JP5462518B2 - 抗体精製方法 - Google Patents
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本発明は、免疫組織化学（Immunohistochemistry; ＩＨＣ）染色に使用する抗体の精製方法に関する。また、該抗体の精製方法を用いたＩＨＣ染色方法に関し、さらには該抗体の精製用組織標本並びに精製用組織標本を含むＩＨＣ染色用キットに関する。
ＩＨＣ染色は、目的抗原を認識する抗体を用いて、目的抗原を個々の症例において解析する方法であり、パラフィンブロック切片や凍結切片で解析が可能である。ＩＨＣ染色は、病理学的に広く用いられる染色法であり、組織又は細胞に存在する特定の抗原を認識する抗体を用いて可視化し、その局在を光学顕微鏡あるいは電子顕微鏡下で観察するために考案された染色法である。
ＩＨＣ染色において、組織や細胞の構造の観察や、組織内の生体高分子（タンパク質、多糖、mRNAなど）の分布を調べるためには、抗原賦活化処理の前処置として固定処理を行う必要がある。固定処理には化学固定や物理固定処理等があるが、これらの処理により目的抗原は著しく変性を受け、ＩＨＣ染色での検出の不安定性や検出不能の結果に至る。
抗原賦活化は、病理学の分野においてルーチンに処理されたホルマリン固定、パラフィン包埋試料を用いてＩＨＣを行う際に、所望の組織内の生体高分子の抗原性を回復する処理である。近年、加熱処理による安定した抗原賦活化の手法が登場し、ＩＨＣの重要性はますます増加した。抗原賦活化として、ＣＣＡ（体系名シトラコン無水物(2-メチルマレイン酸無水物)）を用いて前処理する方法が開示されている（特許文献１）。
しかしながら、加熱処理などの強力な賦活化処理により、目的抗原の検出とともに、非特異反応によるバックグラウンドの検出も増えることが観察され、目的抗原との反応と非特異反応との区別に苦慮することも少なくない。
ＩＨＣは、目的抗原に対する抗体を用いてその局在を可視化する手法であり、その抗体には、様々な動物種でポリクローナル抗体やモノクローナル抗体が作製されている。特異抗体の抗原に対する親和性は抗体により異なり、ProteinA, ProteinG、目的タンパク質のペプチド等により精製された抗体を使用しても、ＩＨＣでは発現を検出できないことがほとんどである。またＩＨＣでの使用が可能であっても、非特異反応などによるバックグラウンドが問題となることも多い。
本発明は、ＩＨＣ染色において、組織又は細胞に存在する目的抗原を認識する抗体を用いて目的抗原を検出する場合に、非特異反応を可能な限り低減化し、目的抗原を効果的に検出しうるＩＨＣ染色方法を提供することを課題とする。
上記課題を解決するために、本発明者らはＩＨＣ染色での抗原賦活化の程度により、目的抗原の発現が弱くバックグラウンドの発色が強く観察され、ある条件では、目的抗原の発現とバックグラウンドの発色が見られるといった「差」があることに着目し、鋭意研究を重ねた結果、組織切片そのものを用いて抗体を精製することにより、ＩＨＣ染色でのバックグラウンドを低減させ、感度良く目的抗原を検出しうることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．ＩＨＣ染色に使用する抗体を、抗体精製用組織標本に予め接触させることにより、目的標本中の目的抗原以外の非特異反応物質と反応する抗体を吸着除去することを特徴とするＩＨＣ染色用抗体の精製方法。
２．前記抗体精製用組織標本と目的標本の組織が同種由来である前項１に記載の抗体の精製方法。
３．ＩＨＣ染色に使用する抗体が、目的標本中の目的抗原と抗原抗体反応しうる一次抗体である前項１又は２に記載の抗体の精製方法。
４．以下の工程を含む、前項１〜３のいずれか１に記載の抗体の精製方法：
１）抗体精製用組織標本を準備する工程；
２）ＩＨＣ染色に使用する抗体を含む溶液を、前記準備した抗体精製用組織標本に接触させる工程；
３）前記抗体精製用組織標本に接触させた抗体を含む溶液を回収する工程。
５．前項１〜４のいずれか１に記載の方法で精製した抗体を用いて、目的抗原を染色するＩＨＣ染色方法。
６．以下の工程を含む、前項５に記載の染色方法：
１）抗体精製用組織標本を準備する工程；
２）ＩＨＣ染色に使用する抗体を含む溶液を、前記準備した抗体精製用組織標本に接触させる工程；
３）前記抗体精製用組織標本に接触させた抗体を含む溶液を回収する工程；
４）前記回収して得た抗体を含む溶液を、ＩＨＣ用の薄切切片に接触させ、目的抗原と精製された抗体とを抗原抗体反応させる工程；
５）前記抗原抗体反応後の薄切切片を、標識物質を付加した二次抗体で処理し、染色する工程。
７．前項１〜４のいずれかに記載の抗体の精製方法に用い、目的標本中の目的抗原以外の非特異反応物質と反応する抗体を吸着除去するための、抗体精製用組織標本。
８．前項７に記載の抗体精製用組織標本を含む、ＩＨＣ染色用キット。
９．前項６に記載の工程２）及び３）で、免疫組織化学染色に使用する抗体を含む溶液を接触させ、抗体を回収した後に、該抗体精製用組織標本を標識物質を付加した二次抗体で処理することによる、目的抗原以外の非特異反応物質の吸着確認試験方法。
１０．前項８に記載の免疫組織化学染色用キットを用い、該キット中の抗体精製用組織標本に、免疫組織化学染色に使用する抗体を含む溶液を接触させ、抗体を回収した後に、該抗体精製用組織標本を標識物質を付加した二次抗体で処理することによる、目的抗原以外の非特異反応物質の吸着確認試験方法。
１．ＩＨＣ染色に使用する抗体を、抗体精製用組織標本に予め接触させることにより、目的標本中の目的抗原以外の非特異反応物質と反応する抗体を吸着除去することを特徴とするＩＨＣ染色用抗体の精製方法。
２．前記抗体精製用組織標本と目的標本の組織が同種由来である前項１に記載の抗体の精製方法。
３．ＩＨＣ染色に使用する抗体が、目的標本中の目的抗原と抗原抗体反応しうる一次抗体である前項１又は２に記載の抗体の精製方法。
４．以下の工程を含む、前項１〜３のいずれか１に記載の抗体の精製方法：
１）抗体精製用組織標本を準備する工程；
２）ＩＨＣ染色に使用する抗体を含む溶液を、前記準備した抗体精製用組織標本に接触させる工程；
３）前記抗体精製用組織標本に接触させた抗体を含む溶液を回収する工程。
５．前項１〜４のいずれか１に記載の方法で精製した抗体を用いて、目的抗原を染色するＩＨＣ染色方法。
６．以下の工程を含む、前項５に記載の染色方法：
１）抗体精製用組織標本を準備する工程；
２）ＩＨＣ染色に使用する抗体を含む溶液を、前記準備した抗体精製用組織標本に接触させる工程；
３）前記抗体精製用組織標本に接触させた抗体を含む溶液を回収する工程；
４）前記回収して得た抗体を含む溶液を、ＩＨＣ用の薄切切片に接触させ、目的抗原と精製された抗体とを抗原抗体反応させる工程；
５）前記抗原抗体反応後の薄切切片を、標識物質を付加した二次抗体で処理し、染色する工程。
７．前項１〜４のいずれかに記載の抗体の精製方法に用い、目的標本中の目的抗原以外の非特異反応物質と反応する抗体を吸着除去するための、抗体精製用組織標本。
８．前項７に記載の抗体精製用組織標本を含む、ＩＨＣ染色用キット。
９．前項６に記載の工程２）及び３）で、免疫組織化学染色に使用する抗体を含む溶液を接触させ、抗体を回収した後に、該抗体精製用組織標本を標識物質を付加した二次抗体で処理することによる、目的抗原以外の非特異反応物質の吸着確認試験方法。
１０．前項８に記載の免疫組織化学染色用キットを用い、該キット中の抗体精製用組織標本に、免疫組織化学染色に使用する抗体を含む溶液を接触させ、抗体を回収した後に、該抗体精製用組織標本を標識物質を付加した二次抗体で処理することによる、目的抗原以外の非特異反応物質の吸着確認試験方法。
本発明の方法によれば、検出しにくい目的抗原であっても、非特異に反応する不要な抗体を吸着除去することで、バックグラウンドの染色を抑え、効果的に目的抗原を検出することができる。本発明の抗体の精製方法に使用した精製用組織標本を含むスライド（吸着スライド）は、目的抗原以外のバックグラウンドが染色され、吸着除去された抗体の局在、量を確認することができ、染色の質確認(quality check)が可能となる。ＩＨＣ染色の際、個々の抗体によりバックグラウンドの低減効果（非特異反応の低減効果）は異なり、一般にバックグラウンドが強いポリクローナル抗体で、バックグラウンドの低減効果が高いが、本発明の抗体の精製方法によりモノクローナル抗体においてもバックグラウンド低減効果が確認された。このことから、本発明の抗体の精製方法は普遍的に使用できる精製法であり、利用価値は非常に高いと考えられる。本発明の方法は、ＩＨＣ用に最適化された抗体精製法で、組織切片そのものを用いて精製することが最大の特徴であり、ＩＨＣ以外にも、ウェスタンブロッティング(Westernblotting)等の抗体を利用した他の手法のバックグラウンドの低減にも使用可能であると考えられる。また本発明の方法により精製された抗体は、抗体の種類によっては、ブロッキング処理が不要となる効果が発生する。
本発明は、ＩＨＣ染色に使用する抗体、即ちＩＨＣ染色用抗体を、予め抗体精製用組織標本に接触させることにより、目的標本中の目的抗原以外の非特異反応物質と反応する抗体を吸着除去することを特徴とするＩＨＣ用抗体の精製方法に関する。
ＩＨＣ染色は、通常以下のＡ）〜Ｇ）の工程により実施される。本発明のＩＨＣ用抗体は、以下の工程において、Ｄ）又はＥ）で使用される一次抗体又は二次抗体に適用することができ、最も好適には一次抗体に適用することができる。本発明の抗体の精製処理は、Ｄ）又はＥ）の前であればどの時点で行なっても良い。例えば、抗体は目的抗原を検出するための目的標本作製前に、精製処理されたものであっても良い。
Ａ）パラフィン包埋による標本を作製後、薄切切片の作製工程。
Ｂ）作製した薄切切片について、脱パラフィン操作工程。
Ｃ）抗原賦活化処理工程。
Ｄ）一次抗体処理工程。
Ｅ）ニ次抗体処理工程。
Ｆ）染色工程。
Ｇ）封入工程。
Ａ）パラフィン包埋による標本を作製後、薄切切片の作製工程。
Ｂ）作製した薄切切片について、脱パラフィン操作工程。
Ｃ）抗原賦活化処理工程。
Ｄ）一次抗体処理工程。
Ｅ）ニ次抗体処理工程。
Ｆ）染色工程。
Ｇ）封入工程。
上記の抗体精製方法は、以下の１）〜３）の工程を少なくとも含む方法により行うことができる。
１）抗体精製用組織標本を準備する工程；
２）ＩＨＣ染色用抗体を含む溶液を、前記準備した抗体精製用組織標本に接触させる工程；
３）前記抗体精製用組織標本に接触させた抗体を含む溶液を回収する工程。
１）抗体精製用組織標本を準備する工程；
２）ＩＨＣ染色用抗体を含む溶液を、前記準備した抗体精製用組織標本に接触させる工程；
３）前記抗体精製用組織標本に接触させた抗体を含む溶液を回収する工程。
上記において、抗体精製用組織標本とは、ＩＨＣ染色用抗体を予め接触させる組織標本であり、目的抗原を検出するための目的標本とは区別される。抗体精製用組織標本の組織と目的標本の組織は、同種動物由来又は同一動物由来であることが好ましい。同種動物由来とは、例えばヒト組織標本中の目的抗原を検出する場合、ヒト由来の抗体精製用組織標本であることが好ましく、同一ヒト由来でも良い。ヒト以外の動物についても同様のＩＨＣ染色を行う場合は、その動物と同種又は同一個体由来の抗体精製用組織標本であるのが好ましい。例えば目的標本から薄切切片を作製した余剰の組織標本を、上記抗体精製用組織標本として使用することもできる。抗体精製用組織標本の厚さは、厚くてもよく、目的標本と同様の厚さとしても良い。抗体精製用組織標本は、抗体精製処理用の容器内に設置することができる。
本発明の方法は、ＩＨＣの最終段階にある、目的抗原が賦活化されない条件で処理された抗体精製用組織標本を吸着材料に用いることで、他の吸着法では除去しきれない不要な抗体を除去することができる。精製する抗体が、腫瘍にのみ発現している抗原を認識するものであれば、非腫瘍組織すなわち正常組織を抗体精製用組織標本とすることもできる。
上記において、ＩＨＣ用抗体は、目的標本中の目的抗原を検出するための一次抗体又は一次抗体を検出するための標識物質を付加した二次抗体であっても良いが、特に好適には一抗体が挙げられる。一次抗体が、目的標本中の目的抗原以外の物質と非特異反応を起こすことにより、ＩＨＣ染色においてバックグラウンドの一因となるからである。
上記において、ＩＨＣ染色用抗体を抗体精製用組織標本に予め接触させるために、ＩＨＣ染色用抗体をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等に溶解し、溶液とするのが好適である。上記調製したＩＨＣ染色用抗体を含む溶液を、例えば抗体精製用組織標本を設置した抗体精製処理用容器に注入し、該抗体精製用組織標本中に含まれる非特異反応物質とＩＨＣ染色用抗体を十分に反応させた後に、ＩＨＣ染色用抗体を含む溶液を、例えばピペットなどにより回収することによって、ＩＨＣ染色用抗体を精製することができる。
本発明は、上記精製したＩＨＣ染色用抗体を用いて、目的抗原を染色するＩＨＣ染色方法にも及ぶ。かかるＩＨＣ染色方法は、上述のＡ）〜Ｇ）の工程を含む方法により実施可能である。本発明のＩＨＣ染色において、抗体の精製処理を行う以外の工程については、自体公知、あるいは今後開発される方法を用いることができ、特に限定されない。
本発明のＩＨＣ染色方法は、より詳細には上記Ａ）〜Ｇ）の工程に、以下の工程を組み込んで行うことができる。
１）抗体精製用組織標本を準備する工程；
２）ＩＨＣ用抗体を含む溶液を、前記準備した抗体精製用組織標本に接触させる工程；
３）前記抗体精製用組織標本に接触させた抗体を含む溶液を回収する工程；
４）前記分離して得た抗体を含む溶液を、ＩＨＣ用の薄切切片に接触させ、目的抗原と精製された抗体とを抗原抗体反応させる工程（工程Ｄ）；
５）前記抗原抗体反応後の薄切切片を、標識物質を付加した二次抗体で処理し（工程Ｅ）、染色する工程（工程Ｆ）。
１）抗体精製用組織標本を準備する工程；
２）ＩＨＣ用抗体を含む溶液を、前記準備した抗体精製用組織標本に接触させる工程；
３）前記抗体精製用組織標本に接触させた抗体を含む溶液を回収する工程；
４）前記分離して得た抗体を含む溶液を、ＩＨＣ用の薄切切片に接触させ、目的抗原と精製された抗体とを抗原抗体反応させる工程（工程Ｄ）；
５）前記抗原抗体反応後の薄切切片を、標識物質を付加した二次抗体で処理し（工程Ｅ）、染色する工程（工程Ｆ）。
上記工程において、抗体精製用組織標本では、目的抗原以外のバックグラウンドが染色され、またコーティングガラススライドそのものも染色される。一方、目的抗原を検出するための目的標本について、精製抗体を用いて染色したスライドでは、目的抗原以外のバックグラウンドの染色が抑えられていることから、不要な抗体が吸着除去されていることが確認される。
本発明は、目的標本中の目的抗原以外の非特異反応物質と反応する抗体を吸着除去するための、抗体精製用組織標本にも及び、該抗体精製用組織標本を含むＩＨＣ染色用キットにも及ぶ。本発明の抗体精製用組織標本を用いて、目的抗原以外の非特異反応物質と反応する抗体の吸着確認試験を行うことができる。具体的には、上記工程２）で、ＩＨＣ染色に使用する抗体を含む溶液を接触させた抗体精製用組織標本を、標識物質を付加した二次抗体で処理して染色することにより目的抗原以外の非特異反応物質と反応する抗体の吸着確認試験を行う。抗体精製用組織標本中の非特異反応物質とＩＨＣ用抗体が反応する為、前述のＡ）〜Ｇ）の工程のうち、Ｅ）二次抗体処理工程以下の工程を行うことで、ＩＨＣ染色をすることができる。ここにおいて、染色された抗体精製用組織標本を確認することで、吸着確認試験を行うことができる。さらには吸着除去された抗体の局在、量を確認することができ、染色の質確認(quality check)が可能となる。個々の抗体により、バックグラウンドの低減効果は異り、一般に、バックグラウンドの強いポリクローナル抗体で、バックグラウンドの低減効果が高いが、本発明の抗体精製方法によるとモノクローナル抗体においてもバックグラウンド低減効果が確認される。
本発明は、ＩＨＣ用抗体を精製した後、非特異反応物質と反応する抗体の吸着を確認する吸着確認試験方法にも及ぶ。上記、吸着確認試験は、上記ＩＨＣ染色用キットを用い、該キット中の抗体精製用組織標本にＩＨＣ染色に使用する抗体を含む溶液を接触させ、抗体を回収した後に、抗体精製用組織標本を標識物質を付加した二次抗体で処理することにより行なうことができる。本発明の抗体精製用組織標本は、抗体精製用にキットに含めることができるほか、非特異物質と反応する抗体吸着確認用標本（例えば吸着確認用スライド）としても利用することができる。
本法は、ＩＨＣ用に最適化された抗体精製法であり、組織切片そのものを用いて精製することが最大の特徴である。ＩＨＣ以外にも、ウェスタンブロッティング(Westernblotting)等の、抗体を利用した他の手法のバックグラウンドの低減にも使用可能であると考えられる。
以下に本発明の実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。
（実施例１）抗ＭＴＡ１抗体を一次抗体とした乳癌組織の免疫染色
本実施例では、抗ＭＴＡ１抗体を一次抗体として乳癌組織の免疫染色を行なった。
本実施例では、抗ＭＴＡ１抗体を一次抗体として乳癌組織の免疫染色を行なった。
１）乳癌組織について、一般的な手法に従ってパラフィン包埋による標本を作製し、ミクロトームを用いて薄切切片（抗体精製用組織標本１枚及びMetastasis-associated protein 1（ＭＴＡ１）を検出するための目的標本（精製抗体用１枚、非精製抗体用１枚）計３枚）を作製した。
２）作製した薄切切片について、キシレン１００％-５分、１００％-５分、１００％-５分、メタノール１００％-５分、１００％-５分、１００％-５分で処理し、脱パラフィン操作行った。
３）その後、流水で５分間洗浄し、各標本の前処理試料を得た。
２）作製した薄切切片について、キシレン１００％-５分、１００％-５分、１００％-５分、メタノール１００％-５分、１００％-５分、１００％-５分で処理し、脱パラフィン操作行った。
３）その後、流水で５分間洗浄し、各標本の前処理試料を得た。
４）上記により得た各標本の前処理試料のうち、etastasis-associated protein 1（ＭＴＡ１）を検出するための目的標本２枚（スライドガラス）を、10mM/tris -0.3mM/EDTA-0.3mM/EGTA-0.3mM/CyDTA(trans-1,2-シクロヘキサンジアミン-N,N,N',N'-四酢酸)-0.025%(v/v)Tween(R)20(Poly(Oxyethylene)sorbitan monolaulate)を含む溶液の入ったバット中に浸し、１２１℃で１５分間オートクレーブ処理し、抗原賦活化処理を行った。前記抗体精製用組織標本（スライドガラス）については抗原賦活化処理は行なわず、ＰＢＳにて５分ずつ３回洗浄した。
上記各標本（スライドガラス）を、 内因性ペルオキシダーゼの抑制操作のために、３％H2O2メタノール （３０％ H2O2 １５ｍＬ＋メタノール１３５ｍＬ）１５０ｍＬを含むバット中に１５分間静置した。次に ＰＢＳを用いて各々５分ずつ３回洗浄した。
上記各標本（スライドガラス）を、 内因性ペルオキシダーゼの抑制操作のために、３％H2O2メタノール （３０％ H2O2 １５ｍＬ＋メタノール１３５ｍＬ）１５０ｍＬを含むバット中に１５分間静置した。次に ＰＢＳを用いて各々５分ずつ３回洗浄した。
５）抗体の精製
上記抗体精製用組織標本（スライドガラス）に、抗ＭＴＡ１抗体（Santa Cruz Biotechnology社、クローンH-166、製品番号sc-10813、rabbit polyclonal抗体）をＰＢＳで５０倍希釈した抗体溶液を３００μｌ滴下し、室温で１．５時間静置した。その後、抗体溶液をピペットで回収し、本発明の精製抗体溶液を調製した。上記操作により、抗体溶液中の非特異反応物質と反応する抗体が抗体精製用組織標本に吸着反応し、回収した抗体溶液から非特異反応物質と反応する抗体が吸着除去される。
精製を行なわない場合は、上記抗体をＰＢＳで５０倍希釈したものを非精製抗体溶液とした。
上記抗体精製用組織標本（スライドガラス）に、抗ＭＴＡ１抗体（Santa Cruz Biotechnology社、クローンH-166、製品番号sc-10813、rabbit polyclonal抗体）をＰＢＳで５０倍希釈した抗体溶液を３００μｌ滴下し、室温で１．５時間静置した。その後、抗体溶液をピペットで回収し、本発明の精製抗体溶液を調製した。上記操作により、抗体溶液中の非特異反応物質と反応する抗体が抗体精製用組織標本に吸着反応し、回収した抗体溶液から非特異反応物質と反応する抗体が吸着除去される。
精製を行なわない場合は、上記抗体をＰＢＳで５０倍希釈したものを非精製抗体溶液とした。
６）免疫組織化学（ＩＨＣ）染色
Ａ）精製抗体スライド
上記４）において抗原賦活化処理を行った目的標本（スライドガラス）に、上記５）で得た精製抗体溶液を２００μｌ滴下し、室温で１時間静置した。
Ｂ）非精製抗体スライド
精製処理を行わない抗体を用いた染色では、上記４）において抗原賦活化処理を行った目的標本（スライドガラス）にブロッキング処理を行い、その後上記５）の非精製抗体溶液を２００μｌ滴下し、室温で１時間静置した。ブロッキング処理は、ＩＨＣ染色用キット(UltraTech HRP Streptavidin-Biotin Detection System (Beckman Coulter社))に含まれるブロッキング液を上記スライドに滴下して室温で５分間静置し、その後ブロッキング剤を除くことにより行なった。
Ａ）精製抗体スライド
上記４）において抗原賦活化処理を行った目的標本（スライドガラス）に、上記５）で得た精製抗体溶液を２００μｌ滴下し、室温で１時間静置した。
Ｂ）非精製抗体スライド
精製処理を行わない抗体を用いた染色では、上記４）において抗原賦活化処理を行った目的標本（スライドガラス）にブロッキング処理を行い、その後上記５）の非精製抗体溶液を２００μｌ滴下し、室温で１時間静置した。ブロッキング処理は、ＩＨＣ染色用キット(UltraTech HRP Streptavidin-Biotin Detection System (Beckman Coulter社))に含まれるブロッキング液を上記スライドに滴下して室温で５分間静置し、その後ブロッキング剤を除くことにより行なった。
その後、ＰＢＳを用いて各々５分ずつ３回洗浄し、上記ＩＨＣ染色用キットに含まれるビオチン標識二次抗体を加えて室温で１０分間静置した。ＰＢＳを用いて各々５分ずつ３回洗浄し、酵素標識ストレプトアビジン液を加えて室温で１０分間静置した。ＰＢＳを用いて各々５分ずつ３回洗浄し、ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）発色液を加えて室温で１〜５分間で発色を確認した。ＰＢＳにて発色停止後、流水で５分間洗浄し、ヘマトキシリンを用いて２０秒間染色を行った。５０℃で１分間発色し、流水で１分間洗浄、脱水透徹（メタノール１００％-５分、１００％-５分、１００％-５分、キシレン１００％-５分、１００％-５分、１００％-５分）し、封入した。
上記ＩＨＣ染色組織は、光学顕微鏡により観察した（図１）。その結果、一次抗体を精製した場合（精製抗体スライド）は、ブロッキング処理を行わなかったにもかかわらず、目的抗原が染色され、精製処理を行わなかった一次抗体の場合（非精製抗体スライド）に比べて、バックグラウンド低減効果が確認された。
（実施例２）抗ＲＦＰ抗体を一次抗体とした乳癌組織の免疫染色
本実施例では、抗ret finger protein（ＲＦＰ）抗体（IBL社、クローン9H-812、rabbit polyclonal抗体）を一次抗体として乳癌組織の免疫染色を行なった。一次抗体に抗ＲＦＰ抗体を用いた以外は実施例１の１）〜３）と同手法により処理し、前処理試料を得た。上記により得た各標本の前処理試料のうち、ＲＦＰを検出するための目的標本（スライドガラス）を、実施例１の４）と同手法により抗原賦活化処理した。前記抗体精製用組織標本（スライドガラス）については抗原賦活化処理は行なわなかった。
本実施例では、抗ret finger protein（ＲＦＰ）抗体（IBL社、クローン9H-812、rabbit polyclonal抗体）を一次抗体として乳癌組織の免疫染色を行なった。一次抗体に抗ＲＦＰ抗体を用いた以外は実施例１の１）〜３）と同手法により処理し、前処理試料を得た。上記により得た各標本の前処理試料のうち、ＲＦＰを検出するための目的標本（スライドガラス）を、実施例１の４）と同手法により抗原賦活化処理した。前記抗体精製用組織標本（スライドガラス）については抗原賦活化処理は行なわなかった。
抗体の精製は、抗ＲＦＰ抗体を用いた以外は実施例１の５）と同手法により行ない、精製抗体溶液とした。精製を行なわない場合は、上記抗体をＰＢＳで５０倍希釈したものを非精製抗体溶液とした。
ＩＨＣ染色
Ａ）精製抗体スライド
上記抗原賦活化処理を行った目的標本（スライドガラス）に、上記精製抗体溶液を２００μｌ滴下し、室温で１時間静置した。ブロッキング処理は、行なわなかった。
Ｂ）非精製抗体スライド
精製処理を行わない抗体を用いた染色では、上記抗原賦活化処理を行った目的標本（スライドガラス）に上記非精製抗体溶液を２００μｌ滴下し、室温で１時間静置した。ブロッキング処理は、行なわなかった。
Ａ）精製抗体スライド
上記抗原賦活化処理を行った目的標本（スライドガラス）に、上記精製抗体溶液を２００μｌ滴下し、室温で１時間静置した。ブロッキング処理は、行なわなかった。
Ｂ）非精製抗体スライド
精製処理を行わない抗体を用いた染色では、上記抗原賦活化処理を行った目的標本（スライドガラス）に上記非精製抗体溶液を２００μｌ滴下し、室温で１時間静置した。ブロッキング処理は、行なわなかった。
その後のＰＢＳによる洗浄、二次抗体処理、発色処理、封入処理については、実施例１と同手法により行なった。また、抗体精製用組織標本を用いた抗体の精製処理後のスライドについても同様に二次抗体処理等を行った。
上記ＩＨＣ染色組織は、光学顕微鏡により観察した（図２）。その結果、一次抗体を精製した場合（精製抗体スライド）は、目的抗原が染色され、精製処理を行わなかった一次抗体の場合（非精製抗体スライド）に比べて、バックグラウンド低減効果が確認された。さらに、抗体精製用組織標本を用いた抗体の精製処理後のスライド（吸着スライド）について、抗体溶液から非特異反応抗体を吸着し、バックグラウンドとして染色されていることが確認された。
（実施例３）抗Ｓｍａｄ４抗体を一次抗体とした乳癌組織の免疫染色
本実施例では、抗Ｓｍａｄ４抗体（Santa Cruz Biotechnology社、クローンB-8、製品番号sc-7966、mouse monoclonal抗体）を一次抗体として乳癌組織の免疫染色を行なった。一次抗体に抗Ｓｍａｄ４抗体を用いた以外は実施例１の１）〜３）と同手法により処理し、前処理試料を得た。また、10mM/tris -0.3mM/EDTA-0.3mM/EGTA-0.3mM/CyDTA-0.025%(v/v)Tween(R)20の代わりに蒸留水を用いた以外は実施例１の４）と同手法により抗原賦活化処理を行った。前記抗体精製用組織標本（スライドガラス）については抗原賦活化処理は行なわなかった。抗体の精製処理についても、抗Ｓｍａｄ４抗体を用いた以外は実施例１の５）と同手法により行なった。
本実施例では、抗Ｓｍａｄ４抗体（Santa Cruz Biotechnology社、クローンB-8、製品番号sc-7966、mouse monoclonal抗体）を一次抗体として乳癌組織の免疫染色を行なった。一次抗体に抗Ｓｍａｄ４抗体を用いた以外は実施例１の１）〜３）と同手法により処理し、前処理試料を得た。また、10mM/tris -0.3mM/EDTA-0.3mM/EGTA-0.3mM/CyDTA-0.025%(v/v)Tween(R)20の代わりに蒸留水を用いた以外は実施例１の４）と同手法により抗原賦活化処理を行った。前記抗体精製用組織標本（スライドガラス）については抗原賦活化処理は行なわなかった。抗体の精製処理についても、抗Ｓｍａｄ４抗体を用いた以外は実施例１の５）と同手法により行なった。
ＩＨＣ染色
Ａ）精製抗体スライド
上記抗原賦活化処理を行った目的標本（スライドガラス）に、上記精製抗体溶液を２００μｌ滴下し、室温で１時間静置した。ブロッキング処理は、行なわなかった。
Ｂ）非精製抗体スライド
精製処理を行わない抗体を用いた染色では、上記抗原賦活化処理を行った目的標本（スライドガラス）に上記非精製抗体溶液を２００μｌ滴下し、室温で１時間静置した。ブロッキング処理は、行なわなかった。
Ａ）精製抗体スライド
上記抗原賦活化処理を行った目的標本（スライドガラス）に、上記精製抗体溶液を２００μｌ滴下し、室温で１時間静置した。ブロッキング処理は、行なわなかった。
Ｂ）非精製抗体スライド
精製処理を行わない抗体を用いた染色では、上記抗原賦活化処理を行った目的標本（スライドガラス）に上記非精製抗体溶液を２００μｌ滴下し、室温で１時間静置した。ブロッキング処理は、行なわなかった。
その後のＰＢＳによる洗浄、二次抗体処理、発色処理、封入処理については、実施例１と同手法により行なった。また、抗体精製用組織標本を用いた抗体の精製処理後のスライドについても同様に二次抗体処理等を行った。
上記ＩＨＣ染色組織は、光学顕微鏡により観察した（図３）。その結果、一次抗体を精製した場合（精製抗体スライド）は、目的抗原が染色され、精製処理を行わなかった一次抗体の場合（非精製抗体スライド）に比べて、バックグラウンド低減効果が確認された。さらに、抗体精製用組織標本を用いた抗体の精製処理後のスライド（吸着スライド）について、抗体溶液から非特異反応抗体を吸着し、バックグラウンドとして染色されていることが確認された。
（実施例４）抗ＴＧＦβＲ１抗体を一次抗体とした乳癌組織の免疫染色
本実施例では、抗ＴＧＦβＲ１抗体（Santa Cruz Biotechnology社、クローンV-22、製品番号sc-398、rabbit polyclonal抗体）を一次抗体として乳癌組織の免疫染色を行なった。一次抗体に抗ＴＧＦβＲ１抗体を用いた以外は実施例１の１）〜３）と同手法により処理し、前処理試料を得た。また、10mM/tris -0.3mM/EDTA-0.3mM/EGTA-0.3mM/CyDTA-0.025%(v/v)Tween(R)20の代わりに10mM/tris -1mM/EDTA-0.025%(v/v)Tween(R)20 を用いた以外は実施例１の４）と同手法により抗原賦活化処理を行った。前記抗体精製用組織標本（スライドガラス）については抗原賦活化処理は行なわなかった。抗体の精製処理は、抗ＴＧＦβＲ１抗体１００倍希釈したものを３００μｌ用い、１時間インキュベートした以外は実施例１の５）と同手法により行なった。
本実施例では、抗ＴＧＦβＲ１抗体（Santa Cruz Biotechnology社、クローンV-22、製品番号sc-398、rabbit polyclonal抗体）を一次抗体として乳癌組織の免疫染色を行なった。一次抗体に抗ＴＧＦβＲ１抗体を用いた以外は実施例１の１）〜３）と同手法により処理し、前処理試料を得た。また、10mM/tris -0.3mM/EDTA-0.3mM/EGTA-0.3mM/CyDTA-0.025%(v/v)Tween(R)20の代わりに10mM/tris -1mM/EDTA-0.025%(v/v)Tween(R)20 を用いた以外は実施例１の４）と同手法により抗原賦活化処理を行った。前記抗体精製用組織標本（スライドガラス）については抗原賦活化処理は行なわなかった。抗体の精製処理は、抗ＴＧＦβＲ１抗体１００倍希釈したものを３００μｌ用い、１時間インキュベートした以外は実施例１の５）と同手法により行なった。
ＩＨＣ染色
Ａ）精製抗体スライド
上記抗原賦活化処理を行った目的標本（スライドガラス）に、上記精製抗体溶液を２００μｌ滴下し、室温で１時間静置した。ブロッキング処理は、実施例１と同手法により行なった。
Ｂ）非精製抗体スライド
精製処理を行わない抗体を用いた染色では、上記抗原賦活化処理を行った目的標本（スライドガラス）に上記非精製抗体溶液を２００μｌ滴下し、室温で１時間静置した。ブロッキング処理は、実施例１と同手法により行なった。
Ａ）精製抗体スライド
上記抗原賦活化処理を行った目的標本（スライドガラス）に、上記精製抗体溶液を２００μｌ滴下し、室温で１時間静置した。ブロッキング処理は、実施例１と同手法により行なった。
Ｂ）非精製抗体スライド
精製処理を行わない抗体を用いた染色では、上記抗原賦活化処理を行った目的標本（スライドガラス）に上記非精製抗体溶液を２００μｌ滴下し、室温で１時間静置した。ブロッキング処理は、実施例１と同手法により行なった。
その後のＰＢＳによる洗浄、二次抗体処理、発色処理、封入処理については、実施例１と同手法により行なった。また、抗体精製用組織標本を用いた抗体の精製処理後のスライドについても同様に二次抗体処理等を行った。
上記ＩＨＣ染色組織は、光学顕微鏡により観察した（図４）。その結果、一次抗体を精製した場合（精製抗体スライド）は、目的抗原が染色され、精製処理を行わなかった一次抗体の場合（非精製抗体スライド）に比べて、バックグラウンド低減効果が確認された。さらに、抗体精製用組織標本を用いた抗体の精製処理後のスライド（吸着スライド）について、抗体溶液から非特異反応抗体を吸着し、バックグラウンドとして染色されていることが確認された。
（実施例５）抗ＣＤ２４抗体を一次抗体とした乳癌組織の免疫染色
本実施例では、抗ＣＤ２４抗体（NeoMarkers社、クローンSN3b、製品番号MS-1279-P0、mouse monoclonal抗体）を一次抗体として乳癌組織の免疫染色を行なった。一次抗体に抗ＣＤ２４抗体を用いた以外は実施例１の１）〜３）と同手法により処理し、前処理試料を得た。また、10mM/tris -0.3mM/EDTA-0.3mM/EGTA-0.3mM/CyDTA-0.025%(v/v)Tween(R)20の代わりにTris -EDTA -tween(R)20を用いた以外は実施例１の４）と同手法により抗原賦活化処理を行った。前記抗体精製用組織標本（スライドガラス）については抗原賦活化処理は行なわなかった。抗体の精製処理は、抗ＣＤ２４抗体５０倍希釈したものを３００μｌ用い、１時間インキュベートした以外は実施例１の５）と同手法により行なった。
本実施例では、抗ＣＤ２４抗体（NeoMarkers社、クローンSN3b、製品番号MS-1279-P0、mouse monoclonal抗体）を一次抗体として乳癌組織の免疫染色を行なった。一次抗体に抗ＣＤ２４抗体を用いた以外は実施例１の１）〜３）と同手法により処理し、前処理試料を得た。また、10mM/tris -0.3mM/EDTA-0.3mM/EGTA-0.3mM/CyDTA-0.025%(v/v)Tween(R)20の代わりにTris -EDTA -tween(R)20を用いた以外は実施例１の４）と同手法により抗原賦活化処理を行った。前記抗体精製用組織標本（スライドガラス）については抗原賦活化処理は行なわなかった。抗体の精製処理は、抗ＣＤ２４抗体５０倍希釈したものを３００μｌ用い、１時間インキュベートした以外は実施例１の５）と同手法により行なった。
ＩＨＣ染色
Ａ）精製抗体スライド
上記抗原賦活化処理を行った目的標本（スライドガラス）に、上記精製抗体溶液を２００μｌ滴下し、室温で１時間静置した。ブロッキング処理は、実施例１と同手法により行なった。
Ｂ）非精製抗体スライド
精製処理を行わない抗体を用いた染色では、上記抗原賦活化処理を行った目的標本（スライドガラス）に上記非精製抗体溶液を２００μｌ滴下し、室温で１時間静置した。ブロッキング処理は、実施例１と同手法により行なった。
Ａ）精製抗体スライド
上記抗原賦活化処理を行った目的標本（スライドガラス）に、上記精製抗体溶液を２００μｌ滴下し、室温で１時間静置した。ブロッキング処理は、実施例１と同手法により行なった。
Ｂ）非精製抗体スライド
精製処理を行わない抗体を用いた染色では、上記抗原賦活化処理を行った目的標本（スライドガラス）に上記非精製抗体溶液を２００μｌ滴下し、室温で１時間静置した。ブロッキング処理は、実施例１と同手法により行なった。
その後のＰＢＳによる洗浄、二次抗体処理、発色処理、封入処理については、実施例１と同手法により行なった。また、抗体精製用組織標本を用いた抗体の精製処理後のスライドについても同様に二次抗体処理等を行った。
上記ＩＨＣ染色組織は、光学顕微鏡により観察した（図５）。その結果、一次抗体を精製した場合（精製抗体スライド）は、目的抗原が染色され、精製処理を行わなかった一次抗体の場合（非精製抗体スライド）に比べて、バックグラウンド低減効果が確認された。さらに、抗体精製用組織標本を用いた抗体の精製処理後のスライド（吸着スライド）について、抗体溶液から非特異反応抗体を吸着し、バックグラウンドとして染色されていることが確認された。
以上詳述したように、本発明の方法によれば、検出しにくい目的抗原であっても、非特異に反応する不要な抗体を吸着除去することで、バックグラウンドの染色を抑え、効果的に目的抗原を検出することができる。本発明の抗体の精製方法に使用した精製用組織標本を含むスライド（吸着スライド）は、目的抗原以外のバックグラウンドが染色され、吸着除去された抗体の局在、量を確認することができ、染色の質確認(quality check)が可能となる。つまり、本発明の抗体精製用組織標本は、該抗体精製用組織標本を用いて抗体を精製した後に、抗体精製用組織標本を常法により二次抗体処理し、染色することで、非特異物質と反応する抗体の吸着結果を確認することができる。これにより、本発明の抗体精製用組織標本は、抗体精製用にキットに含めることができるほか、非特異物質と反応しうる抗体吸着確認用標本（例えば非特異抗体吸着確認用スライド）としても利用することができる。また本発明の方法により精製された抗体の種類によっては、ブロッキング処理が不要となる効果が発生する。
ＩＨＣ染色の際、個々の抗体により、バックグラウンドの低減効果（非特異反応の低減効果）は異なるが、一般にバックグラウンドが強いポリクローナル抗体で、バックグラウンドの低減効果が高いが、モノクローナル抗体においても本法によるバックグラウンド低減効果が確認された。このことから、本発明の抗体の精製方法は、普遍的に使用のできる精製法であり、利用価値は非常に高いと考えられる。本発明の方法は、ＩＨＣ用に最適化された抗体精製法で、組織切片そのものを用いて精製することが最大の特徴であり、ＩＨＣ以外にも、ウェスタンブロッティング(Westernblotting)等の、抗体を利用した他の手法のバックグラウンドの低減にも使用可能であると考えられる。
Claims (8)
- 免疫組織化学染色用抗体を含む抗体溶液を、目的標本の組織と同種由来組織を固定処理した組織標本であって、抗原賦活化されていない吸着スライドからなる抗体精製用組織標本に予め接触させ、回収することにより、目的標本中の目的抗原以外の非特異反応物質と反応する抗体を吸着除去することを特徴とする免疫組織化学染色用抗体の精製方法。
- 以下の工程を含む、請求項１に記載の抗体の精製方法：
１）固定処理した組織標本であって、抗原賦活化されていない抗体精製用組織標本を準備する工程；
２）免疫組織化学染色用抗体を含む抗体溶液を、前記準備した抗体精製用組織標本に接触させ、前記抗体溶液中に含まれる抗体と抗体精製用組織標本に含まれる非特異物質を抗原抗体反応させる工程；
３）前記抗体精製用組織標本に接触させた抗体溶液を回収する工程。 - 固定処理し、かつ抗原賦活化処理を施した目的標本中の目的抗原を、請求項１又は２に記載の方法で精製した免疫組織化学染色用抗体を用いて抗原抗体反応させ、染色する工程を含む、免疫組織化学染色方法。
- 以下の工程を含む、請求項３に記載の染色方法：
１）固定処理した組織標本であって、抗原賦活化されていない抗体精製用組織標本を準備する工程；
２）免疫組織化学染色用抗体を含む抗体溶液を、前記準備した抗体精製用組織標本に接触させ、前記溶液中に含まれる抗体と抗体精製用組織標本に含まれる非特異物質を抗原抗体反応させる工程；
３）前記抗体精製用組織標本に接触させた抗体溶液を回収する工程；
４）前記回収して得た抗体溶液を、固定処理し、かつ抗原賦活化処理を施した目的標本の薄切切片に接触させ、目的抗原と精製した免疫組織化学染色用抗体とを抗原抗体反応させる工程；
５）前記抗原抗体反応後の薄切切片を、標識物質を付加した二次抗体で処理し、染色する工程。 - 請求項１又は２に記載の抗体の精製方法に用い、目的標本中の目的抗原以外の非特異反応物質と反応する抗体を吸着除去するための抗体精製用組織標本であり、目的標本の組織と同種由来組織を固定処理した組織標本であって、抗原賦活化されていない吸着スライドからなることを特徴とする抗体精製用組織標本。
- 少なくとも以下を含む、免疫組織用染色キット：
ａ）請求項５に記載の抗体精製用組織標本；
ｂ）免疫組織化学染色用抗体を含む抗体試薬；及び
ｃ）標識物質を付加した二次抗体を含む標識試薬。 - 請求項４に記載の工程２）及び３）で、抗体精製用組織標本に抗体溶液を接触させ、抗体溶液を回収した後に、該抗体精製用組織標本を、標識物質を付加した二次抗体で処理することによる、目的抗原以外の非特異反応物質の吸着確認試験方法。
- 請求項６に記載の免疫組織化学染色用キットを用い、該キット中の抗体精製用組織標本に、抗体試薬を接触させ、免疫組織化学染色用抗体を回収した後に、該抗体精製用組織標本を、標識試薬で処理することによる、目的抗原以外の非特異反応物質の吸着確認試験方法。
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