umiejętności przeciętnego specjalisty. Wybrane techniki opisano m.in. w WO99/28506.

Przykład 2. ASA dla delecji 5 par zasad w ex. 11 genu BRCA1

Przykładowo, w celu wykonania testu ASA dla delecji 5 par zasad wex. 11 genu BRCA1 bazując na znanej sekwencji tego genu i znanej lokalizacji wskazanej mutacji zaprojektowano następujące primery:

F 5' TCCTAGCCCTTTCACCCATACA

R 5' AGATGCCTTTGCCAATATTACCTG d5 5' CTGAGAAGGTATATTGTTTACCAA

Warunki reakcji PCR: I: 94° 4 minuty; II: 10 cykli (94° - 20 s, 68° - 20 s - temp, zmniejszona o 1,2 w każdym cyklu, 72°-25 s); III: 30 cykli (94° -10 s, 58°- 20 s, 72°-25 s); IV: 72°-1 minut.

Piśmiennictwo:

1. Gronwald J., Menkiszak J., Tołoczko A., Zajączek S., Kładny J., Kurzawski G., Krzystolik K., Podolski J., Lubiński J.: Hereditary Breast Cancer. Pol J Pathol 49, 2: 59-66, 1998.

2. Naród S.A. Hereditary breast cancer syndromes. Cancer 80-S 3S: 53-542, 1997.

3. Byrski T. Huzarski T., Jakubowska A., Gronwald J., Tołoczko A., Zajączek S., Płużańska A., Bembenek M., Lubiński J.: BRCA1, BRCA2 germline mutations in Polish families with aggregation of breast/ovarian cancers. Hum Genet 1999 (ready for submision).

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.

Cena 2,00 zł.

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wykrywania mutacji genów BRCA1 i BRCA2 związanych z silną agregacją raka sutka i/lub jajnika w polskich rodzinach, znamienny tym, że analizy ograniczone są do mutacji obserwowanych w polskiej populacji, przy czym w szczególności wybiera się do badania przynajmniej jedną z mutacji: BRCA1 ex.2 185 del AG, BRCA1 ex.5 300T->G, BRCA1 ex.5 309 T->C, BRCA1 ex.11.15 3819 del GTAAA, BRCA1 ex.11.17 4154 del A, BRCA1 ex.20 5382 ins C, BRCA2 ex.11 5972 C->T, BRCA2 ex.27 10430 C->T, przy czym korzystnie obecność mutacji bada się techniką ASA (ang. allele specific analysis), RFLP-PCR (ang. restriction fragment lenght polymorphism - polymerase chain reaction), SSCP (ang. single-strand conformation polymorphism).
2. 2. Zastosowanie przynajmniej jednej mutacji wybranej spośród: BRCA1 ex.2 185 del AG, BRCA1 ex.5 300T->G, BRCA1 ex.5 309 T->C, BRCA1 ex.11.15 3819 del GTAAA, BRCA1 ex.11.17 4154 del A, BRCA1 ex.20 5382 ins C, BRCA2 ex.11 5972 C->T, BRCA2 ex.27 10430 C—>T do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka sutka i/lub jajnika u osoby pochodzenia polskiego.