PL212811B1 - Sposób uzyskiwania oczyszczonych preparatów bakteriofagowych - Google Patents

Description

Wyzwaniem obecnych czasów jest wygranie wyścigu z mikroorganizmami przekazującymi między sobą informację genetyczną umożliwiającą im nabycie oporności na antybiotyki. Powszechnie stosowana antybiotykoterapia spowodowała, że mikroorganizmy stały się miej wrażliwe na antybiotyki, w tym na wankomycynę - antybiotyk zakłócający biosyntezę peptydoglikanu. Obecnie lawinowo narasta liczba informacji mówiących o alternatywie dla terapii antybiotykowej - wykorzystaniu bakteriofagów. Wśród tych informacji jest wypowiedź laureata Nagrody Nobla profesora Lederberga zapowiadająca wykorzystanie bakteriofagów w terapii zakażeń bakteryjnych.

Badania nad terapeutycznym wykorzystaniem bakteriofagów są prowadzone w kilku ośrodkach na świecie i liczba ich będzie rosła. Najdłuższe tradycje terapii fagami ma Instytut Mikrobiologii i Wirusologii w Tbilisi i Instytut Immunologii PAN we Wrocławiu. Obecnie powstaje wiele firm nastawionych na wykorzystanie fagów w terapii zakażeń bakteryjnych. Przykłady to: Novolytics, Do-CoopTechnologies Ltd, CEO Novolytics Ltd, Phico Therapeutics Ltd itd.

W cyklu litycznym w trakcie terapii bakterie zostają zniszczone przez namnażające się w nich bakteriofagi. Do środowiska uwalniane są potomne, zwielokrotnione w liczbie cząsteczki bakteriofagów, które lizują następne populacje bakterii.

W przypadku produkcji lizatów bakteriofagowych do celów technologicznych znaczenie ma nie tylko liczba potomnych cząsteczek fagowych ale i uwalniane do środowiska elementy budulcowe bakterii, takie jak kwasy nukleinowe, białka i składniki ściany komórkowej. Ściana bakterii Gram ujemnych zbudowana jest z w istotnym ułamku (nawet do 70%) z lipopolisacharydów (nazywanych pirogenami, endotoksynami), peptydoglikanów i białek. Efektywne usunięcie pirogenów z lizatów bakteryjnych jest kluczowym wymogiem otrzymywania preparatów bakteriofagowych dedykowanych terapii zakażeń bakteryjnych. Endotoksyny są silnymi stymulatorami układu immunologicznego indukując produkcję interleukin, TNF, NO, itd.

Procedury usuwania lub izolacji endotoksyn bazują na ekstrakcji rozpuszczalnikami organicznymi jak na przykład wodnym roztworem fenolu Westphal O., Lueritz O., Bister F. Uber die Extraktion von Bakterien mit Phenol/wasser. Z. Naturforsch. 7: 148-155, 1952), mieszaniną kwasów i amin alifatycznych (Patent application Publication US 2007/0020292A1), metodami ekstrakcyjnymi i chromatograficznymi (Patent Application publication US 2007/0031447A1). Oczyszczanie preparatów biologicznych z endotoksyn przeprowadzano wykorzystując interakcje jonów metali z białkami (patent US 6,942,802 B2 Sep. 13, 2005; WO 02083710A1; WO 04003215A1), przez precypitację endotoksyn alkoholem i dwuwartościowymi przeciwjonami (US 5039610). Zastosowanie dwuwartościowych jonów w kombinacji z alkoholami, żywicami i detergentami jest przedmiotem wielu patentów na przykład EPO 407037B1. Do usuwania endotoksyn wykorzystywano białka izolowane z limfy kraba (US 5760177). Opisano wiele metod chromatografii kolumnowej. Wykorzystuje się w nich powinowactwo lipopolisacharydu do zasadowych haptenów takich jak polimysksyna (Petsch D, Beeskow TC, Anspach FB, Deckwer WD, (1997) Membrane adsorbers for selective removal of bacterial endotoxin. J. Chromatogr B Biomed Sci Appl. 693 (1):79-91), złoże oparte na krzemianie wapnia (Hang JP, Wang Q, Smith TR, Hurst WE, Sulpizio T, (2005) Endotoxin removal using a synthetic adsorbent of crystalline calcium silicate hydrate. Biotechnol Prog. 21(4): 1220-5), polimery syntetyczne (Hirayama Ch, Sakata M, (2002) Chromatographic removal of endotoxin from protein solutions by polymer particles. Journal of

Chromatography B, 781:419-432) lub złoża polianionowe (Boratyński J, Syper D, Weber-Dabrowska B, Łusiak-Szelachowska M, Poźniak G, Górski A. Preparation of endotoxin-free bacteriophages Cell Mol Biol Lett. 2004; 9(2):253-9).

Nadal istnieje zapotrzebowanie na dostarczenie sposobu oczyszczania lizatów bakteriofagowych, zwłaszcza z endotoksyn, który mógłby być wykorzystany do przemysłowej produkcji preparatów bakteriofagowych przeznaczonych do stosowania w leczeniu zakażeń bakteryjnych występujących u ludzi. Pomimo mnogości opisanych metod oczyszczania lizatów bakteriofagowych, nie spełniają one w stopniu dostatecznym wymogów stawianych przed sposobami przemysłowej produkcji preparatów o wskazanym powyżej przeznaczeniu.

Nieoczekiwanie sposób spełniający określone powyżej wymogi został uzyskany w niniejszym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania oczyszczonych preparatów bakteriofagowych charakteryzujący się tym, że:

PL 212 811 B1

a) prowadzi się hodowlę szczepu gospodarza bakteryjnego, hodowlę zaszczepia się bakteriofagami i uzyskuje się lizat bakteriofagowy, korzystnie o mianie nie niższym niż 10⁷ pfu/ml, a otrzymany lizat fagowy ewentualnie podaje się sterylizacji filtracyjnej,

b) prowadzi się oczyszczanie lizatu fagowego metodą ultrafiltracji na module tangencjalnym,

c) uzyskany przesącz oczyszcza się techniką chromatografii jonowymiennej na kolumnie wypełnionej kationitom, korzystnie zawierającej polymixin B, a następnie poddaje się ewentualnie sterylizacji filtracyjnej

d) z uzyskanego przesączu przygotowuje się oczyszczony preparat bakteriofagowy, korzystnie o mianie rzędu 10⁹ pfu/ml i pozbawionym co najmniej 95% endotoksyn w stosunku do ich ilości w wyjściowym lizacie bakteriofagowym uzyskiwanym w etapie a.

Korzystnie, w trakcie etapu a) hodowlę szczepu gospodarza bakteryjnego prowadzi się w bulionie hodowlanym o pH około 7,2 zawierającym wyciąg mięsny, enzymatyczny hydrolizat kazeiny, hydrolizat drożdży, pepton, NaCl.

Równie korzystnie, w trakcie etapu a) jako szczep gospodarza bakteryjnego stosuje się szczep bakteryjny wrażliwy na lityczne działanie namnażanego bakteriofaga.

Równie korzystnie, w trakcie etapu a) uzyskany lizat fagowy podaje się sterylizacji filtracyjnej przez filtr jałowiący 0,22 μm.

Równie korzystnie, w trakcie etapu b) stosuje się moduł tangencjalny o cut-off 300 kDa.

Przykład. 1. Oczyszczanie roztworu wzorcowego endotoksyn oraz bulionu wzbogaconego

Przed przystąpieniem do oczyszczania w układzie moduł tangencjalny - kolumna Polymixin B, sprawdzono właściwości sorpcyjne kolumny na wzorcowym roztworze endotoksyn oraz na medium hodowlanym, w którym zawieszone są cząstki fagowe.

1. Wzorcowy roztwór endotoksyny

1. Materiały:

a) roztwór wzorcowej endotoksyny:

EW Endotoxin E.coli O55:B5. Nr serii: EVV8 198, data ważności: 07/2010. Liczba jednostek endotoksycznych 1 mln EU/ml. Producent: Charles River Endosafe.

b) woda do iniekcji do przygotowania buforów

c) złoże Polymixin B-Agarose (Sigma P1411)

1.1. Przygotowanie próbki wzorcowej endotoksyny

Obliczono, iż po przejściu przez moduł tangencjalny teoretyczna zawartość endotoksyn w próbce lizatu fagowego wynosi ok. 320 EU/ml.

Założenia: zagęszczaniu na module poddano 1 litr lizatu o zawartości endotoksyn 16 EU/ml, czyli w 1 litrze lizatu mamy 16 0000 EU. Po przejściu przez moduł objętość próbki wynosi 50 ml. Przyjmując na podstawie objętości, iż zagęszczeni próbki jest ok. 20 krotne, poziom endotoksyn powinien teoretycznie wynosić 320 EU w 1 ml. Wartość 320 EU/ml jest to teoretyczna wartość EU, która zostanie poddana oczyszczaniu na kolumnie. W doświadczeniu założono tzw. „najgorszy przypadek tzn., że na module nie następuję żadne oczyszczanie z endotoksyn, choć w praktyce endotoksyny na module są oczyszczane.

1.2. Roztwór endotoksyny wzorcowej

Sporządzono roztwór wzorcowej endotoksyny (w wodzie apyrogennej) o stężeniu ok. 320 EU/ml w objętości 50 ml.

1.3. Oczyszczanie próbki roztworu endotoksyny wzorcowej

W szklanej kolumnie o wymiarach x/y upakowano 10 ml złoża Polymixin B-Agarose (Sigma P1411) i zrównoważono 100 ml buforu 20 mM fosforan sodu, 150 mM NaCl. Następnie nakładano 50 ml wzorcowego roztworu endotoksyny (320 EU/ml) przy przepływie 0,2 ml/min. w temperaturze pokojowej. Zebrano roztwór wypływający z kolumny (próbka nr 2). Kolumnę płukano 50 ml buforu, po czym nałożono 25 ml próbki 2 przy przepływie 0,2 ml/min. w temperaturze pokojowej. Zebrano roztwór wypływający z kolumny (próbka 3).

Próbki do analiz poziomu endotoksyny:

Próbka nr 1 - bufor równoważący (25 ml)

Próbka nr 2 - roztwór endotoksyny wzorcowej po jednokrotnym przepuszczeniu przez kolumnę

Polymixin B (25 ml)

Próbka nr 3 - roztwór endotoksyny wzorcowej po dwukrotnym przepuszczeniu przez kolumnę

Polymixin B (25 ml)

PL 212 811 B1

Próbka nr 4 - Wyjściowy roztwór endotoksyny wzorcowej, teoretyczna zawartość endotoksyn 320 EU/ml (12 ml).

Próbki zostały poddane sterylizacji filtracyjnej przez filtr jałowiący 0,22 pm Millex GP (firmy Millipore, nr kat. SLGP033RS).

1.4. Wyniki oczyszczania

Wyniki zawartości endotoksyn w próbce nr 2 i próbce nr 4

a) próbka nr 4 - więcej niż 640 EU/ml mniej niż 1280 EU/ml

b) próbka nr 2 - więcej niż 0,25 EU/ml mniej niż 0,5 EU/ml.

Po przeanalizowaniu uzyskanych wyników nie uznano za celowe sprawdzanie zawartości endotoksyn w próbce nr 1 i próbce nr 3. Uzyskane wyniki dla próbki nr 2 dowodzą, iż bufor równoważący posiadał odpowiednią czystość (pod kątem endotoksyn) oraz jednokrotne przepuszczenie przez kolumnę pozwala na uzyskanie roztworu o wysokiej czystości (pod kątem endotoksyn).

1.5. Wniosek końcowy z eksperymentu

Przy założonych warunkach rozdziału kolumna Polymixin B-Agarose posiada zdolność redukcji endotoksyn co najmniej na poziomie 2560 razy (640 EU/ml zawierał roztwór oczyszczany, po oczyszczaniu poziom endotoksyn wynosił 0,25 EU/ml). (Za wynik końcowy przyjęto dolną granicę w oznaczeniach poziomu endotoksyn).

2. Bulion wzbogacony

2.1. Materiały do oczyszczania

a) bulion wzbogacony do bakteriofagów s. 18/09/PC fagi

b) woda do iniekcji do przygotowania buforów

c) złoże Polymixin B-Agarose (Sigma P1411)

2.2. Oczyszczanie bulionu wzbogaconego

Około 1000 ml bulionu wzbogaconego zagęszczono do 25 ml (ustawienie pompy 0,70). Dodano 25 ml buforu (20 mM fosforan sodu, 150 mM NaCl, pH 7,2). Zagęszczono do 25 ml. Dodano 25 ml buforu. Zagęszczono do 25 ml. Dodano 25 ml buforu. Zagęszczono do 25 ml. Dodano 25 ml buforu. Zagęszczono do 25 ml. Dodano 25 ml buforu. Zagęszczono do 25 ml. Dodano 25 ml buforu. Zagęszczono do 25 ml. Dodano 25 ml buforu. Zagęszczono do 25 ml. Dodano 25 ml buforu. Zagęszczono do 25 ml, cyrkulowano w module bez filtracji (wężyk „filtrate zamknięty) 5 min, ustawienie pompy 0,9. Wypompowano faga z modułu. Dodano 25 ml buforu, cyrkulowano w module bez filtracji (wężyk „filtrate” zamknięty) 5 min, ustawienie pompy 0.9. Wypompowano bulion z modułu, połączono obie porcje bulionu. Kolumienkę z wypełnieniem Polymixin B-Agarose Immobilised Sigma P1411 (10 ml złoża) przepłukano buforem przy przepływie 0,2 ml/min. Nakładano próbkę bulionu przy takim samym przepływie.

Próbki do analiz poziomu endotoksyny:

Próbka nr 1 - bufor do płukania (35 ml)

Próbka nr 2 - bulion wyjściowy (wzbogacony)

Próbka nr 3 - bulion flow z modułu (25 ml)

Próbka nr 4 - bulion zagęszczony do 50 ml (5 ml)

Próbka nr 5 - bulion po moduł (przepłukany) (5ml)

Próbka nr 6 - bulion po Polymixin B (42 ml)

Próbki zostały poddane sterylizacji filtracyjnej przez filtr jałowiący 0,22 pm Millex GP (firmy Millipore, nr kat. SLGP033RS).

2.3. Wyniki oczyszczania:

a) próbka nr 2 (bulion wzbogacony) - więcej niż 8 EU/ml mniej niż 16 EU/ml

b) próbka nr 6 - więcej niż 0,125 EU/ml mniej niż 0,25 EU/ml.

próbka nr 5 (bulion po moduł, przepłukany) - więcej niż 0,25 EU/ml mniej niż 0,5 EU/ml.

Wniosek końcowy z eksperymentu

Kolumna Polymixin B powoduje całkowite oczyszczanie bulionu wzbogaconego z endotoksyn (redukcja 64 krotna). Warunki oczyszczania medium, w którym zawieszone są bakteriofagi, na kolumnie Polymixin B zostały dobrane prawidłowo.

W kolejnych eksperymentach przetestowano oczyszczanie mieszanka fagowa przeciwko gronkowcom o nazwie roboczej P-A-Ż-3 z zastosowaniem identycznych warunków jakie zastosowano w eksperymencie z endotoksyną oraz w eksperymencie z bulionem wzbogaconym. (Za wynik końcowy przyjęto dolną granicę w oznaczeniach poziomu endotoksyn)

PL 212 811 B1

PL 212 811 B1

Przykład 2. Sposób oczyszczania mieszanki lizatów fagowych przeciwko gronkowcom

1. Produkcja lizatów fagowych

1.1. Materiał wyjściowy:

Lizaty fagowe przeciwko gronkowcom otrzymano z IITD PAN Wrocław.

Lizaty stanowią cząstki fagowe o mianie nie niższym niż rzędu 10⁷ pfu/ml, zawieszone w bulionie wzbogaconym do namnażania bakteriofagów. Lizaty fagowe spełniają wymagania specyfikacji jakościowej IBSS BIOMED S.A. pod względem postaci i właściwości, zanieczyszczeń mechanicznych widocznych okiem nieuzbrojonym, jałowości oraz aktywności (miana wyrażonego w pfu/.ml). Lizaty fagów są wolne od wirusów HCV, HBS oraz HIV. W czasie produkcji lizatów fagowych stosowana jest wytyczna ds. minimalizacji ryzyka przenoszenia TSE.

1.2. Substancje pomocnicze

Szczepy gospodarze bakteriofagów - szczepy Staphylococcus aureus otrzymano z IITD PAN Wrocław. Charakterystyka szczepów zawarta jest w Karcie charakterystyki szczepu.

Z otrzymanych szczepów S. aureus przygotowywano pulę macierzystą (macierzystą serię siewną, master seed lot) i wykonano następujące operacje:

- ożywianie i namnażanie otrzymanego szczepu,

- separacja masy bakteryjnej,

- zawieszenie odwirowanej masy bakteryjnej w nośniku mlecznym,

- rozlew zawiesiny do ampułek lutowanych,

- liofilizacja szczepu puli macierzystej,

- zatapianie ampułek pod próżnią,

- kontrola szczelności ampułek

Na reprezentatywnych próbkach szczepu puli macierzystej. Dział Kontroli Jakości wykonuje następujące badania kontrolne:

- jednorodność szczepu - morfologia szczepu - test biochemiczny API Coryne

Wyniki badań są zapisywane w Karcie Kontrolnej Puli Macierzystej Szczepu i na ich podstawie KJ dopuszcza szczepy do stosowania.

Szczepy przechowywane są w postaci liofilizatów, w temp. 2-8°C, co zapewnia stabilność ich cech biotechnologicznych.

1.3. Podłoże do namnażania bakteriofagów

Bakteriofagi są namnażane na bulionie wzbogaconym do bakteriofagów.

Skład bulionu

Skład (podano ilości w g na 1000 ml H2Odest.):

1. Wyciąg mięsny 0,4

2. Enzymatyczny hydrolizat kazeiny 5,4

3. Hydrolizat drożdży 1,7

4. Pepton 4,0

5. NaCl 3,5

Wszystkie składniki są dokładnie rozpuszczane w wodzie oczyszczonej i mieszane.

Przy pomocy 10% NaOH ustalana jest pH na wartość 7,2.

Podłoże jest sterylizowane w autoklawie w 12°C, 1 atm., 20 min.

Wszystkie składniki stosowane do produkcji bulionu wzbogaconego pochodzą od certyfikowanych dostawców. Dla każdego ze stosowanych składników opracowane są specyfikacje jakościowe.

1.4. Namnażanie bakteriofagów

1.4.1. Sporządzenie zawiesiny szczepu

1.4.1.1. Do sporządzenia zawiesiny używa się szczep wyhodowany uprzednio na 3% agarze krwawym. Ze szczepu przygotowuje się inokulum o gęstości 1,5 McF w bulionie wzbogaconym do bakteriofagów. Zawiesinę szczepu o gęstości 1,5 w skali McFarlanda inkubuje się w 37°C przez 3 godziny. Po zakończonej inkubacji sprawdza się gęstość zawiesiny. Zawiesinę powinna mieć gęstości ok. 2,0 w skali McFarlanda.

1.4.1.2. Łączenie zawiesiny bakterii i lizatu fagowego

Bulion wzbogacony doprowadza się do temperatury pokojowej. Lizat fagowy i zawiesinę szczepu dodaje się do bulionu wzbogaconego w proporcji 3:1, z zachowaniem kolejności najpierw lizat,

PL 212 811 B1 potem zawiesinę szczepu bakterii. Równocześnie wykonuje się kontrolę wzrostu szczepu bakterii - do bulionu wzbogaconego odmierza się taką samą objętość zawiesiny bakterii jak przy namnażaniu faga.

1.4.1.3. Inkubacja

Hodowlą bakteriofagów (pkt 1.4.1.2) oraz z kontrolą wzrostu szczepu S. aureus poddaje się następującym inkubacjom:

- inkubacja I - temperatura pokojowa 30 min.

- inkubacja II - temperatura 37°C przez 4 h

- inkubacja III - temperatura 2-8°C przez 18-48 h.

1.5. Otrzymanie lizatu fagowego

Po okresie inkubacji w 2-8°C w kontrola wzrostu szczepu powinno wykazywać intensywne zmętnienie hodowli. Po okresie inkubacji w 2-8°C w hodowli bakteriofagów nie powinno być zmętnienia, hodowla powinna być przejrzysta.

1.6. Sterylizacja filtracyjna lizatu fagowego

Otrzymany lizat fagowy podaje się sterylizacji filtracyjnej przez filtr jałowiący 0,22 ąm.

1.7. Badania lizatu fagowego

Lizat fagowy poddaje się badaniom aktywności, jałowości oraz zawartości endotoksyn bakteryjnych.

2. Oczyszczanie bakteriofagów

Głównym źródłem zanieczyszczenia lizatów fagowych są pozostałości komórek S. aureus, metabolity oraz toksyny S. aureus, endotoksyny, a także składniki podłoża do namnażania (bulion wzbogacony). Zasadniczym celem procesu oczyszczania jest redukcja zanieczyszczeń organicznych, a także obniżenie zawartości endotoksyn bakteryjnych. Dopuszczalna zawartość endotoksyn jest zależna od drogi podania produktu leczniczego i jest zdefiniowana w Farmakopei Europejskiej (monografia 2034 „Substancje do celów farmaceutycznych”). Farmakopea Europejska precyzuje wymagania co do zawartości endotoksyn dla preparatów podawanych drogą parenteralną, dla preparatów podawanych doustnie i miejscowo określenie poziomu endotoksyn nie jest wymagane.

Aktualnie w literaturze światowej istnieją dwa trendy oczyszczania bakteriofagów: pierwszy to strącanie bakteriofagów z pożywki hodowlanej glikolem polietylenowym, a następnie ich wirowanie w gradiencie chlorku cezu, drugi to oczyszczanie bakteriofagów metodami chromatograficznymi.

Oczyszczanie w gradiencie chlorku cezu wykonywane jest głównie do celów laboratoryjnych. Dla celów przemysłowych ze względu na aspekty ekonomiczne, a także techniczne bardziej użyteczne są chromatograficzne metody oczyszczania bakteriofagów.

Z doświadczeń twórców w oczyszczaniu toksoidów wynika, iż ważnym etapem w oczyszczaniu jest separacja biomasy i wstępne oczyszczanie z użyciem modułu tangencjalnego.

Na podstawie badań rozwojowych prowadzonych przez twórców stwierdzono, iż najlepsze rezultaty co do wydajności oraz jakości oczyszczonych fagów uzyskuje się stosując oczyszczanie dwustopniowe: najpierw metodą ultrafiltracji na module tangencjalnym a następnie za pomocą chromatografii jonowymiennej stosując jako złoże Polymixin B-Agarose.

2.1. Moduł tangencjalny

Moduł tangencjalny jest urządzeniem przeznaczonym do ultrafiltracji.

Filtracja poprzez moduł tangencjalny (TFF) jest szybką i skuteczną metodą separacji i oczyszczania biocząsteczek. Moduł tangencjalny może być zastosowany do zagęszczania i odsalania próbek w objętości od 10 ml do tysięcy litrów. Jest używany do frakcjonowania cząstek, pozyskiwania zawiesiny komórek oraz klarowania lizatów komórek. Moduł TFF jest łatwy do montażu i szybszy niż dializa, pozwala na uzyskanie wyższego stężenia w krótszym czasie w porównaniu z urządzeniami do wirowania. Pozwala na równoczesne skoncentrowanie i klarowanie próbki (oszczędność czasu i uniknięcie strat produkcyjnych). Moduł TFF daje możliwość zwiększania i zmniejszania skali i jest urządzeniem wielokrotnego użytku. Można wykonać prosty test integralności, potwierdzający, iż membrana nie została uszkodzona.

2.2. Chromatografia jonowymienna

Podstawą chromatografii jonowymiennej jest współzawodnictwo jonów znajdujących się w roztworze oraz zjonizowanych makrocząsteczek o możliwość oddziaływania z przeciwnie naładowanymi grupami funkcyjnymi jonowymieniacza. Zatem rozdział makrocząsteczek w chromatografii jonowymiennej polega na odwracalnym oddziaływaniu złoża zawierającego grupy funkcyjne o zdefiniowanym ładunku z makrocząsteczkami, niosącymi ładunek o znaku przeciwnym.

PL 212 811 B1

Technika ta służy do preparatywnego izolowania białek i peptydów, bazując na występowaniu w ich cząsteczkach bocznych reszt aminokwasowych zdolnych do jonizacji. Determinują one tzw. punkt izoelektryczny białka, a co za tym idzie - jego sumaryczny ładunek w środowisku o danym pH.

Złoża chromatograficzne stosowane w tej technice noszą nazwę jonowymieniaczy, stanowią je odpowiednie nośniki (np. celulozowe, polistyrenowe) zawierające unieruchomione grupy funkcyjne, zdolne do dysocjacji w środowisku polarnym. Złoża te dzielimy na:

a) kationity - oddziałują z kationami, same obdarzone ładunkiem ujemnym

b) anionity - oddziałują z anionami, same obdarzone ładunkiem dodatnim.

Jako złoże do chromatografii jonowymienne wybrano Polymixin B (firmy SIGMA, nr kat. P1411) które jest silnym kationitem, cyklicznym antybiotykiem wyizolowanym z Bacillus polymyxa. Hamuje wzrost drobnoustrojów, włączając E. coli. Polymixin B jest zmienną mieszaniną B1 i B2 z masą molekularną ok. 1450. Polymiksiny łączą się ze ścianą komórkową i niszczą normalną przepuszczalność dla małych cząsteczek. Polymixin B i inne polimiksyny antybiotyków działają głównie przez wiązanie się do fosfolipidów błonowych i niszą błonę cytoplazmatyczną. Polymixin B działa bakteriobójczo na większość pałeczek Gram ujemnych z wyjątkiem Proteus, nie są także aktywne wobec gatunków Neisseria, większości grzybów, a także Gram (+) bakterii.

Ponieważ stwierdzono powinowactwo Polymixin B do ściany komórkowej bakterii (które zawierają LPS, zwane endotoksynami), Polymixin B immobilizowano na agarozie i użyto do usunięcia endotoksyn z roztworów. Agaroza histaminowa była użyta w tym samym celu. Polymixin B (firmy SIGMA, nr kat. P1411) była testowana pod względem zdolności wiązania LPS z E. coli O128:B12. W ulotce informacyjnej opisano sposób preparatyki z zastosowaniem Polymixin B (w załączeniu). Kolumnę można regenerować co najmniej 10 razy.

2.3. Przeprowadzenie procesu oczyszczania lizatu fagowego

2.3.1. Zagęszczanie na module tangencjalnym

Około 1000 ml lizatu fagowego zagęszczono na module tangencjalnym o cut-off 300 kDa (Minmate™ TFF z firmy Pall Life Science), do 25 ml (ustawienie pompy perystaltycznej 0,70). Dodano 25 ml buforu (20 mM fosforan sodu, 150 mM NaCl, pH 7,2). Zagęszczono do 25 ml. Dodano 25 ml bufona. Zagęszczono do 25 ml. Dodano 25 ml bufona. Zagęszczono do 25 ml. Dodano 25 ml buforu. Zagęszczono do 25 ml. Dodano 25 ml buforu. Zagęszczono do 25 ml. Dodano 25 ml buforu. Zagęszczono do 25 ml. Dodano 25 ml buforu. Zagęszczono do 25 ml. Dodano 25 ml buforu. Zagęszczono do 25 ml, cyrkulowano w module bez filtracji (wężyk „filtrate zamknięty) 5 min, ustawienie pompy 0,9. Wypompowano faga z modułu. Dodano 25 ml buforu, cyrkulowano w module bez filtracji (wężyk „filtrate zamknięty) 5 min, ustawienie pompy 0,9. Wypompowano faga z modułu, połączono obie porcje faga.

2.3.2. Oczyszczanie faga na kolumnie chromatograficznej

Kolumienkę szklaną z wypełnieniem Polymixin B-Agarose Immobilised Sigma nr kat. P1411 (10 ml złoża Polymixin B) przepłukano buforem (20 mM fosforan sodu, 150 mM NaCl, pH 7,2), o zawartości endotoksyn więcej niż 0,25 EU/ml mniej niż 0,5 EU/ml, przy przepływie 0,2 ml/min. Nakładano próbkę faga przy takim samym przepływie. Z kolumny (frakcje niezaadsorbowane) wyeluowano kilka frakcji pośrednich oraz frakcję oczyszczonego faga w objętości ok. 50 ml.

Wydajność pierwszego etapu oczyszczania poprzez zagęszczanie i przepłukiwanie na module tangencjalnym wynosi 74-87%. Końcowa wydajność oczyszczania wynosi około 47%. Straty pojawiają się głównie na drugim etapie oczyszczania (kolumna Polymixin B) i wynikają najprawdopodobniej z silnego wiązania endotoksyny do cząstek fagowych, które zatrzymywane są razem z endotoksyną na kolumnie.

2.3.2. Parametry jakościowe oczyszczonego faga

Oczyszczony roztwór faga poddano sterylizacji filtracyjnej, a następnie wykonano badania aktywności (test Gratia), zawartości endotoksyn (test LAL), profilu zanieczyszczeń (metoda HPLC).

Uzyskane wyniki

1. Aktywność cząstek fagowych

Miano lizatu wyjściowego - wynosiło rzędu 10 pfu/ml

Miano oczyszczonego faga - wynosiło rzędu 10⁹ pfu/ml

2. Zawartość endotoksyn bakteryjnych

Etap zagęszczania i przepłukiwania na module tangencjalnym usuwa od 90 do 97,5% endotoksyny w stosunku do jej ilości w preparacie wyjściowym. Natomiast kolumna z wypełnieniem Polymixin B usuwa dodatkowo od 50 do 87,5% endotoksyny. Zatem całościowo w wyniku oczyszczania usuwane jest od 97,5% do 99,4% endotoksyny w stosunku do jej ilości w preparacie wyjściowym. Ponieważ

PL 212 811 B1 jednak w trakcie oczyszczania faga z endotoksyny następują straty w ilości samego faga, dlatego obliczono ilość endotoksyn przypadających na jednostkę faga na każdym etapie oczyszczania. Zatem ilość endotoksyny na jednostkę faga po pierwszym etapie oczyszczania (zagęszczanie i przepłukiwanie na module) spada o około 65 do 91%. Natomiast cała procedura obniża ilość endotoksyn na jednostkę faga od 99,2 do 99,8%.

3. Profil zanieczyszczeń

Analizy „zanieczyszczeń białkowych” wykonano przy zastosowaniu kolumny TSK-G 4000 SW 7,5 x 600 mm, w buforze 0,15 M fosforan sodu pH 6,8; przepływ 1 ml/min. Objętość nakładanej próbki: 100 μ|. Detekcję prowadzono przy trzech długościach fali: 220; 254 i 280 nm. Udział poszczególnych frakcji w badanych preparatach został obliczony poprzez całkowanie pola powierzchni pod szczytami:

Stopień oczyszczenia lizatu fagowego wynosi od 1000 - 3000 razy w stosunku do lizatu wyjściowego. Największy udział w usuwaniu „zanieczyszczeń białkowych” ma kolejne zagęszczanie i przepłukiwanie faga na module tangencjalnym. Oczyszczanie na kolumnie z wypełnieniem Polymixin B nie zwiększa znacząco poziomu czystości w kontekście zanieczyszczeń białkowych. Zadaniem tej kolumny nie jest jednak oczyszczanie faga z tego typu zanieczyszczeń ale usuwanie endotoksyn.

Przykład 3 (porównawczy): Wyniki oczyszczania lizatów bakteriofagowych uzyskiwane innymi metodami

W celu porównania wyników oczyszczania lizatów fagowych uzyskiwanych sposobem według wynalazku z rezultatami stosowania znanych metod oczyszczania wykonano eksperymenty porównawcze, w których wykorzystano następujące techniki:

Eksperyment porównawczy 1: wirowanie w gradiencie chlorku cezu

Eksperyment porównawczy 2: ultrafiltracja z zastosowaniem urządzenia Amicon

Eksperyment porównawczy 3: ultrafiltracja z zastosowaniem urządzenia Amicon i Centricon, a następnie sączenie molekularne (Sepharose 4B)

Eksperyment porównawczy 4: ultrafiltracja z zastosowaniem urządzenia Amicon a następnie sączenie molekularne (Sepharose 4B)

Eksperyment porównawczy 5: chromatografia jonowymienna z zastosowaniem komercyjnej membrany Mustang Acrodisc (firma Pall)

Eksperyment porównawczy 6:

etap 1: Ultrafiltracja (moduł tangencjalny) etap 2: chromatografia jonowymienna z zastosowaniem komercyjnej membrany Mustang Acrodisc (firma Pall) etap 3: kolumna do usuwania endotoksyn (Celllufine Sulfate)

Eksperyment porównawczy 7:

etap 1: Ultrafiltracja (moduł tangencjalny) etap 2: kolumna do usuwania endotoksyn Cellufine Sulfate

Wyniki eksperymentów zaprezentowano w Tabeli 2.

PL 212 811 B1

W celu porównania wyników uzyskiwanych sposobem według wynalazku z rezultatami stosowania znanych metod oczyszczania wykonano eksperymenty porównawcze, w których wykorzystano następujące techniki:

PL 212 811 B1

Eksperyment porównawczy 1: wirowanie w gradiencie chlorku cezu

Eksperyment porównawczy 2: ultrafiltracja z zastosowaniem urządzenia Amicon

Eksperyment porównawczy 3: ultrafiltracja z zastosowaniem urządzenia Amicon i Centricon, a następnie sączenie molekularne (Sepharose 4B)

Eksperyment porównawczy 4: ultrafiltracja z zastosowaniem urządzenia Amicon a następnie sączenie molekularne (Sepharose 4B)

Eksperyment porównawczy 5: chromatografia jonowymienna z zastosowaniem komercyjnej membrany Mustang Acrodisc (firma Pall)

Eksperyment porównawczy 6:

etap 1: Ultrafiltracja (moduł tangencjalny) etap 2: chromatografia jonowymienna z zastosowaniem komercyjnej membrany Mustang Acrodisc (firma Pall) etap 3: kolumna do usuwania endotoksyn (Celllufine Sulfate)

Eksperyment porównawczy 7:

etap 1: Ultrafiltracja (moduł tangencjalny) etap 2: kolumna do usuwania endotoksyn Cellufine Sulfate

Claims (5)

1. Sposób otrzymywania oczyszczonych preparatów bakteriofagowych, znamienny tym, że:

a) prowadzi się hodowlę szczepu gospodarza bakteryjnego, hodowlę zaszczepia się bakteriofagami i uzyskuje się lizat bakteriofagowy, korzystnie o mianie nie niższym niż 10⁷ pfu/ml, a otrzymany lizat fagowy ewentualnie podaje się sterylizacji filtracyjnej,

b) prowadzi się oczyszczanie lizatu fagowego metodą ultrafiltracji na module tangencjalnym,

c) uzyskany przesącz oczyszcza się techniką chromatografii jonowymiennej na kolumnie wypełnionej kationitom, korzystnie zawierającej polymixin B, a następnie poddaje się ewentualnie sterylizacji filtracyjnej

d) z uzyskanego przesączu przygotowuje się oczyszczony preparat bakteriofagowy, korzystnie o mianie rzędu 10⁹ pfu/ml i pozbawionym co najmniej 95% endotoksyn w stosunku do ich ilości w wyjściowym lizacie bakteriofagowym uzyskiwanym w etapie a.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w trakcie etapu a) hodowlę szczepu gospodarza bakteryjnego prowadzi się w bulionie hodowlanym o pH około 7,2 zawierającym wyciąg mięsny, enzymatyczny hydrolizat kazeiny, hydrolizat drożdży, pepton, NaCl.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w trakcie etapu a) jako szczep gospodarza bakteryjnego stosuje się szczep bakteryjny wrażliwy na lityczne działanie namnażanego bakteriofaga.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w trakcie etapu a) uzyskany lizat fagowy podaje się sterylizacji filtracyjnej przez filtr jałowiący 0,22 μm.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w trakcie etapu b) stosuje się moduł tangencjalny o cut-off 300 kDa.