PL199565B1 - Preparat farmaceutyczny zawierający kompozycję o przedłużonym uwalnianiu oraz zastosowanie preparatu farmaceutycznego zawierającego kompozycję o przedłużonym uwalnianiu - Google Patents

Abstract

Obecny wynalazek dotyczy preparatu farmaceutycznego, zawieraj acego kompozycj e o przed lu- zonym uwalnianiu na bazie polimeru hydrofilowego, zeluj ac a z opó znieniem, który zgodnie z wynalaz- kiem cechuje si e tym, ze kompozycja o przed lu zonym uwalnianiu, zeluj aca z opó znieniem zawiera: a) alginian; b) srodek biologicznie aktywny oraz c) co najmniej jeden zwi azany jon metalu wielowarto- sciowego. Kompozycja ta ewentualnie dodatkowo zawiera d) co najmniej jeden donor protonu zdolny do generowania kwasu na drodze hydrolizy, s labej rozpuszczalno sci lub powolnego rozpuszczania, z uwolnieniem zwi azanego jonu metalu wielowarto sciowego. Preparat farmaceutyczny wed lug wyna- lazku zawieraj acy kompozycj e o przed luzonym uwalnianiu w farmaceutycznie dopuszczalnym no sni- ku, rozcie nczalniku lub adjuwancie znajduje zastosowanie do wytwarzania srodków leczniczych na ró znorodne wskazania, zw laszcza na wskazanie b ed ace zaburzeniem wybranym z grupy obejmuj acej: nadmiern a wag e, cukrzyc e, wysoki poziom lipidów we krwi, stwardnienie t etnic, mia zd zyc e t etnic, zmniejszenie lub zahamowanie tworzenia si e kamieni zó lciowych, niewystarczaj ac a mas e tkanki bez- t luszczowej, niewystarczaj ac a wra zliwo sc na insulin e i udar mózgu, b ad z z grupy obejmuj acej: niedo- bory komórek hematopoetycznych, infekcj e i neutropeni e, lub te z b ed ace stanem zapalnym. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy preparatu farmaceutycznego zawierającego kompozycję o przedłużonym uwalnianiu na bazie polimeru hydrofilowego oraz zastosowania preparatu farmaceutycznego według wynalazku, zawierającego kompozycję o przedłużonym uwalnianiu na bazie polimeru hydrofilowego.

Stan techniki

Wraz z rozwojem technologii inżynierii genetycznej i komórkowej dostępność protein rekombinacyjnych spowodowała postęp w zastosowaniu protein jako substancji leczniczych do celów terapeutycznych. Wiele chorób lub stanów chorobowych leczonych za pomocą farmaceutycznie skutecznych protein wymaga utrzymania stałych w czasie poziomów tych protein w organizmie pacjenta w celu osiągnięcia jak najbardziej skutecznego efektu terapeutycznego. Jednak większość proteinowych środków farmaceutycznych - ze względu na generalnie krótki biologiczny okres półtrwania, wymaga częstego podawania. Te iniekcje powtarzające się w różnych odstępach czasu powodują fluktuacje stężeń środków terapeutycznych i są istotnym fizycznym i finansowym obciążeniem dla pacjentów. Ponieważ wiele stanów chorobowych lepiej reaguje na kontrolowane stężenia środka farmaceutycznego w organizmie, istnieje zapotrzebowanie na preparaty o kontrolowanym uwalnianiu środka leczniczego dla zapewnienia dłuższych okresów uwalniania substancji aktywnej na wymaganym poziomie. Takie środki lecznicze o przedłużonym uwalnianiu zapewniłyby pacjentowi nie tylko zwiększenie efektów profilaktycznych, terapeutycznych lub diagnostycznych, lecz także zmniejszenie częstości iniekcji, jak również obniżenie całkowitych kosztów terapii.

Bieżące próby podtrzymania stężeń środka leczniczego pomiędzy kolejno podawanymi dawkami u ludzi lub zwierząt obejmują zastosowanie biodegradowalnych polimerów jako matryc do kontrolowanego uwalniania leku. Przykładowo, w brytyjskim opisie patentowym nr 1,388,580 ujawniono zastosowanie hydrożeli do przedłużonego uwalniania insuliny. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Am. nr 4,789,550 ujawnia zastosowanie mikrokapsułek alginianowych powleczonych polilizyną do dostarczania proteiny przez zamknięcie w kapsułkach żywych komórek. W próbach przedłużonego uwalniania wykorzystywano ponadto kompozycje polimerów anionowych lub kationowych otoczone polimerami jonowymi o przeciwnym ładunku do zamykania w kapsułkach komórek zdolnych do wytwarzania aktywnych biologicznie kompozycji. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Am. nr 4,744,933. Podobnie, wielowarstwowe powłoki sieciujących polimerów anionowych lub kationowych ujawniono jako środki dla uzyskiwania kontrolowanego uwalniania [opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Am. nr 4,690,682 i 4,789,516], Ponadto, dalsze próby ujawniają zastosowanie samych alginianów lub alginianów powleczonych innymi biodegradowalnymi polimerami, w celu kontrolowanego uwalniania kompozycji polipeptydowych lub ich kationowych osadów. PCT WO 96/00081, PCT WO 95/29664 oraz PCT WO 96/03116.

Jednak próby te nie zapewniły wystarczających środków gwarantujących dostarczanie żądanych farmaceutyków proteinowych w warunkach przedłużonego uwalniania. Powszechnie wiadomo, że przy zastosowaniu pewnych biodegradowalnych polimerów, przykładowo kopolimeru polilaktydglikolid, w warunkach in vivo, obserwuje się początkowy wysoki poziom uwolnienia środka leczniczego. O. Johnson i in., Naturę Med., 2/7: 795 (1996). Ponadto, powszechnie wiadomo również, że proteiny stosowane w dotychczasowych preparatach o przedłużonym uwalnianiu mogą ulegać denaturacji i stracić bioaktywność po wystawieniu na działanie środka zamykającego je w kapsułkach. W takich preparatach stosuje się rozpuszczalniki organiczne, które mogą wywierać niszczący wpływ na wybraną proteinę. Ostatecznie zaś, jak to omówiono poniżej, zastosowanie samego alginianu nie zapewniło żądanego kontrolowanego uwalniania proteiny koniecznego dla uzyskania skutecznych rezultatów terapeutycznych.

Generalnie, alginiany są dobrze znanymi, występującymi w naturze, anionowymi polisacharydami zawierającymi kwas 1,4-związany-e-D-manuronowy i kwas α-L-guluronowy. O. Smidsrod i in., Trends in Biotechnology, 8: 71-78 (1990); P. Aslani i in., J. Microencapsulation, 13/5: 601-614 (1996). Alginiany zasadniczo zawierają od 70% kwasu manurowego i 30% kwasu guluronowego, do 30% kwasu manurowego i 70% kwasu guluronowego. Smidsrod, supra. Kwas alginowy nie rozpuszcza się w wodzie, podczas gdy sole utworzone z jednowartościowymi jonami, takimi jak sód, potas i jon amonowy są rozpuszczalne w wodzie. R. H. Mc Dowell, „Properties of Alginates” (London, Alginate Industries Ltd., wydanie IV, 1977). Wiadomo, że wielowartościowe kationy reagując z alginianami spontanicznie tworzą żele.

PL 199 565 B1

Alginiany mają dużą różnorodność zastosowań, w tym jako dodatki do żywności, kleje, tabletki farmaceutyczne, podkładki do wzrostu nowych komórek oraz opatrunki na rany. Alginiany poleca się ponadto do technik rozdziału protein. Przykładowo C. J. Gray i in., Biotechnology and Bioengineering, 31: 607-612 (1998), wychwytywali insulinę za pomocą żeli alginianowych cynk/wapń w celu oddzielenia insuliny od innych protein zawartych w surowicy.

Matryce alginianowe w zastosowaniu do układów dostarczania leków są dobrze opisane, patrz przykładowo opis patentowy Stanów Zjednoczonych Am. nr 4,695,463 w którym ujawniono układ dostarczania na bazie alginianu w postaci gumy do żucia oraz preparaty farmaceutyczne. Alginianowe perełki zastosowano do kontrolowanego uwalniania różnych protein takich jak: receptor czynnika martwicy nowotworu w perełkach kation-alginianowych powleczonych polikationami, S. F. Wee, Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater, 21: 730-31 (1994); transformujący czynnik wzrostu zamknięty w kapsułkach w postaci perełek alginianowych, P. A. Puolakkainen i in., Gastroenterology, 107: 1319-1326 (1994); czynniki angiogeniczne unieruchomione w perełkach alginianu wapnia, E. C. Downs i in., J. of Cellular Physiology, 152: 422-429 (1992); albumina unieruchomiona w mikrokapsułkach chitozan-alginian, A. Polk i in., J. Pharmaceutical Sciences, 83/2: 178-185 (1994) lub perełki chitozanalginian wapnia powleczone polimerami, A. O. Okhamafe i in., J. Microencapsulation, 13/5: 497-508 (1996); hemoglobulina zamknięta w kapsułkach w postaci perełek chitozan-alginian wapnia, M. L. Huguet i in., J. Applied Polymer Science, 51: 1427-1432 (1994), M. L. Huguet i in., Process Biochemistry, 31: 745-751 (1996) oraz interleukina-2 zamknięta w kapsułkach w postaci mikrosfer alginianchitozan, L. S. Liu i in., Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater, 22: 542-543 (1995).

Układy wykorzystujące perełki z żelu alginianowego lub perełki z żelu alginian/wapń do otoczkowania protein nie wykazują żadnego efektu przedłużonego uwalniania z powodu szybkiego uwalniania proteiny z perełek alginianowych. L. Liu i in., J. Control. Rel, 43: 65-74 (1997). Dla uniknięcia takiego szybkiego uwalniania, w szeregu wyżej wymienionych układach próbowano zastosować powłoki z polimeru polikationowego (przykładowo z polilizyny, chitozanu) w celu opóźnienia uwalniania proteiny z perełek alginianowych. Patrz przykładowo M. A. Wheatley i in., J. Applied Polymer Science,

43: 2123-2135 (1991); S. F. Wee i in., supra: L. S. Liu i in., supra; S. F. Wee i in., Controlled Release Society, 22: 556-567 (1995) oraz Lim i in., supra.

Polikationy takie, jak polilizyna, są dodatnio naładowanymi polielektrolitami, które oddziaływają z ujemnie naładowanymi cząsteczkami alginianu i tworzą polielektrolitowe kompleksy, które działają jak bariery dyfuzyjne na powierzchni perełki. Problemy pojawiające się z zastosowaniem polikationów są następujące: (1) preparaty takie mogą być cytotoksyczne z powodu obecności polikationów (M. L. Huguet i in., supra; Ulrich Zimmermann, Electrophoresis, 13: 269 (1992); P. Bergman i in., Clinical Science, 67: 35 (1984)); (2) polikationy są podatne na utlenianie; (3) perełki z otoczką polikationową mają tendencję do nieulegania rozpadowi i kumulowania się w organizmie; (4) preparaty takie otrzymuje się na drodze pracochłonnych procedur powlekania, które obejmują wielokrotne powlekanie polikationową polilizyną (Padół i in., Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater, 2: 216 (1986) oraz (5) oddziaływania jonowe pomiędzy proteiną i polikationami mogą spowodować utratę aktywności proteiny lub są przyczyną jej niestabilności.

Poza wymienionymi wyżej układami istnieją układy dostarczania leków, które żelują po wstrzyknięciu lub mają bazę organiczną i/lub tiksotropową. Zżelowane depozyty, które żelują po wstrzyknięciu do ciała, mogą podtrzymywać uwalnianie unieruchomionych w nich substancji leczniczych. Zalicza się tu żelowanie poloksamerów pod wpływem temperatury (przykładowo Pluronics^®, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Am. nr 2,741,573). Są one ciekłe w niskich temperaturach lecz żelują w podwyższonych temperaturach, takich jak temperatura ciała. Układy te są trudne do kontrolowania ze względu na zmiany warunków temperaturowych otoczenia oraz zmiany temperatur anatomicznych, zwłaszcza w przypadku wstrzyknięć podskórnych.

Jeśli chodzi o żelujące układy na bazie organicznej, nie są one odpowiednie dla wrażliwych leków proteinowych, które ulegają destabilizacji w obecności rozpuszczalników organicznych lub w warunkach niefizjologicznych. Tiksotropowe żele stearynianu glinu w olejach stosuje się również do przedłużenia aktywności penicyliny. Buckwalter i in., J. Am. Pharm. Assoc., 137: 472 (1948); R. E. Thompson, American Journal Clinical Nutrition, 7: 311 (1959); Robert E. Thompson, Sustained Release of Parenteral Drugs, Bulletin of Paranteral Drug Assoc., 14: 6-17, (1960); Y. Chen, Journal of Parenteral Science & Tech., 35: 106 (1981). Proteiny wykazują tendencję do destabilizacji w obecności tego typu układów zawierających olej.

PL 199 565 B1

Z japońskiej publikacji nr JP 1005460 A znane jest rozwiązanie umożliwiające wytwarzania takich produktów żelujących z opóźnieniem jak środki żywnościowe, leki i chemikalia do celów przemysłowych, bez poddawania ich obróbce termicznej, co ma ogromne znaczenie w przypadku leków i innych substancji nietrwałych w podwyższonej temperaturze. W rozwiązaniu tym wykorzystuje się polisacharyd wytwarzany przez bakterie Sphingomonas elodea, znany jako „gellan gum”, rozpuszczalny w wodzie i stosowany wcześniej głównie jako alternatywny dla agaru materiał żelujący do hodowli mikrobiologicznych. Zgodnie z tym rozwiązaniem układ wodny tworzony przez ten polisacharyd w stężeniu 0,03-2% wagowych oraz sól metalu ziem alkalicznych i/lub substancję kwasową taką jak kwas organiczny lub nieorganiczny, zapewnia opóźnione żelowanie środka spożywczego, leku albo środka chemicznego do celów przemysłowych zmieszanego z tym układem.

Układy dostarczania leków, zapewniające przedłużone uwalnianie oraz kontrolowane opóźnienie żelowania w ciele pacjenta nie są zasadniczo znane w stanie techniki. Tego rodzaju układy z opóźnionym żelowaniem są jednak znane w kontekście hodowli tkanek roś linnych, immobilizacji komórek, tworzenia mikrosfer, uwalniania insektycydów oraz przemysłu spożywczego. Przykładowo alginiany zastosowano z nierozpuszczalnymi kompleksami wapnia i δ-glukonolaktonem jako donorem protonu do uwalniania jonów wapnia do roztworu do żelowania. Patrz Draget i in., Appl. Microbiol. Biotechnol., 31: 79-83 (1989). Podobnie, zbliżone układy zastosowano dla tworzenia perełek alginianowych przez emulgowanie/wewnętrzne żelowanie. Mikrosfery alginianowe wytworzono stosując alginian zdyspergowany w oleju roślinnym i żelowanie zainicjowano przez obniżenie pH w celu uwolnienia wapnia z nierozpuszczalnego kompleksu. Patrz D. Poncelet i in., Appl. Microbiol. Biotechnol., 43: 644-650 (1995). Układy alginianowe zastosowano ponadto do immobilizacji komórek. C. Burke ujawnia w Methods of Enzymology, 135: 175-189 (1987), że fosforan diwapniowy i δ-glukonolakton mogą być stosowane z alginianami do opóźnionego żelowania komórek. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Am. nr 4,053,627 ujawnia zastosowanie dysków z żelu alginianowego do kontroli uwalniania insektycydu w środowisku wodnym. Te omówione wyżej zastosowania nie są przeznaczone dla zżelowanych depozytów w ciele pacjenta, zdolnych do przedłużonego uwalniania środków aktywnych biologicznie, w szczególności protein.

Tak więc, istnieje zapotrzebowanie na opracowania preparatów farmaceutycznych z opóźnionym żelowaniem, które zapewniłyby lepsze środki o przedłużonym uwalnianiu do zastosowań klinicznych. Dla licznych protein rekombinacyjnych lub naturalnych korzystne byłoby ich stałe długotrwałe uwalnianie z preparatów o opóźnionym żelowaniu, co tym samym zapewniłoby bardziej skuteczne rezultaty kliniczne.

Obecny wynalazek zapewnia taki postęp.

Preparat farmaceutyczny zawierający farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik oraz kompozycję o przedłużonym uwalnianiu na bazie polimeru hydrofilowego, żelującą z opóźnieniem, znamienny tym, że kompozycja o przedłużonym uwalnianiu, żelująca z opóźnieniem zawiera:

a) alginian;

b) środek biologicznie aktywny oraz

c) co najmniej jeden związany jon metalu wielowartościowego.

W preparacie według wynalazku, kompozycja o przedłużonym uwalnianiu żelująca z opóźnieniem ewentualnie zawiera ponadto:

d) co najmniej jeden donor protonu zdolny do generowania kwasu na drodze hydrolizy, słabej rozpuszczalności lub powolnego rozpuszczania, z uwolnieniem związanego jonu metalu wielowartościowego.

Donor protonu jest zgodnie z wynalazkiem wybrany z grupy obejmującej bufory, estry, słabo rozpuszczalne kwasy, powolnie rozpuszczające się kwasy lub laktony.

Korzystnie, w preparacie według wynalazku donorem protonu jest glukonolakton.

W preparacie według wynalazku, związany jon metalu wielowartościowego jest korzystnie mieszaniną związanego i niezwiązanego jonu metalu wielowartościowego.

Preparat według wynalazku, zawiera ponadto zaróbkę/zaróbki do stabilizowania środka biologicznie aktywnego lub alginianu.

W preparacie według wynalazku, związany jon metalu wielowartościowego jest korzystnie solą takiego metalu wybraną spośród fosforanów, winianów, siarczanów, węglanów, wodorotlenków bądź soli z anionami kwasów tłuszczowych.

PL 199 565 B1

Korzystnie, jon metalu wielowartościowego wybrany jest z grupy obejmującej: mangan, stront, żelazo, magnez, wapń, bar, miedź, glin oraz cynk, a najkorzystniej jonem metalu wielowartościowego jest wapń.

W preparacie wedł ug wynalazku, alginian zawiera co najmniej 30% kwasu guluronowego.

W preparacie wedł ug wynalazku, alginian stanowi co najmniej 0,05% wagowych.

W preparacie wedł ug wynalazku, ś rodek biologicznie aktywny zawiera proteinę . Korzystnie, zawartość proteiny wynosi co najmniej 0,001 mg/mL.

W preparacie wedł ug wynalazku, proteina wybrana jest z grupy obejmują cej: czynniki hematopoetyczne, czynniki stymulujące kolonie, czynniki przeciw otyłości, czynniki wzrostu i czynniki przeciwzapalne.

W szczególności, proteina wybrana jest z grupy obejmującej: leptynę, G-CSF, SCF, BDNF, GDNF, NT3, GM-CSF, IL-1ra, IL2, TNF-bp, MGDF, OPG, interferony, erytropoetynę, KGF, insulinę oraz ich analogi lub pochodne.

W preparacie wedł ug wynalazku, ś rodek biologicznie aktywny jest skompleksowanym ś rodkiem biologicznie aktywnym.

Korzystnie, skompleksowany środek biologicznie aktywny jest wytrąconą proteiną. W szczególności, wytrąconą proteiną jest korzystnie osad cynk-leptyna.

Preparat według wynalazku, korzystnie jest w strzykawce.

Wynalazek obejmuje także zastosowanie wyżej określonego preparatu farmaceutycznego, zawierającego kompozycję o przedłużonym uwalnianiu w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, rozcieńczalniku lub adjuwancie do wytwarzania środka leczniczego na wskazanie lecznicze.

Zgodnie z wynalazkiem, wskazanie jest zaburzeniem wybranym z grupy obejmującej: nadmierną wagę, cukrzycę, wysoki poziom lipidów we krwi, stwardnienie tętnic, miażdżycę tętnic, zmniejszenie lub zahamowanie tworzenia się kamieni żółciowych, niewystarczającą masę tkanki beztłuszczowej, niewystarczającą wrażliwość na insulinę i udar mózgu.

Korzystnie, wskazanie jest zaburzeniem wybranym z grupy obejmującej: niedobory komórek hematopoetycznych, infekcję i neutropenię.

Korzystnie również, wskazanie jest zapaleniem.

Zaletą preparatu farmaceutycznego według wynalazku, zawierającego kompozycję farmaceutyczną o opóźnionym żelowaniu, jest to że kompozycja ta zapewnia ochronę protein, zmniejszenie degradacji i powolne rozpuszczanie przy zwiększonej mocy i trwałości proteiny. Ponadto, wynalazek zapewnia środki prostego, szybkiego i niedrogiego kontrolowanego uwalniania protein rekombinacyjnych dla osiągnięcia skutecznych rezultatów profilaktycznych, terapeutycznych lub diagnostycznych.

Jak wskazano wyżej, obecny wynalazek dotyczy preparatu farmaceutycznego zawierającego kompozycję o przedłużonym uwalnianiu, wykorzystującą żele alginianowe o opóźnionym żelowaniu. W szczególności, ż ele o przedł u ż onym uwalnianiu i opóź nionym ż elowaniu obejmują tiksotropowe żele alginianowe ze środkiem biologicznie aktywnym. Obecny wynalazek zapewnia tę korzyść, że umożliwia ekonomiczne wytwarzanie żeli alginianowych o opóźnionym żelowaniu z dużą zawartością środka biologicznie czynnego, zapewniając układ dostarczania leku o przedłużonym uwalnianiu, przy równoczesnym osiągnięciu zabezpieczenia proteiny, zmniejszonej degradacji, zwiększonej stabilności i sile działania dostarczanego środka terapeutycznie aktywnego. Ponadto, żelowanie w określonym czasie pozwala na większą kontrolę nad właściwościami żelu oraz jego podawaniem.

Tak więc w jednym z aspektów, obecny wynalazek zapewnia preparat farmaceutyczny zawierający kompozycję o przedłużonym uwalnianiu i o opóźnionym żelowaniu obejmującą alginian jako hydrofilowy polimer, środek biologicznie aktywny i co najmniej jeden związany wielowartościowy jon metalu. Szybkość żelowania kompozycji o przedłużonym uwalnianiu podlega kontroli za pomocą stężenia niezwiązanego wielowartościowego jonu metalu, przykładowo stężenia wolnego wapnia. Środek biologicznie aktywny stanowiący składnik tej kompozycji może być w postaci kompleksu. Tworzenie cząsteczek kompleksu i związanych z tym środków kompleksujących jest dobrze znane biegłym w sztuce. Dodatkowo, powyższa kompozycja moż e dodatkowo zawierać wielo wartościowy jon metalu, jako mieszaninę związanych i niezwiązanych wielowartościowych jonów metalu. Z powodu kontrolowanych w funkcji czasu właściwości żeli o opóźnionym żelowaniu, mieszaniny takie mogą być wprowadzone do ciała, gdzie mogą żelować po wstrzyknięciu. Ponadto, z powodu tiksotropowego charakteru kompozycji w stanie zżelowanym, mieszaniny takie mogą być wstrzykiwane w stanie ciekłym, przykładowo pod ciśnieniem panującym w strzykawce, po czym mogą ponownie ulec zżelowaniu w organizmie.

PL 199 565 B1

W innym aspekcie, obecny wynalazek dotyczy preparatu farmaceutycznego zawierającego kompozycję o przedłużonym uwalnianiu i o opóźnionym żelowaniu zawierającą alginian jako hydrofilowy polimer, środek biologicznie aktywny, co najmniej jeden związany wielowartościowy jon metalu, a ponadto co najmniej jeden donor protonu zdolny do uwolnienia zwią zanego wielowartoś ciowego jonu metalu. Uwolnienie protonu z donora protonu uwalnia kation ze związanego wielowartościowego jonu metalu.

Poniżej opisano sposoby wytwarzania kompozycji o przedłużonym uwalnianiu i o opóźnionym żelowaniu stanowiącej składnik preparatu farmaceutycznego według wynalazku. Jeden ze sposobów obejmuje etapy mieszania środka biologicznie aktywnego i hydrofilowego polimeru z rozpuszczalnikiem w celu wytworzenia pierwszej mieszaniny, a następnie wymieszanie pierwszej mieszaniny z co najmniej jednym związanym wielowartościowym jonem metalu w celu wytworzenia drugiej mieszaniny. Alternatywny sposób obejmuje etapy mieszania środka biologicznie aktywnego i hydrofilowego polimeru z rozpuszczalnikiem w celu wytworzenia pierwszej mieszaniny, wymieszanie pierwszej mieszaniny z co najmniej jednym związanym wielowartościowym jonem metalu z wytworzeniem drugiej mieszaniny oraz wymieszanie drugiej mieszaniny z co najmniej jednym donorem protonu zdolnym do uwolnienia związanego wielowartościowego jonu metalu. Związany wielowartościowy jon metalu i donor protonu mogą być również łącznie dodane do pierwszej mieszaniny lub donor protonu moż e być dodany do pierwszej mieszaniny przed dodaniem związanego wielowartościowego jonu metalu. Ponadto, przewidziany jest także etap wydzielania kompozycji o przedłużonym uwalnianiu i o opóźnionym żelowaniu.

W znaczeniu użytym w niniejszym opisie określenie „wielowartościowy jon metalu” odnosi się do wielowartościowego jonu metalu w postaci soli lub chelatu, bądź kompleksu jonowego. „Związany wielowartościowy jon metalu” może stanowić mieszaninę związanego i niezwiązanego wielowartościowego jonu metalu. Objęłoby to, jak wspomniano powyżej, uwolnienie związanego do niezwiązanego wielowartościowego jonu metalu. W znaczeniu użytym w mniejszym opisie określenie „donor protonu zdolny do uwolnienia związanego wielowartościowego jonu metalu” odnosi się do mocnych kwasów, słabych kwasów lub substancji zdolnych do wytworzenia kwasu, przykładowo laktonów lub estrów (w wyniku hydrolizy w środowisku wodnym), bądź też słabo rozpuszczalnego kwasu lub wolno rozpuszczającego się kwasu, takiego jak kwas adypinowy.

W znaczeniu uż ytym w niniejszym opisie okreś lenie „rozpuszczalnik” odnosi się do wodnych lub niewodnych rozpuszczalników zdolnych do dyspergowania lub rozpuszczania środków biologicznie aktywnych, hydrofilowych polimerów, wielowartościowych jonów metalu, donorów protonu lub wybranych czynników kompleksujących. Takie rozpuszczalniki są dobrze znane biegłym w sztuce. Operacje dodawania w celu wytworzenia pierwszej i drugiej mieszaniny mogą być zrealizowane sposobami dobrze znanymi biegłym w sztuce, przy czym obejmują one, lecz nie są ograniczone do: wlewania i mieszania, dodawania kroplami, dyspergowania, rozpylania lub mieszania przy uż yciu dysz rozpylających, strumieni powietrza, atomizacji i pól elektrycznych. Określenie „dyspersja” dla celów niniejszego wynalazku może oznaczać dyspersje ciekłe, stałe lub gazowe. W znaczeniu użytym w niniejszym opisie określenie „wydzielanie” odnosi się do sposobu wydzielenia kompozycji według wynalazku, o przedłużonym uwalnianiu i opóźnionym żelowaniu. Takie procedury wydzielenia i oczyszczenia są dobrze znane.

W jeszcze innym aspekcie, obecny wynalazek dotyczy preparatu farmaceutycznego zawierają cego kompozycję o przedłużonym uwalnianiu i o opóźnionym żelowaniu wytworzoną powyższymi sposobami. Dalsze aspekty obejmują preparaty farmaceutyczne na bazie powyższych kompozycji o opóź nionym ż elowaniu w farmaceutycznie dopuszczalnym noś niku lub zamknię te w strzykawce.

W jeszcze innym aspekcie obecny wynalazek dotyczy zastosowania wyżej określonego preparatu farmaceutycznego, zawierającego kompozycję o przedłużonym uwalnianiu, zawierającą żądane środki biologicznie aktywne, w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, rozcieńczalniku lub adjuwancie, do wytwarzania środka leczniczego do stosowania w wymienionych wyżej wskazaniach leczniczych.

Szczegółowy opis wynalazku

Kompozycje

Polimery hydrofilowe zawierające alginiany i ich pochodne można uzyskać z różnych dobrze znanych źródeł handlowych, naturalnych lub syntetycznych. W znaczeniu użytym w niniejszym opisie określenie „polimer hydrofilowy” odnosi się do polimerów rozpuszczalnych w wodzie lub polimerów o powinowactwie do absorbowania wody. Polimery hydrofilowe są dobrze znane biegł ym w sztuce.

PL 199 565 B1

Obejmują one (lecz nie wyłącznie): polianiony, w tym anionowe polisacharydy takie, jak alginian, gellan, karboksymetyloamyloza, sole kwasu poliakrylowego, sole kwasu polimetakrylowego, kopolimer etylenu z bezwodnikiem maleinowym (monoester), karboksymetyloceluloza, siarczan dekstranu, heparyna, karboksymetylodekstran, karboksyceluloza, 2,3-dikarboksyceluloza, trikarboksyceluloza, karboksylowana guma arabska, karboksykarragenan, karboksypektyna, karboksylowana guma tragakantowa, karboksylowana guma ksantanowa, polisiarczan pentozanu, karboksyskrobia, karboksymetylochityna/chitozan, kurdlan, sześciosiarczan inozytolu, siarczan β-cyklodekstryny, kwas hialuronowy, chondroityno-6-siarczan, siarczan dermatanu, siarczan heparyny, karboksymetyloskrobia, karragenan, poligalakturonian, guma karboksyguarowa, polifosforan, kwas polialdehydokarbonowy, poli-1-hydroksy-1-siarczano-propen-2, kopolimer styren-kwas maleinowy, agaroza, mezoglikan, sulfopropylowane alkohole poliwinylowe, siarczan celulozy, siarczan protaminy, guma fosfoguarowa, kwas poliglutaminowy, kwas poliasparaginowy, poliaminokwasy oraz ich pochodne lub kombinacje. Preparat według wynalazku zawiera kompozycję o przedłużonym uwalnianiu, w której polimerem hydrofilowym jest alginian.

Podobnie, związane wielowartościowe jony metalu można uzyskać z różnych dobrze znanych źródeł handlowych, naturalnych lub syntetycznych. Związane lub zamaskowane wielowartościowe jony metalu, stanowiące składnik kompozycji o przedłużonym uwalnianiu, obejmują (lecz nie wyłącznie): mangan, stront, żelazo, magnez, wapń, bar, miedź, glin lub cynk. Jony metalu mogą pochodzić z rozpuszczalnych soli środka kompleksującego lub ich octanów, fosforanów, mleczanów, winianów, cytrynianów, siarczanów, chlorków, węglanów, wodorotlenków lub soli z amonami kwasów tłuszczowych, takimi jak oleiniany. Biegły w sztuce rozpozna inne różne związane wielowartościowe jony metali/kompleksy, które mieszczą się w ramach niniejszego wynalazku. Związane wielowartościowe jony metalu mogą obejmować mieszaninę związanych i niezwiązanych wielowartościowych jonów metalu.

W znaczeniu użytym w niniejszym opisie określenie „donory protonu” odnosi się do materiału, który może wytworzyć kwasy. Donory protonu są w stanie uwolnić związany lub zamaskowany wielowartościowy jon metalu. Donory protonu są dobrze znane i obejmują (lecz nie wyłącznie) laktony, takie jak glukonolaktony, estry, bufory i inne wolno rozpuszczające się kwasy. W zastosowanym tu znaczeniu określenie wolno rozpuszczające się kwasy odnosi się do kwasów, które jako kwasy w postaci stałej wykazują małą rozpuszczalność w rozpuszczalniku. Ponadto wolno rozpuszczające się kwasy obejmują preparaty lub materiały powleczone, które wolno uwalniają kwasy. Dobrze znane w ramach stanu techniki kwasy obejmują kwas octowy, adypinowy, cytrynowy, fumarowy, glukonowy, mlekowy, jabłkowy, fosforowy i winowy. Biegły w sztuce rozpozna różne inne donory protonu, które mieszczą się w ramach niniejszego wynalazku.

W znaczeniu użytym w niniejszym opisie określenie „bufor” lub „roztwór buforowy” odnosi się do zastosowania nieorganicznych lub organicznych kwasów lub zasad lub ich kombinacji dla otrzymania znanego roztworu buforowego. Obejmują one również substancje amfoteryczne i aminokwasy. W ramach niniejszego wynalazku kwasy nieorganiczne obejmują chlorowcowodory (przykładowo kwas chlorowodorowy), kwas fosforowy, azotowy lub siarkowy. Inne kwasy nieorganiczne są dobrze znane biegłym w sztuce i są tu również rozważane. W ramach niniejszego wynalazku kwasy organiczne obejmują alifatyczne kwasy karboksylowe i kwasy aromatyczne, takie jak mrówkowy, węglowy, octowy, propionowy, masłowy, walerianowy, kapronowy, akrylowy, malonowy, bursztynowy, glutarowy, adypinowy, maleinowy, fumarowy, glicynę lub sulfonofenolowy. Inne kwasy organiczne są dobrze znane biegłym w sztuce. Organiczne zasady obejmują TRIS^®, pirydynę, PIPES^® i HEPES^®. Bufory aminokwasowe obejmują glicynę i mieszaniny glicyna/kwas fosforowy.

W znaczeniu użytym w niniejszym opisie określenie „środki biologicznie aktywne” odnosi się do protein rekombinacyjnych lub występujących naturalnie, ludzkich lub zwierzęcych, przydatnych do zastosowań profilaktycznych, terapeutycznych lub diagnostycznych, jak również środków nieproteinowych, takich jak małe cząsteczki, oligonukleotydy oraz środki nieorganiczne lub organiczne. Środek biologicznie aktywny może być naturalny, syntetyczny lub półsyntetyczny, bądź też może być ich pochodnymi. Ponadto, środki biologicznie aktywne stanowiące składnik kompozycji o przedłużonym uwalnianiu w preparacie według wynalazku mogą być zdolne do wytrącania. Rozważa się szeroki zakres środków biologicznie aktywnych. Obejmują one, lecz nie wyłącznie: hormony, cytokiny, czynniki hematopoetyczne, czynniki wzrostu, czynniki przeciw otyłości, czynniki troficzne, czynniki przeciwzapalne i enzymy (dodatkowe przykłady przydatnych środków biologicznie aktywnych - patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Am. nr 4,695,463). Biegły w sztuce z łatwością dobierze pożądany

PL 199 565 B1 środek biologicznie aktywny do kompozycji stanowiącej składnik preparatu farmaceutycznego według wynalazku.

Proteiny te obejmują, lecz nie wyłącznie: interferony (patrz opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Am. nr 5,372,808; 5,541,293; 4,897,471 i 4,695,623 włączone do niniejszego tekstu jako odsyłacze, wraz z rysunkami), interleukiny (patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Am. nr 5,075,222 włączony do niniejszego tekstu jako odsyłacz, wraz z rysunkami), erytropoetyny (patrz opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Am. nr 4,703,008; 5,441,868; 5,618,698; 5,547,933 i 5,621,080 włączone do niniejszego tekstu jako odsyłacze, wraz z rysunkami), czynniki stymulujące kolonie granulocytów (patrz opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Am. nr 4,810,643; 4,999,291; 5,581,476; 5,582,823 oraz publikacja PCT 94/17185, włączone do niniejszego tekstu jako odsyłacze, wraz z rysunkami), czynnik komórek macierzystych (PCT 91/05795, 92/17505 i 95/17206, włączone do niniejszego tekstu jako odsyłacze, wraz z rysunkami) oraz proteinę OB (patrz PCT 96/40912, 96/05309, 97/00128, 97/01010 i 97/06816 włączone do niniejszego tekstu jako odsyłacze, wraz z rysunkami). Ponadto, środki biologicznie aktywne mogą także obejmować, lecz nie wyłącznie: produkty związane z przeciwdziałaniem otyłości, insulinę, gastrynę, prolaktynę, hormon adrenokortykotropowy (ACTH), hormon stymulujący tarczycę (TSH), hormon luteinizujący (LH), hormon folikulostymulujący (FSH), gonadotropinę kosmówki ludzkiej (HCG), motylinę, interferony (alfa, beta, gamma), interleukiny (IL-1 do IL-12), czynnik martwicy nowotworu (TNF), proteinę wiążącą czynnik martwicy nowotworu (TNF-bp), czynnik neurotropowy pochodzenia mózgowego (BDNF), czynnik neurotropowy pochodzenia glejowego (GDNF), czynnik neurotropowy 3 (NT3), czynniki wzrostu fibroblastu (FGF), neurotropowy czynnik wzrostu (NGF), czynniki wzrostu kości takie, jak osteoprotegeryna (OPG), insulinopodobne czynniki wzrostu (IGFs), czynnik stymulujący kolonię makrofagów (M-CSF), czynnik stymulujący kolonię makrofagów granulocytów (GM-CSF), czynnik wzrostu pochodzący z megakariocytu (MGDF), czynnik wzrostu keratynocytowy (KGF), trombopoetynę, czynnik wzrostu pochodzący z płytek krwi (PGDF), czynniki wzrostu symulujące kolonię (CSFs), proteinę morfogenetyczną kości (BMP), dysmutazę nadtlenkową (SOD), aktywator plazminogenu tkankowego (TPA), urokinazę, streptokinazę i kalikreinę. Określenie „proteiny”, w znaczeniu stosowanym w niniejszym tekście, obejmuje peptydy, polipeptydy, jak również ich cząsteczki konsensusowe, analogi, pochodne oraz kombinacje.

Pochodne środków biologicznie aktywnych mogą obejmować przyłączenia jednego lub większej liczby reszt chemicznych do cząsteczki białka. Stwierdzono, że modyfikacja chemiczna środków biologicznie aktywnych zapewnia w pewnych warunkach dodatkowe korzyści takie, jak wzrost stabilności i czasu krążenia proteiny terapeutycznej oraz obniż enie immunogennoś ci. Biegł y w sztuce bę dzie mógł dobrać pożądane chemiczne modyfikacje stosownie do żądanego dawkowania, czasu krążenia, odporności na proteolizę, zastosowań terapeutycznych i innych względów. Pożądane są pochodne takie, jak z glikolem polietylenowych i proteiny fuzyjne Fc.

Kompleksy

Środek aktywny biologicznie może występować w postaci skompleksowanej. Termin „postać skompleksowana” obejmuje formy wytrącone, strukturalne oraz połączenia z innymi cząsteczkami. Wskazane formy skompleksowane środka mogą obniżyć szybkość dyfuzji środka z żelu, a zatem przedłużać uwalnianie środka. Formy skompleksowane obejmują, lecz nie wyłącznie: środek aktywny biologicznie w postaci kompleksu z przeciwciałami, podłożami, receptorami, lipidami, polimerami i ś rodkami strącającymi.

Przykładowo, środki aktywne biologicznie, ich analogi lub pochodne mogą być podawane w postaci skompleksowanej kompozycją wiążącą. Taka kompozycja wiążąca może dodatkowo - poza wyżej wymienionymi korzyściami - mieć wpływ na wydłużenie czasu cyrkulacji środka, jego analoga lub pochodnej oraz na podwyższenie aktywności środka biologicznie czynnego. Kompozycją taką może być proteina (lub równoznacznie - peptyd), jej pochodna, analog lub kombinacja lub też środek nieproteinowy.

Dla zilustrowania, proteiną wiążącą dla proteiny OB jest receptor proteiny OB lub jego część taka, jak jego część rozpuszczalna. Inne proteiny wiążące mogą być ustalone na drodze badania proteiny OB lub wybranej proteiny, w osoczu lub przez empirycznie przeszukiwanie na występowanie wiązania. Takie wiązanie w typowym przypadku nie będzie kolidować ze zdolnością proteiny OB, jej analoga lub pochodnej do wiązania się z endogennym receptorem proteiny OB i/lub wpływać na transdukcję sygnału. Poza proteiną OB, kompleksy wiążące mogą być tak samo stosowane do innych protein terapeutycznych stanowiących składnik kompozycji o przedłużonym uwalnianiu zawartej

PL 199 565 B1 w preparacie farmaceutycznym według wynalazku. Biegli w sztuce będą mogli ustalić właściwe proteiny wiążące do stosowania w obecnym wynalazku.

Podobnie, środki strącające używane do wytrącania środka aktywnego biologicznie można uzyskać z różnych handlowych, naturalnych lub syntetycznych źródeł, które są dobrze znane. Środki strącające obejmują, lecz nie wyłącznie: wielowartościowe jony metalu lub ich sole takie, jak octany, cytryniany, chlorki, węglany, wodorotlenki, szczawiany, winiany lub ich wodorotlenki, kwasy lub polimery rozpuszczalne w wodzie. W szczególności, jony metalu mogą obejmować, lecz nie wyłącznie: glin, bar, wapń, żelazo, mangan, magnez, stront i cynk. Korzystnie jonem metalu jest cynk lub jego sole, jak sole octanowo-chlorkowe. Mogą być również stosowane małe cząsteczki rozpuszczalne w wodzie i sole, takie jak siarczan amonu, aceton, etanol i gliceryna.

Jeśli chodzi o polimery rozpuszczalne w wodzie, to obejmują one, lecz nie wyłącznie: glikol polietylenowy, kopolimery glikol etylenowy/glikol propylenowy, hydroksyetylocelulozę, amylozę, karboksymetylocelulozę, dekstran, alkohol poliwinylowy, poliwinylopirolidon, poli-1,3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimery etylen/bezwodnik maleinowy, poliaminokwasy, dekstran, poli(n-winylopirolidon), glikol polietylenowy, homopolimery glikolu propylenowego, kopolimery tlenek polipropylenu/tlenek etylenu, polioksyetylowane poliole, bursztynian alkoholu poliwinylowego, glicerynę, tlenki etylenu, tlenki propylenu, poloksamery, kopolimery alkoksylowane, wodorozpuszczalne polianiony, ich pochodne lub kombinacje. Polimery rozpuszczalne w wodzie mogą mieć dowolny ciężar cząsteczkowy i mogą być rozgałęzione lub nierozgałęzione. Przykładowo, korzystny ciężar cząsteczkowy glikolu polietylenowego wynosi od około 700 Da do około 100 kDa, ze względu na łatwość posługiwania się i skuteczność wytrącania.

Inne rozmiary i rodzaje środków strącających mogą być stosowane w zależności od żądanego profilu terapeutycznego (przykładowo pożądany czas trwania przedłużonego uwalniania, wpływ - jeśli wchodzi w grę - na aktywność biologiczną, łatwość posługiwania się, stopień lub brak antygeniczności i inne znane skutki, jakie wywiera żądany środek strącający na proteinę terapeutyczną lub jej analoga). Biegły w sztuce może wybrać inne środki strącające, które mieszczą się w ramach obecnego wynalazku.

Ponadto, kompozycje stanowiące składnik preparatu farmaceutycznego według wynalazku mogą obejmować dodatkowe zaróbki konieczne do stabilizowania środka aktywnego biologicznie i/lub hydrofilowego polimeru. Mogą być one zawarte w buforze i mogą obejmować, lecz nie wyłącznie środki konserwujące.

Preparaty farmaceutyczne

Kompozycje o przedłużonym uwalnianiu stanowiące składnik preparatu farmaceutycznego według wynalazku mogą być podawane jako preparaty doustne (przykładowo ciekłe preparaty żelujące w żołądku lub w jelitach) i preparaty nie-doustne (przykładowo domięśniowe, podskórne, przezskórne, dotrzewiowe, IV (dożylne), IP (śródotrzewnowe), śródstawowe, do umieszczenia w uchu, ICV (śródmózgowokomorowe), IP (śródotrzewnowe), dotętnicze, dooponowe, dotorebkowe, śródoczodołowe, preparaty do iniekcji, dopłucne, donosowe, doodbytnicze i śródśluzówkowe domaciczne). Generalnie, żelowe kompozycje farmaceutyczne o przedłużonym uwalnianiu i opóźnionym żelowaniu w rozumieniu obecnego wynalazku zawierają skuteczne ilości proteiny lub produktów pochodnych oraz kompozycję o przedłużonym uwalnianiu wraz z farmaceutycznie dopuszczalnymi rozcieńczalnikami, środkami konserwującymi, solubilizatorami, emulgatorami, adjuwantami i/lub nośnikami potrzebnymi do podawania. (Patrz zgłoszenie PCT 97/01331 włączone do niniejszego zgłoszenia jako odsyłacz). Optymalny preparat farmaceutyczny według wynalazku, zawierający żądany środek biologicznie aktywny będzie określony przez biegłego w sztuce w zależności od drogi podawania i żądanego dawkowania. Przykładowe kompozycje farmaceutyczne ujawniono w Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing Co., Wyd. 18., Easton, PA, str. 1435-1712 (1990)).

Z powodu tiksotropowego charakteru preparatu żelowego o opóźnionym żelowaniu, można stosować do podawania podskórnego strzykawki. Kompozycję można zżelować w strzykawce do późniejszego podania. Żelowanie można zrealizować w sposób opóźniony w czasie. Czas żelowania można kontrolować przez rozważny dobór ilości czynnika żelującego, donora protonu (jeśli jest stosowany), jak również wielkości cząstek wielowartościowego jonu metalu oraz temperatury mieszaniny. Taki preparat mógłby być stosowany do późniejszego powtórnego zżelowania w organizmie po wstrzyknięciu. Określenie „tiksotropowy” w znaczeniu stosowanym w niniejszym tekście odnosi się do lepkości mieszaniny żelowej, która zmniejsza się pod ciśnieniem, przykładowo wytworzonym przez

PL 199 565 B1 tłok strzykawki, i w tym momencie mieszanina może płynąć przykładowo przez igłę strzykawki, a następnie ponownie utworzyć żel w miejscu wstrzyknięcia.

Zjawisko opóźnionego żelowania może być także wykorzystane przy napełnianiu strzykawek, gdzie strzykawkę napełnia się kompozycją żelową o przedłużonym uwalnianiu i w określonym czasie żeluje ona w strzykawce, przykładowo w czasie od kilku minut do wielu godzin po napełnieniu. Unika się w ten sposób problemu z napełnianiem strzykawki materiałem, który uległ już zżelowaniu. Te wstępnie napełnione strzykawki mogą być przechowywane do późniejszego wstrzykiwania pacjentom.

Składniki, które mogą być potrzebne do podawania obejmują rozcieńczalniki lub bufory o różnych pH i sile jonowej (przykładowo Tris-HCl, bufor octanowy); dodatki takie, jak środki powierzchniowo czynne i środki solubilizujące (przykładowo Tween 80, HCO-60, Polysorbate 80), lipidy, liposomy, antyutleniacze (przykładowo kwas askorbinowy, glutation, wodorosiarczyn sodu), dodatkowe polisacharydy (przykładowo karbometylocelulozę, alginian sodu, hialuronian sodu, siarczan protaminy, glikol polietylenowy), środki konserwujące (przykładowo Thimersol, alkohol benzylowy, metyloparaben, propyloparaben) i substancje masowe (przykładowo laktoza, mannitol); włączenie materiału do określonych ziarnistych preparatów związków polimerycznych takich, jak polimery kwas polimlekowy/kwas poliglikolowy lub kopolimery, itp. lub połączenie z liposomami. Jako składnik do podawania może też być stosowany kwas hialuronowy, który może dodatkowo wywierać wpływ sprzyjający dalszemu przedłużeniu okresu cyrkulacji. Ponadto, kompozycje o przedłużonym uwalnianiu stanowiące składnik preparatu farmaceutycznego według wynalazku mogą być również zdyspergowane w olejach (przykładowo oleju sezamowym, oleju kukurydzianym, roślinnym) lub w ich mieszaninie z fosfolipidem (przykładowo lecytyną) lub z trójglicerydami kwasów tłuszczowych o średniej długości łańcucha (przykładowo Miglyol 812) w celu wytworzenia zawiesiny w oleju. Kompozycje stanowiące preparat farmaceutyczny według wynalazku mogą być także zdyspergowane przy użyciu środków dyspergujących, takich jak rozpuszczalne w wodzie polisacharydy (przykładowo mannitol, laktoza, glukoza, skrobie), kwas hialuronowy, glicyna, fibryna, kolagen i sole nieorganiczne (przykładowo chlorek sodu).

Ponadto, do podawania preparatu farmaceutycznego według wynalazku zawierającego kompozycje o przedłużonym uwalnianiu można wykorzystać urządzenia mechaniczne przeznaczonych do dostarczania produktów terapeutycznych dopłucnie, obejmujące - lecz nie wyłącznie: nebulizatory, inhalatory z dozownikiem dawek oraz inhalatory proszkowe, z których wszystkie są znane biegłym w sztuce.

Składniki do preparatu dostosowane do wybranego reżimu podawania mogą wywierać wpływ na stan fizyczny, stabilność, szybkość uwalniania in vivo oraz szybkość usuwania zawartych w preparacie protein i pochodnych w warunkach in vivo. Biegły w sztuce oceni zastosowanie odpowiednich składników do podawania i/lub odpowiednich urządzeń mechanicznych w zależności od zastosowania terapeutycznego, drogi podawania, żądanego dawkowania, czasu cyrkulacji, odporności na proteolizę, stabilności proteiny i innych względów.

Zastosowania

Wynalazek obejmuje także zastosowanie wyżej omówionego preparatu farmaceutycznego według wynalazku, zawierającego kompozycję o przedłużonym uwalnianiu w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, rozcieńczalniku lub adjuwancie, do wytwarzania środka leczniczego na różnorodne wskazania, związane z użyciem określonego środka biologicznie aktywnego.

Zastosowania terapeutyczne. Zgodnie z wynalazkiem preparat farmaceutyczny znajduje zastosowanie do wytwarzania środków leczniczych o działaniu terapeutycznym, którego zakres działania zależy od zastosowanego środka aktywnego biologicznie. Biegły w sztuce będzie w stanie z łatwością zaadaptować żądany środek aktywny biologicznie do obecnego wynalazku stosownie do zamierzonych zastosowań terapeutycznych. Zastosowania terapeutyczne takich środków biologicznie aktywnych są w bardziej szczegółowy sposób przedstawione w następujących publikacjach włączonych wraz z rysunkami, do niniejszego tekstu jako odsyłacze. Zastosowania terapeutyczne obejmują, lecz nie wyłącznie - zastosowania takich protein, jak interferony (patrz opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Am. nr 5,372,808; 5,541,293; 4,897,471 i 4,695,623 włączone wraz z rysunkami do niniejszego tekstu jako odnośnik), interleukiny (patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Am. nr 5,075,222 włączony wraz z rysunkami do niniejszego tekstu jako odnośniki), erytropoetyny (patrz opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Am. nr 4,703,008; 5,441,868; 5,618,698; 5,547,933 i 5,621,080 włączone wraz z rysunkami do niniejszego tekstu jako odnoś niki), czynniki stymulujące kolonie granulocytów (patrz opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Am. nr 4,999,291; 5,581,476; 5,582,823; 4,810,643 oraz zgłoszenie PCT 94/17185, włączone wraz z rysunkami do niniejszego tekPL 199 565 B1 stu jako odnośniki), czynnik komórek macierzystych (zgłoszenia PCT 91/05795, 92/17505 i 95/17206, włączone wraz z rysunkami do niniejszego tekstu jako odnośniki) oraz proteinę OB (patrz zgłoszenia PCT 96/40912, 96/05309, 97/00128, 97/01010 i 97/06816 włączone wraz z rysunkami do niniejszego tekstu jako odsyłacze).

Ponadto, środki lecznicze o terapeutycznym przeznaczeniu uzyskane w wyniku zastosowania preparatu farmaceutycznego według wynalazku do ich wytwarzania obejmują środki biologicznie aktywne, do których należą, lecz nie wyłącznie: produkty związane z przeciwdziałaniem otyłości, insulina, gastryna, prolaktyna, hormon adrenokortykotropowy (ACTH), hormon stymulujący tarczycę (TSH), hormon luteinizujący (LH), hormon folikulostymulujący (FSH), ludzka gonadotropina kosmówkowa (HCG), motylina, interferony (alfa, beta, gamma), interleukiny (IL-1 do IL-12), czynnik martwicy nowotworu (TNF), proteina wiążąca czynnik martwicy nowotworu (TNF-bp), czynnik neurotropowy pochodzenia mózgowego (BDNF), czynnik neurotropowy pochodzenia glejowego (GDNF), czynnik neurotropowy 3 (NT3), czynniki wzrostu fibroblastu (FGF), neurotropowy czynnik wzrostu (NGF), czynniki wzrostu kości, takie jak osteoprotegeryna (OPG), insulinopodobne czynniki wzrostu (IGFs), czynnik stymulujący kolonię makrofagów (M-CSF), czynnik stymulujący kolonię makrofagów granulocytów (GM-CSF), czynnik wzrostu pochodzący z megakariocytu (MGDF), czynnik wzrostu keratynocytowy (KGF), trombopoetyna, czynnik wzrostu pochodzący z płytek krwi (PGDF), czynniki wzrostu symulujące kolonię (CSFs), proteina morfogenetyczna kości (BMP), dysmutaza nadtlenkowa (SOD), aktywator plazminogenu tkanki (TPA), urokinaza, streptokinaza i kalikreina. Określenie „proteiny”, w znaczeniu stosowanym w niniejszym tekście, obejmuje peptydy, polipeptydy, ich cząsteczki konsensusowe, analogi, pochodne oraz kombinacje. Ponadto obecne kompozycje mogą być także stosowane do wytwarzania jednego lub większej liczby środków leczniczych do leczenia lub poprawy stanów, na które skuteczny jest dany środek aktywny biologicznie.

Terapie skojarzone. Środki lecznicze wytworzone w wyniku zastosowania preparatu farmaceutycznego według wynalazku mogą być stosowane w połączeniu z innymi terapiami, takimi jak zmieniona dieta i ćwiczenia, a także obejmującymi podawanie innych środków leczniczych, takich jak leki przydatne w leczeniu cukrzycy (przykładowo insulina i ewentualnie amylina), środki obniżające poziom cholesterolu i ciśnienie krwi (takie jak środki zmniejszające stężenie lipidów we krwi lub inne środki sercowo-naczyniowe), leki zwiększające aktywność (przykładowo amfetaminy), diuretyki (do usuwania płynów) i środki zmniejszające apetyt. Takie podawanie leku może być równoczesne lub in seriatim. W dodatku, obecne środki lecznicze mogą być stosowane w połączeniu z zabiegami chirurgicznymi, takimi jak operacje kosmetyczne, mające na celu zmianę ogólnego wyglądu ciała (przykładowo odsysanie tłuszczu lub chirurgia laserowa w celu zmniejszenia masy ciała, lub chirurgia implantowa zmierzająca do zwiększenia masy ciała). Korzyści zdrowotne płynące z zabiegów chirurgicznych serca, takich jak wstawianie „bypassów” lub inne zabiegi związane ze złagodzeniem szkodliwych skutków spowodowanych zablokowaniem naczyń krwionośnych przez złogi tłuszczowe, takie jak płytki tętnicze, mogą być zwiększone przez towarzyszące im wykorzystanie obecnie ujawnionych preparatów farmaceutycznych i ich zastosowań. Sposoby usuwania kamieni żółciowych, takie jak ultradźwięki lub sposoby laserowe, mogą być stosowane zarówno przed, w trakcie, jak i po wykorzystaniu obecnych środków leczniczych o działaniu terapeutycznym. Ponadto, obecny wynalazek może być wykorzystany w celu wytworzenia środków leczniczych wykorzystywanych w terapiach wspomagających w chirurgii lub terapii złamań kości, uszkodzonych mięśni lub innych terapii, które mogłyby ulec poprawie przez zwiększenie masy tkanki beztłuszczowej.

Dawkowanie

Biegły w sztuce będzie w stanie ustalić skutecznie dawkowania na drodze podawania i obserwowania pożądanych efektów terapeutycznych. Dawka preparatu zawierającego kompozycję o przedłużonym uwalnianiu oznacza ilość konieczną do osiągnięcia skutecznego stężenia środka biologicznie aktywnego in vivo, w określonym okresie. Dawki i korzystna częstotliwość podawania preparatów zawierających kompozycję o przedłużonym uwalnianiu zmieniają się w zależności od rodzaju środka biologicznie aktywnego, żądanego czasu trwania uwalniania, leczonej choroby, żądanej częstości podawania, gatunku leczonego osobnika zwierzęcego i innych czynników. Korzystny preparat danego związku będzie taki, że od około 0,10 μg/kg/dzień do 100 mg/kg/dzień da pożądany skutek terapeutyczny.

Skuteczne dawki można wyznaczyć wykorzystując narzędzia diagnostyczne w funkcji czasu. Jako przykład, niniejszy wynalazek podaje dawki proteiny OB. Przykładowo, metodę diagnostyczną do mierzenia ilości proteiny OB we krwi (lub plazmie lub osoczu) można najpierw wykorzystać w celu

PL 199 565 B1 wyznaczania endogennych stężeń proteiny OB. Takim narzędziem diagnostycznym może być próba na przeciwciała, taka jak próba sandwiczowa na przeciwciała. Wstępnie oznacza się ilościowo ilość endogennej proteiny OB i wyznacza się linię podstawową. Dawki terapeutyczne wyznacza się poprzez ocenę ilościową endogennej i egzogennej proteiny OB (tj. proteiny, jej analoga lub pochodnej znalezionej w organizmie, zarówno wytworzonej przez organizm, jak i podanej) w trakcie trwania kuracji. Przykładowo, początkowo mogą być potrzebne względnie wysokie dawki, aż do momentu zauważenia korzyści terapeutycznej, a następnie - mniejsze dawki stosuje się do podtrzymania korzyści terapeutycznych.

Materiały i sposoby

Materiały. Alginian w postaci soli alginianowej można uzyskać z wielu źródeł lub można otrzymać sposobami znanymi ze stanu techniki. Leptyna, GCSF i interferon konsensusowy pochodzą z Amgen Inc. Inne odczynniki pochodzą ze ź ródeł znanych ze stanu techniki.

Wytwarzanie żelu o opóźnionym żelowaniu - Wprowadzenie:

Żel o opóźnionym żelowaniu otrzymuje się przez połączenie mieszaniny środka biologicznie aktywnego i anionowego polimeru (przykładowo alginianu) z solą wielowartościowego kationu (przykładowo CaCO3) i donorem protonu (przykładowo zakwaszonym buforem lub wolno uwalniającym kwas lub rozpuszczającym się źródłem kwasu, takim jak δ-glukonolakton), jeśli są one stosowane. W każdym przypadku anionowy polimer, proteina oraz środki strącające/zaróbki mogą być wytworzone w postaci jednej mieszaniny. Żelowanie inicjuje się przez dodanie do tej mieszaniny soli wielowartościowego kationu i donora protonu, jeśli są stosowane. Proton i wielowartościowy jon metalu można dodać równocześnie do mieszaniny polimeru ze środkiem biologicznie aktywnym lub oddzielnie, przy czym najpierw dodaje się albo donor protonu lub wielowartościowy jon metalu. W przypadku żelowania inicjowanego buforem sól wielowartościowego kationu i źródło protonu mogą być wymieszane w postaci wodnej zawiesiny znacznie przed momentem żelowania. Po zainicjowaniu żelowania napełnia się strzykawki, zanim nastąpi zżelowanie (w typowym przypadku 5 do 10 minut). Iniekcje można wykonać przed zżelowaniem materiału w celu żelowania in situ lub po zżelowaniu materiału.

Mieszanina proteina-alginian: Przygotowuje się mieszaninę rozpuszczalnika i środków strącających/zaróbek (przykładowo sole cynku, bufory, itp.). W chwilę potem szybko miesza się roztwór proteiny (przykładowo leptyny w 10 mM Tris HCl, pH 8) ze sterylnym alginianem (przykładowo autoklawowanym 10% roztworem). W przypadku, gdy środek biologicznie aktywny przygotowuje się w formie drobnej zawiesiny (przykładowo cynk-leptyna jest w typowym przypadku wytwarzana w stężeniu 10-15 mg/mL), konieczne może być zatężanie zawiesiny.

Sól wapnia: Sól wapnia można przygotować w postaci autoklawowanej zawiesiny drobnego proszku w wodzie (przykładowo 9,1% CaCO3 w wodzie).

Źródło protonu: W przypadku żeli indukowanych buforem zawiesinę soli wapnia można łączyć z buforem takim jak 1 M Tris HCl, pH 7,0 lub 0,5 M PIPES, pH 6,7.

W przypadku wolno rozpuszczających się lub wolno uwalniających kwas źródeł kwasu (δ-glukonolakton) daną ilość proszku rozpuszcza się w wodzie w wybranym czasie krótko przed zastosowaniem (przykładowo jedną minutę przed zmieszaniem). Można także zastosować wstępnie odważoną mieszaninę wysuszonych, sterylnych proszków źródła kwasu i soli wapnia w celu uproszczenia procesu.

Rozpuszczalnik: Rozpuszczalnik może być rozpuszczalnikiem wodnym, niewodnym lub ich mieszaniną. Przykładami niewodnych rozpuszczalników są dimetylosulfotlenek, dimetyloformamid, gliceryna, glikole polietylenowe, Pluronics^® itd.

Żelowanie: Żelowanie mieszaniny polimer-lek można zainicjować przez dodanie soli wapnia. Temperatura mieszaniny, ilość i wielkość cząstek soli mogą być wykorzystane do kontroli szybkości żelowania. Jeśli dodatkowo stosuje się donor protonu, to żelowanie mieszaniny można zainicjować przez dodanie albo 1) soli wapnia i zakwaszonej zawiesiny buforu (oddzielnie lub łącznie), 2) zawiesiny soli wapnia, a następnie świeżo przygotowanego roztworu/zawiesiny źródła wolno uwalniającego proton lub odwrotnie, bądź 3) proszków soli wapnia i źródła protonu razem lub oddzielnie. Po dodaniu soli wapnia, można dodać do mieszaniny inne środki strącające/zaróbki (przykładowo sole cynku, bufory itp.). Po dokładnym i szybkim wymieszaniu mieszanina żelu może być zaciągnięta do strzykawki przed zżelowaniem.

Obciążenie żelu: Zasadniczo obciążenie żelu proteiną jest znane. Nieznane obciążenia mogą być wyznaczone w następujący sposób.

PL 199 565 B1

Metoda rozrywania: około 0,1-0,2 mL (należy pobrać dokładną masę) żelu wylewa się do rurki Eppendorfa, następnie rozpuszcza w 1 mL 0,1 M cytrynianu sodu. Mieszaninę inkubuje się w temperaturze otoczenia delikatnie mieszając do chwili rozpadu żelu (zwykle 2 godz. lub przez noc). Utworzoną zawiesinę poddaje się wirowaniu z szybkością 8K obr/min przez 2 min (Eppendorf, 5415 C), a następnie rejestruje się absorbancję roztworu znad osadu przy długości fali 280 nm. Pozostałe części stałe rozpuszcza się w 1 mL 7M mocznika i rejestruje absorbancję roztworu. Na podstawie tych absorbancji można obliczyć ilość proteiny w miligramach na gram żelu.

Metoda kumulatywna: Metodę tę stosuje się w połączeniu z badaniami uwalniania in vitro. Ilości proteiny uwolnionej z żelu oraz z rozerwania na końcu badania są sumowane. Odnośnie szczegółów - patrz część poświęcona badaniom uwalniania in vitro.

Badania uwalniania in vitro: Żel jest uformowany w rurce Eppendorfa (próbki „wylewane”) lub w strzykawce, a następnie wytłoczony do rurki Eppendorfa (próbki „wytłoczone”). Zasadniczo wylewa się lub wytłacza około 0,1-0,2 mL żelu (waży się dokładną ilość). Uwalnianie rozpoczyna się przez dodanie buforu do każdej rurki (10 mM Tris HCl, pH 8 dla leptyny, pH 7,4 dla GCSF), i umieszcza się je w wytrząsarce inkubatorowej (New Brunswick Scientific) w 37°C i przy szybkości 100-200 obr./min. W wybranych przedziałach czasu próbkę wyjmuje się z inkubatora. Jeśli żel jest nienaruszony, ciecz znad roztworu usuwa się i wiruje (Eppendorf, 8000 obr./min, 2 min) i zbiera się. Części stałe zawiesza się w 1 mL świeżego buforu Tris i zawraca do rurki, w której prowadzi się badanie uwalniania w celu wznowienia uwalniania. Jeśli żel jest w znacznym stopniu rozerwany zawartość rurki poddaje się wirowaniu, zbiera się ciecz znad osadu, a części stałe zawiesza w 1 mL buforu w celu wznowienia uwalniania. Pobrane w czasie próbki cieczy znad osadu mogą wymagać dalszego wirowania (8000-13 000 obr./min, 8 min), aby uzyskać klarowną ciecz do skanowania UV. Ilość uwolnionej proteiny oznacza się na podstawie absorbancji cieczy znad osadu. Po pobraniu końcowej próbki z uwalniania, pozostałą w podłożu ilość oznacza się metodą rozerwania (powyżej). Procent uwolnienia w danym czasie wyznacza się z uwolnienia skumulowanej proteiny wyrażonego jako frakcja bądź oryginalnego wsadu proteiny w żelu (znanego z masy żelu i sposobu przygotowania) bądź całkowitej końcowej ilości uwolnionej proteiny (włączając w to końcowe rozerwanie cytrynian-mocznik).

Badania in vivo

Utrata wagi ciała myszy: Samice myszy w wieku od sześciu do ośmiu tygodni, typu C57/BLC uzyskano z Charles River and Taconic Inc. Przeciętna waga 20 gramów. Każda grupa dawkowania liczy pięć myszy. Iniekcje wykonuje się podskórnie.

Badanie PK szczurów. W tym badaniu wykorzystano samce szczurów o typowej wadze 250300 gramów. Iniekcje wykonywano w podobny sposób jak to opisano w badaniach utraty wagi ciała myszy. Krew pobierano przez cewnikowanie w różnych przedziałach czasu po iniekcji i próbki analizowano na zawartość leptyny próbą ELISA.

Przykłady

Poniższe przykłady podano w celu pełniejszego zilustrowania wynalazku lecz nie należy ich rozumieć jako ograniczenia jego zakresu. Ponadto, co się tyczy powyższego ujawnienia lub poniższych przykładów biegły w sztuce będzie w stanie dokonać niezbędnych zmian w ujawnieniu celem przygotowania wytwarzania w dużej skali.

P r z y k ł a d 1

Ten przykład in vivo pokazuje, że leptyna w indukowanym buforem żelu o opóźnionym żelowaniu jest aktywna i wykazuje przedłużone uwalnianie w porównaniu z roztworem leptyny. Przykład ten pokazuje także układ, który ulega żelowaniu po iniekcji do organizmu zwierzęcego. Z przesianej substancji stałej o wielkości cząstek mniejszej niż 75 mikronów przygotowano sterylną zawiesinę węglanu wapnia. Premiks tej zawiesiny z Tris pH 7 dodano do leptyny w alginianie (w 10 mM Tris pH 8) tak, aby końcowe stężenia składników wyniosły: 2% alginianu (sterylnie filtrowanego), 10 mg/mL leptyny, 7 mM Tris pH 8, 150 mM Tris pH 7 i 24 mM CaCO3 (zakładając całkowitą rozpuszczalność). Taka mieszanina żelowała w ciągu ośmiu do dziewięciu minut. Kiedy pominięto leptynę czas żelowania był nieznacznie dłuższy (10-12 minut). Pozwoliło to na napełnienie strzykawek.

Preparat żelu o opóźnionym żelowaniu wstrzykiwano (w stanie niezżelowanym) jednej grupie myszy co drugi dzień w dawce 100 mg/kg/dzień (co odpowiada dawce 2 dni po 50 mg/kg). Drugiej grupie wstrzykiwano dziennie 50 mg/kg/roztworu leptyny (o stężeniu 10 mg/mL w buforze Tris), a trzecia grupa otrzymała roztwór leptyny co drugi dzień w dawce 100 mg/kg. Myszy ważono codziennie i zmianę wagi wyrażono jako procent początkowej wagi ciała myszy.

PL 199 565 B1

Harmonogram dawkowania co drugi dzień za pomocą żelu o opóźnionym żelowaniu dał prawie taki sam ubytek wagi jak roztwór leptyny podawany codziennie (8-9%). W przeciwieństwie do tego, roztwór leptyny podawany co drugi dzień spowodował mniejszy ubytek wagi (6%) o krótszym czasie trwania. Ta ostatnia grupa powróciła do podstawowej wagi w ciągu 8 dni, podczas gdy inne grupy osiągnęły oryginalną wagę w ciągu 10-11 dni.

P r z y k ł a d 2

Przykład ten pokazuje, że otrzymywanie indukowanego buforem żelu wapniowoalginianowego o opóźnionym żelowaniu może wydłużyć in vitro przedłużone uwalnianie w porównaniu z preparatami niezżelowanymi. Z bardzo drobnego proszku przygotowano zawiesinę węglanu wapnia o stężeniu 100 mg/mL. Premiks tej zawiesiny z buforem PIPES pH 6,7 dodano do zawiesiny cynk-leptyna w alginianie (buforowanej Tris pH 8), którą utworzono ze stężonego roztworu leptyny (83 mg/mL w Tris pH 8 w chwili dodania cynku). Jeden mL takiej mieszaniny wylano do 10 mL zlewki. Koń cowe stężenia wszystkich składników wynosiły: 2% alginianu (z autoklawowanego 10% roztworu Keltonu LVCR), 15 mM Tris pH 8, 50 mg/mL leptyny, 1 mM ZnCl2, 10 mM CaCO3 (zakładając całkowitą rozpuszczalność) i 93 mM PIPES pH 6,7. Bez leptyny mieszanina żelowała w czasie 7 min. Po całonocnym żelowaniu kawałki żelu o wadze ok. 0,2 g zważono i umieszczono w fiolkach scyntylacyjnych w celu uwalniania, na wytrząsarce w 37°C. To uwalnianie porównano z uwalnianiem z takiego samego preparatu bez wapnia i PIPES (żel alginianowy bez wapnia). Spęczniony preparat alginianu cynk-leptyna (w stanie niezżelowanym) uwalniał po 5 godz. 75% i stopniowo do 90% w ciągu następnych 3 dni. Jednakże, żel wapniowo-alginianowy o opóźnionym żelowaniu zawierający wykazywał znacznie bardzie przedłużone uwalnianie cynk-leptyna: 35% po 5 godz., 60% po jednym dniu, a następnie bardziej stopniowe uwalnianie do 70% w ciągu 5 dni.

P r z y k ł a d 3

Przykład ten pokazuje, że żel indukowany δ-glukonolaktonem zawierający leptynę w formie drobnego osadu z cynkiem, wykazuje przedłużone uwalnianie leptyny. Leptynę (~14 mg/mL w Tris pH 8) dodano do roztworu PIPES o pH 6,7 i natychmiast wymieszano z roztworem ZnCl2, a następnie szybko wymieszano z roztworem alginianu (autoklawowany 10%) tak, aby końcowe stężenia składników wynosiły: 1,1 mM ZnCl2, 2,2% alginianu, 10 mM Tris (pH 8) i 22 mM PIPES (pH 6,7). Mieszaninę zatężono na wirówce do stężenia leptyny 46 mg/mL. Mieszaninę żelu przygotowano przez wymieszanie z zawiesiną CaCO3 (drobny proszek) i następnie przez szybkie wymieszanie z roztworem δ-glukonolaktonu. Końcowe stężenia składników wynosiły: 2% alginianu, 20 mM PIPES, 9 mM Tris, 1 mM ZnCl₂, 16 mM (zakładając całkowitą rozpuszczalność) CaCO₃ i 79 mM δ-glukonolakton. Mieszaninę zaciągnięto do strzykawek przed zżelowaniem, które nastąpiło w strzykawkach po 10 min. Po całonocnym przechowywaniu (3 godz. w temperaturze otoczenia, a następnie w 4°C), żele wstrzykiwano myszom. Ubytek wagi monitorowano w porównaniu z buforem kontrolnym.

Wykonano iniekcję odpowiadającą wartości pięciu dni przy dawce dziennej leptyny 50 mg/kg/dzień, tj. 250 mg/kg w jednej dużej dawce zawartej w żelu, i porównano z taką samą dużą dawką wolnej leptyny w roztworze. Jedna duża dawka wolnej leptyny wykazała umiarkowany ubytek wagi maksymalnie 4,4-4,8% w ciągu 2 do 3 dni, a przybywanie na wadze rozpoczęło się w 5 dniu. Dla kontrastu żel z kompleksem cynk-leptyna spowodował w ciągu 2 do 4 dni 9% ubytek wagi. Po pięciu dniach ubytek wagi wynosił nadal 5% i utrzymywał się powyżej linii podstawowej (utrzymany ubytek wagi) po 7 dniach, gdy zakończono badanie.

P r z y k ł a d 4

Przykład ten pokazuje, że jeśli stężenie proteiny w mieszaninie alginian-leptyna-cynk jest wystarczająco wysokie, mieszanina tworzy żel wykazujący przedłużone uwalnianie nawet pod nieobecność wapnia. Leptynę (~14 mg/mL w Tris pH 8) dodano do roztworu bufora i natychmiast wymieszano z roztworem ZnCl2, a następnie szybko wymieszano z roztworem alginianu (autoklawowany 10%) tak, aby końcowe stężenia składników wynosiły: 1,1 mM ZnCl2, albo 1,1 lub 2,2% alginianu, 10 mM Tris (pH 8) i 22 mM PIPES pH 6,7 jeśli stosowano). Mieszaninę zatężono na wirówce do osiągnięcia żądanego stężenia części stałych leptyny. Preparat o stężeniu ~50 mg/mL zawierał PIPES i 2,2% alginianu. Preparat o stężeniu ~100 mg/mL zawierał 1,1% alginianu i nie zawierał PIPES.

Końcowe stężenia składników w żelu wapniowym 50 mg/mL z przykładu 3 wynosiły: 2% alginianu, 20 mM PIPES, 9 mM Tris, 1 mM ZnCl2, 16 mM (zakładając całkowitą rozpuszczalność) CaCO3 i 79 mM δ-glukonolakton. W przypadku żelu wapniowego 100 mg/mL preparat był podobny, z tym że końcowe stężenia składników wynosiły: 1% alginian, nie dodano PIPES, 13 mM CaCO3 i 67 mM δ-glukonolakton.

PL 199 565 B1

W przypadku żeli z wapniem mieszaniny zaciągnięto do strzykawek przed żelowaniem, które nastąpiło w strzykawkach po 10 min. Jeżeli w żelu nie było wapnia, mieszaninę Zn-leptyna-alginian zaciągnięto do strzykawek i pozostawiono do zżelowania. Okazało się, że preparat 50 mg/mL bez wapnia nie żelował po całonocnym przechowywaniu (3 godz. w temperaturze otoczenia i następnie w 4°C); żele wstrzyknięto myszom. Ubytek wagi monitorowano w porównaniu z buforem kontrolnym.

Wykonano iniekcję odpowiadającą wartości pięciu dni przy dawce dziennej leptyny 50 mg/kg/dzień, tj. 250 mg/kg w jednej dużej dawce zawartej w żelu. Żele wapniowe z przykładu 3 dały 9% ubytek wagi ciała w ciągu 2-4 dni; po pięciu dniach ubytek wagi wynosił nadal 5% i utrzymywał się powyżej linii podstawowej (utrzymany ubytek wagi) po 7 dniach, gdy zakończono badanie. Dla porównania preparat 50 mg/mL bez wapnia dał 3% ubytek wagi w ciągu 2 do 4 dni, jednak spadł on do zera 5-go dnia. W przeciwieństwie do tego preparat leptyny 100 mg/mL bez wapnia był co najmniej tak aktywny jak preparat 100 mg/mL leptyny z wapniem. Szczytowy ubytek wagi dla żelu 100 mg/mL bez wapnia wynosił 9% w 4-tym dniu, szczytowy ubytek wagi dla żelu 100 mg/mL z wapniem wynosił 6%, także 4-tego dnia. W przypadku obydwu tych preparatów wzrost wagi wystąpił w 9 dniu.

P r z y k ł a d 5

Przykład ten pokazuje, że przedłużone uwalnianie leptyny in vitro z alginianowego żelu o opóźnionym żelowaniu może być osiągnięte bez wstępnego utworzenia drobnego osadu leptyna-cynk. Leptynę (100 mg/mL; 10 mM Tris HCl, pH 8,8; pH z 8,0 do 8,8 ustawiono za pomocą 1M NaOH) i 6% alginian (10 mM Tris HCl, pH 8,6) ochłodzono na łaźni lodowej. Leptynę (0,5 mL) dodano do 6% alginianu (0,18 mL) i mieszaninę mieszano po umieszczeniu w łaźni lodowej w ciągu 10-15 min; końcowe pH wynosiło 8,6-8,8. Do tej mieszaniny dodano zawiesinę 1M CaCO3 (16 mcL) i utworzoną zawiesinę dobrze wymieszano. Do tej zawiesiny dodano kroplami, utrzymując mieszanie, roztwór 0,1M ZnCl3 (100 mcL); następnie dodano wodę do objętości 1 mL. Mieszaninę w formie zawiesiny starannie wymieszano i trzymano w łaźni lodowej w czasie 10-20 min. Następnie mieszając dodano roztwór 1,68M δ-glukonolaktonu (56 mcL). 0,1 mL ostatecznej mieszaniny (50 mg/mL leptyny, 1% alginianu) wylano do rurki Eppendorfa i pozostawiono na noc w 4°C.

Po całonocnym przechowywaniu przeprowadzono uwalnianie in vitro w 10 mM histydyny, pH 7,4. Wylewany żel wykazał niewielkie pękanie i dość stałe uwalnianie leptyny przy 50% uwolnienia w ciągu 6 dni.

P r z y k ł a d 6

Przykład ten pokazuje, że żel indukowany δ-glukonolaktonem zawierający leptynę w formie drobnego osadu z cynkiem, wykazuje zwiększone przedłużone uwalnianie leptyny w porównaniu do tej samej zawiesiny cynkowej w alginianie, która nie uległa żelowaniu. Żel zawierający kompleks cynk-leptyna otrzymano w sposób opisany w przykładzie 3. Niezżelowaną zawiesinę cynk-leptyna otrzymano w ten sam sposób, z wyjątkiem tego, że nie dodano CaCO₃ i δ-glukonolaktonu. Myszom dawkowano iniekcje 250 mg/kg w postaci jednej dużej dawki i w sposób opisany w przykładzie 3 zrealizowano badanie ubytku wagi ciała. Niezżelowana zawiesina dała tylko 3% ubytek wagi ciała w ciągu 2-4 dni, podczas gdy zżelowana zawiesina spowodowała 9% ubytek wagi w tym samym okresie czasu. W przypadku niezżelowanej zawiesiny ubytek wagi powrócił do poziomu podstawowego 5-tego dnia, podczas gdy w przypadku zżelowanej zawiesiny utrzymał się powyżej linii podstawowej przez siedem dni, w chwili zakończenia badania.

P r z y k ł a d 7

Przykład ten przedstawia badanie farmakokinetyczne/farmakodynamiczne przeprowadzone na samcach szczura, które wykazuje, że kinetyka uwalniania ma charakter reakcji rzędu zero i demonstruje zarówno przedłużone uwalnianie jak i równoczesny przedłużony efekt działania leptyny (tj. ubytek wagi) dostarczanej przez kompozycję żelu opisaną w przykładzie 3. Stężenie leptyny wynosiło 47 mg/mL i była ona wstępnie podżelowana w strzykawce, jak to opisano w przykładzie 3. Szczurom podano jednorazowo duże dawki 0 mg/kg (kontrolnie), 50 mg/kg i 250 mg/kg, a następnie monitorowano stężenie we krwi i ubytek wagi w ciągu sześciu dni. Szczurom wstrzyknięto również osad cynk-leptyna bez żelu w dawce 100 mg/kg.

U grupy z dużą dawką leptyny w żelu stwierdzono stałe stężenie we krwi ~ 2000 ng/mL w całym okresie czasu, podczas gdy u grupy z małą dawką leptyny w żelu stężenie wyniosło ~ 1/5 powyższej wartości w ciągu czterech dni. W przeciwieństwie do tego, stężenie we krwi u grupy, której podano leptynę bez żelu wyniosło 2300 ng/ml, przy czym maksimum wystąpiło po 12 godz., a następnie stężenie w tym samym czasie zmniejszyło się 100-krotnie. Waga ciała szczurów (w funkcji kontroli zaróbki) zmniejszała się w stały sposób w czasie badania w przypadku grupy, której podano dużą dawkę

PL 199 565 B1 leptyny w żelu. Ubytek wagi u grupy z małą dawką leptyny w żelu przebiegał w ten sam sposób przez prawie 5 dni, po czym stężenie leptyny we krwi w tej grupie spadło.

Biodostępność leku zawierającego leptynę oceniono przez porównanie znormalizowanych względem dawki powierzchni pod krzywą preparatu żelu z leptyną, preparatu leptyny bez żelu oraz leptyny podawanej dożylnie. Biodostępność preparatu żelu z leptyną wyniosła 80% w porównaniu do 63% biodostępności preparatu leptyny bez żelu.

P r z y k ł a d 8

Przykład ten pokazuje przedłużone uwalnianie in vitro G-CSF z zaróbek żelowych o opóźnionym żelowaniu. Zilustrowano zarówno „wylewane” jak i „wytłaczane” materiały. G-CFS w wodzie o pH 3,4 wymieszano ze stężonym alginianem (10%) tak, aby utworzyć mleczną, lepką zawiesinę.

Mieszaninę tę żelowano za pomocą CaCO₃ i δ-glukonolaktonu, w ilości odpowiednio 16 mM i 79 mM. Przed zżelowaniem próbki tych mieszanin były albo wylewane do rurek lub zaciągane do strzykawek. Po 1 godz. w temperaturze otoczenia żele przechowywano przez noc w 4°C. Przed przeprowadzeniem badania uwalniania żel ze strzykawek wytłoczono do rurek i w czasie 20 min pozostawiono do uformowania. Następnie dodano bufor do uwalniania. Wytłoczony żel uwalniał GCSF w czasie trzech dni tj. 11% po 1 godz., 35% w ciągu 1 dnia, 75% po dwóch dniach i ~90% po trzech dniach. Żel wylewany uwalniał 22% po 1 godz., 80% po 1 dniu i 94% po dwóch dniach.

P r z y k ł a d 9

Przykład ten pokazuje przedłużone uwalnianie leptyny in vitro z żelu alginianowego o opóźnionym żelowaniu otrzymanego z soli wapnia (CaSO4) bez dodatku donora protonu. Niebuforowaną leptynę o pH 8 zastosowano do utworzenia zawiesiny cynk-leptyna w 2% alginianie. Końcowe stężenia ZnCl2 i leptyny wynosiły odpowiednio 1 mM i 55 mg/mL. Drobny proszek CaSO4 wymieszano z zawiesiną cynk-leptyna-alginian, tak by końcowa mieszanina zawierała 10 mM CaSO4. Próbki materiału wylano na ścianki rurek Eppendorfa. Mieszaniny żelowały w ciągu 4-5 min.

Po całonocnym przechowywaniu w temperaturze otoczenia, przeprowadzono badania uwalniania. Uwalnianie proteiny z żelu wykazało niewielkie pękanie (< 5%) po 1 godz. Po jednym dniu uwolniło się 11% leptyny. Leptyna uwalniała się stopniowo, 1,1% na dzień, przez następne siedem dni.

P r z y k ł a d 10

Przykład ten pokazuje przedłużone uwalnianie leptyny in vitro z żelu alginianowego o opóźnionym żelowaniu otrzymanego z soli wapnia w niewodnym rozpuszczalniku bez dodatku donora protonu. Liofilizowany proszek leptyny zawieszono w 2% alginianie w bezwodnym dimetylosulfotlenku. Drobny proszek oleinianu wapnia wymieszano z zawiesiną alginian-leptyna tak, by mieszanina zawierała 10 mM wapnia. Próbki materiału wylano na ścianki testowych rurek. Mieszanina żelowała w czasie. Po całonocnym przechowywaniu w temperaturze otoczenia przeprowadzono badania uwalniania. Uwalnianie proteiny z żelu przebiega stopniowo i ma przedłużony charakter, w ciągu następnych 7 dni.

P r z y k ł a d 11

Przykład ten pokazuje przedłużone uwalnianie leptyny in vitro z żelu alginianowego o opóźnionym żelowaniu otrzymanego z soli wapnia w sposób opisany w przykładzie 10. Badanie ubytku wagi ciała myszy przeprowadzono po pojedynczej iniekcji 250 mg/kg żelu zawierającego leptynę. Ubytek wagi mierzono przez kilka dni.

P r z y k ł a d 12

Przykład ten pokazuje przedłużone uwalnianie G-CSF in vitro z żelu alginianowego o opóźnionym żelowaniu otrzymanego z soli wapnia w niewodnym rozpuszczalniku bez dodatku donora protonu. Liofilizowany proszek G-CSF zawieszono w 2% alginianie w bezwodnym dimetylosulfotlenku. Drobny proszek oleinianu wapnia wymieszano z zawiesiną alginian-G-CSF tak, by mieszanina zawierała 10 mM wapnia. Próbki materiału wylano na ścianki testowych rurek. Mieszanina żelowała w czasie. Po całonocnym przechowywaniu w temperaturze otoczenia przeprowadzono badania uwalniania. Uwalnianie proteiny przebiega stopniowo i ma przedłużony charakter.

P r z y k ł a d 13

Przykład ten pokazuje przedłużone uwalnianie interferonu konsensusowego in vitro, jak ujawniono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Am. nr 4,695,623, supra, z żeli alginianowych o opóźnionym żelowaniu. Wodę, ZnCl₂, bufor Tris i interferon konsensusowy (w 10 mM Tris pH 7,5) wymieszano z roztworem alginianu, następnie wymieszano z CaCO₃ i δ-glukonolaktonem, tak aby końcowe stężenia składników wynosiły: 1 mg/mL interferonu konsensusowy, 10 mM ZnCl2, 1% alginianu, 20 mM Tris, 10 mM CaCO₃ i 40 mM δ-glukonolaktonu. Mieszaninę wylano do rurki Eppendorfa

PL 199 565 B1 (0,4 mL na rurkę), poddano żelowaniu w temperaturze otoczenia i przechowywano przez noc w 4°C. Po całonocnym przechowywaniu przeprowadzono uwalnianie in vitro w 10 mM buforze histydyny, pH 7,4. Wylewany żel wykazał niewielkie początkowe pękanie - uwalnianie po 1 godz. wyniosło 3%, 14% po jednym dniu. Po 4 dniach uwalnianie wyniosło 70%. Po 5-6 dniach, szybkość uwalniania zmniejszyła się do < 5% na dzień.

P r z y k ł a d 14

Przykład ten pokazuje, że żele alginianowe o opóźnionym żelowaniu mogą być stosowane do przedłużonego uwalniania interferonu konsensusowego. Żel alginianowy o opóźnionym żelowaniu, zawierający interferon konsensusowy otrzymano według przykładu 13 z wyjątkiem tego, że końcowe stężenia były następujące: 0,2 mg/mL interferonu konsensusowego, 10 mM ZnCl2, 2% alginianu, 20 mM Tris, 10 mM CaCO₃ i 40 mM δ-glukonolaktonu. Przygotowano drugi preparat o tym samym składzie, lecz końcowe stężenie interferonu konsensusowego wyniosło 1 mg/mL. Mieszaniny po zaciągnięciu do strzykawek zżelowały po 2 godz. Preparat o stężeniu 0,2 mg/mL wstrzyknięto podskórnie samcom chomika syryjskiego w dawce 1 mg/kg, a preparat o stężeniu 1 mg/mL w dawkach 1 mg/kg i 5 mg/kg. Krew pobierano na drodze punkcji serca i oznaczano interferon konsensusowy w celu obserwowania przedłużonego uwalniania leku.

Claims (23)

1. Preparat farmaceutyczny zawierający farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik oraz kompozycję o przedłużonym uwalnianiu na bazie polimeru hydrofilowego, żelującą z opóźnieniem, znamienny tym, że kompozycja o przedłużonym uwalnianiu, żelująca z opóźnieniem zawiera:

a) alginian;

b) środek biologicznie aktywny oraz

c) co najmniej jeden związany jon metalu wielowartościowego.

2. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że kompozycja zawiera ponadto

d) co najmniej jeden donor protonu zdolny do generowania kwasu na drodze hydrolizy, słabej rozpuszczalności lub powolnego rozpuszczania, z uwolnieniem związanego jonu metalu wielowartościowego.

3. Preparat według zastrz. 2, znamienny tym, że donor protonu jest wybrany z grupy obejmującej bufory, estry, słabo rozpuszczalne kwasy, powolnie rozpuszczające się kwasy lub laktony.

4. Preparat według zastrz. 3, znamienny tym, że donorem protonu jest glukonolakton.

5. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że związany jon metalu wielowartościowego jest mieszaniną związanego i niezwiązanego jonu metalu wielowartościowego.

6. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera ponadto zaróbkę/zaróbki do stabilizowania środka biologicznie aktywnego lub alginianu.

7. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że związany jon metalu wielowartościowego jest solą takiego metalu wybraną spośród fosforanów, winianów, siarczanów, węglanów, wodorotlenków bądź soli z anionami kwasów tłuszczowych.

8. Preparat według zastrz. 7, znamienny tym, że jon metalu wielowartościowego wybrany jest z grupy obejmującej: mangan, stront, żelazo, magnez, wapń, bar, miedź, glin oraz cynk.

9. Preparat według zastrz. 8, znamienny tym, że jonem metalu wielowartościowego jest wapń.

10. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że alginian zawiera co najmniej 30% kwasu guluronowego.

11. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że alginian stanowi co najmniej 0,05% wagowych.

12. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że środek biologicznie aktywny zawiera proteinę.

13. Preparat według zastrz. 12, znamienny tym, że zawartość proteiny wynosi co najmniej 0,001 mg/mL.

14. Preparat według zastrz. 12 albo 13, znamienny tym, że proteina wybrana jest z grupy obejmującej: czynniki hematopoetyczne, czynniki stymulujące kolonie, czynniki przeciw otyłości, czynniki wzrostu i czynniki przeciwzapalne.

PL 199 565 B1

15. Preparat według zastrz. 14, znamienny tym, że proteina wybrana jest z grupy obejmującej: leptynę, G-CSF, SCF, BDNF, GDNF, NT3, GM-CSF, IL-1ra, IL2, TNF-bp, MGDF, OPG, interferony, erytropoetynę, KGF, insulinę oraz ich analogi lub pochodne.

16. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że środek biologicznie aktywny jest skompleksowanym środkiem biologicznie aktywnym.

17. Preparat według zastrz. 16, znamienny tym, że skompleksowany środek biologicznie aktywny jest wytrąconą proteiną.

18. Preparat według zastrz. 17, znamienny tym, że wytrąconą proteiną jest osad cynk-leptyna.

19. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że preparat jest w strzykawce.

20. Zastosowanie preparatu farmaceutycznego określonego w zastrz. 1 do 18, zawierającego kompozycję o przedłużonym uwalnianiu w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, rozcieńczalniku lub adjuwancie do wytwarzania środka leczniczego na wskazanie.

21. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że wskazanie jest zaburzeniem wybranym z grupy obejmującej: nadmierną wagę, cukrzycę, wysoki poziom lipidów we krwi, stwardnienie tętnic, miażdżycę tętnic, zmniejszenie lub zahamowanie tworzenia się kamieni żółciowych, niewystarczającą masę tkanki beztłuszczowej, niewystarczającą wrażliwość na insulinę i udar mózgu.

22. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że wskazanie jest zaburzeniem wybranym z grupy obejmującej: niedobory komórek hematopoetycznych, infekcję i neutropenię.

23. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że wskazanie jest zapaleniem.