PL209978B1 - Awirulentna postać wirusa DNA karpia powodującego wirusową chorobę ryb, sposób wyodrębniania żywego atenuowanego wirusa DNA karpia, żywy atenuowany wirus karpia otrzymany tym sposobem, sposób diagnozowania choroby związanej z wirusem DNA karpia, szczepionka i zastosowanie szczepionki, oraz zestaw zawierający żywe atenuowane wirusy - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest awirulentna postać wirusa DNA karpia powodującego wirusową chorobę ryb, sposób wyodrębniania żywego atenuowanego wirusa DNA karpia, żywy atenuowany wirus karpia otrzymany tym sposobem, sposób diagnozowania choroby związanej z wirusem DNA karpia, szczepionka i zastosowanie szczepionki, oraz zestaw zawierający żywe atenuowane wirusy.

Ocenia się, że w USA koszty chorób ryb wynoszą dwadzieścia do trzydziestu centów z każdego dolara wydawanego na hodowlę ryb. Mimo, że patogeny ryb obejmują grzyby, pierwotniaki i bakterie, to choroby wirusowe są największym problemem posiadaczy wylęgarni, ponieważ zasadniczo nie możliwa jest kontrola wirusów. Nie istnieją skuteczne antybiotyki ani inne środki przeciwwirusowe, które skutecznie działają na wirusy u ryb.

W wielu krajach obserwowano, powodują c ą poważne straty finansowe, olbrzymią śmiertelność gatunku Cyprinus carpio w gospodarstwach rybnych hodujących ryby przeznaczone do spożycia, jak i ryby ozdobne. Chociaż ta śmiertelna choroba jest wysoce zakaźna i wyjątkowo zjadliwa, występowanie choroby i umieralność są ograniczone do populacji karpia i karpia Koi. Stwierdzono, że kilka blisko spokrewnionych gatunków, w tym inne karpiowate takie, jak karaś złocisty, nie wykazują objawów choroby, nawet po długotrwałym wspólnym przebywaniu z chorymi rybami w tym samym zbiorniku.

Intensywna hodowla karpia, karpia Koi, oraz innych karpiowatych w stawach lub w niewoli powoduje częste występowanie chorób wirusowych w tych populacjach. Jako przyczyny poważnych chorób u karpiowatych podawano koronawirusy (Miyazaki, 2000), rabdowirusy (Kim, 1999) iridowirusy (Shchelkunov, 1990) i wirusy opryszczki (Sano, 1985; Hedrick, 1990, 2000; Calle, 1999). Wirus opryszczki wykryto w brodawczakowatych wzrostach skórnych u karpia Koi w Ameryce Północnej (Hedrick, 1990; Calle, 1999). Wirus opryszczki karpia (CHV) jest identyczny z Herpesvirus cyprini występującym w populacjach karpia Koi w Japonii (Sano, 1985, 1991). Śmiertelna choroba obserwowana u karpiowatych w Izraelu występuje również w Ameryce Północnej, Europie i Korei (Hedrick, 2000; Walster, 1999; Oh, 2001).

Sugerowano, że chorobę wywołującą znaczną śmiertelność gatunku Cyprinus carpio powoduje wirus opryszczki karpia Koi (KHV). Jednakże w rzeczywistości wirus KHV scharakteryzowano jedynie częściowo (Hedrick, 2000; Gray, 2002; Body, 2000). Niezależnie od tego, jaki to wirus, choroba wykazuje charakterystyczny przebieg. Zaatakowane ryby zachowują się ospale, a później następuje śmierć. W okresie poprzedzającym śmierć na skrzelach pojawiają się białe plamy. Powstają one na skutek nekrozy tkanki skrzeli oraz nadmiernej produkcji śluzu i może im towarzyszyć krwawienie (Dawes, 2002).

Obecnie nie istnieją sposoby kontrolowania tej choroby oprócz zniszczenia zainfekowanego rybostanu i odkażenia urządzeń wylęgarni. Chociaż umieralność może osiągnąć nawet 100%, niektóre ryby mogą przeżyć i przeżywają, a czasami przeżywalność przekracza 20%. Ryby te stają się wówczas odporne na kolejne ataki wirusa i pozostają zdrowe mimo przeprowadzonych prób ich ponownego zakażenia.

Na podstawie tych i innych, podobnych, obserwacji miejscowi hodowcy w Izraelu stworzyli składający się z siedmiu etapów protokół mający na celu uzyskanie naturalnie odpornych ryb, które są bezpieczne, czyste i mogą być dopuszczone do sprzedaży (Dawes, 2002).

Ten składający się z siedmiu etapów protokół obejmuje umożliwienie tarła i wylęgania się ryb w marcu, a nastę pnie hodowlę bez rozdzielania aż do lipca, kiedy to ryby są dzielone na róż ne kategorie jakości. Rozdzielone ryby naraża się wówczas na kontakt z wirusem przez cztery dni poprzez wprowadzenie chorych ryb do zbiornika, a następnie zapewnia się im dwa trwające trzy miesiące okresy rekonwalescencji. Następnie ryby doświadczają optymalnych warunków infekcji, które występują, kiedy na początku października spada temperatura, po czym są badane pod kątem odporności w styczniu.

Wynalazek odnosi się zatem do wyodrębnionego czynnika wywołującego chorobę atakującą Cyprinus carpio. Zgodnie z obecnym wynalazkiem stwierdzono, że ten czynnik to niesklasyfikowany jeszcze wirus DNA.

Przedmiotem wynalazku jest awirulentna postać wirusa DNA karpia powodującego wirusową chorobę ryb, który jest dwuniciowym wirusem DNA o kapsydzie w kształcie dwudziestościanu, o wielkości około 90-110 nm, według mikroskopii elektronowej, którego DNA zawiera od 250 000 do 300 000 par zasad, korzystnie od 260 000 do 285 000 par zasad, najkorzystniej około 277 000 par zasad.

PL 209 978 B1

W korzystnym rozwią zaniu awirulentna postać wirusa ma postać ż ywego atenuowanego wirusa lub dezaktywowanego DNA wirusa karpia.

Korzystnie ryby należą do gatunku Cyprinus carpio.

Przedmiotem wynalazku jest także awirulentna postać wirusa będąca żywym atenuowanym wirusem DNA karpia, którym jest wirus zdeponowany pod numerem dostępu CNCM 1-3146 w Collection Nationale de Cultures De Microorganismes, Instytut Pasteura, Paryż, Francja.

Korzystnie awirulentna postać wirusa ma właściwości żywego atenuowanego wirusa, korzystniej ma właściwości indukowania u ryb odpowiedzi immunologicznej przeciw wirusowi DNA karpia, bez zjadliwości związanej z tym wirusem DNA karpia.

W korzystnym rozwiązaniu awirulentna postać wirusa jest w postaci dezaktywowanego DNA wirusa karpia i ma właściwości indukowania u ryb odpowiedzi immunologicznej przeciw wirusowi DNA karpia bez zjadliwości związanej z tym wirusem DNA karpia.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wyodrębnienia żywego atenuowanego wirusa DNA karpia, w którym najpierw wysiewa się zjadliwy wirus powodujący wirusową chorobę ryb na hodowle komórek rybich, przy czym zjadliwy wirus jest dwuniciowym wirusem DNA, o kapsydzie w kształcie dwudziestoś cianu, o wielkości około 90-110 nm, według mikroskopii elektronowej, którego DNA zawiera od 250 000 do 300 000 par zasad; po czym identyfikuje się łysinki wywołane przez wirus o zmniejszonej zjadliwości i wyodrębnia się z takiej łysinki wirus potomny.

Korzystnie wyodrębnione wirusy ponownie wysiewa się na hodowle komórek rybich i procedurę tę powtarza się wielokrotnie, aż do uzyskania odpowiednio atenuowanego żywego wirusa.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto żywy atenuowany wirus karpia otrzymany sposobem według wynalazku.

Przedmiotem wynalazku również jest preparat szczepionki do immunizacji ryb przeciw infekcji powodowanej przez wirusa DNA karpia powodującego wirusową chorobę ryb, który to preparat szczepionki zawiera awirulentnego wirusa będącego dwuniciowym wirusem DNA, o kapsydzie w kształcie dwudziestościanu, o wielkości około 90-110 nm, wed ług mikroskopii elektronowej, którego DNA zawiera od 250 000 do 300 000 par zasad. Korzystnie jako awirulentną postać wirusa zawiera żywy atenuowany wirus według wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób diagnozowania choroby związanej z wirusem DNA karpia, powodującym wirusowa chorobę ryb, będącym dwuniciowym wirusem DNA, o kapsydzie w kształcie dwudziestościanu, o wielkości około 90-110 nm, według mikroskopii elektronowej, którego DNA zawiera od 250 000 do 300 000 par zasad, w którym to sposobie wyodrębnia się tkanki z podejrzanych ryb i stwierdza się obecność markerów wirusowych związanych z wirusem DNA, których obecność wskazuje, że badana ryba jest zainfekowana badanym wirusem DNA.

Korzystnie tkankę uzyskuje się z pojedynczego narządu, z kilku narządów, z całej ryby, lub z krwi, korzystniej z narządu takiego jak skrzela, nerki, ś ledziona, wątroba lub jelita.

Ponadto przedmiotem wynalazku jest zastosowanie preparatu szczepionki składający się z żywej atenuowanej postaci wirusa określonej powyżej do wytwarzania leku do zastosowania w zapobieganiu lub leczeniu infekcji powodowanej przez wirus u ryb przez immunizację ryb przeciw infekcji wirusowej, powodowanej jest przez wirus DNA, który jest dwuniciowym wirusem DNA o kapsydzie w kształcie dwudziestoś cianu, o wielkości około 90-110 nm, według mikroskopii elektronowej, a jego DNA zawiera od 250 000 do 300 000 par zasad, w którym podaje się podatnym na zakażenie rybom skuteczną ilość szczepionki.

Korzystnie szczepionkę podaje się do hodowli prowadzonej w wodzie, korzystniej podawanie obejmuje podawanie poszczególnym rybom zastrzyków, rozpylanie lub zanurzenie preparatu w hodowli prowadzonej w wodzie. W korzystnym rozwiązaniu szczepionkę podaje się rybom doustnie w pokarmie.

Przedmiotem wynalazku jest także zestaw zawierający żywe atenuowane wirusy określone powyżej do leczenia ryb przeciwko wirusowi karpia i instrukcje jego stosowania.

W innej odmianie, przedmiotem jest zestaw, który zawiera przeciwciało lub skoniugowane przeciwciało do diagnozowania choroby związanej z wirusem DNA karpia powodującym chorobę wirusową u ryb, który to wirus jest dwuniciowym wirusem DNA o kapsydzie w kształcie dwudziestoś cianu, o wielkoś ci okoł o 90-110 nm, wedł ug mikroskopii elektronowej, którego DNA zawiera od 250 000 do 300 000 par zasad, i instrukcje jego stosowania, przy czym przeciwciało oraz skoniugowane przeciwciało wiążą się selektywnie z wirusem DNA lub z jego składnikiem. Zestaw korzystnie zawiera ponadto co najmniej jedną kontrolę będącą antygenem lub tkanką zawierającą antygen.

PL 209 978 B1

Przedmiotem wynalazku jest również preparat szczepionki do immunizacji ryb przeciw infekcji powodowanej przez DNA-wirusa karpia powodującego chorobę wirusową u ryb, który jest dwuniciowym wirusem DNA o kapsydzie w kształcie dwudziestościanu, o wielkości około 90-110 nm, według mikroskopii elektronowej, a jego DNA zawiera od 250 000 do 300 000 par zasad, który to preparat szczepionki zawiera surowicę zwierząt immunizowanych żywą atenuowaną postacią wirusa określonego powyżej.

W innej odmianie przedmiotem wynalazku jest preparat szczepionki indukują cej odpowiedź immunologiczną u ryb, zawierający wektor ekspresyjny niosący sekwencję nukleotydową, która koduje jedno lub więcej białek wirusa DNA karpia powodującego chorobę wirusową u ryb, który to wirus jest dwuniciowym wirusem DNA o kapsydzie w kształcie dwudziestościanu, o wielkości około 90-110 nm, według mikroskopii elektronowej, a jego DNA zawiera od 250 000 do 300 000 par zasad, sekwencję kontrolną regulującą ekspresję tej sekwencji nukleotydowej w komórkach karpia wraz z nośnikiem, zaróbką lub adiuwantem. Korzystnie rybami są karpie oraz karpie Koi.

Będący przedmiotem wynalazku, wyodrębniony wirus DNA karpia (określany jako wirus DNA CV) to duży dwuniciowy wirus DNA, o kapsydzie w kształcie dwudziestościanu, mający wielkość około 90-110 nm, co wyznaczono techniką mikroskopii elektronowej. Stwierdzono, że DNA wirusa karpia zawiera od około 250 000 do 300 000 par zasad, co wyznaczono elektroforetycznie, w żelu w zmiennym polu elektrycznym i w wyniku analizy produktów otrzymanych w wyniku trawienia enzymami restrykcyjnymi. Wirus ten jest w oczywisty sposób różny od wirusa KHV opisanego w literaturze.

Objęty wynalazkiem wirus karpia może charakteryzować się jedną lub więcej spośród następujących cech (stwierdzonych dla specyficznego preparatu wirusa opisanego poniżej): (a) wirus jest wysoce zakaźny, (b) może być przenoszony przez wodę, (c) wywołuje chorobę w zakresie temperatur 18-25°C, jak to zaobserwowano w zbiornikach na otwartym powietrzu oraz w warunkach laboratoryjnych, i (d) ma wąski zakres możliwych gospodarzy, ponieważ nawet blisko spokrewnione karpiowate są odporne na zakażenie tym wirusem, który nie mógł się rozmnażać w hodowlach nabłoniaka brodawkowatego karpia (EPC).

Wirus DNA CV według wynalazku może być przygotowany w czystej postaci, to znaczy wolnej od innych wirusów lub czynników bakteryjnych.

Wirus DNA CV, może być wyodrębniony sposobem, który obejmuje identyfikację ryb mających objawy związane z CV, zebranie tkanek z zakażonych ryb, hodowlę zaatakowanej tkanki razem z komórkami ryb do momentu, gdy w tych komórkach ryb wystą pi efekt cytopatogenny, zebranie pożywki hodowlanej z takiej hodowli i wyodrębnienie cząstek wirusa. Stosowane komórki ryb to korzystnie hodowle komórek płetwy. Jeśli zakażonymi rybami są karpie, korzystnie, stosuje się komórki płetwy karpia (CFC). Jeśli zakażonymi rybami są karpie Koi, stosuje się komórki płetwy karpia Koi.

Zjadliwy wirus zazwyczaj jest wyodrębniany z tkanek chorych ryb, korzystnie z tkanek nerek i wątroby, oraz z krwi. W przypadku karpia hodowla razem z CFC trwa zwykle 5-6 dni, zanim można zaobserwować efekt cytopatogenny.

Wirus DNA CV zdeponowany został także pod numerem CNCM I-3145 w Collection Nationale de Cultures De Microorganismes (CNCM), Instytut Pasteura, Paryż, Francja, w dniu 12 grudnia 2003.

Jednym z zastosowań wyodrębnionego wirusa DNA CV według wynalazku jest przygotowanie awirulentnej postaci wirusa, którą można stosować, zgodnie z wynalazkiem, do szczepienia ryb przeciwko infekcjom spowodowanym przez wirus DNA CV. Awirulentna postać wirusa DNA CV może być na przykład postacią atenuowaną wirusa, inaktywowaną postacią wirusa, genetycznie zmodyfikowaną postacią wirusa, nagim DNA wirusa i tym podobnymi.

Po wyodrębnieniu wirusa z łysinek w sposobie wyodrębnienia żywej atenuowanej postaci wirusa, jeśli jest to pożądane, można następnie oczyścić wirus. Korzystnie wyodrębnione wirusy ponownie wysiewa się na hodowle rybich komórek wywodzących się z karpia lub z różnych innych gatunków ryb, takich jak między innymi tołpygi białej (Hypophthalmichthys molitrix), karasia złocistego (Carassius aurata) i amura białego (Ctenopharyngodon idella). Taki sam proces można następnie wielokrotnie powtarzać, aż do otrzymania istotnie atenuowanych żywych wirusów.

Wyodrębniony wirus DNA CV stosowany jest w przygotowaniu inaktywowanej postaci wirusa, którą można stosować do szczepienia ryb przeciw infekcjom spowodowanym przez wirus DNA CV.

Opisany tutaj sposób inaktywacji wirusa DNA CV obejmuje wyodrębnienie zjadliwego wirusa, poddawanie go obróbce chemicznej lub fizycznej, i otrzymywanie w ten sposób dezaktywowanego wirusa CV. Można stosować dowolny znany w tej dziedzinie sposób obróbki chemicznej lub fizycznej. Obróbka chemiczna może na przykład, obejmować narażenie wirusa na rozpuszczalniki organiczne

PL 209 978 B1 takie, jak formalina, aceton, metanol, etanol, itd., zgodnie ze sposobami znanymi z literatury specjalistom w tej dziedzinie. Obróbka fizyczna może obejmować na przykład naświetlanie UV lub działanie wysokich albo niskich temperatur.

Inaktywowany wirus otrzymany tak, jak to opisano wcześniej lub za pomocą jakiegokolwiek innego sposobu znanego w tej dziedzinie, może nie tworzyć łysinek nawet w wysokich stężeniach i przy wysokim mianie, lub może tworzyć łysinki jedynie w bardzo wysokim stężeniu, w porównaniu z żywym atenuowanym wirusem, który tworzy łysinki nawet w minimalnych stężeniach.

Wyodrębniony wirus DNA CV stosowany jest do przygotowania genetycznie modyfikowanej postaci wirusa, którą można stosować do szczepienia ryb przeciw infekcjom spowodowanym przez wirus DNAa CV.

Zgodnie z wynalazkiem, żywa atenuowana postać wirusa DNAa CV powodująca chorobę u Cyprinus carpio, może być stosowana w szczepieniach.

Odpowiednia jest również inaktywowana postać wirusa DNAa CV powodującego chorobę u Cyprinus carpio, jak to opisano powyżej, do zastosowana w szczepieniach.

Preparat szczepionki do immunizacji ryb przeciw infekcji powodowanej przez tego wirusa DNAa CV, zawierający jako składnik aktywny awirulentną postać owego wirusa, może zawierać na przykład, żywy atenuowany wirus, inaktywowany wirus, lub ich kombinację. W tym aspekcie opisano tu zastosowanie awirulentnego wirusa takiego, jak żywy atenuowany wirus, aktywny wirus lub ich kombinacja, do produkcji tego preparatu szczepionki.

Inaktywowany wirus może być stosowany w szczepionce jednoskładnikowej lub w szczepionce wieloskładnikowej w połączeniu z ujawnionym tutaj żywym atenuowanym wirusem lub, z co najmniej jedną inną szczepionką, która może być znana specjalistom w tej dziedzinie. Inaktywowany wirus może być podawany równocześnie z inną szczepionką, lub w innym czasie. Na przykład podanie dezaktywowanego wirusa może nastąpić kilka dni przed podaniem żywego atenuowanego wirusa.

W korzystnym rozwiązaniu preparat szczepionki zawierający awirulentną postać wirusa występuje w postaci stałej, np. w postaci proszku, w postaci liofilizowanej, w postaci sprasowanych granulek lub tabletek, itd. W innym rozwiązaniu ten wirus może występować w formie płynu z hodowli tkankowej. Taki płyn można przechowywać w temperaturze otoczenia, korzystnie w -70°C, jeszcze korzystniej jako roztwór zawierający glicerol. W jednym szczególnym przykładzie płyn z hodowli tkankowej zawiera 20% glicerol.

W kolejnym aspekcie preparat szczepionki do biernej immunizacji ryb przeciw infekcji wywoł anej przez tego wirusa CV, zawiera surowicę immunizowanych ryb, otrzymaną ze zwierząt, np. ryb, koni, świń, bydła, myszy, królików, itd., immunizowanych żywą atenuowaną postacią tego wirusa CV. W korzystnym rozwiązaniu zwierzętami są ryby.

W odniesieniu do tego aspektu sposób leczenia ryb zainfekowanych przez ten wirus DNA CV obejmuje etapy immunizacji zwierzęcia awirulentnym wirusem CV według wynalazku, zbieranie surowicy immunizowanego zwierzęcia i leczenie ryb za pomocą tej surowicy, dzięki czemu następuje immunizacja ryb.

Różne formy wirusa przedstawione tutaj można przekształcić w postać suchą różnymi sposobami. Szczególnie korzystnym sposobem suszenia jest liofilizacja. Przed suszeniem, tzn. przed procesem liofilizacji, do pożywki można dodać różne dodatki, takie jak środki konserwujące, przeciwutleniacze, lub środki redukujące, rozmaite zaróbki, itd. Takie zaróbki można również dodawać do stałego, np. liofilizowanego aktywnego atenuowanego wirusa, także po etapie suszenia.

Immunizację przeprowadza się zazwyczaj dodając awirulentną postać wirusa taką, jak żywy atenuowany wirus lub inaktywowany wirus, lub ich kombinację, do wody zawierającej ryby, które mają być immunizowane. Można również podawać preparat szczepionki bezpośrednio rybom za pomocą zastrzyków. Aby wzmocnić odpowiedź immunologiczną, preparat może również zawierać rozmaite adiuwanty, cytokiny lub inne immunostymulanty, szczególnie w przypadku preparatów, które mają być podawane w zastrzykach. Preparat szczepionki, szczególnie wtedy, gdy wprowadza się go do wody z rybami, może również obejmować rozmaite stabilizatory, antybiotyki, itd.

Przeciwciało, które selektywnie wiąże się z wirusem CV według wynalazku, lub z jego składnikiem, w jednym rozwiązaniu wiąże się specyficznie z rybim wirusem DNA lub z jego składnikiem.

Zestaw diagnostyczny według wniosku można stosować do diagnozowania żywych lub nieżywych ryb, pod kątem obecności wirusa według wynalazku.

PL 209 978 B1

Skróty

CFC - komórki płetwy karpia; CHV - wirus opryszczki karpia; CNGV - wirus zapalenia nerek i nekrozy skrzeli u karpia; CPE - efekt cytopatogenny; CV - wirus karpia; EPC - nabłoniaka brodawkowatego karpia; HSV - wirus opryszczki; KHV - wirus opryszczki karpia Koi; KFC - komórki płetwy karpia Koi; PBS - izotoniczny roztwór chlorku sodu buforowany fosforanami; PFU - jednostki powstawania łysinek; PTA -fosfowolframian; SDS - dodecylosiarczan sodu; TCI - całkowite DNA wyizolowane z zainfekowanych CFC; TCU - cał kowite DNA wyizolowane z niezainfekowanych CFC.

Krótki opis rysunku

W celu lepszego zrozumienia wynalazku i przedstawienia realizacji wynalazku w praktyce, bez ograniczenia zakresu wynalazku, zilustrowano korzystne rozwiązanie w przykładach, w odniesieniu do dołączonego rysunku, w którym:

Fig. 1 przedstawia kinetykę umieralności dla karpia Koi po teście prowokacji przez współzamieszkanie. Dorosłe ryby podzielono na trzy grupy po 114, 114 i 115 ryb. Grupę 1 (□) i grupę 2 () narażono na kontakt z zainfekowanym osobnikiem, a grupa 3 (▲) stanowiła niezainfekowaną grupę kontrolną. Ilość ryb, które przeżyły sprawdzano codziennie.

Fig. 2 przedstawia uzyskane za pomocą mikroskopii elektronowej obrazy wirusa CV zebranego z zainfekowanych komórek płetwy karpia (CFC). Oczyszczony wirus barwiono negatywnie za pomocą 2% fosfowolframianu (PTA). Rozmiary cząstek były w zakresie 96 - 105 nm, średnia wynosiła 103 nm.

Fig. 3 przedstawia analizę DNA CV za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Na Fig. 3A genom wirusowego DNA otrzymano z oczyszczonych wirusów za pomocą ekstrakcji fenolem. Każda ścieżka przedstawia inny protokół: inkubacja z proteinazą K i SDS (ścieżka 2), inkubacja z samym SDS (ścieżka 3), traktowanie pronazą i SDS (ścieżka 4) oraz bez wstępnego traktowania (ścieżka 5). Jako markery wykorzystano DNA plazmidu adenowirusowego (pAdEasy-1) zlinearyzowane przez trawienie ClaI (ścieżka 6) i nietrawione (ścieżka 7). Analizę przeprowadzono w 0,8% żelu agarozowym, a jako standardy wielkości wykorzystano DNA faga λ nałożone na ścieżki 1 i 8. Fig. 3B przedstawia analizę DNA CV za pomocą elektroforezy w żelu w zmiennym polu elektrycznym (PFGE). Na ścieżki 2-7 nałożono te same preparaty DNA, które opisano dla Fig. 3A, a na ścieżkę 8 nałożono dodatkową próbkę DNA CV oczyszczonego za pomocą proteinazy K. Jako standardy wielkości posłużyły DNA faga λ trawione Hindlll (ścieżka 9) i drabinki (zawierające coraz większe konkatamery DNA faga λ mające od 50 do 1000 kilobaz) DNA faga λ po ligacji (ścieżka 1). Fig. 3C przedstawia wyniki otrzymane po trawieniu DNA CV enzymami restrykcyjnymi. Wirusowe DNA inkubowano z enzymem restrykcyjnym Swal w buforze reakcyjnym (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol, z dodatkiem 100 μ g/ml BSA) w 25°C przez 3 godziny. Prowadzą c PFGE za pomocą ż eli typu CHEF (Contour-clamped Homogeneous Electric Field), produkty reakcji analizowano na 1% żelu agarozowym, w następujących warunkach: 6 V/cm, 14°C, przez 14 godzin. Czasy przełączania wydłużały się od 5 do 35 sekund. Ścieżka 1 - nietrawione DNA wirusowe; ścieżka 2 - wirusowe DNA trawione enzymem restrykcyjnym Swal.

Fig. 4 przedstawia analizę białka wirusowego CV. Adenowirus, HSV-1 i wirus karpia oczyszczono z pożywki do hodowli tkankowych za pomocą gradientu sacharozy. Osady wirusów zagotowano w buforze Laemeli i rozdzielono przez elektroforezę w dwóch równoległ ych 10% ż elach akrylamidowych. Pierwszy żel wybarwiono błękitem Coomassie i pokazano na panelu A. Z drugiego żelu dokonano transferu białek na membranę PVDF i znakowano je za pomocą króliczych przeciwciał przeciw wirusowi karpia, a wyniki pokazano na panelu B. Surowica reaguje z białkami CV (ścieżka po prawej), ale nie z białkami wirusa opryszczki lub adenowirusa.

Fig. 5 przedstawia identyfikację fragmentów genomu CV powielonych za pomocą reakcji PCR z DNA z CFC i z narządów ryby. Całkowite DNA uzyskane z zainfekowanych CFC (TCI), niezainfekowanych CFC (TCU), wirusowe DNA (CV) i DNA z wątroby chorych i nie kontaktujących się z wirusem ryb (odpowiednio LI oraz LU) oraz z nerek chorych i nie kontaktujących się z wirusem ryb (odpowiednio KI oraz KU). M = standard wielkości DNA. Startery używane do amplifikacji DNA pochodziły z klonu D. Startery AP1-AP2 i AP1-AP3 stosowano w reakcji PCR (odpowiednio panel A i panel B).

Fig. 6A-F przedstawiają homologię sekwencji pochodzących z genomu CV do innych sekwencji wirusowych. Klony wirusowego DNA sekwencjonowano i analizowano za pomocą programu BLAST z PubMed (NIH). Skróty uż ywane tutaj są nastę pujące: herpeswirus (wirus opryszczki pospolitej) Herpex simplex 1, 2, 5 i 8 (odpowiednio HSV-1, HSV-2, HSV-5 i HSV-8); wirus Aujeszkyego (Herpesvirus suis) (PRV); wirus drobiu wywołujący chorobę Mareka (GHV); radinowirus rezusa (MMRV); herpeswirus tupai (THV); mysi wirus cytomegalii (CMVm); ludzki wirus cytomegalii (CMVh); herpeswirus marPL 209 978 B1 mozety (MarHV). Wszystkie wymienione powyżej wirusy należą do Herpesviridae. Wirus poliedrozy jądrowej Spodoptera exigua (SENHV), granulowirus (wirus ziarnisty) rolnicy panewki (XcNGV), wirus poliedrozy jądrowej brudnicy nieparki (LDNV), wirus poliedrozy jądrowej Orygia pseudosugata (OPNV) i bakulowirus komara Culex nigripapus (CBV) należą do Baculoviridae, wirus Ectocarpus siliculosus (ESV) to wirus występujący u glonów. Wirus yaba (YIDV) należy do wirusów ospy. Ludzki wirus niedoboru odpornościowego typu 1 (HIV-1), ludzki wirus endogenny (HEV) i świński retrowirus endogenny (PERV) należą do Retroviridea. Świński adenowirus (PAdV) i ludzki adenowirus (HAdV) należą do grupy Adenoviridae. Wirus biegunki bydła (BVDV) to flawiwirus. Wirus zakaźnej martwicy trzustki (IPNV) to birnawirus. Wirus różyczki (Rubella) to togawirus. Ludzki wirus papilloma typu 27 (HPV-27).

Fig. 7A-B przedstawiają wpływ zakażenia ryb wirusem zjadliwym. Fig. 7A przedstawia łączną umieralność w grupie 50 ryb, które wcześniej nie miały kontaktu z wirusem, po infekcji wirusem zjadliwym. Fig. 7B przedstawia umieralność ryb, które przeżyły początkową infekcję, a następnie poddano je testowi prowokacji przez współmieszkanie z chorymi rybami.

Fig. 8A-B przedstawiają efekty zakażenia ryb żywym atenuowanym wirusem. Fig. 8A przedstawia umieralność ryb po podaniu zastrzyku (dootrzewnowo), który zawierał żywe atenuowane wirusy w stężeniu 6x10³ PFU/ml. Fig. 8B przedstawia umieralność ryb, które przeż yły początkowe podanie atenuowanego wirusa, a następnie poddano je testowi prowokacji przez współmieszkanie z chorymi rybami.

Fig. 9 przedstawia umieralność ogólną zaszczepionych ryb po teście prowokacji przez infekcję. Ryby (n=100 ryb w każdej grupie, średnia waga 50 g) zaszczepiano przez dootrzewnowy zastrzyk 4 klonów wirusów uzyskanych z wirusa CV po pasażu P26. Ryby, którym podano zastrzyk PBS stanowiły kontrolę negatywną (N.C.). Dwadzieścia pięć dni po infekcji, pięć ryb poddano kolejnemu testowi prowokacji przez współzamieszkanie z chorymi rybami.

Fig. 10 przedstawia kinetykę powstawania przeciwciał anty-CV u karpi immunizowanych przeciw atenuowanym wirusom.

Szczegółowy opis wynalazku

Poniżej zilustrowano wynalazek w odniesieniu do pewnych nieograniczających szczególnych rozwiązań.

Określenia wirus DNA karpia (wirus DNA CV lub CV, wirus DNA karpia) lub wirus zapalenia nerek i nekrozy skrzeli u karpia (CNGV), tak, jak się je stosuje poniżej i powyżej, są stosowanymi zamiennie synonimami, używanymi do określenia nowego wirusa według wynalazku, mającego cechy opisane poniżej i powyżej. Należy wziąć pod uwagę, że te określenia, tzn. CV oraz CNGV, nie ograniczają wynalazku do jakiegokolwiek szczególnego izolatu tego wirusa. Wynalazek obejmuje dowolne wirusy mające opisane tu nowe cechy.

Określenie wirus w kontekście wynalazku, odnosi się, bez ograniczeń, do blisko spokrewnionych szczepów szczególnego izolatu opisanego poniżej, mianowicie do dowolnego szczepu, który ma cechy genotypowe i/lub fenotypowe podobne do tego wyodrębnionego szczepu. Obejmuje to nieznacznie zmodyfikowane postacie oraz warianty wirusa, które zachowują taką samą aktywność funkcjonalną, a mianowicie addycje, delecje oraz podstawienia aminokwasów lub nukleotydów.

Określenie awirulentna/niezjadliwa postać wirusa w kontekście wynalazku, odnosi się, bez ograniczeń, do wirusa, który jest pozbawiony wszelkich cech wywołujących chorobę. Takie awirulentne wirusy mogą być np. wirusami atenuowanymi, inaktywowanymi, które stosuje się we wszelkich typach immunizacji, włączając w to immunizację bierną i czynną. Zakres wynalazku obejmuje również dowolne naturalne awirulentne odpowiedniki, których właściwości wywoływania opisanej tu choroby są zmniejszone.

Określenie ryba odnosi się do dowolnej ryby hodowlanej zaatakowanej przez wirusa CV, włączając w to ryby przeznaczone do spożycia i ryby ozdobne, na jakimkolwiek etapie jej rozwoju, np. larwy, narybku lub dorosłej ryby. To określenie obejmuje również wszelkie inne wodne zwierzęta hodowlane, które mogą zostać zaatakowane przez wirusa CV, lub mogą być zainfekowane, nie wykazując żadnych zachowań charakterystycznych dla chorych karpi zainfekowanych wirusem CV.

Fig. 1 przedstawia narażenie hodowanych w niewoli karpi, które nie miały wcześniej styczności z wirusem, z zainfekowanymi osobnikami pochodzą cymi z zaraż onej wylę garni. Naraż enie ryb na kontakt z zainfekowanym osobnikiem powoduje ich wysoką umieralność. Średnio 74% (odpowiednio 87 i 84 ryb) ryb zmarło 8-13 dni po narażeniu. Jednakże wszystkie ryby z grupy kontrolnej przeżyły 21-dniowy okres prowadzenia doświadczenia.

PL 209 978 B1

Trzy do czterech dni przed śmiercią ryby przestały jeść i zaczęły wykazywać anormalne zachowania takie, jak zmęczenie i ruchy dyszenia w płytkiej wodzie. Ponadto ryby miały nieskoordynowane ruchy i pływały w sposób nieregularny, co jest charakterystyczne dla chorób neurologicznych. U kilku ryb zaobserwowano objawy neurologiczne takie, jak zmniejszenie częstotliwości ruchów ogona i utrata równowagi. Podobne objawy opisano poprzednio u karpia i karpia Koi w USA (Hedrick, 2000). Po tych oznakach wystąpiły objawy poważnej nekrozy tkanek skrzeli, powierzchniowe krwotoki i zwiększone wydzielanie śluzu przez skórę. Przeprowadzenie sekcji chorych ryb ujawniło krwawe wybroczyny w wątrobie oraz inne niespójne zmiany patologiczne, co sugeruje objawy wtórnej infekcji (dane niepokazane).

W podobnych doś wiadczeniach przeprowadzanych w zbiornikach, gdzie ryby wylę gał y się w temperaturze 29°C, wszystkie narażone ryby przeż yły 22-dniowy okres prowadzenia doś wiadczeń (dane nieprzedstawione). Te wyniki jasno pokazują, że wirus wywołujący chorobę jest łatwo przenoszony w wodzie i jest wysoce zakaźny. Wirus powoduje wysoką umieralność, ale występowanie choroby ogranicza się do temperatur wody w zakresie 18 - 25°C.

Zgodnie z obecnym wynalazkiem przedstawiono sposób wyodrębnienia scharakteryzowanego powyżej wirusa CV, obejmujący identyfikację ryb wykazujących objawy związane z wirusem CV, hodowlę zaatakowanych tkanek razem z komórkami płetwy karpia, do wystąpienia efektu cytopatogennego, zbieranie pożywki z hodowli CFC razem z zaatakowanymi tkankami i wyodrębnienie cząstek wirusa.

W jednym specyficznym przykł adzie wirus wyodrę bniono z zainfekowanych osobników zgodnie z następującą procedurą: Wspólna hodowla komórek, które pobrano z nerek (11 osobników) i wą troby (5 osobników) zainfekowanych ryb, razem z CFC doprowadziła do pojawienia się efektów cytopatogennych (CPE) 5-6 dni po rozpoczęciu hodowli, podczas gdy wspólna hodowla komórek krwi z mózgu lub surowicy pochodzących z chorych karpi nie powodowała CPE. Dziesięć dni po wspólnej hodowli komórki odczepiły się od dna butelki i umarły. Pożywka hodowlana zebrana ze wspólnej hodowli CFC razem z komórkami nerki lub wątroby (5-7 po infekcji) została najpierw oczyszczona z komórek i resztek komórek przez wirowanie, a następnie zastosowano ją do oznaczenia miana wirusa w świeżych butelkach z CFC.

Pożywkę hodowlaną zebraną z zainfekowanych hodowli CFC oczyszczono przez wirowanie, a następnie za pomocą gradientu sacharozy. Czysty prążek przy 37-39% sacharozie ściągnięto z gradientu, rozcieńczono dziesięciokrotnie w PBS i żwirowano. Osad zawieszono w 500 μΐ PBS, a następnie pobrano próbki do miareczkowania na CFC i do analizy za pomocą mikroskopii elektronowej. Miano oczyszczonego preparatu wirusa w pożywce wynosiło 10⁶-10⁷ PFU/ml. Fig. 2 przedstawia parę cząstek wirusa z tego preparatu, całkowicie pozbawionych resztek komórek. Cząstki wybarwiono negatywnie i uwidoczniono ich symetryczny kształt dwudziestościanu z przeciętną średnicą rdzenia wynoszącą 103 nm, co przypomina rdzeń wirusów opryszczkowych (Riozman i wsp., Exp. Med. Biol., tom 278, 285-291, 1990).

Tabela 1A przedstawia, że ryby nie mające wcześniej kontaktu z wirusem, którym podano oczyszczoną pożywkę hodowlaną z niezainfekowanych CFC, nie wykazują objawów. Jednakże u 75% i 82% ryb, którym podano odpowiednio ekstrakty z zainfekowanych komórek lub oczyszczoną pożywkę hodowlaną zebraną z zainfekowanych hodowli, zmarły w ciągu 15 dni po zastrzyku dootrzewnowym. U tych ryb rozwinęły się typowe objawy patologiczne identyczne z objawami obserwowanymi u zainfekowanych ryb hodowanych w stawach.

Komórki nerki pobrane od zainfekowanych osobników wykazujących objawy choroby hodowano razem z CFC. Miano wirusa zebranego ze wspólnej hodowli wynosiło 1,5x10² - 1,8x10² PFU/ml dla CFC, według testu tworzenia łysinek, jak pokazano w Tabeli 1B. Pożywkę hodowlaną zebraną z tych zainfekowanych CFC zastosowano do ponownej infekcji młodocianych ryb, które nie miały wcześniej kontaktu z wirusem. Cztery spośród 10 ryb zmarły w wyniku choroby 9 do 14 dni po infekcji (Tabela 1C).

Takie doświadczenie typu 'ping-pong', które powtarzano w serii trzy razy, jasno świadczy, że wirus wyodrębniony z zainfekowanych ryb i hodowany w CFC jest rzeczywiście czynnikiem etiologicznym choroby.

PL 209 978 B1

T a b e l a 1A: Wyodrębnienie wirusa odpowiedzialnego za umieralność karpia

	Infekcja za pomocą:
Ryby:	Ekstrakty z zainfekowanych komórek: n=20	Pożywka z niezainfekowanych CFC: n=15	Pożywka z zainfekowanych CFC: n=17
Martwe ryby:	15 (75%)	0 (0%)	14 (82%)

T a b e l a 1B: Wspólna hodowla z CFC

Ryby zainfekowane za pomocą:
Ekstrakty z zainfekowanych komórek	Pożywka z niezainfekowanych CFC	Pożywka z zainfekowanych CFC
1,8x102 łysinek	0 łysinek	1,5x102 łysinek

T a b e l a 1C: Ponowna infekcja mł odocianych karpi

	Infekcja za pomocą:
Ryby:	Ekstrakty z zainfekowanych komórek	Pożywka z CFC:	Pożywka z zainfekowanych CFC
Martwe ryby:	—	0 (%)	4 (40%)

Fig. 3A przedstawia porównanie wirusowego DNA genomowego otrzymanego z oczyszczonych wirusów za pomocą ekstrakcji fenolem przy zastosowaniu różnych protokołów: inkubacja z proteinazą K i SDS (Fig. 3A, ścież ka 2), inkubacja z samym SDS (ścież ka 3), traktowanie pronazą i SDS (ścieżka 4) oraz bez wstępnego traktowania (ścieżka 5). Preparaty DNA analizowano za pomocą elektroforezy na żelu agarozowym (0,8%). Genomowe DNA CV migruje w żelu agarozowym na wysokości odpowiadającej 25-35 kilobazom DNA według standardu wielkości - DNA faga λ. DNA zlinearyzowanego plazmidu adenowirusowego (pAdEasy-1) trawione enzymem ClaI (ścieżka 6), użyte jako standard wielkości, migruje na podobną odległość.

Aby ocenić masę genomowego DNA CV, ten sam preparat DNA opisany na Fig. 3A analizowano za pomocą elektroforezy w żelu w zmiennym polu elektrycznym (PFGE), jak to pokazano na Fig. 3B. Wszystkie cztery preparaty DNA CV migrowały w żelu bardzo powoli do miejsca wyznaczonego na 250-300 kb za pomocą standardu wielkości - DNA faga λ. Zamknięta, nie zlinearyzowana forma plazmidu pAdEasy-1 również migrowała powoli na żelu, jak standard wielkości DNA faga λ 150-200 kb.

Dodatkowy dowód, że CV to duży wirus DNA mający około 275 kb otrzymano za pomocą trawienia DNA CV enzymami restrykcyjnymi i przedstawiono na Fig. 3C. Ścieżka 1 na Fig. 3C przedstawia, że wielkość nietrawionego DNA CV wynosi około 275 kb. Trawienie enzymem Swal dało dwa prążki mające 20 i 255 kb (Ścieżka 2).

Analiza białka wirusowego CV za pomocą barwienia Coomassie blue pokazała, że CV różni się w istotny sposób od adenowirusa i wirusa HSV-1. Ponadto, jak pokazano na Fig. 4, znakowanie króliczymi przeciwciałami przeciw wirusowi karpia przedstawia, że taka surowica reaguje jedynie z białkami CV, a nie reaguje z białkami wirusa opryszczki i adenowirusa.

Tak więc w innym aspekcie przedmiotem wynalazku jest izolowane przeciwciało, które wiąże się selektywnie z wirusem CV należącym do wynalazku lub z jego składnikiem. W jednym rozwiązaniu to przeciwciało jest w postaci unieruchomionej.

Fragmenty BamHI-EcoRI wirusowego DNA wklonowano do plazmidów Bluescript (Alting-Mees i wsp., Nucl. Acids Res., tom 17, 9494, 1989), otrzymane klony wirusowego DNA sekwencjonowano i analizowano za pomocą programu BLAST (Altchul i wsp., Nucl. Acids Res., Vol. 25, 3389-3402, 1997 i Short i wsp., Nucl. Acids Res., Vol. 16, 7583-7600, 1988). Używając wewnętrznych starterów wywodzących się z sekwencji klonów A-D wykazano, że klony reprezentują wirusowe DNA. Fig. 5 przedstawia, że na przykład startery wywodzące się z klonu D są skuteczne przy amplifikacji odpowiednich fragmentów z wirusowego DNA, z DNA z zainfekowanych hodowli komórkowych, oraz z chorych ryb, ale nie z niezainfekowanych CFC czy ryb, które nie miał y kontaktu z wirusem. Podobne wyniki otrzymano dla klonów A-C (wyniki niepokazane). Analiza ponad 3500 par zasad genomu CV nie ujawniła fragmentów dłuższych niż 45 par zasad, które byłyby homologiczne do genomów wirusowych opisanych w banku genów (GeneBank, Fig. 6). Chociaż klony CV niosą jedynie małe fragmenty

PL 209 978 B1 homologiczne do innych wirusów, wiele spośród tych sekwencji wywodzi się z wirusów należących do rodzin Herpesviridae i Baculoviradae.

W jednym z aspektów obecny wynalazek dotyczy sposobu diagnozowania choroby zwią zanej z wirusem CV, obejmującego wyodrębnienie tkanki z podejrzanych ryb i stwierdzenie obecności markerów wirusowych związanych z wirusem DNA CV, których obecność wskazuje, że badana ryba jest zainfekowana wirusem według wynalazku.

Określenie tkanka odnosi się do każdej tkanki otrzymanej z narządu, tkanek otrzymanych z kilku narządów, całej ryby lub krwi. Określenie to obejmuje ponadto dowolny narząd lub jego część, stosowane do diagnozowania choroby. Korzystnie, gdy jako tkanki stosuje się tkanki zebrane ze skrzeli, nerek, śledziony, wątroby lub jelit.

Zgodnie z tym sposobem diagnostycznym choroba może być zdiagnozowana, nie ograniczając sposobów diagnozy do wymienionych, za pomocą PCR, jak to opisano powyżej, za pomocą metod immunohistochemicznych, jak to opisano poniżej, i/lub przez badanie przeciwwirusowych surowic ryb za pomocą ELISA, jak to opisano poniżej.

W róż nych protokoł ach diagnostycznych stosowane są takie sposoby, jak AP (fosfataza alkaliczna), HRP (peroksydaza chrzanowa) i FITC (koniugat izotiocyjanianu fluoresceiny) (patrz część doświadczalna przykładów).

Zgodnie z innym aspektem przedmiotem wynalazku jest żywa atenuowana postać wirusa DNA CV. Określenie żywy atenuowany lub atenuacja odnosi się do postaci wirusa, które straciły swoją zjadliwość, lub do sposobu, w jaki wirusy tracą swoje właściwości wywołujące chorobę. Znane są różne rozwiązania umożliwiające otrzymywanie żywych atenuowanych wirusów. Atenuację można uzyskać ograniczając infekcję do części ciała, w której choroba się nie rozwija (Virology, wyd 2., Raven Press, NY, 1990) lub przez wielokrotne pasażowanie wirusa w hodowlach komórkowych nie pochodzących od naturalnego gospodarza, gdyż podczas takiego pasażowania wirus zachowuje mutacje.

Stosowanie szczepionek zawierających żywe atenuowane wirusy takich, jak te należące do wynalazku, ma kilka zalet. Zazwyczaj szczepionki z żywymi wirusami aktywują wszystkie fazy układu odpornościowego, w wyniku czego rozwija się zrównoważona odpowiedź systemowa i miejscowa, zależna od przeciwciał i komórkowa. Szczepionki z żywych wirusów stymulują również odpowiedź immunologiczną na każdy z antygenów ochronnych wirusa, usuwając trudności wynikające z wybiórczego niszczenia jednego z antygenów ochronnych, które mogą nastąpić podczas wytwarzania szczepionki z inaktywowanym wirusem. Ponadto odporność wywołana przez takie szczepionki zazwyczaj jest długotrwała, bardziej skuteczna i powoduje więcej reakcji krzyżowych, niż odporność indukowana przez szczepionkę z inaktywowanym wirusem, a oprócz tego takie szczepionki są tańsze i łatwiejsze do podawania (Virology, wyd. 2., Raven Press, NY, 1990).

W kolejnym aspekcie przedmiotem wynalazku jest sposób wyodrębnienia ż ywego atenuowanego wirusa, obejmujący wysiewanie zjadliwego wirusa w hodowlach komórek ryb, korzystnie otrzymanych z płetw ogonowych lub grzbietowych karpia lub karpia Koi, identyfikację łysinek wywołanych przez wirusa ze zmniejszoną zjadliwością i izolowanie potomnych wirusów z takich łysinek.

Wyodrębniony wirus może być ponownie wysiany na hodowlach komórek ryb uzyskanych z karpia lub z różnych innych gatunków ryb, obejmujących między innymi tołpygę białą (Hypophthalmichthys molitrix), karasia złocistego (Carassius aurata), i amura białego (Ctenopharyngodon idella). Korzystnie, gdy innym gatunkiem ryby jest karaś złocisty (Carassius aurata) a procedura jest wielokrotnie powtarzana, aż do otrzymania odpowiedniego żywego atenuowanego wirusa.

Sposób może ponadto obejmować etap oczyszczania tego wyodrębnionego wirusa.

W jednym szczególnym przykł adzie wirusy z czwartego pasaż u (P4) uznano za zjadliwe, podczas, gdy wirusy z 20-stego pasażu (P20 i kolejnych) wykazywały zmniejszoną zjadliwość i uznano je za atenuowane. Od 25-tego pasażu (P25) wirusy całkowicie straciły właściwość wywoływania choroby. Klony awirulentnych wirusów izolowano i oceniano ich niepatogenny charakter oraz zastosowanie jako szczepionki.

Pożywki i ekstrakty komórkowe zebrane z P4 wirusa w hodowlach komórkowych stosowano do wywoływania choroby przez zastrzyk dootrzewnowy i zanurzenie młodych karpi, które nie miały wcześniej kontaktu z wirusem.

W jednym korzystnym rozwiązaniu sposób wyodrębnienia ż ywego atenuowanego wirusa może ponadto obejmować etap suszenia, korzystnie przez liofilizację, pożywki zawierającej żywy atenuowany wirus i otrzymanie dzięki temu postaci stałej żywego atenuowanego wirusa.

PL 209 978 B1

Według innego rozwiązania sposób może ponadto obejmować etap dodawania do pożywki i/lub suchego proszku środków konserwujących i/lub środków redukujących i/lub cukrów.

W celu stabilizacji atenuowanego wirusa i aby zapobiec rewersji do dzikiego fenotypu moż na wprowadzić do genomu wirusowego losowe mutacje, np. za pomocą procesów chemicznych lub fizycznych. W obróbce chemicznej można wykorzystywać rozmaite mutageny takie, jak 5-bromodeoksyurydyna lub 5-azacytydyna, zaś proces fizyczny może opierać się na naświetlaniu promieniowaniem ultrafioletowym (260 nm, 5-30 sekund, w odległości 10 cm od próbki). Komórki zainfekowane wirusem można traktować mutagenami, aby ocenić krzywą zależności od dawki dla każdego czynnika. Aby zmaksymalizować prawdopodobieństwo izolacji mutantów, powinno się stosować dawki semiletalne, a nastę pnie wybierać ł ysinki. Zmutowane wirusy namnaż a się w CFC lub KFC, a nastę pnie bada się ich przydatność jako szczepionek przez podanie 10-gramowym rybom, i zastosowanie testu prowokacji za pomocą izolatu P4, jak to opisano powyżej. Ta sama procedura, mutatis mutandis, może być przeprowadzona w przypadku procesów fizycznych.

Odnośnie sposobów wyodrębnienia wirusa karpia i wyodrębnienia żywego atenuowanego wirusa, obecny wynalazek obejmuje również wirus karpia otrzymany tymi sposobami.

Wynalazek obejmuje ponadto zastosowanie żywego atenuowanego wirusa do przygotowania preparatu szczepionki do immunizacji ryb przeciwko infekcji wywołanej wirusem CV opisanym powyżej. Preparat zawiera jako składnik aktywny żywe atenuowane wirusy uzyskane tak, jak to opisano powyżej.

Określenie szczepionka w kontekście wynalazku odnosi się do substancji, która może wywołać odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciw infekcji spowodowanej przez wirus według wynalazku. Taka szczepionka może wywołać odporność w celu profilaktycznym lub terapeutycznym. Szczepionki mogą zawierać żywe lub inaktywowane (lub „martwe) wirusy lub ich kombinacje.

Określenie immunizacja lub odpowiedź immunologiczna w kontekście wynalazku odnosi się do odporności na infekcję wirusową, która może wywołać zależną od przeciwciał lub komórkową odpowiedź immunologiczną, lub przeszkodzić w aktywności, rozprzestrzenianiu się lub wzroście wirusa. U ryb immunizowanych szczepionką według wynalazku nie występuje lub jest ograniczone rozprzestrzenianie się i wzrost zakaźnego wirusa.

W jednym rozwią zaniu, preparat mo ż e również obejmować immunomodulują ce adiuwanty, środki stabilizujące, antybiotyki, środki stymulujące układ opornościowy i inne substancje.

Adiuwanty mają przedłużone działanie i działają powoli, stymulując odporność przez długi czas. U ryb słabe antygeny mogą być skuteczne i wywołać długotrwałą ochronę jedynie wtedy, gdy szczepionki zawierają adiuwanty. Te adiuwanty są wybrane spośród adiuwantów stosowanych już w medycynie i w weterynarii. Adiuwanty mogą być adiuwantami hydrofilowymi, takimi jak np. wodorotlenek glinu czy fosforan glinu, lub adiuwantami hydrofobowymi, jak np. adiuwanty oparte na olejach mineralnych.

Możliwe jest dodanie stabilizatorów, takich jak laktozy, w celu zabezpieczenia preparatu szczepionki przed rozmaitymi szkodliwymi warunkami, takimi, jak zmiany temperatury lub liofilizacja. Można również dodawać antybiotyki takie, jak neomycyna i streptomycyna, aby zapobiec możliwemu wzrostowi bakterii. Substancje o działaniu immunostymulującym mogą wzmacniać ochronę uzyskiwaną w wyniku podania szczepionki i dostarczać niespecyficznej ochrony przed wieloma chorobami. Istnieją doniesienia, że wiele związków chemicznych i innych substancji ma u ryb działanie immunostymulujące, np. związki chemiczne i glukany, ekstrakty z glonów - alginiany (estry sililowe kwasu alginowego) oraz cytokiny.

Szczepionka zawierająca żywy atenuowany wirus, stosowany w postaci stałej może zawierać także płyn do przywracania do postaci płynnej, korzystnie sterylną wodę, roztwór soli lub sól fizjologiczną. Może także zawierać niewielkie ilości substancji pozostałych po procesie produkcji, takie jak białka komórkowe lub bakteryjne, białka z jaj, DNA, RNA, itd. Chociaż te substancje jako takie nie stanowią dodatków, niemniej jednak mogą być obecne w preparacie szczepionki.

W innym aspekcie przedmiotem wynalazku jest preparat szczepionki do immunizacji ryb przeciw wirusowi CV, zawierający żywy atenuowany wirus, scharakteryzowany powyżej. W jednym korzystnym rozwiązaniu taki preparat szczepionki zawiera ponadto immunomodulujący adiuwant, stabilizator, antybiotyki, immunostymulanty lub inne substancje, jak to opisano powyżej.

W jednym szczególnym rozwiązaniu preparat zawiera ż ywe atenuowane wirusy w postaci stałej. W innym rozwią zaniu preparat zawiera pł yn z hodowli tkankowych lub roztwór soli dla ryb zawierają cy żywe atenuowane wirusy, gdzie taki płyn jest korzystnie przechowywany w -70°C, i korzystnie płyn zawiera glicerol.

PL 209 978 B1

W jeszcze innym rozwią zaniu preparat zawiera rozdrobnione zainfekowane ryby lub rozdrobnione narządy ryb, korzystnie w postaci stałej. Takie rozdrobnione zainfekowane ryby lub narządy ryb można przygotować za pomocą sposobu obejmującego zakażanie ryb atenuowanym wirusem i rozdrabnianie tych zainfekowanych ryb lub ich narządów 5-6 dni po infekcji.

W jednym rozwią zaniu sposób obejmuje ponadto suszenie rozdrobnionych ryb lub rybich narządów, korzystnie przez liofilizację. W innym rozwiązaniu sposób obejmuje dodawanie do rozdrobnionych ryb lub rybich narządów i/lub suchego proszku środków konserwujących i/lub środków redukujących i/lub cukrów.

W jednym korzystnym zastosowaniu preparat szczepionki przygotowuje się przez rozpuszczanie lub zawieszanie żywego atenuowanego wirusa w co najmniej jednym płynie do przywracania do postaci płynnej bez dodatkowych adiuwantów czy immunostymulantów.

Wynalazek dotyczy ponadto sposobu immunizacji ryb przeciw infekcji wirusowej powodowanej przez wirusa CV opisanego powyżej, obejmującego podawanie podatnym rybom preparatu szczepionki złożonego z żywego atenuowanego wirusa CV, jak to opisano powyżej, którą to szczepionkę podaje się w ilości wystarczającej do wywołania odporności na późniejszą infekcję wirusem CV.

Żywy atenuowany wirus może być podawany rybom hodowlanym indywidualnie - doustnie, tzn. w karmie lub przez doustne podawanie siłą, oraz w zastrzykach. Ewentualnie żywy atenuowany wirus może być podawany równocześnie całej populacji ryb przebywającej w zbiorniku wodnym przez rozpylanie, rozpuszczanie lub zanurzenie wirusa w tym zbiorniku wodnym. Te sposoby są użyteczne przy szczepieniu wszystkich rodzajów ryb, tzn. jadalnych i ozdobnych, w różnych środowiskach, takich jak między innymi, stawy, akwaria, naturalne siedliska i zbiorniki słodkowodne.

W innym aspekcie szczepionka jest podawana jednodniowym larwom, narybkowi mniej więcej w czasie, kiedy po raz pierwszy przyjmuj ą pokarm, lub dorosł ym rybom.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto preparat szczepionki do biernej immunizacji ryb przeciw infekcji spowodowanej przez tego wirusa CV, zawierający surowicę immunizowanych ryb, otrzymaną od zwierząt, tj. ryb, koni, świń, bydła, myszy, królików, itd., immunizowanych żywą atenuowaną postacią tego wirusa CV. W jednym korzystnym przypadku te zwierzęta to ryby.

Bierna immunizacja może być stosowana jako profilaktyka przed lub po narażeniu. Jednakże jest najbardziej użyteczna w stawach i hodowlach, gdzie ryby były już narażone na kontakt z wirusem. Szczepionkę można podawać rybom w dowolny spośród ujawnionych tu sposobów, korzystnie doustnie, jeszcze lepiej w zastrzyku.

Przedmiotem wynalazku, odnośnie tego aspektu, jest ponadto sposób prowadzenia terapii ryb przeciwko infekcji wywołanej tym wirusem CV. Sposób obejmuje etapy immunizacji zwierzęcia za pomocą atenuowanego wirusa CV według wynalazku, zbierania surowicy immunizowanego zwierzęcia i terapię ryb surowicą, dzięki czemu osiąga się immunizację ryb.

Przedstawiono tu ponadto konstrukt genetyczny zawierający sekwencję nukleotydową pochodzącą z co najmniej jednej części wirusa CV. Konstrukt genetyczny może obejmować wszystkie naturalnie występujące genomy wirusa karpia, ich odpowiedniki cDNA, i/lub wszelkie rekombinowane konstrukty zawierające sekwencje nukleotydowe pochodzące z co najmniej jednej części genomu wirusa CV.

W szczególnym rozwiązaniu przedmiotem wynalazku jest preparat szczepionki indukującej odpowiedź immunologiczną u ryb, korzystnie u karpia i karpia Koi, zawierający wektor ekspresyjny niosący sekwencję nukleotydową, która odpowiada za ekspresję białek wirusowych, a w szczególności białek otoczki wirusa CV według wynalazku. Wektor ekspresyjny może być podawany oddzielnie lub w połączeniu z co najmniej jedną inną sekwencją nukleotydową niesioną przez ten sam lub inny wektor ekspresyjny, w celu równoczesnej immunizacji przeciwko co najmniej jednej dodatkowej chorobie. Ekspresja białek w komórkach docelowych u ryb wywoła odpowiedź immunologiczną. Jeśli wektor ekspresyjny niesie sekwencje kodujące białka lub polipeptydy związane z inną chorobą, wywołana odpowiedź immunologiczna może spowodować powstanie odporności zarówno przeciw wirusowi CV według wynalazku, jak i innej choroby.

W innym aspekcie rozwią zaniem wedł ug wynalazku jest wektor niosą cy sekwencje nukleotydowe, które odpowiadają za ekspresję białek wirusowych, a szczególnie białek otoczki wirusa CV według wynalazku.

Jednym z zastosowań takiego wektora jest wywoływanie odpowiedzi immunologicznej w rybach hodowlanych, obejmujące podawanie rybom preparatu szczepionki wywołującej odpowiedź immunologiczną, który to preparat zawiera wektor ekspresyjny niosący sekwencję nukleotydową kodującą

PL 209 978 B1 jedno lub więcej białek wirusa karpi i sekwencję regulującą ekspresję tej sekwencji nukleotydowej w komórkach karpia.

Wynalazek dotyczy również zestawu do leczenia ryb zakażonych przez wirus karpia, który zawiera żywe atenuowane wirusy, oraz instrukcję, jak go stosować. Żywe atenuowane wirusy mogą być w postaci stałej lub przywrócone do postaci płynnej, w postaci płynu z hodowli tkankowych przechowywanego w temperaturze pokojowej, korzystnie w -70°C, lub jako roztwór zawierający glicerol. Zestaw może również zawierać żywe atenuowane wirusy w postaci rozdrobnionych ryb lub rybich narządów, korzystnie w postaci stałej. W przypadku wirusa w postaci stałej, zestaw może ponadto zawierać płyn do przywracania do postaci płynnej. W korzystnym rozwiązaniu żywy atenuowany wirus jest w postaci stałej. W innym rozwiązaniu żywy atenuowany wirus jest przechowywany w -70°C.

Zestaw może być przechowywany w atmosferze pokojowej, korzystnie w próżni.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto przeciwciało, które wiąże się selektywnie lub specyficznie z wirusem DNA CV według wynalazku lub z jego fragmentem. Określenie przeciwciało odnosi się do przeciwciał IgG, IgM, IgD, IgA i IgG. Definicja obejmuje przeciwciała poliklonalne i przeciwciała monoklonalne. Określenie to odnosi się również do całych przeciwciał lub fragmentów przeciwciał zawierających wiążącą antygen domenę przeciwciał anty-CLH, np. przeciwciał bez fragmentu Fc, pojedynczych łańcuchów przeciwciał, fragmentów składających się właściwie tylko ze zmiennej wiążącej antygen domeny przeciwciała, itd. Określenie selektywnie odnosi się tutaj do przeciwciał takich, jak to zdefiniowano powyżej, które wiążą się z wirusem DNA CV z wyższym powinowactwem, niż z innymi wirusami DNA, i może to być uznane za istotną różnicę w testach statystycznych.

Wynalazek dotyczy ponadto zestawu diagnostycznego, zawierającego co najmniej jedno przeciwciało lub co najmniej jedno skoniugowane przeciwciało, do diagnozowania choroby związanej z wirusem CV, i instrukcje stosowania. Zestaw może ponadto zawierać co najmniej jeden antygen kontrolny lub próbkę tkanki kontrolnej zawierającą ten antygen kontrolny. Przeciwciało lub skoniugowane przeciwciało może być w roztworze lub w postaci stałej. W przypadku, gdy przeciwciało lub skoniugowane przeciwciało jest w postaci stałej, zestaw może ponadto zawierać odpowiednie roztwory do reakcji. W rozwiązaniu według wynalazku, w którym koniugat stanowi enzym, zestaw może ponadto zawierać co najmniej jeden substrat niezbędny do przeprowadzenia reakcji detekcji.

Zestaw diagnostyczny według wynalazku można stosować do diagnozowania żywych lub nieżywych ryb na obecność wirusa według wynalazku. Zgodnie z jednym rozwiązaniem zestaw diagnostyczny może być stosowany do oceny stopnia immunizacji ryb po traktowaniu szczepionką według wynalazku lub dowolną szczepionką znaną specjalistom w tej dziedzinie. W tym przypadku można pobrać krew żywym rybom i zastosować zestaw diagnostyczny do oceny stopnia immunizacji, np. czy badane ryby są, czy też nie są chore, i do oceny stopnia zakażenia. W przypadku, gdy okaże się, że ryby nie są zainfekowane, mogą one wrócić do hodowli.

P r z y k ł a d y

Ogólne

Ryby: karpie lub karpie Koi, o średniej masie 42 gramów hodowano w zbiornikach o pojemności 500 l, w temperaturze wody utrzymywanej na poziomie 22-24°C, otrzymujących świeżą wodę z szybkością 0,9 l/min.

Mikroskopia elektronowa: Oczyszczone preparaty wirusa barwiono negatywnie 2% fosfowolframianem. Siatki badano za pomocą mikroskopu elektronowego Philips 120 przy 80 kV.

P r z y k ł a d 1: Przygotowanie hodowli komórkowych

Płetwy ogonowe ważących 50 g karpi lub karpi Koi usuwano rybom pod znieczuleniem, moczono w 1% roztworze podchlorynu sodu przez 1 minutę, a następnie płukano w 70% etanolu przez kilka sekund. Następnie płetwy płukano trzykrotnie po 0,5 min w PBS zawierającym penicylinę i streptomycynę. Płetwy przenoszono na szalki Petriego, dokładnie rozdrabniano za pomocą nożyczek, i przenoszono na wpół suche małe kawałki tkanki o objętości około 1 mm³ do pustych butelek hodowlanych na 50 ml. Po 60-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej kawałki przylegające do butelek przykrywano pożywką hodowlaną zawierającą 60% pożywki DMEM (Dulbeco modified Essential medium) i 20% pożywki Leibovitza L-15 (dostarczone przez Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Izrael), 10% płodowej surowicy bydlęcej (FCS) (Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Izrael) i 10% fosforanu tryptozy, z dodatkiem 1% HEPES i antybiotyków. Podczas inkubacji przez 10-14 dni w 22°C, komórki rosły na zewnątrz tkanki tworząc pojedynczą warstwę wokół każdego kawałka tkanki. Tworzące pojedynczą warstwę hodowle trypsynizowano i przenoszono do nowych butelek ze świeżą po14

PL 209 978 B1 żywką. Kawałki płetwy mogą być przenoszone do nowych butelek, aby uzyskać nową jednowarstwową hodowlę komórek pierwotnych.

P r z y k ł a d 2: Oczyszczanie wirusa z pożywki hodowlanej

Pożywkę zebraną z zainfekowanych CFC oczyszczano z komórek i resztek komórek przez wirowanie 10 minut przy 10000 x g. Następnie wirusy wirowano w rotorze Beckman Ti-60 przez 50 minut przy 10000 x g. Osad zawieszano w PBS i nakładano na gradient sacharozy 15-65% (masa/objętość) przygotowany w PBS, a następnie wirowano przez 60 minut przy 110 000 x g w rotorze Beckman SW28. Prążki pobierano z probówek, rozcieńczano dziesięciokrotnie w PBS i ponownie wirowano. Osad zawieszano w PBS i zamrażano w -75°C w celu dalszej analizy.

P r z y k ł a d 3: Oczyszczanie wirusowego DNA i uzyskanie plazmidów

Oczyszczony osad wirusowy zawieszano w buforze TNE (10 mM Tris pH 7,8, 100 nM NaCl i 1 nM

EDTA) zawierającym 0,5% dodecylosiarczan sodu (SDS). Preparat wirusa traktowano proteinazą K (50 μg/ml) przez 3 godziny. Wirusowe DNA ekstrahowano fenolem, wytrącano etanolem, i zawieszano osad DNA w TNE. Wirusowe DNA trawiono BamHI i EcoRI, a uzyskane fragmenty wklonowano w plazmid Bluescript II KS (Alting i wsp., Nucl. Acids Res., Vol. 17, 9494, 1989). Wstawki z fragmentów wirusowego DNA sekwencjonowano za pomocą PCR stosując startery T7 i T3, a ich sekwencje analizowano za pomocą standardowego programu BLAST (Altschul i wsp., Nucl. Acids Res., Vol. 25, 3389-3402, 1997 i Short i wsp., Nucl. Acids Res., Vol. 16, 7583-7600, 1988).

P r z y k ł a d 4: Diagnozowanie choroby za pomocą analizy PCR

Preparaty DNA komórkowego ekstrahowano z komórek za pomocą fenolu i wytrącano etanolem, jak to opisano powyżej w przykładzie 3. Osad DNA zawieszano w buforze TE (Tris-EDTA) o pH7,4, jak to opisano w Sambrook i Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001, str. 6.7-6.10). Startery AP1, AP2 i AP3, to znaczy odpowiednio 5'-CCCATGAGGCTGAGGAACGCCG-3', 5'-GCACCCCCGTGATGGTCTTGC-3', i 5'-GGAAGATGAGGGCCAGTATGTG-3', pochodzące z klonu D wirusowego DNA (patrz Fig. 6), stosowano do amplifikacji fragmentów wirusowego DNA za pomocą PCR. DNA amplifikowano przez 30 cykli przy 94°C przez 45 sek., 55°C przez 30 sek., i 72°C przez 45 sek. Produkty PCR rozdzielano na 1% żelu agarozowym (w/v) w buforze 0,5 x TAE i analizowano.

P r z y k ł a d 5: Diagnozowanie choroby przez pośrednią mikroskopię immunofluorescencyjną

Aby uzyskać przeciwciała przeciw wirusowi karpia (CV), immunizowano królika za pomocą 0,1 mg oczyszczonego CV emulgowanego 1:1 w kompletnym adiuwancie Freunda. Królik otrzymał trzykrotnie w dziesięciodniowych przerwach dawki wspomagające z 0,05 mg oczyszczonego CV zmieszanego 1:1 z niekompletnym adiuwantem Freunda, i trzykrotnie podczas 7 do 10 tygodni po pierwszej immunizacji pobrano mu krew. Surowicę zawierającą przeciwciała oddzielono od skrzepu krwi i absorbowano na suchym proszku przygotowanym z normalnych rybich tkanek, żeby wykluczyć przeciwciała niespecyficzne i skierowane przeciw niewirusowym białkom komórkowym.

Zdrowym i chorym rybom usunięto nerki, śledzionę, wątrobę i mózg, i użyto do przygotowania imprintowych preparatów histologicznych. Preparaty imprintowe utrwalano w 3% para-formaldehydzie, przemywano PBS i blokowano przez inkubację przez 60 minut z odtłuszczonym mlekiem zawierającym 50% FCS. Następnie preparaty inkubowano przez 1 godz. z króliczymi przeciwciałami anty-CV, przemywano PBS, inkubowano przez 1 godz. ze świńskimi przeciwciałami antykróliczymi skoniugowanymi z izotiocyjanianem fluoresceiny, przemywano PBS i analizowano za pomocą mikroskopu Nikon Microphot-FX wyposażonego w obiektyw 40x planapochromat, pod światłem ultrafioletowym.

Zastosowanie króliczej surowicy odpornościowej anty-CV pozwoliło na lokalizację wirusa w zainfekowanych rybach. Preparaty nerek pobrane z zainfekowanych ryb, ale nie z ryb, które nie miały kontaktu z wirusem, były wyznakowane pozytywnie króliczą surowicą odpornościową anty-CV, co wskazuje, że w nerkach znajdują się duże ilości wirusa. Te wyniki są zgodne z analizą PCR i innymi doświadczeniami pokazującymi, że w nerkach znajdują się duże ilości zakaźnego wirusa. Według tej techniki ilość wirusa w mózgu i wątrobie chorych ryb była znacząca, ale niższa, niż w nerkach. Kontrolne preparaty imprintowe odpowiednich narządów pochodzących z ryb, które nie miały kontaktu z wirusem, lub chorych ryb, które były traktowane surowicą pochodzącą od nieimmunizowanego królika nie wykazywały barwienia świńską surowicą przeciw królikowi skoniugowaną z barwnikiem fluorescencyjnym. Nie wykryto antygenów wirusowych w preparatach imprintowych ze śledziony ani w rozmazach krwi pochodzących od chorych ryb.

PL 209 978 B1

P r z y k ł a d 6: Diagnozowanie choroby przez badanie rybiej surowicy przeciwwirusowej

Płytki do ELISA opłaszczano oczyszczonym preparatem wirusa i blokowano mlekiem i/lub żelatyną. Po trzech płukaniach PBS studzienki przykrywano badanymi surowicami rybimi i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godz. Pł ytki ponownie pł ukano, traktowano króliczymi przeciwciałami przeciw rybim IgB przez godzinę i ponownie płukano. Miano rybich surowic przeciwwirusowych oznaczano za pomocą koziej surowicy przeciwkróliczej skoniugowanej z fosfatazą alkaliczną, inkubowanej z substratem ELISA i odczytywano za pomocą czytnika ELISA.

P r z y k ł a d 7: Ocena optymalnego wieku ryb podczas immunizacji

Grupę 200 jednodniowych larw zainfekowano P4 przez zanurzenie na 50 minut w 5 l zbiorniku, do którego dodano 10 ml roztworu P4. Przez 20 dni po infekcji larwy trzymano w temperaturze wody 23°C, pozwalając na rozwój choroby. Zainfekowane larwy wykazywały niższą przeżywalność w porównaniu z niezainfekowanymi. Te, które przeżyły infekcję, hodowano do osiągnięcia wieku 45 dni. Wówczas narybek ponownie infekowano roztworem P4 za pomocą procedury identycznej z opisaną poprzednio dla larw.

Oprócz narybku zainfekowanego tak jak to opisano, drugą grupę 45-dniowych ryb z tej samej wylęgarni, które przedtem nie były zainfekowane wirusem, narażono na kontakt z wirusem po raz pierwszy. Narybek, który przeżył infekcję w wieku jednego dnia, wykazywał istotną odporność na chorobę w wieku 45 dni w porównaniu z rybami w tym samym wieku, które miały kontakt z wirusem po raz pierwszy.

Te doświadczenia wykazały, że 45-dniowe ryby (ważące 7 g) i starsze dobrze się immunizuje. Mniejsze ryby, tzn. ważące 2,5-3 g, immunizuje się równie dobrze, ale obserwuje się wyższą umieralność wynoszącą około 20%.

P r z y k ł a d 8: Infekcja ryb wirusem zjadliwym

Kilka grup zawierających po 50 10-gramowych ryb zainfekowano patogennym wirusem P4 podając każdej rybie w zastrzyku 0,2 ml wirusa (dootrzewnowo). Grupy kontrolne składały się z ryb, którym podano roztwory fizjologiczne (PBS). Jak pokazano na Fig. 7A, 80% ryb zmarło 10-25 dni po zastrzyku.

Ryby, które przeżyły infekcję, tzn. 20 ryb z grupy zainfekowanej i 50 z grupy kontrolnej, zainfekowano ponownie po 35 dniach. Ponowną infekcję przeprowadzono przez współmieszkanie z chorymi rybami. Jak przedstawia Fig. 7B, ryby, które przeżyły pierwszą infekcję, były odporne na zakażenie wirusem, i w wyniku choroby zmarło jedynie 30% ryb. Jednakże u ryb, które po raz pierwszy narażono na kontakt z wirusem, obserwowano wysoką śmiertelność wynoszącą niemal 100%.

P r z y k ł a d 9a: Infekcja ryb żywym atenuowanym wirusem

Dwóm grupom zawierającym po 25 10-gramowych ryb podano w zastrzyku dootrzewnowym 0,3 ml atenuowanego wirusa P25 w stężeniu 6 x 10³ PFU/ml. Jako kontrolę negatywną wykorzystano 25 ryb, którym podano roztwór soli, a jako kontrolę pozytywną 25 ryb, którym podano w zastrzyku wirusa P4 w stężeniu 0,3 x 10³ PFU/ml. Po zastrzyku ryby trzymano w warunkach pozwalają cych na rozwój choroby przez 30 dni.

Jak można zobaczyć na Fig. 8A, niemal żadna ryba, której podano atenuowany wirus, nie zachorowała, w porównaniu z tymi, którym podano postać zjadliwą.

Ryby, którym podano atenuowanego wirusa i które przeżyły, poddano następnie testowi prowokacji przez ponowny kontakt z wirusem 30 po początkowym narażeniu, przez współzamieszkiwanie z chorymi rybami. Jak przedstawia Fig. 8B, ryby wykazywały wysoki stopień odporności na chorobę. Tylko około 5% ryb, którym podano wcześniej zastrzyk z atenuowanym wirusem, zostało zainfekowanych.

To doświadczenie przedstawia, że żywy atenuowany wirus ma właściwości immunizujące ryby przeciw wirusowi karpia. Ten typ doświadczenia powtórzono trzykrotnie z podobnym wynikiem.

P r z y k ł a d 9b: Skuteczność atenuowanego wirusa

Komórki płetwy karpia Koi (KFC) zainfekowano rozcieńczonym wirusem CV z pasażu P26 i zalano agarem. Zebrano wirusy z czterech odrębnych łysinek, oznaczono miano i podano w zastrzyku dootrzewnowym rybom, które nie miały wcześniej kontaktu z wirusem. Kontrolnej grupie ryb podano PBS. Umieralność ryb badano przez 25 dni, podczas których zmarło bardzo mało ryb. 25 dnia ryby narażono na kontakt z wirusem przez współmieszkanie z chorymi rybami, aby ocenić ich odporność na chorobę. Jak można wnioskować z Fig. 9, 95% niezainfekowanej grupy kontrolnej zmarło krótko po współzamieszkaniu. Żadna z ryb, którym podano klony wirusa, nie wykazywała objawów choroby, i nie zaobserwowano przypadków śmierci. Te wyniki jasno wskazują, że klony otrzymane z pasażu P26 wywołują odporność na infekcję powodowaną przez wirusa CV.

PL 209 978 B1

P r z y k ł a d 10: Przygotowanie stałego żywego atenuowanego wirusa

Wirusa wyodrębnionego tak, jak to opisano w przykładzie 1, pasażowano co najmniej 30 razy w serii linii komórek karpia, a następnie pasażowano w wyznaczonych warunkach i w wysokich rozcieńczeniach. Stwierdzono, że otrzymane łysinki różniły się morfologicznie od produkowanych przez zjadliwego wirusa. Stwierdzono, że wirusy z czwartego pasażu P4 są zjadliwe. Od 20-stego pasażu (P20), właściwości wywoływania choroby przez wirusa były zmniejszone. Wirusy od 25-tego pasażu (P25), ich klony i subklony, całkowicie straciły właściwości wywoływania choroby.

Pożywkę hodowlaną z zainfekowanych pasażem P20 hodowli komórkowych zebrano i podzielono na dwie probówki. Jedną probówkę przechowywano w -70°C. Drugą probówkę zamrożono i zliofilizowano, dzięki czemu otrzymano żółty proszek, który inkubowano w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Nie dodawano środków konserwujących takich, jak środki redukujące czy cukrów. Wirus w postaci stałej może być przechowywany w atmosferze pokojowej, korzystnie w probówkach pod próżnią.

Aby ocenić zjadliwość liofilizatu wirusa, próbkę stałego wirusa przywrócono do postaci płynnej i oznaczono miano na świeżych CFC. Równocześnie rozmrożono próbkę z pierwszej probówki jako kontrolę i zainfekowano nią świeże hodowle. Policzono łysinki i stwierdzono, że miano suchego wirusa było 5-10 razy niższe w porównaniu z kontrolą.

Stałego wirusa przywrócono do postaci płynnej w oczyszczonej, sterylnej wodzie.

P r z y k ł a d 11: Kinetyka powstawania przeciwciał anty-CV po immunizacji atenuowanym wirusem

Grupie pięciu ryb podano w zastrzyku atenuowanego wirusa w dniu 0. Następnie rybom pobierano krew w wyznaczonych dniach po zastrzyku i oceniano poziom przeciwciał anty-CV w surowicy, stosując następujący sposób: studzienki płytek ELISA pokrywano wirusem CV i blokowano mlekiem przed dodaniem rybich surowic. W celu osiągnięcia dokładności rybie surowice rozcieńczano następująco: w stosunku 1:100, 1:500, 1:2500, i 1:12500. Po intensywnym płukaniu wszystkich studzienek pokrywano je króliczymi przeciwciałami przeciw rybim Fc, jak to poprzednio opisano, na 60 minut w temperaturze pokojowej. Następnie traktowano je kozimi przeciwciałami przeciw króliczym IgG, skoniugowanymi z AP.

Jak przedstawia Fig. 10, rybie surowice zawierały wysoki poziom przeciwciał anty-CV. Przeciwciała pojawiają się między 7 a 14 dniem po infekcji. Ich miano wzrasta, osiąga wysoki poziom w dniu 21, i pozostaje na tym poziomie, co najmniej do 51 dnia po infekcji. To badanie jasno przedstawia, że atenuowany wirus indukuje wysoki poziom przeciwciał anty-CV.

P r z y k ł a d 12: Przygotowanie szczepionki do biernej immunizacji

Grupie 15 ryb podano trzykrotnie zastrzyk z atenuowanym wirusem według wynalazku, w stężeniu 200-2000 PFU/zastrzyk w 15-dnowych odstępach. 15-20 dni po ostatnim podaniu rybom pobrano krew, wyizolowano surowicę anty-CNGV za pomocą jednego ze sposobów znanych specjalistom w tej dziedzinie, i przechowywano ją w -70°C. Ewentualnie próbki surowicy liofilizowano i przechowywano do chwili użycia.

Grupę 50 ryb narażono przez 2-4 dni na wirusa CV przez współzamieszkiwanie z chorymi rybami. Każdej z 50 ryb podano następnie zastrzyk z surowicy anty-CNGV i obserwowano rozwój choroby.

Stwierdzono, że u ryb, którym podano zastrzyk surowicy anty-CNGV, nie rozwinęła się choroba, natomiast u ryb nieimmunizowanych choroba się rozwinęła i zmarły one w ciągu 18 dni po kontakcie z chorymi osobnikami.

P r z y k ł a d 13: Przygotowanie dezaktywowanego wirusa

Zjadliwego wirusa umieszczono w odległości 10 cm od lamp UV i naświetlano światłem o długości 260 nm przez około 2 minuty. Po 2 min. zakończono naświetlanie i podano wirusa rybom, tak, jak to opisano w poprzednich przykładach.

Po zakończeniu naświetlania oceniane jest tworzenie łysinek przez wirusa tak, jak to opisano wcześniej. Próbki niewytwarzające łysinek uważa się za inaktywowane i stosuje się je do immunizacji ryb.

Powtarzane doświadczenia wykazały, że w wyniku naświetlania próbek zjadliwego wirusa zaledwie przez kilka sekund otrzymywano aktywne wirusy, które uległy losowym mutacjom.

P r z y k ł a d 14: Immunizacja ryb za pomocą łączonej terapii inaktywowanym wirusem, a następnie żywym atenuowanym wirusem

Grupie 32 zdrowych ryb podano w zastrzyku inaktywowany wirus. Po 5 dniach rybom podano w zastrzyku żywy atenuowany wirus zgodnie ze sposobem opisanym szczegółowo powyżej. Ryby

PL 209 978 B1 narażono na współzamieszkiwanie z chorymi rybami przez 10 dni. U żadnej z immunizowanych ryb nie wystąpiło zachowanie charakterystyczne dla choroby zakaźnej (dane nie pokazane).

Literatura

Następujące pozycje literaturowe są tu przedstawione w celu lepszego zrozumienia wynalazku i nie powinny służyć do wyjaśnienia, czy wynalazek ma zdolność patentową.

Body A., LiefRing F., Charlier G, Collard A., Bull. Europ. Assoc. Fish Path., 20, 87-88, 2000. Calle P.P., McNamara T., Kress Y, J. Zoo and Wild Med., 30, 165-169, 1999.

Dawes J, OFI Journal, 39, 2002.

Gray W. L., Mullis L., LaPatra S. E., Groff J. M., Goodwin A., J. Fish Dis., 25, 171-178, 2002. Hedrick R. P., Groff J.M., Okihiro M. S., McDowell T. S., J. Wild Dis., 26, 578-581,1990.

Hedrick R, P., Gilad O, Yun S., Spangenberg J., Marty G, Nordhausen R., Kebus M., Bercovier

H, Eldar A., J. AquaAnimal Health 12, 44-55, 2000.

Kim C.H., Dummer D. M., Chiou P. P., Leong J. A., J. Virol., 73, 843-849, 1999.

Miyazaki T., Okamoto H., Kageyama T., Kobayashi T., Dis. Of Aqua Organ. 39, 183-192, 2000. Oh M. J., Jung S. J., Choi T. J., Kim H.R., Rajendran K., Kim Y.J., Park M. A., Chun S. K.,

FishPath., 36, 147-151, 2001.

Sano T., Fukuda H., Furukawa M., Fish and Shel. Path., 32, 307-311, 1985.

Sano T., Morita N.,Shima N., Akimoto M., J. Fish Dis., 14, 533-543, 1991.

Shchelkunov I., Shchelkunov T., J. Fish Dis., 13, 475-484, 1990.

Walster C, Fish Vet. J., 3, 54-58, 1999.

Claims (27)

1. Awirulentna postać wirusa DNA karpia powodują cego wirusową chorobę ryb, który jest dwuniciowym wirusem DNA o kapsydzie w kształcie dwudziestościanu, o wielkości około 90-110 nm, według mikroskopii elektronowej, którego DNA zawiera od 250 000 do 300 000 par zasad.

2. Awirulentna postać wirusa DNA karpia według zastrz. 1, znamienna tym, że jego DNA zawiera od 260 000 do 285 000 par zasad.

3. Awirulentna postać wirusa DNA karpia według zastrz. 1, znamienna tym, że jego DNA zawiera około 277 000 par zasad.

4. Awirulentna postać wirusa wedł ug dowolnego z zastrz. 1-3, znamienna tym, ż e ma postać żywego atenuowanego wirusa lub dezaktywowanego DNA wirusa karpia.

5. Awirulentna postać wirusa według dowolnego z zastrz. 1-4, znamienna tym, ż e ryby należą do gatunku Cyprinus carpio.

6. Awirulentna postać wirusa, znamienna tym, ż e ż ywym atenuowanym wirusem DNA karpia jest wirus zdeponowany pod numerem dostępu CNCM I-3145 w Collection Nationale de Cultures De Microorganismes, Instytut Pasteura, Paryż, Francja.

7. Awirulentna postać wirusa według zastrz. 6, znamienna tym, że ma właściwości ż ywego atenuowanego wirusa.

8. Awirulentna postać wirusa według zastrz. 7, znamienna tym, że ma w łaściwości indukowania u ryb odpowiedzi immunologicznej przeciw wirusowi DNA karpia, bez zjadliwości związanej z tym wirusem DNA karpia.

9. Awirulentna postać wirusa według zastrz. 4, znamienna tym, że jest w postaci dezaktywowanego DNA wirusa karpia i ma właściwości indukowania u ryb odpowiedzi immunologicznej przeciw wirusowi DNA karpia bez zjadliwości związanej z tym wirusem DNA karpia.

10. Sposób wyodrębnienia żywego atenuowanego wirusa DNA karpia, w którym najpierw wysiewa się zjadliwy wirus powodujący wirusową chorobę ryb na hodowle komórek rybich, przy czym zjadliwy wirus jest dwuniciowym wirusem DNA, o kapsydzie w kształcie dwudziestościanu, o wielkości około 90-110 nm, według mikroskopii elektronowej, którego DNA zawiera od 250 000 do 300 000 par zasad; po czym identyfikuje się łysinki wywołane przez wirus o zmniejszonej zjadliwości i wyodrębnia się z takiej łysinki wirus potomny.

11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że wyodrębnione wirusy ponownie wysiewa się na hodowle komórek rybich i procedurę tę powtarza się wielokrotnie, aż do uzyskania odpowiednio atenuowanego żywego wirusa.

12. Żywy atenuowany wirus karpia otrzymany sposobem określonym w zastrz. 10 lub 11.

PL 209 978 B1

13. Preparat szczepionki do immunizacji ryb przeciw infekcji powodowanej przez wirusa DNA karpia powodującego wirusową chorobę ryb, który to preparat szczepionki zawiera awirulentnego wirusa będącego dwuniciowym wirusem DNA, o kapsydzie w kształcie dwudziestościanu, o wielkości około 90-110 nm, według mikroskopii elektronowej, którego DNA zawiera od 250 000 do 300 000 par zasad, według zastrz. od 1 do 8 lub od 12 do 13.

14. Preparat szczepionki według zastrz. 14, znamienny tym, że jako awirulentną postać wirusa zawiera żywy atenuowany wirus według zastrz. 8.

15. Sposób diagnozowania choroby związanej z wirusem DNA karpia, powodującym wirusową chorobę ryb, będącym dwuniciowym wirusem DNA, o kapsydzie w kształcie dwudziestościanu, o wielkości około 90-110 nm, według mikroskopii elektronowej, którego DNA zawiera od 250 000 do 300 000 par zasad, w którym to sposobie wyodrębnia się tkanki z podejrzanych ryb i stwierdza się obecność markerów wirusowych związanych z wirusem DNA, których obecność wskazuje, że badana ryba jest zainfekowana badanym wirusem DNA.

16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że tkankę uzyskuje się z pojedynczego narządu, z kilku narządów, z całej ryby, lub z krwi.

17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że tkankę uzyskuje się z narządu takiego jak skrzela, nerki, śledziona, wątroba lub jelita.

18. Zastosowanie preparatu szczepionki składający się z żywej atenuowanej postaci wirusa określonej w dowolnym z zastrz. 1-8 lub 12-13 do wytwarzania leku do zastosowania w zapobieganiu lub leczeniu infekcji powodowanej przez wirus u ryb przez immunizację ryb przeciw infekcji wirusowej, powodowanej przez wirus DNA, który jest dwuniciowym wirusem DNA o kapsydzie w kształcie dwudziestościanu, o wielkości około 90-110 nm, według mikroskopii elektronowej, a jego DNA zawiera od 250 000 do 300 000 par zasad, w którym podaje się podatnym na zakażenie rybom skuteczną ilość szczepionki.

19. Zastosowanie według zastrz. 18, znamienne tym, że szczepionkę podaje się do hodowli prowadzonej w wodzie.

20. Zastosowanie według zastrz. 19, znamienne tym, że podawanie obejmuje podawanie poszczególnym rybom zastrzyków, rozpylanie lub zanurzenie preparatu w hodowli prowadzonej w wodzie.

21. Zastosowanie według zastrz. 19, znamienne tym, że szczepionkę podaje się rybom doustnie w pokarmie.

22. Zestaw zawierający żywe atenuowane wirusy określone w dowolnym z zastrz. 1-8 lub 12-13 do leczenia ryb przeciwko wirusowi karpia i instrukcje jego stosowania.

23. Zestaw, który zawiera przeciwciało lub skoniugowane przeciwciało do diagnozowania choroby związanej z wirusem DNA karpia powodującym chorobę wirusową u ryb, który to wirus jest dwuniciowym wirusem DNA o kapsydzie w kształcie dwudziestościanu, o wielkości około 90-110 nm, według mikroskopii elektronowej, którego DNA zawiera od 250 000 do 300 000 par zasad, i instrukcje jego stosowania, przy czym przeciwciało oraz skoniugowane przeciwciało wiążą się selektywnie z wirusem DNA lub z jego skł adnikiem.

24. Zestaw według zastrz. 23, znamienny tym, że zawiera ponadto co najmniej jedną kontrolę będącą antygenem lub tkanką zawierającą antygen.

25. Preparat szczepionki do immunizacji ryb przeciw infekcji powodowanej przez DNA-wirusa karpia powodującego chorobę wirusową u ryb, który jest dwuniciowym wirusem DNA o kapsydzie w kształcie dwudziestościanu, o wielkości około 90-110 nm, według mikroskopii elektronowej, a jego DNA zawiera od 250 000 do 300 000 par zasad, który to preparat szczepionki zawiera surowicę zwierząt immunizowanych żywą atenuowaną postacią wirusa według zastrz. od 1 do 8 lub od 12 do 13.

26. Preparat szczepionki indukującej odpowiedź immunologiczną u ryb, zawierający wektor ekspresyjny niosący sekwencję nukleotydową, która koduje jedno lub więcej białek wirusa DNA karpia powodującego chorobę wirusową u ryb, który to wirus jest dwuniciowym wirusem DNA o kapsydzie w kształcie dwudziestoś cianu, o wielkości około 90-110 nm, według mikroskopii elektronowej, a jego DNA zawiera od 250 000 do 300 000 par zasad, sekwencję kontrolną regulującą ekspresję tej sekwencji nukleotydowej w komórkach karpia wraz z nośnikiem, zaróbką lub adiuwantem.

27. Preparat szczepionki według zastrz. 26, znamienny tym, że rybami są karpie oraz karpie Koi.